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CN111163810B - 用于递送pklr以治疗丙酮酸激酶缺乏症的慢病毒载体 - Google Patents

用于递送pklr以治疗丙酮酸激酶缺乏症的慢病毒载体 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于在哺乳动物细胞中表达基因以提供针对丙酮酸激酶缺乏症的基因疗法的多核苷酸盒、表达载体和方法。

Description

用于递送PKLR以治疗丙酮酸激酶缺乏症的慢病毒载体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年10月16日提交的美国临时申请第62/573,037号的优先权，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文中。
对以电子方式提交的文本文件的说明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为ROPA_004_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件为29KB，创建于2018年10月15日并且通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本发明涉及对丙酮酸激酶缺乏症的基因疗法。
背景技术
丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是一种由PKLR基因突变引起的单基因代谢疾病，所述单基因代谢疾病导致具有不同症状的溶血性贫血并且在新生儿期可能致命。PKD隐性遗传特征和其通过同种异体骨髓移植进行的治愈性治疗提供了开发基因疗法方法的理想场景。
在影响红细胞的许多其它遗传性酶缺陷中，丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是导致慢性非球形红细胞溶血性贫血(CNSHA)的最常见的一种疾病(Zanella等人，2007)。PKD的发作和严重程度变化很大，并且范围为轻度到重度新生儿贫血，在最严重的情况下在儿童时期会致命(Pissard等人，2006)。还报告了低频率的生长迟缓、胎儿水肿和新生儿期死亡(Gilsanz等人，1993)。据估计，PKD患病率在普通高加索人群中为1:20,000(Beutler等人，2000)，并且到目前为止，已鉴定出PKLR基因中超过195种不同的突变(http://www.lovd.nl/pklr)。
同种异体骨髓移植(BMT)已经成功地用于治愈严重的PKD患者(Tanphaichitr等人，2000)，但是组织相容性供体的低可用性和与这些患者的BMT相关的严重并发症(即，移植物抗宿主病、机会性感染等)使定期输血和脾切除术成为大多数严重形式的PKD的主要治疗选择(Zanella等人，2005年)，从而显著增加患者发病率和死亡率(Hilgard等人，2005)。用于严重PKD患者的治疗选择的有限功效和副作用以及其隐性遗传特征使PKD成为通过基因疗法治疗的合适疾病。
PKD是由催化所有细胞中的糖酵解途径的最后ATP生成反应的丙酮酸激酶(PK)酶的缺陷(Zanella，2005)引起的。在成熟红细胞中，由于PKLR基因座(Noguchi等人，1987)的红系特异性替代性启动子的调节，PK因RBC仅表达R型特异性同种型(RPK)而变得至关重要(Kanno等人，1992)。因此，RPK活性的任何丧失都会损害RBC代谢和寿命(Zanella，2005)，从而导致CNSHA。
一种有希望治疗和预防遗传以及其它疾病和病症的方法是递送具有基因疗法载体的治疗剂。目前，病毒载体在基因转移中示出最大效率，并且对于需要持续基因表达的遗传疾病的修正，由于病毒生命周期的整合性质，基于疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或AAV的载体是期望的。
针对单基因疾病(具体地那些影响造血系统的疾病)的基因疗法提供了令人信服的证据，表明自体造血干细胞(HSC)的基因修正是同种异体HSCT的替代治疗选择，从而避免了其主要并发症(Cartier等人，2009；Cavazzana-Calvo等人，2010；Cartier等人，2012；Aiuti等人，2013；Biffi等人，2013)。已经在动物模型(Pestina等人，2009；Breda等人，2012)和人类(Cavazzana-Calvo等人，2010)中解决了影响红细胞的疾病(如β-地中海贫血和镰状细胞疾病)的基因修正。然而，如PKD等遗传性红系代谢缺陷的基因疗法方法仍然是有限的。
已经在小鼠(Tani等人，1994；Meza等人，2009)和犬PKD缺陷的实验模型(Trobridge等人，2012)中证明了针对PKD的HSC基因疗法的可行性，这表明供体嵌合或基因修饰细胞的水平是实现溶血表型的有效修正的关键点(Richard等人，2004)，考虑到缺乏基因修正的HSC的选择性优势。用PKD小鼠模型进行的先前工作表明，当超过25％的基因修正细胞被移植时，逆转录病毒衍生的人RPK表达能够完全修正PKD表型(Meza等人，2009)。最近报道了体内输注有膨胀性和泡沫状载体修正的HSC的一只PKD巴辛吉犬的修正细胞的类似治疗阈值(Trobridge等人，2012)。
在设计用于基因疗法的多核苷酸盒和表达载体方面仍存在许多挑战。一个重大挑战是获得靶细胞中的转基因的充分表达。本领域长期存在的未满足的需求是基因转移后转基因的足够稳健的表达。在某些情况下，某些载体(例如，质粒DNA载体)的功效需要更有效的表达。在其它情况下，期望允许更少治疗剂量的更有效的基因表达盒，所述更少治疗剂量具有更有利的安全性特性或更不侵入性的施用途径。
当使用γ逆转录病毒(γ-RV)载体时，由于治疗性转基因表达受其长末端重复序列(LTR)调节的事实，因此可以实现高水平的转基因表达。然而，基于这种类型的载体的首次临床试验引起了安全性问题，因为若干个患者出现了出乎意料的白血病(Hacein-Bey-Abina等人，2008)。LTR的强启动子活性可以通过激活原癌基因启动子或通过抑制肿瘤抑制基因来影响周围基因的调节，从而导致插入诱变(Ott等人，2006；Howe等人，2008；Stein等人，2010；Braun等人，2014)。这些发现突显了需要使用针对PKD基因疗法的比γ-RV载体更安全和更有效的载体。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了一种表达盒，所述表达盒包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括：a)启动子序列；b)对基因产物进行编码的序列；以及c)核糖核酸(RNA)输出信号，其中所述启动子序列与所述对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列可操作地连接，并且任选地，其中a)-c)按5'到3'顺序存在于所述表达盒中。在某些实施例中，所述启动子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施例中，所述基因产物是治疗性基因产物。在一些实施例中，所述治疗性基因产物是丙酮酸激酶(PK)多肽，任选地丙酮酸激酶、肝脏和红细胞(PKLR)多肽。在某些实施例中，所述对基因产物进行编码的序列是密码子优化的。在一些实施例中，所述对基因产物进行编码的序列是密码子优化的人丙酮酸激酶cDNA版本，所述人丙酮酸激酶cDNA与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性。在特定实施例中，所述RNA输出信号是突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件(wPRE)。
在某些实施例中，所述突变的wPRE是包括与SEQ ID NO:24具有至少80％同一性的序列的嵌合wPRE。在一些实施例中，所述表达盒进一步包括一个或多个增强子序列。在一些实施例中，所述表达盒进一步包括聚嘌呤段(PPT)或聚腺苷酸化(polyA)信号序列。在一些实施例中，所述表达盒进一步包括以下序列中的一个或多个：i)包装信号序列；ii)截短Gag序列；iii)Rev应答元件(RRE)；iv)中央聚嘌呤段(cPPT)；v)中央末端序列(CTS)；以及vi)上游序列元件(USE)，任选地来自猿猴病毒40(SV40-USE)。在一些实施例中，所述表达盒进一步包括5'和3'长末端重复(LTR)序列。
在相关实施例中，本发明提供了一种重组基因递送载体，所述重组基因递送载体包括本文公开的表达盒。在某些实施例中，所述重组基因递送载体是病毒或病毒载体。在某些实施例中，所述病毒或病毒载体是慢病毒(LV)。
在另一个相关实施例中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包括本文公开的表达盒或基因递送载体。在一些实施例中，所述细胞是血细胞。在一些实施例中，所述细胞是红系细胞。在一些实施例中，所述细胞是骨髓细胞，例如谱系耗竭骨髓细胞。在一些实施例中，所述细胞是造血干细胞。在一些实施例中，所述细胞是CD34+造血干细胞。在一些实施例中，所述细胞是定向造血红系祖细胞。
在又另一个相关实施例中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的赋形剂和本文公开的重组基因递送载体或细胞。
在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供本文公开的表达盒、基因递送载体或药物组合物。在一个实施例中，所述疾病或病症是PKD，并且所述基因产物是PK多肽，任选地PKLR多肽。在某些实施例中，所述药物组合物包括所述重组基因递送载体。在其它实施例中，所述药物组合物包括所述细胞。在一个实施例中，所述细胞对所述受试者是自体的。
在相关实施例中，本发明提供了一种用于在红系细胞中表达转基因的方法，所述方法包括使一种或多种红系细胞与有效量的重组病毒载体接触，其中所述载体包含人PGK启动子、密码子优化的人PKLR cDNA转基因版本和突变的wPRE，其中在所述接触后，PKLR在所述一种或多种红系细胞中以可检测的水平表达。
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考对说明性实施例进行阐述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本发明的原理，并且在所述附图中：
图1描绘了反映存在于说明性LV载体的主链中的不同元件的位置的方案。
图2A是在整个基因疗法实验中使用的说明性自失活(SIN)LV载体的示意图，所述SIN LV载体携带调节对照载体(上图)中的EGFP转基因的表达或治疗性基因(下图)中的密码子优化的PKLR基因cDNA序列(coRPK)的表达的人PGK启动子。
图2B是为了解决显影的PGK-coRPK LV载体的功能而进行的基因疗法方案的示意图。
图3A-3D描绘了示出基因修正后原代接受者的外周血中的PKD表型的修正的数据。图3A和3B分别示出了健康(黑条，n＝5)和PKD贫血小鼠(灰条，n＝6)以及移植有EGFP(白条，n＝9)或coRPK转导的细胞(划线条，n＝17)的PKD贫血小鼠中的RBC和网织红细胞水平。数据表示为平均值±SEM，并通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)进行分析。图3C示出了用于在整个时间内检测生物素标记的RBC的流式细胞术策略，图3D示出了健康(黑线，n＝2)、贫血(灰线，n＝2)和基因修正小鼠(不连续线，n＝4)的RBC存活动力学。数据表示为平均值±SEM，并通过双向ANOVA检验进行分析。健康，非移植对照小鼠；PKD，非移植PKD小鼠；coRPK，表达治疗性转基因的PKD小鼠。
图4A-4C示出了二代移植小鼠的多谱系造血重建。图4A是用于通过用CD3-PE、B220-PE、B220-PECy5、Gr1-生物素和Mac1-生物素抗体加上SAV-PE-Cy5标记来鉴定不同造血谱系的流式细胞术策略的图。图4B描绘了代表性点图，并且图4C描绘了移植后140天时每个谱系在PB中的百分比。条表示健康(n＝2，黑条)和PKD小鼠(n＝2，灰条)对照物以及表达coRPK治疗性转基因的二代移植小鼠(n＝4，划线条)的平均百分比±SEM。
图5A-5D描绘了二代移植小鼠中的PKD表型修正。图5A示出了来自非移植小鼠和二代接受者的血液涂片的亮甲酚蓝染色以鉴定网织红细胞群(蓝色)。图5B是外周血中网织红细胞水平的流式细胞术分析。图5C表示RBC百分比，并且图5D表示表达coRPK转基因的二代移植小鼠(划线条，n＝4)、健康小鼠(黑条，n＝3)和贫血对照小鼠(灰条，n＝3)中的网织红细胞百分比。数据表示为平均值±SEM，并通过非参数双尾曼-惠特尼检验(Mann-Whitneytest)进行分析。
图6A-6C示出了前病毒整合的定量。图6A示出了移植后120到170天时来自单个移植小鼠的BM CFU中每个细胞的载体拷贝数。还示出了转导和嵌合百分比。图6B示出了来自不同造血区室的细胞中的前病毒拷贝数。柱表示不同组移植小鼠的平均值±SEM。图6C示出了来自单个移植EGFP表达性小鼠(灰线)和携带coRPK转基因的小鼠(黑线)的BM细胞中前病毒整合的动力学。
图7A-7C描绘了基因修正的小鼠中的红系分化模式的归一化。图7A示出了移植后140天时骨髓和脾脏中不同红系亚群的百分比。图7B描绘了所使用的流式细胞术策略的代表性点图。CD71和Ter119标志物的表达强度允许鉴定四个红系亚群：群I：早期原红细胞(Ter119med CD71高)，群II：嗜碱性成红细胞(Ter119高CD71高)，群III：晚期嗜碱性和多染性成红细胞(Ter119高CD71med)和群IV：正色性成红细胞、网织红细胞和成熟红细胞(Ter119高CD71低)。图7C示出了在非移植和移植小鼠中通过ELISA测量的血浆Epo水平。点表示单个小鼠的值。线表示平均值±SEM，并通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行分析。健康，非移植对照小鼠；PKD，非移植PKD小鼠；EGFP，表达EGFP转基因的PKD小鼠；coRPK，表达治疗性转基因的PKD小鼠。
图8A-8B示出了对照小鼠和具有转导细胞的移植小鼠中的造血祖细胞测定。数据展示了移植后140天时来自脾脏(图8A)和骨髓(图8B)的总CFU。点表示分析的每只小鼠的菌落数，并且线表示每组的平均值±SEM。数据通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行统计分析。
图9A-9C示出了移植后140天时基因修正的小鼠的脾肿大和器官病理学的逆转。图9A示出了代表性脾脏的图片，并且图9B示出了来自原代和二代移植PKD小鼠的脾脏重量占总体重的比率。点表示单个小鼠的值。线表示每组的平均值±SEM。数据通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行分析。图9C示出了来自原代移植PKD小鼠的脾脏和肝脏的组织学研究。第一列和第二列示出了用苏木精-伊红染色并分别使用4×和10×物镜在光学显微镜下拍摄的脾脏和肝脏的代表性组织切片。箭头指向指示髓外红细胞生成的红系细胞簇。第三列示出了肝脏切片的普鲁士蓝染色(Fe)，以检测箭头指示的铁沉积物。照片用20×物镜拍摄。组图例如图7所示。二代coRPK，二代接受者。
图10A-10G描绘了来自移植有经过基因修饰的细胞的小鼠的RBC样品中的代谢图谱。通过在两个独立实验中与PKD动物进行比较来分析健康小鼠和移植小鼠的显著代谢图谱变化。图10A示出了通过非靶向图谱获得的完整的RBC热图，其中较高和较低的代谢物水平分别以红色和蓝色表示。所列代谢物具有至少一个使用以下标准而显著的比较：绝对倍数变化>1.5；最小信号>2000；调整后的p值<0.01。黑框突显了各组间具有不同图谱的代谢物变化簇。图10B、10C和10D分别描绘了RBC中的ATP、ADP和丙酮酸水平，通过与移植后140天时的PKD小鼠进行比较，所述ATP、ADP和丙酮酸水平通过非靶向图谱来测量。测定1：健康小鼠(黑条)n＝1，PKD(灰条)n＝1，hPGK-EGFP(白条)n＝2，hPGK-coRPK(划线条)n＝3。测定2：健康小鼠n＝2，PKD n＝2，hPGK-EGFP n＝6，hPGK-coRPK n＝10。图10E、10F和10G描绘了移植后280天时涉及糖酵解途径的选定数量的代谢物(分别为PEP、3-磷酸甘油酸和D-乳酸)的RBC靶向代谢图谱。点表示单个小鼠的值。线表示平均值±SEM，并通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行分析。测定2：健康小鼠n＝7，PKD n＝5，hPGK-EGFP n＝3，hPGK-coRPK n＝5。
图11A-11C分别描绘了来自对照小鼠和移植有转导细胞的小鼠的RBC中的丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性以及丙酮酸激酶与己糖激酶酶活性的比率。RBC通过纤维素柱从血液样品纯化以避免白细胞PK活性污染，并进行酶活性评估。黑条，健康小鼠(n＝2)；白条，移植有用EGFP表达性载体转导的细胞的小鼠(n＝3)；划线条，移植有用coRPK表达性载体转导的细胞的小鼠(n＝3)。方格条表示来自健康志愿者的值(n＝1)。数据表示每组的平均值±SEM。
图12A-12D示出了来自移植有经过基因修饰的细胞的小鼠的WBC样品中的非靶向代谢图谱。图12A表示对照物和移植小鼠中RBC(红点；左侧和中心)和WBC(蓝点；右侧的簇)中非靶向代谢图谱的主成分分析。图12B、12C和12D分别描述了与PKD小鼠相比WBC中的ATP、ADP和丙酮酸水平。测定1：健康小鼠(黑条)n＝1，PKD(灰条)n＝1，hPGK-EGFP(白条)n＝2，hPGK-coRPK(划线条)n＝3。测定2：健康小鼠n＝2，PKD n＝2，hPGK-EGFP n＝6，hPGK-coRPKn＝10。数据表示每组的平均值±SEM，并通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行分析。
图13示出了针对在不同时间点和组织处从所有小鼠中采集的样品用Tsp509I酶生成的LAM-PCR产物的凝胶图像。载体整合位点通过3'载体LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增来鉴定。使用了MultiNA自动化系统，从而生成由若干个带表征的图案。载体主链衍生的Tsp509I内部控制带(IC)用箭头指示。
图14示出了针对在不同时间点和组织处从所有小鼠中采集的样品用HpyCH4IV5酶生成的LAM-PCR产物的凝胶图像。载体整合位点通过3'载体LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增来鉴定。使用了MultiNA自动化系统，从而生成由若干个带表征的图案。载体主链衍生的HpyCH4IV5 IC用箭头指示。
图15描绘了在移植有经过基因修饰的造血祖细胞的小鼠中进行的整合位点映射的分析的总体方案。如在补充方法中描述的，按照所示流水线对来自属于两个独立实验(表3)的移植小鼠并在移植之后的不同时间点采集的骨髓和白血细胞样品进行分析。
图16A-16B示出了LV整合沿移植小鼠的基因组的分布。图16A描绘了在TSS上游和下游跨越500Kb的最近的RefSeq基因的转录起始位点(TSS)周围的整合位点(IS)频率分布。顶部的数字是针对所有样品和时间点检测到的IS的数量。图16B描绘了表达EGFP转基因(黑条)或coRPK治疗性转基因(灰条)的移植小鼠中的LV整合位点的染色体分布，从而示出没有向任何特定染色体偏斜。
图17A-17C展示了coRPK-LV转导细胞的克隆丰度分析。点图表示来自测定1(图17A)和测定2(图17B和17C)的每只小鼠中的汇集整合的克隆丰度。每个IS的相对百分比(y轴)与在每个数据集中获得的序列读段的总数有关。BM，骨髓；PB，外周血；coRPK1-14，移植有用治疗性载体转导的造血细胞的小鼠。
图18表示携带治疗性PGK-coRPK LV载体的原代接受者小鼠与二代接受者小鼠之间的跟踪共享整合。汇集在任何器官、任何时间在任一小鼠中检测到的整合。二代接受者从移植小鼠coRPK11到14接收汇集的BM。检测到的其余IS是在原代或二代接受者中检测到的。框中的数字示出了提到的小鼠中对应整合的百分比的代表性。除了应用于整合分析的≥5％过滤器外，消除所有序列计数<3的整合。
图19展示了EGFP-LV转导细胞的克隆丰度分析。点图表示每只小鼠骨髓中的汇集整合的克隆丰度。每个IS的相对百分比(y轴)与在每个数据集中获得的序列读段的总数有关。类似于co-RPK转导的细胞(图17)，本图表明绝大多数移植小鼠示出造血再增殖的多克隆模式。
图20描绘了LV基因组整合图谱。使用GREAT软件对来自移植小鼠的样品进行基因本体(GO)分析。从本研究中检索到的所有整合(N＝2220)示出了图左部指示的基因功能的过度表示。为了解决最丰富的整合是否在特定基因类别上富集的问题，选择了相对序列计数大于整个数据集的5％的所有IS(如图17所示)，从而示出没有过度表示的GO基因类别。
图21描绘了PGK-coRPK LV慢病毒载体的示意图。
图22描绘了包括PGK-coRPK LV慢病毒载体的质粒(CPcoRPKW-17)的图。
图23A-23F表示PGK-coRPK LV慢病毒载体的核苷酸序列，所述核苷酸序列带有注释以示出各种功能元件的位置。
图24A-24B描绘了PGK-coRPK LV慢病毒载体的作用机制。图24A描绘了PGK-coRPKLV载体的异位表达将挽救PKD红细胞的野生型表型，否则不能生成功能性RPK蛋白以产生足够的能量来执行其功能。图24B示出了针对PKD患者的基因疗法策略，所述基因疗法策略基于用PGK-coRPK LV慢病毒载体进行的RPK缺陷CD34+造血祖细胞的体外转导以及随后的到患者体内的移植。携带治疗性人PKLR基因cDNA的显影的PGK-coRPK LV慢病毒载体将在体外转导时整合到患者CD34+细胞基因组中。然后，将这些经过基因修正的细胞重新输注回患者体内，其将在患者体内产生表达治疗性转基因的RBC，并且因此产生将修正PKD病理表型的功能性RPK蛋白。图修改自波士顿儿童医院(Boston Children's Hospital)博客。
具体实施方式
定义
如本文所使用的，“载体”是指包括多核苷酸或与多核苷酸缔合并且可以介导多核苷酸到细胞的递送的大分子或大分子的缔合物。说明性载体包含例如质粒、病毒载体、脂质体和其它基因递送媒剂。
术语“LV”是慢病毒的缩写，并且可以指病毒本身或其衍生物。所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式，除非另有要求。
如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指对基因产物进行编码的体外或体内核苷酸序列。在一些情况下，基因由编码序列组成或基本上由编码序列组成，所述编码序列即对基因产物进行编码的序列。在其它情况下，基因包括另外的非编码序列。例如，基因可以包含或可以不包含在编码区域之前和之后的区域，例如，5'非转译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如本文所使用的，“治疗性基因”是指当表达时对所述治疗性基因所存在于的细胞或组织或对表达所述基因的哺乳动物赋予有益效果的基因。有益效果的实例包含改善病状或疾病的体征或症状、预防或抑制病状或疾病或者赋予期望的特性。治疗性基因包含修正细胞或哺乳动物中的遗传缺陷的基因。
如本文所使用的，转基因是由载体递送到细胞的基因。
如本文所使用的，术语“基因产物”是指如多肽、肽、蛋白质或包含短干扰RNA(siRNA)、miRNA或小发夹RNA(shRNA)的干扰RNA等多核苷酸序列的期望的表达产物。
如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述术语还涵盖已修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分缀合。
“包括”意指所列元件是例如组合物、方法、试剂盒等中必需的，但是可以包含其它元件以在权利要求的范围内形成例如组合物、方法、试剂盒等。例如，“包括”对与启动子可操作地连接的治疗性多肽进行编码的基因的表达盒是除基因和启动子以外可以包含其它元件的表达盒，其它元件例如聚腺苷酸化序列、增强子元件、其它基因、连接子结构域等。
“基本上由……组成”意指对实质上不影响例如组合物、方法、试剂盒等的一个或多个基本和新颖特征的特定材料或步骤所描述的例如组合物、方法、试剂盒等的范围的限制。例如，“基本上由”对可操作地连接到启动子和多腺苷酸化序列的治疗性多肽进行编码的基因“组成”的表达盒可以包含另外的序列，例如，连接子序列，只要它们实质上不影响基因的转录或转译。作为另一个实例，“基本上由列举的序列组成”的变体或突变多肽片段具有列举的序列的、基于全长初始多肽在序列的边界处加上或减去约10个氨基酸残基的氨基酸序列，例如比列举的结合氨基酸残基少10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个残基或者比列举的结合氨基酸残基多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基，所述氨基酸序列源自全长初始多肽。
“由……组成”意指从组合物、方法或试剂盒中排除未在权利要求中指定的任何元件、步骤或成分。例如，“由对与启动子可操作地连接的治疗性多肽进行编码的基因以及转录后调节元件组成”的表达盒仅由启动子、对治疗性多肽进行编码的多核苷酸序列和转录后调节元件组成。作为另一个实例，“由列举的序列组成”的多肽仅含有列举的序列。
如本文所使用的，“表达载体”涵盖载体，例如如上文所讨论的或如本领域中已知的质粒、微环、病毒载体、脂质体等，所述载体包括对关注的基因产物进行编码的多核苷酸，并且在预期靶细胞中影响基因产物的表达。表达载体还包括与编码区域操作性地连接以促进基因产物在靶标中表达的控制元件。控制元件(例如，启动子、增强子、UTR、miRNA靶向序列等)和与其可操作地连接以供表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”。许多这种控制元件在本领域中是已知且可获得的或者可以由本领域中可获得的组分容易地构建。
如本文所使用的，“启动子”涵盖引导RNA聚合酶的结合并且从而促进RNA合成的DNA序列，即足以直接转录的最小序列。启动子和对应的蛋白质或多肽表达可以是普遍存在的，这意味着在广泛范围的细胞、组织和物种中具有强活性或者细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性。启动子可以是“组成型的”(意指持续活性)或“诱导型的”(意指启动子可以通过生物因子或非生物因子的存在或不存在而活化或失活)。还包含在本发明的核酸构建体或载体中的是增强子序列，所述增强子序列可以或可以不与启动子序列邻接。增强子序列影响启动子依赖性基因表达并且可以定位于天然基因的5'或3'区。
如本文所使用的，“增强子”涵盖刺激或抑制相邻基因的转录的顺式作用元件。抑制转录的增强子也被称为“沉默子”。增强子可以在任一朝向上在距编码序列和转录区下游的位置几千碱基对(kb)的距离上起作用(即，可以与编码序列相关)。
如本文所使用的，“终止信号序列”涵盖使RNA聚合酶终止转录的任何遗传元件，如例如多腺苷酸化信号序列。
如本文所使用的，术语“操作性地连接”或“可操作地连接”是指遗传元件(例如，启动子、增强子、终止信号序列、多腺苷酸化序列等)的并列，其中元件处于允许其以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动对编码序列进行转录，则启动子与编码区域操作性地连接。只要维持这一功能关系，启动子与编码区域之间就会存在插入残基。
如本文所使用的，术语“异源”是指源自与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术引入到源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。作为另一个实例，从启动子的天然编码序列中移除并且未与启动子有天然连接的编码序列操作性地连接的启动子是异源启动子。因此，例如，包含对异源基因产物进行编码的异源核酸的LV载体是包含通常不包含在天然存在的野生型LV中的核酸的LV载体，并且经过编码的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型LV编码的基因产物。
如本文所使用的关于核苷酸分子或基因产物的术语“内源性”是指核酸序列(例如，基因或遗传元件)或天然存在于宿主病毒或细胞中或与其相关联的基因产物(例如，RNA、蛋白质)。
如本文所使用的，术语“天然的”是指核苷酸序列(例如，基因)或存在于野生型病毒或细胞中的基因产物(例如，RNA、蛋白质)。
如本文所使用的，术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列的突变体，例如天然多核苷酸或多肽序列，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％序列同一性。换句话说，多核苷酸序列的变体包括相对于参考多核苷酸序列(例如，天然多核苷酸序列)的至少一个核苷酸差异(例如，核苷酸取代、核苷酸插入或核苷酸缺失)。多肽序列的变体包括相对于参考多肽序列(例如，天然多肽序列)的至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)。例如，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有70％或更高序列同一性的多核苷酸，例如与全长天然多核苷酸序列具有75％、80％或更高同一性，如85％、90％或95％或更高，例如98％或99％同一性。作为另一个实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更高序列同一性的多肽，例如与全长天然多肽序列具有75％、80％或更高同一性，如85％、90％、或95％或更高，例如98％或99％同一性。变体还可以包含与参考例如天然序列的片段共享70％或更高序列同一性的参考例如天然序列的变体片段，例如与天然序列共享75％、80％或更高同一性，如85％、90％、或95％或更高，例如98％或99％同一性。
如本文所使用的，术语“生物活性(biological activity)”和“生物活性(biologically active)”是指归因于细胞中的特定生物要素的活性。例如，“免疫球蛋白”、“抗体”或其片段或变体的“生物活性”是指结合抗原决定簇并且从而促进免疫功能的能力。作为另一个实例，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或变体实现其例如结合、酶活性等的天然功能的能力。作为第三实例，基因调节元件(例如，启动子、增强子、Kozak序列等)的生物活性是指调节元件或其功能片段或变体分别调节(即，促进、增强或活化)其可操作地连接的基因的表达的转译的能力。
如本文所使用的，术语“施用”或“引入”是指将重组蛋白表达的载体递送到细胞、受试者的细胞和/或器官或受试者。这种施用或引入可以发生在体内、体外或离体。用于表达基因产物的载体可以通过以下引入到细胞中：转染，其通常意指通过物理手段(例如，磷酸钙转染、电穿孔、微注射或脂质转染)将异源DNA插入到细胞中；感染，其通常是指通过感染剂即病毒引入；或者转导，其通常意指用病毒稳定感染细胞或通过病毒剂(例如，细菌噬菌体)将基因材料从一个微生物转移到另一个微生物。
“转化”通常用于指包括异源DNA的细菌或如肿瘤细胞等表达致癌基因并且已经转换为连续生长模式的细胞。用于“转化”细胞的载体可以是质粒、病毒或其它媒剂。
通常，根据用于向细胞施用、引入或插入异源DNA(即，载体)的方法，将细胞称为“转导的”、“感染的”、“转染的”或“转化的”。术语“转导”、“转染”和“转化”可以在本文中可互换地使用，而不论引入异源DNA的方法如何。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指已经用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。培养条件(如温度、pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。应当理解，术语“宿主细胞”是指原始转导、感染、转染或转化的细胞和其子代。
术语“治疗(treatment、treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，例如降低受试者体内发生疾病或其症状的可能性，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应方面可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”覆盖对哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包含：(a)防止疾病在可能倾向于患有疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者身上发生；(b)抑制疾病，即，阻止其发展；或者(c)缓解疾病，即，使疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。特别关注了对发展中的疾病的治疗，其中所述治疗稳定或减少了患者的不期望的临床症状。理想的是，在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。理想的是，将在疾病的症状期期间并且在一些情况下在疾病的症状期之后施用主题疗法。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指哺乳动物，包含但不限于：人和非人灵长类动物，包含猿类和人类；哺乳类运动动物(例如，马)；哺乳类农场动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在限制本发明。如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”旨在也包含复数形式。此外，在具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含(including)”、“包含(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体的情况下，此类术语旨在以类似于术语“包括(comprising)”的方式是包含性的。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受的误差范围之内，这将部分地取决于所述值是如何测量或确定的，即受测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个或大于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以意指给定值的高达20％、优选地高达10％、更优选地高达5％并且还更优选地高达1％的范围。可替代地，特别是对于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的数量级内，优选地在5倍内并且更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
除非另有指示，否则本文所使用的所有术语具有与本领域技术人员所知的含义相同的含义，并且实践本发明将采用微生物学的常规技术和重组DNA技术，所述技术在本领域技术人员的知识范围内。
除非另有指示，否则本发明的实践采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的技术范围内。此类技术在文献中进行了充分解释，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987)；酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；《分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987)；聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994)；《免疫学实验指南(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,1991)，上述文献中的每个文献通过引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，本公开提供了用于在细胞中表达基因的多核苷酸、多核苷酸盒和表达载体。还提供了药物组合物和使用任何组合物促进基因在细胞中(例如，在个体中)表达的方法以例如治疗或预防病症。在阅读如下文更全面地描述的组合物和方法的细节后，本发明的这些和其它目的、优点和特征对本领域技术人员而言将变得显而易见。
本发明总体上涉及分子生物学和病毒学领域，并且具体地说，涉及基因表达盒和包括所述基因表达盒的用于将编码所选治疗构建体(包含例如肽、多肽、核酶和催化RNA分子)的核酸片段递送到脊椎动物的所选细胞和组织的载体。具体地，这些基因构建体可以用于开发基因疗法载体，所述基因疗法载体包含例如用于治疗哺乳动物以及具体地人类疾病、病症和功能障碍的LV载体。
所公开的组合物可以用于各种调查、诊断和治疗方案，包含预防和治疗各种人类疾病。以下描述了本发明的各种组合物和方法。
尽管本文例示了特定的组合物和方法，但是应当理解，多个替代性组合物和方法中的任何替代性组合物和方法均是适用的并且适于用于实践本发明。还应当理解，可以使用本领域中标准的程序对本发明的表达构建体和方法进行评估。
在某些实施例中，提供了用于制备基因疗法载体组合物(例如，病毒载体)的方法和组合物，所述基因疗法载体组合物包括这些用于制备可用于动物以及具体地人类的疾病、病症和功能障碍的中心和所靶向基因疗法的药物的基因表达盒。
在一些实施例中，本发明提供了针对PKD的基于携带驱动PKLR cDNA表达的PGK真核启动子的LV载体的基因疗法。此治疗载体可以用于转导造血干细胞(HSC)，所述HSC可以随后移植到受试者体内。异位RPK表达使红系区室归一化，从而修正血液表型并恢复器官病理学。代谢组学研究表明，在白细胞没有代谢紊乱的情况下，对源自经过基因修正的PKDHSC的RBC中的糖酵解途径进行功能修正。对移植的造血细胞的基因组中的LV IS的分析表明，在经过移植的动物中的任一个动物中均没有遗传毒性的证据。总的来说，这些结果强调了PGK-coRPK LV载体的治疗潜力，并为PKD和其它红系代谢性遗传疾病的基因疗法提供了很高的期望。
在某些实施例中，本发明提供了用于PKD的基因修正的RPK LV载体。用此载体对鼠类PKD-HSC进行遗传修饰可以有效地修正经过移植的PKD小鼠的溶血表型和RBC代谢物图谱。没有观察到白细胞代谢紊乱和源自载体整合的遗传毒性的证据，从而支持了PGK-coRPKLV载体的治疗潜力。总的来说，结果提供了令人鼓舞的证据，证明了针对PKD的用针对临床应用设计的LV进行的基因疗法的可行性。
本发明的某些实施例包括表达密码子优化的人PLKR基因版本的自失活(SIN)LV载体。表达载体包括启动子区、编码序列和转录后调节元件。
本发明的多核苷酸盒的某些实施例包括启动子区，所述启动子区包括启动子序列或其功能性片段。在一个实施例中，启动子是人PGK启动子。
本发明的一些实施例包括用于增强丙酮酸激酶(例如，人PLKR基因)表达的多核苷酸盒。在一些实施例中，多核苷酸盒包括密码子优化的人PKLR cDNA版本(coRPK)，以增加转录时的mRNA稳定性。对于优化，可以使用软件，从而增加GC含量并移除隐蔽剪接位点，以避免转录沉默并且因此增加转基因表达。coRPK优化的序列示出了与人PKLR基因80.4％的同源性，而蛋白质的氨基酸序列没有变化。可替代地，可以使用本领域已知的任何优化方法。
在一些实施例中，多核苷酸盒包括第二增强子下游的RNA输出信号。所述RNA输出信号可以包括wPRE序列。在一些实施例中，还包含缺少任何残留开放阅读框的突变wPRE(Schambach、Bohne等人，2006)，以改善治疗性基因的表达水平和稳定性。术语“RNA输出信号”可以指本领域已知的“转录后调节元件”中的任一个。术语“RNA输出信号”和“转录后调节元件”等在本文中可互换使用，正如其通常在载体技术和开发领域中一样。在本公开的一些实施例中使用的示例性RNA输出信号或转录后调节元件包含但不限于：乙肝病毒转录后调节元件(HBVPRE)或源自不同猿猴逆转录病毒的组成型转运元件(CTE)，所述猿猴逆转录病毒包含1型猿猴逆转录病毒(SRV-1)和2型猿猴逆转录病毒(SRV-2)以及梅森-辉瑞(Mason-Pfizer)(MPV)。以下文献提供了转录后调节元件：美国专利第6,136,597号；Donello等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》72:5085-92(1998)；Hlavaty等人,《病毒学(Virology)》341:1-11(2005)；以及Oh等人,《逆转录病毒学(Retrovirology)》4:38(2007)。Zanta-Boussif等人,《基因疗法(Gene Therapy)》16:605-19(2009)提供了另外的替代性wPRE序列。前述参考文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在本发明的一些方面，提供了基因递送载体，所述基因递送载体包括本发明的多核苷酸盒。在一些实施例中，基因递送载体是LV。
在本发明的一些方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包括本发明的多核苷酸盒和药物赋形剂。在一些实施例中，所述药物组合物包括本发明的基因递送载体和药物赋形剂。
在本发明的一些方面，提供了用于在哺乳动物细胞中表达转基因的方法。在一些实施例中，所述方法包括使一种或多种哺乳动物细胞与有效量的本发明的多核苷酸盒或本发明的基因递送载体接触，其中转基因在一种或多种哺乳动物细胞中以可检测的水平表达。在一些实施例中，所述方法包括使一种或多种哺乳动物细胞与有效量的本发明的多核苷酸盒或本发明的基因递送载体接触，其中转基因在一种或多种哺乳动物细胞中以治疗性水平表达。在一些实施例中，所述方法在体外进行。在其它实施例中，所述方法在体内进行。
在本发明的一些方面，提供了用于治疗或预防有疾病或病症治疗或预防需要的哺乳动物的疾病或病症的方法。在一些实施例中，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本发明的药物组合物，其中所述编码序列对治疗性基因产物进行编码。
组合物
在本公开的一些方面，提供了用于在一个或多个真核细胞中表达转基因的组合物。在一些方面，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，哺乳动物细胞是造血干细胞。在一些实施例中，所述细胞是骨髓细胞，例如谱系耗竭骨髓细胞。在一些方面，哺乳动物细胞是定向造血红系祖细胞。
在本公开的一些实施例中，所述组合物是多核苷酸盒。“多核苷酸盒”是指包括两个或更多个功能性多核苷酸序列的通常彼此可操作地连接的多核苷酸序列，例如，调节元件、转译起始序列、编码序列和/或终止序列等。同样地，“用于在哺乳动物细胞中表达转基因的多核苷酸盒”是指促进在细胞中表达转基因的两个或更多个功能性多核苷酸序列(例如，启动子、增强子、5'UTR、转译起始序列、编码序列和/或终止序列等)的组合。
在一些实施例中，本公开的多核苷酸盒提供了哺乳动物细胞中转基因的增强的表达。如本文所使用的，“转基因的表达”或“表达转基因”是指由宿主细胞将转基因转录成信使RNA(mRNA)并且将所述mRNA转译成多肽(即，转基因产物)。因此，转基因的表达可以在mRNA水平(即，通过细胞中mRNA水平的序列特异性定量)上或在多肽水平(即，通过使用蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光显微技术或其它定量特异性多肽的方法来测量多肽基因产物的水平)上进行测量。如本公开的工作实例所表明的，诸位发明人已经发现了多个多核苷酸元件，即与本领域已知的那些元件相比有所改进的元件，所述元件单独地和协同地在哺乳动物细胞中提供转基因的增强表达。在某些实施例中，本公开的多核苷酸盒内的两个或更多个功能性多核苷酸序列的布置提供了哺乳动物细胞中转基因的增强的表达。“增强的”是指携带本公开的多核苷酸盒的细胞相对于携带可操作地连接到例如本领域已知的可比较的调节元件的转基因的细胞中转基因的表达增加、加强或更强。换句话说，来自本公开的多核苷酸盒的转基因表达相对于来自本公开的不包括一个或多个经过优化的元件的多核苷酸盒(即参考对照)的表达增加、增强或更强。在某些实施例中，增强的表达特异于或限于一种或多种所期望的细胞类型。
例如，在包括本文公开的包括启动子的多核苷酸盒的细胞中转基因的表达可以比在携带可操作地连接到例如本领域已知的不同启动子的转基因的细胞中转基因的表达增强、加强或增加。作为另一个实例，在包括本文公开的包括增强子序列的多核苷酸盒的细胞中转基因的表达可以比在携带可操作地连接到不同增强子序列的转基因的细胞中转基因的表达增强、或增加、加强或更强。
不希望受理论束缚，认为细胞中转基因的表达增强是由于细胞中的基因产物的较快积聚或细胞中的更稳定的基因产物引起的。因此，可以以多种方式观察通过本公开的多核苷酸盒增强的转基因表达。例如，通过与在转基因可操作地连接到例如本领域已知的可比较调节元件的情况下所观察到的表达相比，在所述多核苷酸盒与细胞的接触后检测到转基因表达的时间更早，例如早2天、早7天、早2周、早3周、早4周、早8周、早12周或更长时间，可以观察到增强的表达。还可以以每个细胞的基因产物的量增加的形式观察到增强的表达。例如，每个哺乳动物细胞的基因产物的量可能增加2倍或更多倍，例如增加3倍或更多倍、增加4倍或更多倍、增加5倍或更多倍、或增加10倍或更多倍。还可以以表达可检测水平的由多核苷酸盒携带的转基因的哺乳动物细胞数量增加的形式观察到增强的表达。例如，表达可检测水平的转基因的哺乳动物细胞的数量可能增加2倍或更多倍，例如增加3倍或更多倍、增加4倍或更多倍、增加5倍或更多倍、或增加10倍或更多倍。
作为另一个实例，与常规多核苷酸盒相比，本发明的多核苷酸可以在更大百分比的细胞中促进可检测水平的转基因；例如，当常规盒可以例如在某个区中小于5％的细胞中促进可检测水平的转基因表达时，本发明的多核苷酸在所述区中5％或更多细胞中促进可检测水平的表达；例如，接触的10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多，在某些情况下50％或更多、55％或更多；60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多(例如，80％或更多、85％或更多、90％或更多或95％或更多)的细胞将表达可检测水平的基因产物。还可以以细胞活力和/或功能的改变的形式观察到增强的表达。
本公开的多核苷酸盒通常包括启动子区。任何合适的启动子区或其中的启动子序列都可以用于主题多核苷酸盒中，只要所述启动子区促进编码序列在真核细胞中的表达。在某些实施例中，启动子区促进编码序列在哺乳动物细胞中的表达。在某些情况下，启动子是普遍存在的启动子，即是在广泛的细胞、组织和物种中具有活性的启动子。在其它情况下，启动子是人PGK启动子。
启动子和增强子元件可以是组织特异性的或阶段特异性的。例如，组织特异性启动子或增强子优先驱动在一种或多种特定细胞类型中的表达(或高水平的表达)。细胞类型的实例包含但不限于：造血干细胞、长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、造血CD34+细胞以及CD34+群内的任何分化亚群簇。阶段特异性启动子或增强子优先驱动在细胞周期或发育的一个或多个特异性阶段的表达(或高水平的表达)。这些包含但不限于β-珠蛋白基因座控制区、血影蛋白启动子和红系特异性启动子。
在一些实施例中，多核苷酸包括一个或多个增强子。增强子是本领域已知的增强转录的核酸元件，并且可以位于与其调节的基因相关联的任何地方，例如上游、下游、内含子内等。任何增强子元件都可以用于本公开的多核苷酸盒和基因疗法载体中，只要其在与启动子组合使用时增强基因的表达。
待在细胞中表达的编码序列可以是任何多核苷酸序列，例如，对基因产物进行编码的基因或cDNA，例如多肽或基于RNA的治疗剂(siRNA、反义、核酶、shRNA等)。编码序列可以与启动子序列异源，所述启动子序列与所述编码序列可操作地连接，即不与其天然可操作地缔合。可替代地，编码序列可以与启动子序列内源，所述启动子序列与所述编码序列可操作地连接，即本质上与所述启动子缔合。基因产物可以内在地作用于哺乳动物细胞，或者可以外在地起作用，例如，其可能被分泌。例如，当转基因是治疗性基因时，编码序列可以是对所期望的基因产物或其功能片段或变体进行编码的任何基因，所期望的基因产物或其功能片段或变体可以用作治疗疾病或病症的治疗剂。在各个优选的实施例中，转基因对人PKLR进行编码。
在本发明的一个实施例中，对转基因编码序列进行修饰或“密码子优化”，以通过用更频繁表示的密码子替换不频繁表示的密码子来增强表达。编码序列是对用于转译的氨基酸进行编码的mRNA序列的一部分。在转译过程中，61个三核苷酸密码子中的每个三核苷酸密码子被转译成20个氨基酸中的一个氨基酸，从而导致遗传密码中的简并或冗余。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种会利用在不同频率下对相同氨基酸进行编码的tRNA(各自携带反密码子)。当基因序列含有由对应tRNA不频繁表示的密码子时，核糖体转译机制可能会减慢，从而阻碍有效转译。可以通过特定物种的“密码子优化”来改进表达，其中改变编码序列以对相同的蛋白质序列进行编码，而利用高度表示和/或由高度表示的人蛋白质利用的密码子(Cid-Arregui等人,2003；《病毒学杂志》77:4928)。在本发明的一个方面，对转基因的编码序列进行修饰以用灵长类动物中频繁表达的密码子替换哺乳动物或灵长类动物中不频繁表达的密码子。例如，在一些实施例中，由转基因编码的编码序列编码对多肽进行编码，所述多肽与由上文或在此所公开的序列编码的多肽具有至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性，其中编码序列的至少一个密码子在人中具有比上文或在此所公开的序列中的对应密码子更高的tRNA频率。
在本发明的另外的实施例中，转基因编码序列被修饰以通过终止或移除不对所期望的转基因进行编码的开放阅读框(ORF)来增强表达。开放阅读框(ORF)是跟随起始密码子且不含有终止密码子的核酸序列。与所关注的基因相比，ORF可以处于正向或反向朝向，并且可以在“框内”或“框外”。这种开放阅读框有可能在所关注的基因旁边的表达盒中表达，并且可能引起不期望的副作用。在本发明的一方面，已经对转基因的编码序列进行修饰，以通过进一步改变密码子使用来移除开放阅读框。这是通过以下来实现的：消除起始密码子(ATG)和引入反向朝向或ORF框外的终止密码子(TAG、TAA或TGA)，同时保留氨基酸序列并维持所关注的基因中高度利用的密码子(即，避免频率<20％的密码子)。在本发明中，转基因编码序列可以通过密码子优化和移除非转基因ORF或同时使用两种技术来优化。对于本领域普通技术人员而言将显而易见的是，优选在密码子优化后移除或最小化非转基因ORF，以便移除在密码子优化期间引入的ORF。
RRE序列提高了基因转移的效率。在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，RRE序列包括以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
AGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCT(SEQ ID NO:1)。
逆转录病毒前导区含有包装信号(Ψ)，所述包装信号参与将逆转录病毒基因组包装到病毒衣壳中。LV载体被认为在此区需要大约300bp的Gag基因。目前，此Gag序列已经减少到只有40bp(图1)。在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，ψ序列是HIV-1ψ序列，或者ψ序列包括以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：CTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC(SEQ ID NO:2)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，截短的HIV-15'LTR包括以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA(SEQ ID NO:3)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体的任一个的特定实施例中，HIV-1自失活3'LTR包括以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA(SEQ ID NO:4)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT(SEQ ID NO:5)。
促进整合前复合物的核易位的cPPT与参与逆转录酶的分离的CTS一起被认为能改善病毒滴度(Zennou等人，2000；Follenzi等人，2000)。在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，HIV-1的中央聚嘌呤段和中央终止序列(cPPT/CTS)包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
TTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTT(SEQ ID NO:6)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，人磷酸甘油酸激酶1(hPGK)启动子包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG(SEQ ID NO:7)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，密码子优化的人PKLR cDNA版本(coRPK)包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：ATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGA(SEQ ID NO:8)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，人CMV增强子包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG(SEQ ID NO:9)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，猿猴病毒40(SV40)poly(A)信号包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA(SEQ ID NO:10)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，SV40复制起点包括以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC(SEQ IDNO:11)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的cPPT包括以下序列或由其组成：TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT(SEQ ID NO:12)，或与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的dNEF信号包括以下序列或由其组成：GAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGAC(SEQ ID NO:13)，或与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的NeoR/KanR序列包括以下序列或由其组成：ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA(SEQ ID NO:14)，或与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的rrnG终止子(来自大肠杆菌核糖体RNA rrnG操纵子的转录终止子(Albrechtsen等人，1991))包括以下序列或由其组成：
GCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAA(SEQ IDNO:15)，或与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的ori(高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点)包括以下序列或由其组成：
TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA(SEQ ID NO:16)，或与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的CAP结合位点包括以下序列或由其组成：TAATGTGAGTTAGCTCACTCAT(SEQ ID NO:17)，或与SEQ ID NO:17具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的大肠杆菌lac启动子包括以下序列或由其组成：TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG(SEQ ID NO:18)，或与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的lac操作子包括以下序列或由其组成：TTGTGAGCGGATAACAA(SEQ ID NO:19)，或与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的T3启动子(噬菌体T3 RNA聚合酶的启动子)包括以下序列或由其组成：AATTAACCCTCACTAAAGG(SEQ ID NO:20)，或与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的CMV增强子包括以下序列或由其组成：GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG(SEQ IDNO:21)，或与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的T7启动子(噬菌体T7 RNA聚合酶的启动子)包括以下序列或由其组成：CCTATAGTGAGTCGTATTA(SEQ ID NO:22)，或与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的一些实施例中，存在于本文所述的表达盒或基因递送载体中的任一个中的f1 ori(f1噬菌体复制起点)包括以下序列或由其组成：
ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATT(SEQ ID NO:23)，或与SEQ ID NO:23具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸盒进一步包括RNA输出信号。示例性RNA输出信号包含但不限于wPRE。通过以转基因、启动子和载体非依赖性方式增加RNA稳定性，wPRE显著增加了靶细胞中的转基因表达(Zuffrey等人，1999)。然而，它可以表达来源于参与肝癌的WHV X基因的截短的60个氨基酸的蛋白质(Kingsman等人，2005)。因此，大多数临床前方案和临床试验包含突变的wPRE元件版本(Zanta-Boussif等人，2009)。另一方面，在抑制转录通读中，在SIN-LV载体中使用两个SV40-USE元件被认为比wPRE序列更有效(Schambach等人，2007)。更确切地说，本文公开的wPRE是一种嵌合wPRE，所述嵌合wPRE携带589个来自由Axel Schambach进行的经过修饰的WPRE的核苷酸(核苷酸1-589)(WO 2008136670A2；[5])和88个来自之前wPRE的核苷酸(核苷酸590-677)(Zuffrey等人，1999)。本文公开的数据示出了这种嵌合wPRE比之前的wPRE效果更好。嵌合wPRE序列包括以下序列：
CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:24)。
在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的特定实施例中，wPRE序列包括SEQ ID NO:24的序列或与SEQ ID NO:24的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成。
CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:24)
本领域普通技术人员将容易理解如本文公开的或如本领域已知的元件的其它组合。
另外，如本领域普通技术人员将认识到的，多核苷酸盒可以任选地含有其它元件，包含但不限于促进克隆的限制性位点和用于特定基因表达载体的调节元件。
在本发明的一些方面，主题多核苷酸盒用于将基因递送到动物细胞，例如以确定基因对细胞活力和/或功能的影响、治疗细胞病症等。因此，在本发明的一些方面，提供用于在哺乳动物细胞中表达转基因的组合物为基因递送载体，其中基因递送载体包括本公开的多核苷酸盒。
本公开的基因递送载体涵盖了发现用于将多核苷酸序列递送到哺乳动物细胞的任何方便的基因疗法载体。例如，载体可以包括单链核酸或双链核酸，例如单链DNA或双链DNA。例如，基因递送载体可以是DNA，例如裸DNA，例如质粒、微环等。载体可以包括单链RNA或双链RNA，包含RNA的经过修饰的形式。在另一个实例中，基因递送载体可以是RNA，例如mRNA或经过修饰的mRNA。
作为另一个实例，基因递送载体可以是源自于病毒的病毒载体，例如腺病毒、腺相关病毒、LV、疱疹病毒、α病毒或逆转录病毒，例如莫洛尼(Moloney)鼠类白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(MoMSV)、哈维(Harvey)鼠类肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德(Friend)鼠类白血病病毒、鼠类干细胞病毒(MSCV)或劳斯氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)。虽然以下更详细地描述了涵盖LV的用途的实施例，但是期望本领域普通技术人员应了解，本领域中的类似知识和技术也可以用于非LV基因疗法载体。
在一些实施例中，基因递送载体是自限制LV。在一些实施例中，基因递送载体是自失活LV。在一些实施例中，基因递送载体是非整合LV。在本文所述的表达盒和基因递送载体中的任一个的具体实施例中，本公开的自限制LV(图22和23)包括以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GTGTTTAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAACGATCGGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTGCAAGCTTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCGATCACGAGACTAGCCTCGAGAAGCTTGATATCGAATTCCACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGGGGATCCGTCGACACCGGTGCCACCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGACCGCGGTCTAGAGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGGACGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATCGTTCCCTCAGGACGTC(SEQ ID NO:25)。
在本文所述的表达盒的具体实施例中，所述表达包括以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列或由其组成：
GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGGGGGATCCGTCGACACCGGTGCCACCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGACCGCGGTCTAGAGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCC(SEQ ID NO:26)。
在此类实施例中，主题多核苷酸盒通过功能性LTR序列处于5'和3'末端侧翼。在一个实施例中，在图1中描绘了存在于LV载体的主链中的不同元件的位置。两个LTR序列都已经修饰，以生成SIN LV载体。SIN载体在3'-LTR中具有400bp缺失，从而覆盖来自U3区的启动子/增强子元件。转基因的表达由此依赖于内部启动子，从而降低了RCL的风险并减少了启动子干扰(Ginn等人，2003)。这种3'-LTR缺失移除了TATA盒，从而阻止了转录起始(Miyoshi等人，1998；Zuffrey等人，1998)；并且因此使载体失活。5'-LTR的U3区已被其它异源启动序列(即CMV或RSV)替代，以实现Tat非依赖性转录并增加基因组RNA合成，从而使病毒滴度增加。因为5'-U3区驱动初级转录物的表达，所以其修饰将不存在于经过转导的细胞中(Schambach等人，2009)。
外源元件(如β-珠蛋白或SV40聚腺苷酸化信号(Iwakuma等人，1999)或来自SV40-USE的USE(Schambach等人，2007))也已经包含在病毒3'LTR的R区中，以减少来自内部启动子(Zaiss等人，2002)或来自SIN-LV载体的缺失U3区的残余物(Almarza等人，2011)的转录通读，从而防止下游基因的潜在转录激活。
在某些实施例中，表达盒或基因递送载体(例如，LV)包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按5'到3'顺序包括以下序列：
a)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
b)对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列，任选地coRPK编码或cDNA序列；以及
c)突变wPRE序列，任选地包括SEQ ID NO:24的序列或由其组成。
在某些实施例中，表达盒或基因递送载体(例如，LV)包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按5'到3'顺序包括以下序列：
a)cPPT序列；
b)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
c)对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列，任选地coRPK编码或cDNA序列；以及
d)突变wPRE序列，任选地包括SEQ ID NO:24的序列或由其组成。
在某些实施例中，表达盒或基因递送载体(例如，LV)包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按5'到3'顺序包括以下序列：
a)5'LTR，任选地经过修饰的5'LTR；
b)cPPT序列；
c)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
d)对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列，任选地coRPK编码或cDNA序列；
e)突变wPRE序列，任选地包括SEQ ID NO:24的序列或由其组成；以及
f)3'LTR，任选地经过修饰的3'LTR。
在某些实施例中，表达盒或基因递送载体(例如，LV)包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按5'到3'顺序包括以下序列：
a)5'LTR，任选地经过修饰的5'LTR；
b)cPPT序列；
c)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
d)对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列，任选地coRPK编码或cDNA序列；
e)突变wPRE序列，任选地包括SEQ ID NO:24的序列或由其组成；
f)3'LTR，任选地经过修饰的3'LTR；
g)SV40 poly(A)信号；以及
h)SV40复制起点(ori)。
在某些实施例中，表达盒或基因递送载体(例如，LV)包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按5'到3'顺序包括以下序列：
a)5'LTR，任选地经过修饰的5'LTR；
b)cPPT序列；
c)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
d)对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列，任选地coRPK编码或cDNA序列；
e)突变wPRE序列，任选地包括SEQ ID NO:24的序列或由其组成；
f)3'LTR，任选地经过修饰的3'LTR；
g)SV40 poly(A)信号；
h)SV40复制起点(ori)；
i)T7启动子；
j)f1 ori；以及
k)NeoR/KanR序列。
在某些实施例中，表达盒或基因递送载体(例如，LV)包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按5'到3'顺序包括以下序列：
a)5'LTR，任选地经过修饰的5'LTR；
b)HIV-1ψ序列；
c)RRE；
d)cPPT/CTS序列；
e)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
f)对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列，任选地coRPK编码或cDNA序列；
g)突变wPRE序列，任选地包括SEQ ID NO:24的序列或由其组成；
h)dNEF信号；
i)3'LTR，任选地经过修饰的3'LTR；
j)SV40 poly(A)信号；
k)SV40复制起点(ori)；
l)T7启动子；
m)f1 ori；
n)NeoR/KanR序列；
o)rrnG终止子；
p)ori序列；
q)CAP结合位点；
r)lac启动子序列；
s)lac操作子序列；
t)T3启动子序列；
u)CMV增强子序列；以及
v)CMV启动子序列。
在某些实施例中，基因递送载体是PGK-coRPK LV，或包括图21描绘的元件。
在某些实施例中，表达盒或基因递送载体(例如，LV)包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按5'到3'顺序包括以下序列：
a)5'LTR，任选地经过修饰的5'LTR；
b)HIV-1ψ序列；
c)RRE；
d)cPPT/CTS序列；
e)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；
f)对丙酮酸激酶多肽进行编码的序列，任选地coRPK编码或cDNA序列；
g)突变wPRE序列，任选地包括SEQ ID NO:24的序列或由其组成；
h)任选地，dNEF信号；
i)3'LTR，任选地经过修饰的3'LTR；
j)SV40 poly(A)信号；
k)SV40复制起点(ori)；
l)T7启动子；
m)pUCori；
u)CMV增强子序列；以及
v)CMV启动子序列。
在本文所述的表达盒和基因递送载体的任一个的特定实施例中，coRPK cDNA或编码序列对包括或包含以下序列的PKLR多肽进行编码：基因库(GenBank)登录号XP_016856982.1、XP_011507942.1、XP_006711449.1、NP_870986.1或NP_000289.1的任一个中公开的序列、这些序列的任一个的功能片段，或与这些序列的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列。
可以使用标准方法来产生使本公开的多核苷酸盒衣壳化的基因疗法载体。例如，在LV病毒粒子的情况下，根据本发明的LV表达载体可以引入到生产细胞中，然后引入LV辅助构建体，其中辅助构建体包含能够在生产细胞中进行表达的LV编码区并且所述LV编码区可对LV载体中不存在的LV辅助功能进行补充。随后将辅助病毒和/或另外的载体引入到生产细胞中，其中辅助病毒和/或另外的载体提供了能够支持高效LV病毒生产的辅助功能。然后培养生产细胞以产生LV。这些步骤是使用标准方法进行的。
可以使用任何合适的用于产生用于递送主题多核苷酸盒的病毒颗粒的方法，包含但不限于以下实例中描述的那些。可以制备适合于对哺乳动物细胞进行有效转导的任何浓度的病毒颗粒，以在体外或体内接触哺乳动物细胞。例如，病毒颗粒的浓度可以调配成每毫升108个载体基因组或更多个，例如每毫升5×108个载体基因组；每毫升109个载体基因组；每毫升5×109个载体基因组、每毫升1010个载体基因组、每毫升5×1010个载体基因组；每毫升1011个载体基因组；每毫升5×1011个载体基因组；每毫升1012个载体基因组；每毫升5×1012个载体基因组；每毫升1013个载体基因组；每毫升1.5×1013个载体基因组；每毫升3×1013个载体基因组；每毫升5×1013个载体基因组；每毫升7.5×1013个载体基因组；每毫升9×1013个载体基因组；每毫升1×1014个载体基因组、每毫升5×1014个或更多个载体基因组，但是通常每毫升不超过1×1015个载体基因组。
在制备主题LV组合物时，可以采用用于产生LV病毒粒子的任何宿主细胞，包含但不限于例如哺乳动物细胞(例如，293个细胞)、昆虫细胞(例如，SF9细胞)、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞或生产细胞，在所述包装细胞中，LV rep和cap基因稳定地维持在宿主细胞中，在所述生产细胞中，LV载体基因组稳定地维持和包装。示例性包装和生产细胞源自于SF-9、293、A549或HeLa细胞。LV载体使用本领域已知的标准技术进行纯化和调配。
在某些实施例中，本发明包含一种细胞，所述细胞包括本文公开的表达盒或基因递送载体。在相关的实施例中，用包括本文公开的表达盒或具有本文公开的整合到细胞基因组中的表达盒的病毒载体转导细胞。在某些实施例中，细胞是用于产生病毒基因递送载体的细胞。在其它实施例中，细胞是待递送给受试者以向受试者提供由表达盒编码的基因产物的细胞。因此，在某些实施例中，细胞对待治疗的受试者是自体的，或者从待治疗的受试者获得。在其它实施例中，细胞对待治疗的受试者是同种异体的，或者从不同于待治疗的受试者的供体获得。在特定实施例中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在某些实施例中，细胞是血细胞、红细胞、造血祖细胞、骨髓细胞，例如谱系耗竭骨髓细胞、造血干细胞(例如，CD34+)或定向造血红系祖细胞。
本发明包含药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的多核苷酸盒、基因递送载体或细胞以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。主题多核苷酸盒、基因递送载体或细胞可以与可用于制备调配物的药学上可接受的载剂、稀释剂和试剂进行组合，所述调配物通常是安全、无毒且期望的并且包含供灵长类动物使用的可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体或气体(在气溶胶组合物的情况下)。此类赋形剂、载剂或稀释剂的实例包含但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。补充性活性化合物也可以并入调配物中。用于调配物的溶液或悬浮液可以包含：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如用于防止聚合的吐温(Tween)20；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调节pH。在特定实施例中，药物组合物是无菌的。
适合于在本发明中使用的药物组合物进一步包含无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
根据需要，可以通过将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一种成分或其组合一起并入适当溶剂中、随后进行过滤灭菌处理来制备无菌溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌媒剂中来制备分散液，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自以上列举的那些的其它所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述干燥产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。
在一个实施例中，所述组合物与将保护基因盒或表达载体免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控制释放调配物，包含植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。材料也可以商购获得。
特别有利的是以剂量单位形式调配口服、眼部或肠胃外组合物以便于施用和剂量统一。如本文所用，剂量单位形式是指作为针对有待治疗的受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以与所需的药物载剂关联产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果和本领域中复合用于治疗个体的这种活性化合物固有的局限性。
药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中，分配器例如注射器，例如载药注射器。
本发明的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐、或在施用于包括人的动物时能够(直接或间接)提供生物活性代谢物或其残留物的任何其它化合物。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的生理学上可接受的盐和药学上可接受的盐：即，保留了亲本化合物的期望生物活性并且不对亲本化合物产生不期望的毒理效果的盐。各种药学上可接受的盐是本领域已知的并且在以下文献中描述：例如，《雷明顿氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第17版,Alfonso R.Gennaro(编),美国宾夕法尼亚州伊斯顿Mark出版公司(Mark Publishing Company,Easton,PA,USA),1985(以及其最近的版本)；《制药技术百科全书(Encyclopaedia of PharmaceuticalTechnology)》,第3版,James Swarbrick(编),美国纽约州美国英富曼卫生保健(有限公司)(Informa Healthcare USA(Inc.),NY,USA),2007；以及《制药科学(J.Pharm.Sci.)》66:2(1977)。此外，关于适合的盐，参见Stahl和Camille的《药用盐手册：性质、选择与使用(Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)》(Wiley-VCH公司,2002)。
用如碱金属和碱土金属或有机胺等金属或胺形成药学上可接受的碱加成盐。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺包括N-N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见例如Berge等人,“药用盐(Pharmaceutical Salts)”,《药学杂志(J.Pharma Sci)》,1977,66,119)。酸性化合物的碱加成盐是通过使游离酸形式与足量的期望的碱相接触以常规方式产生盐来制备的。游离酸形式可以通过使盐形式与酸相接触并且以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式在某些物理性质方面如在极性溶剂中的溶解度与其各自的盐形式略有不同，但是出于本发明的目的，盐等同于其各自的游离酸。
主题多核苷酸盒、基因递送载体(例如，重组病毒(病毒粒子)或(例如，用本文公开的基因递送载体转导的)细胞)可以并入药物组合物中以施用于哺乳动物患者，特别是灵长类动物并且更具体地人类。主题多核苷酸盒、基因递送载体(例如，病毒粒子或细胞)可以在无毒的惰性的药学上可接受的水性载剂中调配，优选地，pH的范围为3到8，更优选地，范围为6到8。这种无菌组合物将包括含有对在重建后溶解在具有可接受的pH值的水性缓冲液中的治疗分子进行编码的核酸的载体或病毒粒子。
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括与药学上可接受的载剂和/或赋形剂混合的本文公开的治疗有效量的细胞、载体或病毒粒子，所述药学上可接受的载剂和/或赋形剂例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其它蛋白质。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、右旋糖酐、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏溶液和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地，这一调配物在4℃下在至少六个月内是稳定的。
在一些实施例中，本文所提供的药物组合物包括缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水以及本领域普通技术人员已知的其它缓冲液，如Good等人(1966)《生物化学(Biochemistry)》5:467中描述的那些缓冲液。包括腺病毒载体递送系统中含有的肿瘤抑制基因的药物组合物的缓冲液的pH可以在6.5到7.75的范围内，优选地7到7.5，并且最优选地7.2到7.4。
在某些实施例中，病毒载体可以调配成任何适合的单位剂量，包含但不限于1×108个载体基因组或更多个，例如，1×109个、1×1010个、1×1011个、1×1012个或1×1013个载体基因组或更多个，在某些情况下1×1014个载体基因组，但通常不多于4×1015个载体基因组。在一些情况下，单位剂量最多为约5×1015个载体基因组，例如1×1014个载体基因组或更少，例如1×1013个、1×1012个、1×1011个、1×1010个或1×109个载体基因组或更少，在某些情况下，1×108个载体基因组或更少，并且通常不少于1×108个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×1010个到1×1011个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×1010个到3×1012个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×109个到3×1013个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×108个到3×1014个载体基因组。在一个实施例中，所述范围为约5×1010个到约1×1011个载体基因组。在一些实施例中，所述范围为约1×109个到约1×1010个载体基因组。
在一些情况下，可以使用感染复数(MOI)测量药物组合物的单位剂量。MOI意指载体或病毒基因组与核酸可以递送到的细胞的比率或倍数。在一些情况下，MOI可以为1×106个。在一些情况下，MOI可以为1×105-1×107个。在一些情况下，MOI可以为1×104-1×108个。在一些情况下，本公开的重组病毒至少为约1×101个、1×102个、1×103个、1×104个、1×105个、1×106个、1×107个、1×108个、1×109个、1×1010个、1×1011个、1×1012个、1×1013个、1×1014个、1×1015个、1×1016个、1×1017和1×1018个MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒为1×108个到3×1014个MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒最多为约1×101个、1×102个、1×103个、1×104个、1×105个、1×106个、1×107个、1×108个、1×109个、1×1010个、1×1011个、1×1012个、1×1013个、1×1014个、1×1015个、1×1016个、1×1017和1×1018个MOI。在一些实施例中，所述范围为约20个到约400个MOI。
在一些方面，药物组合物的量包括约1×108个到约1×1015个重组病毒、约1×109个到约1×1014个重组病毒、约1×1010个到约1×1013个重组病毒或约1×1011个到约3×1012个重组病毒。
方法
因此，本文中统称为“主题组合物”的主题多核苷酸盒和基因递送载体可用于在动物的细胞中对转基因进行表达。例如，主题组合物可以用于研究中，以例如确定基因对细胞活力和/或功能的影响。作为另一个实例，主题组合物可以用于医药中，以例如治疗或预防疾病或病症。因此，在本发明的一些方面，提供了在细胞中表达基因的方法，所述方法包括使细胞与本公开的组合物相接触。在一些实施例中，接触在体内或体外发生。在一些实施例中，接触在体内发生，即向受试者施用主题组合物。
对于哺乳动物细胞在体内或体外与主题多核苷酸盒或包括主题多核苷酸盒的基因递送载体接触的情况，细胞可以来自任何哺乳动物物种，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠、松鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛、灵长类动物、人类。细胞可以来自已建立的细胞系或者细胞可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用来指代源自于受试者的细胞和细胞培养物并且允许在体外生长培养物的有限数量的传代，即分裂。例如，原代培养物是可以传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但次数不足以渡过危机期的培养物。通常，在体外维持本发明的原代细胞系少于10次传代。
在特定实施例中，与公开的多核苷酸盒或基因递送载体接触的细胞是来自受试者或来自供体(例如，同种异体供体)的造血干细胞。在一些实施例中，生物样品(例如，外周血)是在造血干细胞(HSC)的动员之后从受试者中获得的。在一个实施例中，通过用G-CSF或其类似物治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。可以在收集生物样品之前动员外周血中的HSC和祖细胞(HSPC)。可以通过本领域中已知的任何方法来动员外周血HSC和HSPC。可以通过用本文中描述的或本领域中已知的增加HSPC在受试者的外周血中循环的数量的任何一种或多种药剂治疗受试者来动员外周血HSC和HSPC。例如，在特定实施例中，通过用一个或多个细胞因子或生长因子(例如，G-CSF、试剂盒配体(KL)、IL-I、IL-7、IL-8、IL-11、Flt3配体、SCF、促血小板生成素或GM-CSF(如沙格司亭(sargramostim)))治疗受试者来动员外周血。可以在用于动员外周血的方法中使用的不同类型的G-CSF包含非格司亭(filgrastim)和更长效G-CSF：培非格司亭(pegfilgrastim)。在特定实施例中，通过用一个或多个趋化因子(例如，巨噬细胞炎性蛋白-1a(MIP1a/CCL3))、趋化因子受体配体(例如，趋化因子受体2配体GROl3和GR013M)、趋化因子受体类似物(例如，基质细胞源性因子-1a(SDF-1a)蛋白类似物，如CTCE-0021、CTCE-0214或SDF-1a，如Met-SDF-113)或趋化因子受体拮抗剂(例如，趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)拮抗剂，如AMD3100)治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过用一个或多个抗整合素信号传导药剂(例如，功能阻断抗极迟抗原4(VLA-4)抗体或抗血管细胞粘附分子1(VCAM-1))治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过用如环磷酰胺、依托泊苷或紫杉醇等一种或多种细胞毒性药物治疗受试者来动员外周血。在特定实施例中，通过向受试者施用以上所列药剂中的一种或多种药剂持续一定时间段来动员外周血。例如，在收集HSPC之前，可以通过注射(例如，皮下、静脉内或腹膜内)用一种或多种药剂(例如，G-CSF)治疗受试者每天一次或每天两次持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在具体实施例中，在最后剂量的用于将HSPC动员到外周血中的药剂之后的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或24小时内收集HSPC。在特定实施例中，通过用上文描述的或本领域已知的两种或更多种不同类型的药剂(如生长因子(例如，G-CSF)和趋化因子受体拮抗剂(例如，CXCR4受体拮抗剂，如AMD3100)或生长因子(例如，G-CSF或KL)和抗整合素药剂(例如，功能阻断VLA-4抗体))治疗受试者来动员HSC和HSPC。在一个实施例中，通过用G-CSF或其类似物治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。在一个实施例中，G-CSF是非格司亭。在一个实施例中，通过用普乐沙福(plerixafor)治疗受试者来动员HSC和/或祖细胞。在某个实施例中，使用非格司亭和普乐沙福的组合、通过单独地非格司亭或通过单独地普乐沙福来动员HSC和/或祖细胞。在特定实施例中，同时地或顺序地施用不同类型的动员剂。对于关于动员外周血的方法的另外的信息，参加例如Craddock等人,1997,《血液(Blood)》90(12):4779-4788；Jin等人,2008,《转化医学杂志(Journal of Translational Medicine)》6:39；Pelus,2008,《血液学新见(Curr.Opin.Hematol.)》15(4):285-292；Papayannopoulou等人,1998,《血液》91(7):2231-2239；Tricot等人,2008,《血液病学(Haematologica)》93(11):1739-1742；以及Weaver等人,2001,《骨髓移植(Bone Marrow Transplantation)》27(2):S23-S29。
在一些实施例中，在使细胞与公开的多核苷酸盒或基因递送载体接触之前富集细胞。如本文中使用的，“富集的”或“高度富集的”是指富集细胞群的方法，所述方法旨在引起对表达特定生物标志物(例如，CD34)的细胞进行大量细胞富集。例如，临床上使用的CD34富集导致平均值：61.6％和中值：CD34+细胞的65.7％产率和平均值：88.5％和中值：95.9％相对纯度(N＝166)(《临床实验室(Clin Lab.)》2016年7月1日；62(7):1243-1248(PMID：28164638))。“富集”是指以大量富集相对少见的细胞类型CD34+为目标的过程，所述相对少见的细胞类型CD34+通常包括介于0.2-2％之间的动员的白细胞清除术或骨髓收集中的细胞产物。富集来自动员的白细胞清除术或骨髓收集中的CD34+细胞以百分比从0.2-2％增加到>80％的最终CD34+为靶标。为此，在初步将生物样品应用到捕获基质之后，以移除弱结合或非特异性结合到捕获基质的细胞为目标来执行在本文中称为“洗涤”的重复的缓冲液交换。通常，在每个洗涤周期中将细胞从捕获基质中移除并重新应用。移除和重新应用可以通过从试管中移液而手动地完成或使用泵和管道系统而自动化。例如，使用与磁性细胞分离系统耦接的Quad Technologies细胞磁性颗粒复合物在磁性支架上的试管中被分离并且手动完成洗涤。使用美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec)系统，预设置的自动化程序将细胞磁性颗粒复合物应用到管组中的磁柱并且使用阀泵系统完成洗涤/重新应用。在某些实施例中，可以在各种器械上执行选择，包含但不限于美天旎生物技术公司Quad TechnologiesGE细胞分离系统、Terumo细胞分离系统、COBE细胞分离器、或系统、美天旎生物技术公司系统或系统。可以在实验室中或定点照护时执行选择。例如在国际专利公开第WO/2016/118790号中描述了用于制备和富集细胞和细胞群的详细方法，包含用于选择CD34+细胞的示例性方法。美国专利第8,727,132号提供了对高严格性选择有用的说明性选择方法。
在某些实施例中，通过注射器或插入到受试者的或供体的血管中的导管来获得外周血。例如，可以使用单采血液成分机来收集外周血。血液从血管中流动穿过导管到分离白细胞(包含来自血液的剩余部分的HSPC)的单采血液成分机中，并且然后将血液的剩余部分返回到受试者的身体。可以在连续的天数内(例如，1到5天)执行血液成分单采术持续若干个小时，直到已收集到足够的HSPC。
在某些实施例中，通过细针抽吸从受试者的后髂嵴中获得骨髓(参加例如，Koda等人,1984,《临床研究杂志(J.Clin Invest.)》73:1377-1384)。
在某些实施例中，可以确定生物样品的血细胞比容水平。可以通过在处理室内将样品离心使样品的RBC分离成层来确定血细胞比容水平，使得可以确定血细胞压积。应当理解，样品可以与抗凝血剂组合以便帮助确定血细胞比容水平，并且此种抗凝血剂可以在离心之前或期间添加到处理室。可替代地，可以通过测量样品的光学性质来确定血细胞比容水平。例如，可以使用光谱仪来分析样品。应当理解，可以使用任何类型的确定血细胞比容水平的已知光谱法，如例如拉曼光谱法和/或光散射技术。
在某些实施例中，生物样品消耗红细胞，例如在制备针对来自生物样品的CD34+细胞而富集的一个或多个细胞群之前。在一些实施例中，对在消耗技术之后剩余的细胞进行洗涤。在另一个实施例中，将非特异性IgG添加到经过洗涤的细胞。在一些实施例中，非特异性IgG是flebogamma。
本发明的实施例包括用病毒递送载体(例如，含有人PKLR基因的LV载体)转导的哺乳动物细胞(例如，CD34+细胞)。因此，本发明包含转导哺乳动物细胞(例如，人造血干细胞或本文中描述的其它细胞)的方法，所述方法包括使细胞与包括本文中描述的基因表达盒的病毒递送载体(例如，LV载体)接触。在某些实施例中，从有待治疗的受试者或从另一个供体先前获得细胞。在特定实施例中，受试者被诊断患有PKD，并且细胞用包括对丙酮酸激酶进行编码的表达盒(例如，coRPK编码区或cDNA)的LV转导。应当理解，公开的方法(例如用于例如使用coPRK cDNA序列将丙酮酸激酶基因产物递送到受试者的那些方法)还可以用于治疗溶血性贫血和/或使红细胞分化归一化、增加功能成熟红细胞的数量、减少髓外红细胞生成、减少肝肿大和溶血性贫血或PKD的其它继发效应。
为了促进转基因的表达，主题多核苷酸盒或包括主题多核苷酸盒的基因递送载体将与细胞接触约30分钟到24小时或更长，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、24小时等。
主题多核苷酸盒或包括主题多核苷酸盒的基因递送载体可以提供到主题细胞一次或多次，例如一次、两次、三次或多于三次，并且细胞可以被允许在每个接触事件例如16-24小时之后与一种或多种药剂一起培育某个时间量，在所述时间量之后，用新鲜培养基替换培养基并且进一步培养细胞。接触细胞可以在任何培养基中和在促进细胞存活的任何培养条件下发生。培养物可以含有细胞对其有响应的生长因子。如本文所定义的，生长因子是能够通过对跨膜受体的特定作用促进细胞在培养物或完整组织中存活、生长和/或分化的分子。生长因子包含多肽和非多肽因子。
通常，提供了有效量的主题多核苷酸盒或包括主题多核苷酸盒的基因递送载体以在细胞中产生转基因的表达。如本文其它地方所讨论的，可以根据经验容易地确定有效量，例如通过检测转基因产物的存在或水平、通过检测对细胞活力或功能的影响等。通常，与相同量的本领域已知的主题多核苷酸盒相比，有效量的主题多核苷酸盒或包括主题多核苷酸盒的基因递送载体将促进细胞中转基因的更高表达。通常，相对于来自参照或对照(例如本领域已知的多核苷酸盒)的表达，表达将增强2倍或更多倍，例如3倍、4倍或5倍或更多倍，在一些情况下，10倍、20倍或50倍或更多倍，例如100倍。
对于细胞在体内与主题多核苷酸盒或包括主题多核苷酸盒的基因递送载体接触的情况，受试者可以是任何哺乳动物，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛或灵长类动物。在优选实施例中，灵长类动物是人。在一些实施例中，细胞是CD34+细胞。
本公开的方法和组合物用于例如治疗丙酮酸激酶缺乏症。
在另一个实施例中，本发明包含一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的用基因递送载体(例如，病毒载体)转导的细胞，所述基因递送载体在细胞中表达治疗性基因产物。在特定实施例中，细胞对受试者是自体的。在某些实施例中，细胞是红系细胞，例如造血干细胞或定向造血红系祖细胞。在一些实施例中，所述细胞是骨髓细胞，例如谱系耗竭骨髓细胞。在特定实施例中，所述方法用于治疗PKD，并且病毒载体是包括本文中公开的表达构建体的LV，所述表达构建体包括与coRPK基因cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子和本文中公开的突变wPRE。在特定实施例中，细胞经肠胃外提供给受试者，例如通过静脉内注射。在特定实施例中，细胞通过输液提供给受试者。
在另一个实施例中，本发明包含一种治疗有需要的受试者的PKD的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的用LV载体转导的自体CD34+干细胞，所述LV载体在细胞中表达coRPK cDNA，其中所述LV载体包括与coRPK cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子和本文中公开的突变wPRE序列。在特定实施例中，细胞是造血干细胞或定向造血红系祖细胞，例如骨髓细胞。在特定实施例中，细胞经肠胃外提供给受试者，例如通过静脉内注射。
在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的基因递送载体(例如，病毒载体)，所述基因递送载体在受试者中表达治疗性基因产物。在特定实施例中，所述方法用于治疗PKD，并且病毒载体是包括本文中公开的表达构建体的LV，所述表达构建体包括与coRPK基因cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子和本文中公开的突变wPRE。在特定实施例中，基因递送载体经肠胃外提供给受试者，例如通过静脉内注射。
在特定实施例中，细胞或基因递送载体以药物组合物的形式提供给受试者。
在一些实施例中，主题方法产生了治疗益处，例如预防病症的发展、停止病症的进展、逆转病症的进展等。在一些实施例中，主题方法包括检测到已经达到治疗益处的步骤。普通技术人员应了解，治疗功效的这种量度将适用于正被修饰的特定疾病，并且应认识到用来测量治疗功效的适当检测方法。
期望使用主题转基因获得的转基因的表达是稳健的。因此，在一些情况下，例如如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等检测到的转基因的表达可以在施用后两个月或更短时间观察到，例如在施用后4周、3周或2周或更短时间，例如在施用主题组合物后1周。也期望转基因的表达随着时间的推移而持续。因此，在一些情况下，例如如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等检测到的转基因的表达可以在施用主题组合物后2个月或更长时间观察到，例如4个月、6个月、8个月或10个月或更长时间，在一些情况下1年或更长时间，例如2年、3年、4年或5年，在某些情况下超过5年。
在某些实施例中，所述方法包括检测细胞中或受试者中转基因的表达的步骤，其中表达相对于来自不包括本公开的一个或多个经过改进的元件的多核苷酸盒的表达有所增强。通常，如通过例如早期检测、更高水平的基因产物、对细胞更强的功能性影响等证实的，相对于来自例如本领域已知的参照(即，对照多核苷酸盒)的表达，表达将增强2倍或更多倍，例如3倍、4倍或5倍或更多倍，在一些情况下，10倍、20倍或50倍或更多倍，例如100倍。
通常，如果主题组合物为包括本公开的主题多核苷酸盒的LV，则用于实现变化的有效量将为约1×108个载体基因组或更多个，在一些情况下，1×109个、1×1010个、1×1011个、1×1012或1×1013个载体基因组或更多个，在某些情况下，1×1014个载体基因组或更多个，并且通常不多于1×1015个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量至多为约1×1015个载体基因组，例如1×1014个载体基因组或更少，例如1×1013个、1×1012个、1×1011个、1×1010或1×109个载体基因组或更少，在某些情况下，1×108个载体基因组，并且通常不少于1×108个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1×1010个到1×1011个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1×1010个到3×1012个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1×109个到3×1013个载体基因组。在一些情况下，所递送的载体基因组的量为1×108个到3×1014个载体基因组。
在一些情况下，可以使用感染复数(MOI)测量待施用的药物组合物的量。在一些情况下，MOI可以指载体或病毒基因组与核酸可以递送到的细胞的比率或倍数。在一些情况下，MOI可以为1×106个。在一些情况下，MOI可以为1×105-1×107个。在一些情况下，MOI可以为1×104-1×108个。在一些情况下，本公开的重组病毒至少为约1×101个、1×102个、1×103个、1×104个、1×105个、1×106个、1×107个、1×108个、1×109个、1×1010个、1×1011个、1×1012个、1×1013个、1×1014个、1×1015个、1×1016个、1×1017和1×1018个MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒为1×108个到3×1014个MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒最多为约1×101个、1×102个、1×103个、1×104个、1×105个、1×106个、1×107个、1×108个、1×109个、1×1010个、1×1011个、1×1012个、1×1013个、1×1014个、1×1015个、1×1016个、1×1017和1×1018个MOI。
在一些方面，药物组合物的量包括约1×108个到约1×1015个重组病毒颗粒、约1×109个到约1×1014个重组病毒颗粒、约1×1010个到约1×1013个重组病毒颗粒或约1×1011个到约3×1012个重组病毒颗粒。
可以向哺乳动物施用适合于提供适当的细胞转导以赋予期望的效果或治疗疾病的任何总数量的病毒颗粒。在各个优选实施例中，至少为108个；5×108个；109个；5×109个、1010个、5×1010个；1011个；5×1011个；1012个；5×1012个；1013个；1.5×1013个；3×1013个；5×1013个；7.5×1013个；9×1013个、1×1014个病毒颗粒或5×1014个病毒颗粒或更多个，但是注射通常不超过1×1015个病毒颗粒。可以向哺乳动物或灵长类动物的眼睛施用任何合适数量的载体。在一个实施例中，所述方法包括单次施用；在其它实施例中，当主治临床医师认为合适时，随时间进行多次施用。在一些实施例中，单次施用(24小时转导)需要至少2×108VG/ml的5×105个细胞/ml以产生高转导效率。单独剂量通常不小于对受试者产生可测量效果所需的量，并且可以基于主题组合物或其副产物的吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)的药代动力学和药理学来确定并且因此基于受试者内的组合物的处置来确定。这包含考虑施用途径和剂量。根据临床前测定、根据安全性和递增以及剂量范围试验、个体临床医师-患者关系以及体外和体内测定(如本文中描述的和实例中展示的那些测定)凭经验可以容易地确定有效剂量和/或剂量方案。
本文中参考用于说明的示例应用描述了本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多特定细节、关系以及方法从而提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个具体细节的情况下或用其它方法实践本发明。本发明不受所说明的动作或事件的排序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序和/或与其它动作或事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法不需要所有展示的动作或事件。
进一步地，应注意，权利要求书的撰写可以不包含任何任选的要素。因此，本声明旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
仅提供本文所讨论的出版物在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不应被视为承认本发明因现有发明而无权先于这种出版物。进一步地，所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，实际的出版日期可能需要独立地确认。
本说明书中提及的和/或在申请数据表中列出的所有上述美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过全文引用的方式并入本文中，例如以结合所引用的出版物来公开和描述所述方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开代替所并入的出版物的任何公开内容。
根据前文，应当了解，尽管本文出于说明的目的已经描述了本发明的具体实施例，但是可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下作出各种修改。因此，除所附的权利要求书之外本发明不受限制。
实例
提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制诸位发明人考虑作为其发明的范围，它们也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已努力确保关于所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是在大气压下或接近大气压。
实验方法
载体和LV上清液产生.如本文中描述的，生成了LV。使用软件设计CoRPK序列以增加序列的GC含量并且防止隐蔽剪接位点。使用由Naldinip博士(意大利米兰圣拉斐尔特里松基因疗法研究院(San Raffaele Telethon Institute)HSR-TIGET)慷慨提供的pCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-wPRE*构建体作为主链显影载体。在Dull等人,《病毒学杂志》,1998；72(11):8463-8471中描述了原始pCCL慢病毒转移载体和其元件，所述文献以其全文并入本文中。在293T细胞(美国马里兰州罗克维尔市ATCC:CRL-1573)中通过3-质粒磷酸钙介导的转染制备VSV-G假型LV的载体储备液，如先前描述的[Follenzi A等人,(2000).《自然遗传学(Nat Genet)》25:217-222]。通过如其它地方[Charrier S等人,(2005).《基因疗法》12:597-606]描述的qPCR在HT1080细胞中确定感染性LV的滴度。常规获得107-108个病毒颗粒(vp)/mL滴度的LV储备液。
鼠类HSC的纯化和转导.从腿骨中采集来自8-14周大的雄性PKD小鼠的BM，并且使用Lin-细胞消耗试剂盒(德国格拉德巴赫美天旎生物技术公司)纯化谱系阴性细胞(Lin-)，从而获得70-90％的纯度。用100ng/mL的重组人IL-11(英国伦敦派普泰克生物科技有限公司(Peprotech EC Ltd.))和100ng/mL的重组小鼠SCF(明尼苏达州明尼阿波利斯市R&D系统公司(R&D Systems Inc.))在补充有20％FBS和0.5％抗生素(50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素)的IMDM-Glutamax培养基(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))中预刺激Lin-细胞24小时，并且然后以1-10vp/细胞的MOI用携带LV的EGFP或coRPK将其在两个转导周期中转导。在存在前述细胞因子的情况下，每次转导在先前涂覆有CH-296纤连蛋白片段(2μg/cm2；日本大津市宝酒造株式会社(TakaraShuzo)Retronectin)的板上在4℃下过夜进行24小时。
体内RBC存活.向携带coRPK转基因的移植小鼠连续三次静脉内注射(间隔12小时)生物素3-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(50mg/kg)(密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。最后一次注射之后的12小时，采集尾静脉血并且在4℃下用2μg/mL的抗小鼠Ter119-PE(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences))和链霉亲和素-FITC(50μg/mL，加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司)对其进行标记持续30分钟。在注射之后的40天内每2-4天在EPICS XL流式细胞仪(加利福尼亚州贝瑞阿贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))中分析样品。通过生物素化细胞在总RBC群内的百分比测量RBC存活动力学。
CFC测定.根据来自Methocult培养基GF M3434(加拿大温哥华干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))的制造商的程序，在来自对照物和移植小鼠的BM和脾脏中进行CFC测定。在移植之后的不同时间点从所有组小鼠中采集BM细胞，并且CFU(30个或更多个细胞的簇)在Nikon Diaphot-TMD显微镜中接种7天后被评分。
造血谱系的鉴定.从移植动物的尾静脉获得PBMC并且用一组抗体对其进行标记以检测不同的造血细胞。用抗GR-1和抗Mac-1生物素化抗体(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司，5μg/mL)检测髓样细胞，而使用针对T细胞的抗CD3-PE抗体和针对B细胞的抗B220-PE抗体和抗B220-PECy5抗体(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司，10μg/mL)与SAV-TRC二级抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司旗下英杰公司(Invitrogen))一起检测淋巴样细胞。添加DAPI(德国勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)，2μg/mL)在BD LSRFortessa细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司)中分析样品以排除死细胞。
结构研究和组织学研究.收集、拍摄并在精密天平上称重脾脏以确定脾肿大的存在。在按照常规组织学方法获得并用苏木精(美国匹兹堡赛默公司的Gill-2苏木精)和伊红(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司的伊红醇)染色的脾脏切片和肝脏切片上进行组织学研究。还按照制造商的说明书通过普鲁士蓝或Perls染色(密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司)在脾脏中研究了铁沉积物。使用奥林巴斯(Olympus)BX40光学显微镜检查所有切片并且用奥林巴斯DP21相机以100×或200×的最终放大率对其进行拍摄。
红细胞分化.BM和脾脏中的Ter119和CD71标志物强度的流式细胞仪分析术可以用于使用4μg/mL的抗小鼠Ter119-PE抗体(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司)、10μg/mL的生物素化抗CD71抗体(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司)和链霉亲和素三基色(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司旗下英杰公司)来鉴定如其它地方[Socolovsky M等人,(2001).《血液》98:3261-3273]描述的不同的红细胞亚群。然后，使用碘化丙啶(IP，2μg/mL)在EPICS XL流失细胞仪(加利福尼亚州贝瑞阿贝克曼库尔特公司)中分析细胞以检测活细胞。
前病毒定量.使用包装前病毒序列(Ψ)和小鼠肌联蛋白管家基因的互补引物完成每个细胞的整合前病毒的检测和定量。周期性地收集总BM和外周血样品，并且使用DNeasy血液和组织试剂盒(荷兰林堡省芬洛凯杰公司(Qiagen))将来自有核细胞的基因组DNA分离。使用7500快速实时PCR系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司旗下的应用生物系统公司(Applied Biosystems))和先前描述的引物和探针[Charrier S等人,(2011).《基因疗法》18:479-487]通过多个qPCR扩增20到50ng的基因组DNA(gDNA)。
嵌合.通过qPCR检测Y染色体SRY基因和小鼠β-肌动蛋白管家基因量化供体细胞的存在。使用先前描述的引物和探针[Navarro S等人(2006).《分子疗法(Mol Ther)》14:525-535]，并且使用7500快速实时PCR系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司旗下的应用生物系统公司)扩增来自移植小鼠的PB中的基因组DNA。使用来自含有来自雄性/雌性小鼠混合物的0％到100％的BM细胞的样品的gDNA提取物制备标准曲线，并且嵌合计算为：供体移植的％＝100×2(CtβAct-CtSRY)。
LAM-PCR程序.为了鉴定载体整合位点，按照Schmidt等人,2007[《自然方法(NatMethods)》4:1051-1057]出版的方法通过LAM-PCR扩增3'载体LTR-基因组连接。使用生物素化LTR特异性引物和多达100ng的gDNA作为模板进行起始线性扩增(100个循环)。使用链霉亲和素磁珠纯化线性扩增产物，并且然后进行互补链合成、用2种不同的限制酶(Tsp509I和HpyCH4IV)进行并行消化并且使用与酶切留下的端互补的连接子盒进行两种连接反应。通过两个另外的指数PCR步骤扩增生成的片段。通过MultiNA自动化系统(岛津(Shimadzu))上的凝胶电泳分离和量化LAM-PCR产物。
对用于Illumina MiSeq测序的LAM-PCR产物的设置.按照Parazynski等人[Paruzynski A等人,(2010).《自然实验手册(Nat Protoc)》5:1379-1395]出版的方法，使用含有允许在Illumina MiSeq序列仪上进行双端测序的特异性序列的融合引物重新扩增通过Tsp509I和HpyCH4IV酶生成的40ng的第二指数PCR产物。通过融合PCR来添加罗氏(Roche)454GS-FLX衔接子以使LAM-PCR样品适用于454-焦磷酸测序(pyrusequencing)：将衔接子A加上8-核苷酸条形码添加到LAM-PCR扩增子的LTR端；将衔接子B添加到连接子盒侧。在5'-3'朝向上，最终扩增子构成如下：衔接子A、条形码、LTR序列、未知基因组序列、连接子盒序列和引物B。在MultiNA自动化电泳系统上运行和定量经过纯化的融合引物PCR产物并且将其汇集在一起以便获得10nM的最终等摩尔文库。然后，使用用于Viia7实时PCR系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司旗下的应用生物系统公司)上的Illumina测序平台(马萨诸塞州威尔明顿KAPA生物系统公司(KAPA Biosystems))的KAPA文库定量试剂盒重新定量最终文库，从而获得16.35nM的估计的浓度。最终，使用Illumina MiSeq试剂盒对文库进行测序。
生物信息学分析.为了从高通量测序平台，即罗氏454和Illumina MiSeq/HiSeq两者中提取载体IS，设计了接受原始数据(通常以FastQ文件格式)的输入的流水线，从而提供了可靠IS的列表和最近的基因。使用Excel、GraphPad Prism(TM)和可获得的在线工具进行针对克隆丰度定量和基因本体富集的高级水平分析。
NGS数据处理和流水线使用.NGS数据处理的步骤涉及管理来自Illumina MiSeq测序平台的高通量数据并且旨在鉴定在其中所有有效序列读段与参考基因组对齐的IS。数据处理包括两个主要活动：1.数据质量检查和分析，其中LV载体序列和其它污染物被修整。2.整合位点鉴定，其中所有有效序列读段与参考基因组对齐并且检索到有效IS。
数据质量分析.为了鉴定来自Illumina MiSeq原始数据的IS，开发了生物信息学流水线。标准LAM-PCR产物含有LTR序列、侧翼人基因组序列和连接子盒(LC)序列。459技术允许检索长度范围为10bp到900bp的LAM-PCR序列。从Illumina MiSeq双端读段中检索到类似的结果。这些长度边界是质量分析过程中要考虑的重要参数，因为其影响后续对齐程序和载体组分鉴定的算法两者。太短而不能与参考基因正确对齐的序列以及那些超过NSG技术可达到的最大尺寸的序列被丢弃，以避免丢失部分或全部LC序列。一旦每个池的流水线结束，就在文件(存档在TIGET网络附加文件存储-NAS-中)和内部数据库两者中收集所有整合位点，并且将其维持在跟踪经过修改的拷贝的存储服务器中。
整合位点鉴定.为了鉴定独特的整合位点并且提取所有IS在行中并且每个样品在列中的具有最近基因注解的excel文件(IS矩阵)，我们运行以下步骤：1.使用名为create_matrix的程序创建IS矩阵，从而实现项目间的碰撞检测。这个程序将产生制表符分割的文件(TSV)；2.使用程序annotate_bed对IS矩阵文件进行注解，对于使用输入TSV文件的每个池，所述注解如下所示：awk‘{print“chr”$1”\t”$2”\t”$2}’TSV_FILE|tail-n+2>TSV_FILE.bed；annotate_bed–a/opt/genome/mouse/mm9/annotation/mm9.refGene.TIGET.gtf-b TSV_FILE.bed-o TSV_FILE.annotated.bed；3.将注解和矩阵文件两者导入到新的Excel工作表(在此称为XLS)中。
碰撞检测.为了从每个移植小鼠中获得IS的可靠数据集，我们从潜在污染/碰撞和基于序列计数的假阳性中过滤数据。需要数据归一化的另外的步骤来组合由不同的实验产生的整合位点。
术语“碰撞”用于鉴定独立样品中的相同IS的存在。在我们的实验设置中，在不同细胞中的相同基因组位置中的载体整合是极低概率事件。因此，独立样品中的相同IS的检测可能源自于可能在湿实验室程序(样品纯化、DNA提取、LAM-PCR和测序)的不用阶段处发生的污染。虽然我们的工作流水线被设计成使样品间接触的发生最小化，但是IS的高通量分析固有地携带某种程度的背景污染。样品之间的污染程度的鉴定也至关重要，因为在从相同小鼠中获得的不同样品中检索相同IS在后续步骤中用于推断载体标记的造血细胞的生物学特性(即多谱系潜能和持续促克隆形成活性)。因此，我们必须能够在不同样品(来自相同小鼠)中从污染/碰撞中区分出相同IS的实际发生。
为了解决这些问题，我们评估了源自于不同测试项目和小鼠的样品之间的共享IS的程度作为测量我们的分析中的碰撞程度并且然后设计规则以从每个小鼠的数据集中丢弃可以归因于碰撞的那些IS并且在寻找来自相同小鼠的样品之间的共享IS时使评为假阳性的可能性最小化的方式。我们设计了允许验证每个整合基因座的碰撞检测过程。总体结果应该是，给定整合基因座的集合I，在I中的整合基因座i分类为碰撞的情况下，将i从I中丢弃。我们在3个独立移植组之间应用了碰撞检测过程：1.coPKR170s：移植有用coRPK表达性LV载体(coRPK 1-3)转导的Lin-细胞之后的170天时安乐死的来自测定1的小鼠。2.EGFP：移植有携带EGFP表达性LV载体(EGFP 1-6)的Lin-细胞的来自测定2的小鼠。3.coPKR-TC：移植有用coRPK表达性LV载体(coRPK 1-14)转导的Lin-细胞的来自测定2的小鼠，在不同的时间点对其血液和BM进行分析，包含移植有来自原代移植小鼠的亚组(coRPK 11-14)的汇集的BM的二代接受者。
每个相同IS在不同小鼠之间具有不同序列读段(序列计数)。序列计数可以用于基于丰度标准确定来自一个小鼠的样品是否污染其它小鼠的样品。在我们的基本原理中，在两个小鼠中发现的整合将分配给示出最高丰度的小鼠，而在另一个小鼠中，所述整合将被认为是污染物。因此，我们可以识别出允许将给定碰撞分配给小鼠并从其它小鼠中移除的差分序列计数的阈值。我们从我们的数据中检索出阈值，获得的值为10，这意味着对于每个IS，在所有TI之间，如果IS已经得到的丰度值(百分比序列计数比率)比其它TI的最高丰度值(百分比序列计数)低10倍，则将所述IS从当前TI中丢弃。我们将这些规则在TI和所选择组之间应用，并且Excel文件用于通过应用以下规则(在此针对TI过滤详述，但是所述规则也可以扩展到组过滤)计算碰撞检测：1.分离每个TI，通过对序列计数求和将相同TI的所有样品分组在一起。2.对于获得的三个TI，针对每个IS，计算IS序列计数与针对TI的读段的总和之间的百分比。3.然后，应用以下规则来计算允许将每个IS分配给可靠TI的阈值为10的决策步骤。
一旦检测到IS被移除，那么所述IS的读段会从组中移除，使得其将不会再被分配给所述组。上文描述的过滤应用于移植有不同的离体转导细胞群(来自测定2的EGFP表达性小鼠的一个队列和属于两个独立移植实验的coPKR小鼠的两个队列)的小鼠之间。此外，对于coPKR-TC组(测定2)，以两种方式修改上文提到的过滤方法：a)为了在克隆丰度分析的背景下更好地突显整合在时间点之间的共享，我们添加了以下规则：如果一个整合在一个或多个小鼠之间共享，则所有时间点的整合将保留，即使其序列计数小于小鼠之间的最大序列计数的10％；b)对于谱系跟踪关系，我们通过消除序列计数小于的3的IS和10％序列计数过滤器应用了更加严格的过滤器以便进行时间点之间的共享。这意味着两个时间点之间共享的整合只有在分别多于或少于另一个时才会被保留或丢弃。
基因本体分析.所有基因本体分析是使用GREAT在线软件(http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/)完成的。网页允许上传每个数据集的整合的基因组坐标并且通过使位置信息(基于用于p-值计算的二项分布分析)与最靠近整合位点的基因的带注解的功能(基于用于p-值计算的超几何分布分析)相关来计算经过测试的数据集中的富集水平[Groeschel S等人,(2011).《遗传性代谢病杂志(J Inherit MetabDis)》34:1095-1102]。选择生物学过程和GO数据库的分子功能进行富集分析。仅考虑两个统计分析中错误发现率<0.05的基因类别(图20)。
数据存储.将所有数据(原始数据和结果两者)存储于根文件夹中的TIGET网络附加文件存储(NAS)中，其中来自流水线的所有对齐以及丰度矩阵和图是可利用的。通过认证和授权策略来保护NAS存储，并且使用磁盘冗余阵列RAID 5将其建立在可靠且可扩展的基础设施上，并且在TIGET中注册的我们的CrashPlan软件上对其进行备份。
实例1
PGK-coRPK治疗性LV载体导致基因修正的PKD小鼠中的贫血表型的稳定和长期修 正。
通过转导和移植来自PKD小鼠(图2b)的谱系耗竭BM细胞(Lin-细胞)来测定PGK-coRPK LV(图2a)的体内功效。图2a是在整个基因疗法实验中使用的SIN LV载体的示意图，所述SIN LV载体携带调节对照载体(上图)中的EGFP转基因的表达或治疗性载体(下图)中的coRPK cDNA的表达的人PGK启动子。coRPK序列示出与人PKLR cDNA 80.4％同源并且与小鼠Pklr cDNA 76.5％同源，其中氨基酸序列无变化。图2b是为了解决显影的PGK-coRPK LV载体的功能而进行的基因疗法方案的示意图。通过血液学分析和代谢图谱研究PKD表型在移植之后的4到9个月内在PB和BM中的修正。整合分析在来自所有小鼠的不同组织和时间点中进行以解决LV载体安全性。在移植后280天，来自携带coRPK转基因的原代移植小鼠中的总BM被再次移植到被致命地照射的雌性PKD小鼠(二代接受者)中以测试移植的稳定性和安全性。当与未移植PKD同窝小鼠或与移植有用EGFP LV转导的细胞的小鼠比较时，移植有用coRPK LV转导的缺陷细胞的被致命地照射的PKD小鼠在所有测试的血液红系参数方面示出显著改善(图3和表2)。
表2.记录的移植后140天外周血中的血液学变量.
数据表示平均值±SEM并且使用克鲁斯卡尔-沃利斯非参数检验通过与EGFP表达性小鼠对比对其进行统计分析。*p<0.05；**p<0.01。
移植后40天就增加的RBC计数(图3a)和组成型网织红细胞增多(其为PKD的最常见体征之一)在携带PGK-coRPK转基因的小鼠中显著逆转，从而达到接近于移植之后至少9个月在健康对照物中观察到那些水平的水平(图3b)。相反，移植有EGFP LV转导细胞的PKD动物示出在分析的所有时间点与PKD小鼠并行的贫血和显著的网织红细胞增多。当与未移植PKD同窝小鼠相比时，移植有LV修正细胞的小鼠中的血红蛋白水平(HGB)、血细胞比容指数(HTC)、平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞血红蛋白(MCH)值也被修正(表2)。血液学修正实现，其中供体嵌合为63.66±4.45％并且转导效率的范围为60％到90％(表3)。
表3移植有经过基因修饰的细胞的小鼠中的相关分子参数.
数据表示平均值±SEM，n.d表示未确定。a表示在由实验1构建的线性回归中通过插值得到的估计的转导百分比(X轴：VCN/WBC，Y轴：％前病毒+CFU)。
转导细胞示出平均每个细胞1.65±0.08个整合的载体拷贝，这指示PGK-coRPKLV-载体提供了足够的人RPK转基因表达来逆转溶血性贫血。值得注意的是，当与未移植PKD小鼠比较时，coRPK转基因的表达导致红系细胞半衰期延长(图3c、d)。平均而言，PKD小鼠示出19天的RBC半衰期，而在基因修正小鼠中，RBC半衰期延长到25天(6天的延长)，从而达到接近于野生型RBC半衰期的值(图3d)。因此，coRPK表达性小鼠的RBC在健康对照小鼠与缺陷对照小鼠之间表现出中间存活动力学(图3c)，最有可能因为完全嵌合未在这些动物中实现(表3)。
移植之后九个月，将来自原代接受者的造血祖细胞移植到维持移植水平(62.89±5.61％)和VCN(1.44±0.08个拷贝)(表3)的二代接受者中。二代移植接受者在移植后长达5个月示出多谱系造血重建(图4)并且在所有PB红系参数方面示出显著改善(图5和表2)。图4a是用于通过用CD3-PE、B220-PE、B220-PECy5、Gr1-生物素和Mac1-生物素抗体加上SAV-PE-Cy5标记来鉴定不同造血谱系的流式细胞术策略的图。图4b描绘了代表性点图以及移植后140天时每个谱系在PB中的百分比(图4c)。条表示健康(n＝2，黑条)和PKD小鼠(n＝2，灰条)对照物以及表达coRPK治疗性转基因的二代移植小鼠(n＝4，划线条)的平均百分比±SEM。另外，在区别地定向的造血祖细胞中检测到前病毒整合(图6a、b)并且其数量随时间推移保持恒定(图6c)，这显示了基因修正的稳定性并且突出了PGK-coRPK LV的安全性。图6a示出了移植后120到170天时来自单个移植小鼠的BM CFU中每个细胞的载体拷贝数。还示出了转导和嵌合百分比。图6b示出了来自不同造血区室的细胞中的前病毒拷贝数。柱表示不同组移植小鼠的平均值±SEM。图6c示出了来自单个移植EGFP表达性小鼠(灰线)和携带coRPK转基因的小鼠(黑线)的BM细胞中前病毒整合的动力学。
实例2
LV衍生的RPK表达使红系分化归一化并且允许产生功能性成熟红细胞。
PKD小鼠示出由补偿性红细胞生成机制引起的红系区室的特性扩增(Min-oo等人2004)。对移植小鼠中的红系分化模式的研究表明异位RPK表达逆转了这个机制(图7a、b)。PKD和EGFP表达性小鼠示出未成熟红系前体在BM和脾脏中的优势(亚群I：原红细胞和亚群II：嗜碱性成红细胞)以及晚期红系细胞(群IV：网织红细胞和成熟红细胞)的显著下降，而移植有用coRPK LV转导的细胞的小鼠示出未成熟红系前体(亚群I和II)的显著减少以及相当于健康小鼠的最晚期红系区室(亚群IV)的显著增加(图7a、b)。另外，与PKD和EGFP表达性小鼠不同，携带coRPK转基因的那些小鼠示出血浆中促红细胞生成素(Epo)水平的显著下降(图7c)。图8a示出来自脾脏的总CFU，并且图8b示出移植之后140天的骨髓。点表示分析的每只小鼠的菌落数，并且线表示每组的平均值±SEM。数据通过非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行统计分析。用治疗性载体处理的PKD小鼠中的红细胞生成的归一化通过使祖细胞含量的脾数量减少到正常水平(图8a)来实现，尽管BM CFU含量未见变化(图8b)。
实例3
用coRPK LV载体转导的细胞的移植逆转髓外红细胞生成和器官病理学。
由于RPK缺陷红细胞的主动破坏，当与健康对照物比较时，PKD和EGFP表达性小鼠表现出急性脾肿大，其中脾重量和尺寸增加超过200％(图9a、b)。还在这些动物中观察到脾组织的结构紊乱和脾红髓的扩增，这表明强烈髓外红细胞生成也由PKD和EGFP表达性肝脏切片中的红系细胞簇的存在支持(图9c)。值得注意的是，coRPK转基因的异位表达完全逆转了经过基因修正的小鼠中脾脏和肝脏病理，从而减少了RBC积聚并且使脾脏组织学结构和尺寸归一化(图9)。另外，组织学研究显示经过基因修正的小鼠的肝脏中完全不存在铁沉积物，而来自未移植组或移植有用EGFP携带载体转导的HSC的组的PKD小鼠表现出由于持续溶血过程引起的强烈铁过载(图9c)。总的来说，PKD小鼠中的经过基因修正的HSC的移植恢复了红细胞生成的正常状态和因溶血性贫血所致的所有继发性影响。
实例4
PGK-coRPK LV衍生的表达在不修改WBC代谢平衡的情况下恢复RBC中的糖酵解途 径。
接下来，我们对所有移植小鼠和对照小鼠进行广泛代谢组学分析以研究RPK酶活性的功能修正。按照非靶向图谱策略，我们观察了不同组之间的RBC中的糖酵解中间体的显著变化，从而识别具有不同趋势的代谢物模式的三大簇(图10a)。来自coRPK表达性小鼠的RBC示出来自类似于健康对照物但与携带EGFP转基因的移植小鼠不同的簇1的代谢物的增加。同理，簇3反映了类似于野生型小鼠并与EGFP表达性小鼠不同的经过基因修正的小鼠中的减少的代谢物趋势。然而，来自测定1的簇2未示出移植小鼠组(EGFP和coRPK表达性小鼠)之间的代谢物图谱的区别(图10a)。非靶向代谢图谱还示出基因修饰能够修饰一些重要的糖酵解中间体，从而实现从移植有PGK-coRPK LV转导HSC的小鼠中分离的红细胞中的ATP(图10b)、ADP(图10c)和丙酮酸(图10d)水平的提高。考虑到这些代谢趋势，我们然后使用靶向图谱方法分析了更靠近PK-催化反应定位的其它代谢物。位于PK-催化反应上游的直接PK基底磷酸烯醇丙酮酸(PEP)(图10e)和3-磷酸甘油酸(3-PG)(图10f)的水平接近于健康对照小鼠的水平。当与PKD和EGFP表达性小鼠比较时，表达coRPK转基因的缺陷红细胞还产生了D-乳酸(图10g)(无氧酵解的最终产物)的增加。为了测试糖醇解代谢产物中的补偿是否由成熟红细胞中的PK活性的归一化引起，我们测量了这种酶的活性并且使其相对于己糖激酶活性归一化，以便避免大量网织红细胞对缺陷动物的影响。通过纤维素柱纯化RBC以防止白细胞PK活性污染。在达到的比率类似于从野生型健康动物和从正常健康血液供体志愿者中获得的那些比率的表达coRPK的动物中观察到PK活性的完全补偿(图11)。图11a示出丙酮酸激酶活性，图11b示出己糖激酶活性，并且图11c示出来自对照小鼠和移植有转导细胞的小鼠的RBC中的丙酮酸激酶活性与己糖激酶活性的比率。RBC通过纤维素柱从血液样品纯化以避免白细胞PK活性污染，并进行酶活性评估。黑条，健康小鼠(n＝2)；白条，移植有用EGFP表达性载体转导的细胞的小鼠(n＝3)；划线条，移植有用coRPK表达性载体转导的细胞的小鼠(n＝3)。方格条表示来自健康志愿者的值(n＝1)。数据表示每组的平均值±SEM。
主成分分析示出RBC的代谢物模式因组而异并且与WBC图谱显著不同(图12a)。相反，WBC亚组以非常小的组间差异聚集在一起，这表明在表达异位coRPK时白细胞的代谢平衡没有变化(图12a)。另外，在RBC非靶向图谱中观察到的特异性代谢物变化不存在于WBC中(图12b-d)。
实例5
PGK-coRPK LV转导细胞在没有载体基因毒性的证据的情况下致使多克隆造血重 建。
在移植小鼠中分析携带coRPK或EGFP转基因的LV的整合图谱。由于LV的全基因组整合图谱，每个插入创建了可以用于跟踪单个转导细胞中的克隆行为的独特的基因标记。从WBC和BM细胞、以及原代移植小鼠和二代移植小鼠、以及移植之前的转导细胞池(Lin-细胞)中获得基因组DNA(gDNA)。线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)(图13和14)用于扩增载体/基因组连接并且鉴定载体IS。图13展示了载体IS通过3'载体LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增来鉴定。使用了MultiNA自动化系统，从而生成由若干个带表征的图案。载体主链衍生的Tsp509I内部控制带(IC)用箭头指示。图14展示了载体IS通过3'载体LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增来鉴定。使用了MultiNA自动化系统，从而生成由若干个带表征的图案。载体主链衍生的HpyCH4IV5 IC用箭头指示。
通过MiSeq Illumina平台对PCR产物进行测序，并且将所获得的序列通过生物信息学流水线映射到小鼠基因组上并且对如上文描述的方法部分中的碰撞进行过滤(图15)。图15是在移植有经过基因修饰的造血祖细胞的小鼠中进行的IS映射的分析的总体方案。如在补充方法中描述的，按照所示流水线对来自属于两个独立实验(表3)的移植小鼠并在移植之后的不同时间点采集的骨髓和白血细胞样品进行分析。
总的来说，我们将5,173,892个测序读数映射在移植小鼠基因组上，从而得到2,220个独特的载体整合位点。来自两个独立实验的IS的基因组分布与先前报告的对转录单元内(尤其是转录起始位点-TSS-的前50Kb下游内)的整合的LV偏好匹配(图16a)，从而示出没有向小鼠基因组中的任何特定染色体偏斜(图16b)。图16a示出了在TSS上游和下游跨越500Kb的最近的RefSeq基因的TSS周围的IS频率分布。顶部的数字是针对所有样品和时间点检测到的IS的数量。图16b示出了表达EGFP转基因(黑条)或coRPK治疗性转基因(灰条)的移植小鼠中的LV IS的染色体分布，从而示出没有向任何特定染色体偏斜。
通过克隆丰度估计研究了基于PGK-coRPK LV的基因疗法的安全性，从而计算了每个IS(克隆标记)的序列计数相对于数据集的序列总数的百分比。针对每个小鼠检索到的每个IS的相对丰度的点图和热图表示(图17、18和19)示出不同小鼠和体外培养的Lin-细胞的克隆组合物的强烈波动。图17是携带治疗性PGK-coRPK LV载体的原代接受者小鼠与二代接受者小鼠之间的跟踪共享整合的图表。汇集在任何器官、任何时间在任一小鼠中检测到的整合。二代接受者从移植小鼠coRPK11到14接收汇集的BM。检测到的其余IS是在原代或二代接受者中检测到的。框中的数字示出了提到的小鼠中对应整合的百分比的代表性。除了应用于整合分析的≥5％过滤器外，消除序列计数<3的所有整合。图19展示了每只小鼠骨髓中的汇集整合的克隆丰度的点图表示。每个IS的相对百分比(y轴)与在每个数据集中获得的序列读段的总数有关。类似于co-RPK转导的细胞(图17)，本图表明绝大多数移植小鼠示出造血再增殖的多克隆模式。
而且，可以理解的是，对于若干个样品，少量的整合导致大量的序列读段(图17和18)，这揭示了转导HSC的再增殖的多克隆模式。另外，携带治疗性PGK-coRPK LV的原代小鼠与随后移植的二代小鼠之间的跟踪共享整合示出组之间没有强的整合共享，从而证实缺乏克隆优势(图18)。
为了确定移植小鼠中是否存在插入诱变的标志，我们评估了类似于当前正在进行的LV介导的临床试验的常见插入位点(CIS)的发生。CIS是可以由转导时的整合偏置或携带赋予生长优势的载体整合的克隆的体内选择造成的插入热点。使用基于Abel和cols的算法以及针对离群值的格鲁布斯检验(Grubbs test)来鉴定CIS，从而通过这个读数发现没有CIS，并且因此没有令人担忧的基因毒性的迹象。此外，GO分析显示在按照组织分布、时间点或再增殖造血细胞克隆的丰度排序的整合数据集中的任一整合数据集中没有发现向涉及癌症、细胞增殖或凋亡调节的基因类别的偏斜(图20)。图20表示LV基因组整合图谱。使用GREAT软件对来自移植小鼠的样品进行GO分析。从本研究中检索到的所有整合(N＝2220)示出了图左部指示的基因功能的过度表示。为了解决最丰富的整合是否在特定基因类别上富集的问题，选择了相对序列计数大于整个数据集的5％的所有IS(如图17所示)，从而示出没有过度表示的GO基因类别。
这些结果表明载体整合的中性并且证明了PGK-coRPK LV在临床前环境中的安全性。
实例6
人临床试验
进行临床试验来评估在患有PKD、具有脾切除术难以治疗的严重且输血依赖性贫血症病史的患者中使用EU/3/14/1130药物产品(用含有RPK基因的LV载体转导的自体CD34+造血干细胞)的自体造血干细胞移植(HSCT)的安全性和初步功效。
ODD EU/3/14/1130包括表达coRPK基因的SIN LV载体(图21)。
SIN LV载体提供更加稳健的表达(Ellis 2005)并且比γ-RV载体(Pfeifer,Ikawa等人2002)更不易受到转录沉默。SIN LV载体还示出更加安全的整合图谱(Schroder,Shinn等人2002)(Mitchell,Beitzel等人2004)(Wu,Li等人2003)，并且由于其在3'LTR序列中携带的400bp缺失(Miyoshi,Blomer等人1998)(Zufferey,Dull等人1998)，所以通过内部启动子调节转基因表达，从而增加基于LV的基因修饰的安全性。
接受的LV载体的序列还包含若干个修饰以改善靶细胞中的转基因表达和安全性。
一个修饰是使用人PGK启动子，与基因疗法中使用的其它启动子相比，所述人PGK启动子已由其稳定体内活性和改善的安全性特性表征(Montini,Cesana等人2006,Modlich,Navarro等人2009,Montini,Cesana等人2009,Biffi,Montini等人2013)。PGK启动子的并入导致转基因的生理学表达和对转录沉默的较低敏感性(Gerolami,Uch等人2000,Zychlinski,Schambach等人2008)。
另一个修饰是coRPK基因以增加转录时的mRNA稳定性。对于优化，已使用软件，从而增加GC含量并移除隐蔽剪接位点，以避免转录沉默并且因此增加转基因表达。coRPK优化的序列示出了与人PKLR基因80.4％的同源性，而蛋白质的氨基酸序列没有变化。
另一个修饰是突变的wPRE，其缺少任何残留开放阅读框(Schambach,Bohne等人2006)，以改善治疗性基因的表达水平和稳定性。这个LV载体(PGK-coRPK LV)的主链、启动子和wPRE*序列与对应于药物产品“用于治疗范可尼贫血(Fanconi anemia)A型患者的含有范可尼贫血A(FANCA)基因的慢病毒载体”(参见141/2000)的一个以及在针对异染性脑白质营养不良(MLD)的当前正在进行的临床试验中使用的载体主链(Biffi,Montini等人2013)相同。
作用方式
在从PKD患者(从骨髓(BM)或动员的外周血细胞)采集CD34+祖细胞之后，用药物产品对其进行离体转导，并且将治疗性载体整合在细胞的基因组中。一旦整合，治疗性人基因(coRPK)就在缺陷细胞内转录和转译以产生PKD成熟红细胞中丢失或减少的治疗性RPK蛋白。然后，对转导的PKD造血祖细胞进行基因修正，并且因此其能够产生具有足够量的ATP的RBC来实现其功能(图22)。然后，将这些基因修正造血祖细胞(其将构成药物产品)移植回到患者中，一旦移植，就将生成正常红细胞，从而提供终身的疾病治愈。
活性成分由具有治疗性LV载体PGK.coRPK.wpre的经过修正的造血干细胞(CD34+)细胞的细胞悬浮液组成，其被欧盟委员会(ODD EU/3/14/1130)指定为用于治疗PKD的孤儿药。因此，这种新药物应该包含在基因疗法亚类内的先进疗法研发组中。
活性成分由至少2×106个CD34+细胞/kg体重的经过基因修饰的细胞悬浮液构成，其中每个细胞具有治疗载体的至少0.1个拷贝。细胞悬浮于具有2％HSA的盐水缓冲液中。
最终的治疗性产品根据GMP规则产生，因此对其在患者中的释放和输注的产品要求将与产品的质量相关。关于此，这些规范将包含细胞活力≥30％、无菌性(革兰氏(Gram)测试和无菌药典)、没有支原体、没有具复制能力的LV颗粒以及通过定量PCR检测每个细胞至少0.1个载体拷贝的存在来证明治疗潜力的效力。因此，对造血祖细胞的含量以及其中的载体拷贝数进行了调查和研究。用健康对照细胞进行三个独立验证以确保程序达到上述要求。
将最终产物包装在通过加热密封并且特别用于冷冻和储存的转移袋中，直到其输注到患者为止；此前，将针对精确对应的质量控制收集样品。
动员
将患者在其相应的医院中动员，尽管前两名患者是在马德里(西班牙)的 Jesús医院中动员的。动员过程包含从出生起持续长达八天每天两次按12mg/kg的剂量施用重组粒细胞集落刺激因子(加利福尼亚州千橡市安进公司(Amgen)Neupogen的G-CSF)，在第4天按240mg/kg/d连续4天皮下给药普乐沙福(荷兰纳尔登Genzyme Europe BV的)。通过白细胞移除术从外周血中收集造血祖细胞，并且按照马德里的Jesús医院的标准方案通过细胞分离器从动员的第5天起输送大体积。所有器械和溶液都有CE标记并且符合医疗装置法规的规范。
CD34+细胞纯化
与动员过程一致，血液成分单采术在患者被动员的医院中发生。立即对血液成分单采术产物进行处理以通过MACS“磁性细胞分选”技术(德国美天旎生物技术公司)选择造血祖细胞(CD34+细胞)，所述技术允许通过强大的永磁体和具有铁磁矩阵的分离柱利用高磁场梯度对细胞进行分离。CliniMACS(德国格拉德巴赫美天旎生物技术公司)系统包含计算机(+器械)、特异性CD34+选择软件、一组无菌试管(CliniMACS试管组)、磁控反应性无菌器械(CliniMACS CD34试剂)和无菌缓冲液(CliniMACS PBS/EDTA缓冲液)。所使用的器械和试剂都有CE标记并且将符合医疗装置法规的规范。在这个阶段和随后的洗涤期间，采用非特异性免疫球蛋白(基立福公司(Grifols)的静脉注射Flebogamma 5％0.5gr)和人血白蛋白(基立福公司的人白蛋白20％)，离心后，通过洗涤移除所述非特异性免疫球蛋白和所述人血白蛋白。然后对CD34+细胞进行定量。将按照特定方案通过采用标准真菌、好氧细菌和厌氧样品进行培养来对获得的产物进行微生物学控制。
CD34+转导
在从患者中提取细胞(血液成分单采术)后的48小时内的时间窗中在GMP条件下对具有ODD EU/3/14/1130的经过纯化的CD34+细胞进行转导。细胞的离体培养持续不到48小时，并且将按照建立的标准对其进行培养，所述标准包含使用适当调配的培养基X-vivo-20(龙沙集团(Lonza))、添加造血生长因子(100ng/ml hrSCF、100ng/ml hrFlt-3、100ng/mlTPO和20ng/mL IL-3(全部来自Prepotech))、1μg/mL百慕时(Pulmozyme)和受控的5％O2浓度。将用由VIVE生物技术公司(VIVEbiotech)(西班牙圣塞巴斯蒂安)生产的ODD EU/3/14/1130的GMP LV批次进行转导。在转导之后，在X-vivo-20(龙沙集团)中洗涤细胞，以最后将其包装在适合于冷冻保存的转移袋中。采集特异性样品以确定最终产物是否符合已针对其最终释放提及的所有规范。进行三个独立验证来评估产物的稳定性。包含载体的所有产物和溶液将符合针对医疗装置和临床使用的法规的规范。在产生之前，将由CliniStem的质量控制(QC)单元根据标准操作程序(SOP)对所有原材料(包含消耗品、生物学试剂和化学粉末)进行检查。
调节
根据为试验考虑的标准化和特定方案对患者进行调节。为了考虑进行调节的患者，作为替代方案，将备用的2×106个未经操纵的CD34+细胞/kg保持冷冻，以在制备的产品无法完全重构所治疗患者的造血的情况下使用。
输注
在输注之前，检查患者资格以确保患者符合研究要求。记录输注、术前用药和所使用的预防性药物的天数。
实例7
非临床开发
先前的工作证实了在移植了超过25％的基因修正细胞时针对PKD的HSC基因疗法在小鼠中的可行性。这些结果表明，需要大量的供体基因修正的HSC(Zaucha,Yu等人2001)和高水平的转基因表达来实现对PKD的治疗效果。我们已开发针对此临床试验提出的新的治疗性LV载体，其携带驱动PKLR cDNA的表达的hPGK真核启动子，所述hPGK真核启动子于2014年8月被指定为孤儿药(EU/3/14/1130)。在此载体的情况下，我们在疾病的小鼠模型中进行了针对PKD的临床前基因疗法方案。在基于临床标准的LV剂量的情况下，异位RPK表达能够使红系区室归一化，从而修正血液学表型并逆转器官病理学。代谢组学研究表明，对基因修正RBC中的糖酵解途径进行功能修正，而未在白细胞中观察到代谢紊乱。值得注意的是，并行分析的WBC示出，当在普遍存在的启动子(如PGK)的活性下对RPK进行异位表达时，白细胞中的代谢平衡没有变化，这排除了白细胞代谢优势可能的安全问题并且增强了EU/3/14/1130载体的治疗潜力。
由BM重新移植诱导的增殖性应激之后的二代接受者中的多谱系重构和任何白血病事件或克隆扩增的缺乏证实了基于PGK-coRPK LV载体的方案的长期稳定性和安全性。i)可能导致RPK转基因的更多生理学表达、ii)已被证实是弱反式激活因子并且iii)当前在针对异染性脑白质营养不良(MLD)的临床试验中使用的人PGK真核启动子的使用也可以解释整个程序的安全性。
为了通过载体IS的分析评估HSC基因疗法的长期安全性，使用下一代测序来预测HSC中的插入肿瘤形成的风险。将超过5,173,892序列读段映射在小鼠基因组上以形成总共2220个独特的载体IS，从而没有发现体内扩增的证据或对携带IS的克隆的选择。相反，我们的数据示出在小鼠中移植经过转导的HSC之后的克隆组合物和造血的动力学，从而表明HSC随时间推移的真正且稳定的基因体内修饰。总的来说，对载体整合模式的分析强调了在没有基因毒性的证据的情况下提供PKD基因修正的PGK-coRPK LV载体的安全性特性。
实例8
临床研发
监管机构要求临床研究的方案辅助。我们的目标是进行由欧洲委员会赞助的临床试验。已建立由欧洲不同的临床医生和基础研究人员构成的ForGeTPKD联盟来致力于PKD研究和新的治疗性策略的开发。ForGeTPKD临床试验将是这种药物产品在人体中的第一次施用。其被指定为评估用含有红细胞型丙酮酸激酶(RPK)基因(EU/3/14/1130)的慢病毒载体离体转导的自体CD34+细胞在患有严重丙酮酸激酶缺乏症的患者中的移植的安全性和功效的国际性、多中心、I/II期开放标记研究。
监管状态
药物产品目前不具有上市许可。PKD联盟的目标是推进药物产品的临床研发以便最终获得上市许可。
提到的最终产物将用LV载体产生，所述LV载体已获得与以下有关的孤儿药资格认定：
指示：丙酮酸激酶缺乏症的治疗
标准：PKD的唯一治愈性治疗是已在患有其它措施难治的输血依赖性严重贫血症的患者中使用的同种异体BMT。然而，同种异体BMT不是广泛接受的针对PKD的治疗(在文献(Tanphaichitr,Suvatte等人2000)中仅报道了一个患者)，因为其与涉及通过化学疗法或放化疗法的密集型pre-allo-BMT调节的严重并发症以及急性和慢性移植物抗宿主病(GVHD)相关。我们的假设是使用用含有由ODD EU/3/14/1130提供的野生型基因版本的病毒载体转导的自体造血干细胞的基因疗法可以表现出针对这些患者的潜在的治愈治机会，从而避免GVHD的风险，GVHD是造血祖细胞移植失败的主要原因。
活性物质：表达野生型蛋白质版本的用含有红细胞型丙酮酸激酶(RPK)基因(ODDEU/3/14/1130)的慢病毒载体转导的自体CD34+造血干细胞。
成品：悬浮于具有2％HAS的盐水缓冲液中的含有至少2×106个活性物质/kg患者体重的冷冻袋。
实例9
药理学
完成的研究：开发的药物产品包含为PKD的基因疗法提供一些优势的其序列中的若干个修饰：1)SIN-LV载体设计的使用允许相对简单和安全地生产能够有效地转导HSC的病毒储备液；2)不易通过甲基化沉默(Gerolami,Uch等人2000)的弱真核启动子(如hPGK)的使用导致转基因的生理学表达，从而用临床标准(Matrai,Chuah等人2010)内的病毒剂量(1.65VCN)实现治疗性水平；以及3)密码子优化的转基因序列和突变的wPRE序列的存在增加转基因mRNA稳定性。治疗性载体序列中未包含报告基因，从而避免了可能的免疫原性问题(Morris,Conerly等人2004)；(Stripecke,Carmen Villacres等人1999)。
开发的hPGK-coRPK LV药物产品有效地逆转了移植有用ODD EU/3/14/1130转导和修正的祖细胞的原代和二代缺陷小鼠两者中的PKD病理学。用治疗性转基因的平均每个细胞携带1.65个拷贝的细胞实现修正。
人PGK启动子足够有效以表达coRPK蛋白质的临床上相关的水平，从而恢复移植小鼠中的溶血表型。
基因修正能够：延长RBC半衰期；使血液学变量和网织红细胞水平归一化；逆转在PKD小鼠中组成性地活化的补偿性红细胞生成；并且挽救脾脏和肝脏中的病理学，从而显著地减少铁过载，所述铁过载是PKD的危及生命的并发症之一。另外，人RPK的异位表达在不改变WBC中的代谢平衡的情况下修正了RBC中的能量缺陷，从而强调了药物产品的功效和安全性。
实例10
正在进行的研究
对来自健康供体和PKD患者的人造血组细胞进行转导，以便于研究：1)确定ODDEU/3/14/1130在人细胞中的转导效率；2)限定最优载体拷贝数/细胞以获得RPK治疗性蛋白质的高效和治疗性表达；并且3)限定最优条件以在不损失造血干细胞能力的情况下获得治疗性转导水平。
计划的研究包含建立针对GMP设施处的大规模转导的条件、预验证和3个验证研究，以建立最优条件来达到针对最终治疗性产物限定的所需规范。
毒理学
完成的研究结果包含：1)人RPK的异位表达在不改变WBC中的代谢平衡的情况下修正了RBC中的能量缺陷；2)载体的基因组整合分析已表明：(i)对特异性细胞克隆的相对丰度的分析示出针对一些小鼠的寡克隆造血重建，其中任何原代和二代移植小鼠没有克隆优势；(ii)考虑插入诱变的标志的CIS分析未示出任何基因毒性迹象或CIS随着时间推移的异常富集，因为来自在小鼠中进行的两个独立的基因疗法的检测到的CIS并不由高序列计数表示并且没有优先地靶向致癌基因；(iii)由LV整合靶向的基因的GO分析和对载体整合在基因组的特异性区中的位置的分析表明没有向涉及癌症、细胞增殖或凋亡调节的基因类别偏斜；并且(iv)总的来说，药物产品整合分析未示出任何基因毒性的证据。
计划的研究包含1)对重组感受态慢病毒(RCL)产生的分析：来自健康供体和来自PKD患者的人T淋巴细胞将用ODD EU/3/14/1130转导并在体外培养持续延长的时间段。将通过ELISA在上清液中对病毒p24蛋白质的存在进行分析以评估RCL的潜在生成；以及2)药物产品的生物分布：小鼠造血祖细胞将用ODD EU/3/14/1130转导并且将被移植到被致命地照射的接受者中。移植后一个月，动物将被处死，并且将针对载体DNA的存在对不同的器官(生殖腺、肝脏、肾脏、大脑、骨髓、脾脏和外周血)进行分析；以及3)人细胞中的载体整合酶：来自健康供体和来自PKD患者的造血祖细胞将用ODD EU/3/14/1130转导并将被移植到严重免疫缺陷小鼠中以允许人造血细胞的移植和增殖。在不同的时间点(移植后1个月、2个月和3个月)，将进行血液和BM移植，针对人细胞对其进行分选并对其进行如已经用小鼠细胞进行的载体整合酶分析。
实例11
人临床试验
为了测试临床功效，将进行ForGeTPKD试验。提出的临床试验旨在评估在患有PKD、具有脾切除术难治的严重且输血依赖性贫血症病史的患者中使用EU/3/14/1130药物产品(用含有红细胞型丙酮酸激酶(RPK)基因的慢病毒载体转导的自体CD34+造血干细胞)的自体HSCT的安全性和初步功效。
主要目的是评估治疗、安全性和耐受性/可行性。以下端点将根据以下测量：1)不良事件(AE)的发生率和表征，包含与转导细胞的输注相关的AE、衍生自细胞输注前的调节的AE以及衍生自与转导细胞相关的克隆进化的AE；以及2)在移植后30天具有干细胞移植的患者的数量。
次要目的是评估初步治疗功效。以下端点将根据以下测量：1)在研究结束时变成“脱离输血”的患者的数量，以及在治疗后仍需要输血的患者的数量；2)研究时间段(1年)内需要的平均输血次数相对于基线评估之前的最近1.5年中的平均输血次数之间的比率；3)贫血症在临床上的显著减少，定义为在研究结束时血红蛋白水平较基线升高2gr/dL的患者的数量；4)网织红细胞增多在临床上的显著减少，定义为在研究结束时较基线评估减少50％的患者的数量；以及5)具有干细胞移植的患者的数量，其中1％的转导细胞可以在研究结束时在细胞输注后的6个月和12个月被检测到。
探究性目的是评估治疗对患者的生活质量的影响。以下端点将根据以下测量：生活质量在研究结束时较基线的改善，使用生活质量问卷(SF-36用于成人或PEDSQL用于儿童)以及其用参与国家的语言(意大利语、荷兰语和西班牙语)翻译的经过验证的版本。
ForGetPKD试验是将在3个欧盟成员国进行的多中心国际性试验：西班牙、意大利和荷兰。参与中心包含PKD诊断和治疗的参考国家调查员和机构。
试验将展示所述产品第一次向人施用。其被设计为非对照、开放标记、单剂量、I/II期研究。
全球研究持续时间将为2年，从第一位患者的首次就诊到最后一位患者的最后一次就诊。这包含1年的招募期和1年的治疗期以及早期(立即)随访。在试验结束之后，包含的受试者将被要求参与随后的随访研究，所述研究将在移植后长达5年内监测安全性和功效。
研究程序包含括筛选期、治疗期和随访期。在下文中详述并在表4中总结了每个阶段的就诊详情和相关联的研究程序。
表4.研究程序
筛选期
就诊-1：预筛选就诊
将告知潜在候选者试验的目标和特性，并由患者(或法定代表人，如果是未成年人的话)一式两份地获取、填写和签署书面知情同意书。为了有资格参加研究，患者必须满足所有的纳入标准且不满足排除标准，将对这些进行检查。这包含用于动员和获得活CD34+细胞的预治疗程序，以便：A.储存2×106个CD34+细胞/kg体重以在未移植的情况下用作备份，B.用EU/3/14/1130载体转导至少6×106个CD34+细胞/kg体重以生成药物产品并进行药物产品的释放所需的所有质量控制。只有在药物产品的释放之后可用的具有足够转导细胞(2×106个转导CD34+细胞/kg体重)的患者才会被纳入研究。
还将在此就诊中执行以下程序：
-相关医疗或外科手术病史的登记。
-人口统计学数据和临床上相关的体检结果的登记。
-相关伴随用药的登记。
-针对常规血细胞计数(CBC)、生物化学、凝血测定和血清学的外周血测试。
-超声波心动图、肺功能测试及胸部x射线。
-生活质量问卷(SF-36或PEDSQL)。
-PKD的基因诊断。
为了有资格参与研究，患者必须满足所有以下纳入标准且不满足排除标准。
纳入标准为：男性或女性患者、招募时年龄>2岁、愿意给予已签署的知情同意书(在18岁以下儿童的情况下，其将由其父母或法定代表人签署)、对基因检测证实的PKD的先前诊断、严重输血依赖性贫血症病史、对脾切除术不应答、自体造血干细胞移植的候选者、可获得≥2×106个转导CD34+细胞/kg体重以及在至少过去2年内在维护详细医疗记录(包含输血历史)的专门中心进行过治疗和随访。
排除标准为：对人免疫缺陷病毒1或2型(HIV 1和HIV 2)呈阳性、未修正的出血病症、存在导致溶血的其它原因、任何先前或当前恶性肿瘤或骨髓增殖性病症或免疫缺陷病症、直系亲属患有已知或疑似家族性癌症综合征(包含但不限于遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征、遗传性非息肉性结直肠癌综合征和家族性腺瘤性息肉病)、先前进行过同种异体移植的患者、存在供体源的残留细胞、医疗评估后被视为患有III/IV级心脏、肺、肝或肾功能异常的患者、不受控制的癫痫症、一氧化碳(DLco)的扩散能力<预测的(针对血红蛋白修正的)50％、根据研究者的见解保证排除的严重铁过载的任何其它证据、在筛选的30天内参与使用试验药物的另一项临床研究、可获得HLA配型相合供体进行同种异体骨髓移植、孕妇或母乳喂养妇女、根据调查员标准将不能理解研究目的、益处和风险和/或遵守研究程序的患者、根据成人中的Karnofsky指数≤80或儿童中的Lansky≤80证实的较差的功能状态。
研究的统计学分析将是描述性的。定性端点将用频率和百分比来描述。定性端点包含：不良事件、干细胞移植的患者的数量、成为“脱离输血”的患者的数量、贫血症在临床上显著减少的患者的数量、网织红细胞增多在临床上显著减少的患者的数量、具有干细胞移植的患者的数量(其中转导细胞的存在可以被检测到)和生活质量较由SF-36或PEDSQL问卷测量的基线的改善。定量端点将用平均值和标准偏差或中位数和四分位数来描述。定量端点包含：贫血症和网织红细胞增多较基线的减少、研究期内需要的输血次数相对于基线评估前最近1年的输血次数和外周血和骨髓中的载体拷贝数。所有端点将在研究结束时描述。
先前的工作证实了在移植了超过25％的基因修正细胞时针对PKD的HSC基因疗法在小鼠中的可行性。这些结果表明，需要大量的供体基因修正的HSC(Zaucha,Yu等人2001)和高水平的转基因表达来实现对PKD的治疗效果。我们已开发针对此临床试验提出的新的治疗性LV载体，其携带驱动PKLR cDNA的表达的hPGK真核启动子，所述hPGK真核启动子于2014年8月被指定为孤儿药(EU/3/14/1130)。在此载体的情况下，我们在疾病的小鼠模型中进行了针对PKD的临床前基因疗法方案。在基于临床标准的LV剂量的情况下，异位RPK表达能够使红系区室归一化，从而修正血液学表型并逆转器官病理学。代谢组学研究表明，对基因修正RBC中的糖酵解途径进行功能修正，而未在白细胞中观察到代谢紊乱。值得注意的是，并行分析的WBC示出，当在普遍存在的启动子(如PGK)的活性下对RPK进行异位表达时，白细胞中的代谢平衡没有变化，这排除了白细胞代谢优势可能的安全问题并且增强了EU/3/14/1130载体的治疗潜力。
由BM重新移植诱导的增殖性应激之后的二代接受者中的多谱系重构和任何白血病事件或克隆扩增的缺乏证实了基于PGK-coRPK LV载体的方案的长期稳定性和安全性。可能导致RPK转基因的更多生理学表达、已被证实是弱反式激活因子并且当前在针对异染性脑白质营养不良(MLD)的临床试验中使用的人PGK真核启动子的使用也可以解释整个程序的安全性。
为了通过载体IS的分析评估HSC基因疗法的长期安全性，使用下一代测序来预测HSC中的插入肿瘤形成的风险。将超过5,173,892序列读段映射在小鼠基因组上以形成总共2220个独特的载体IS，从而没有发现体内扩增的证据或对携带IS的克隆的选择。相反，我们的数据示出在小鼠中移植经过转导的HSC之后的克隆组合物和造血的动力学，从而表明HSC随时间推移的真正且稳定的基因体内修饰。总的来说，对载体整合模式的分析强调了在没有基因毒性的证据的情况下提供PKD基因修正的PGK-coRPK LV载体的安全性特性。
可以通过参考以下说明性条款来进一步定义本发明：
1.一种表达盒，其包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：
a)启动子序列；
b)对基因产物进行编码的序列；以及
c)核糖核酸(RNA)输出信号，
其中所述启动子序列与所述对基因产物进行编码的序列可操作地连接。
2.根据条款1所述的表达盒，其中所述启动子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
3.根据条款1或条款2所述的表达盒，其中所述基因产物是治疗性基因产物。
4.根据条款3所述的表达盒，其中所述治疗性基因产物是丙酮酸激酶(PK)多肽，任选地丙酮酸激酶、肝脏和红细胞(PKLR)多肽。
5.根据条款1到4中任一项所述的表达盒，其中所述对基因产物进行编码的序列是密码子优化的。
6.根据条款5所述的表达盒，其中所述密码子优化的序列包括与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的序列。
7.根据条款1到6中任一项所述的表达盒，其中所述RNA输出信号是突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件(wPRE)。
8.根据条款7所述的表达盒，其中所述突变的wPRE是包括与SEQ ID NO:24具有至少80％同一性的序列的嵌合wPRE。
9.根据条款1到8中任一项所述的表达盒，其进一步包括一个或多个增强子序列。
10.根据条款1到9中任一项所述的表达盒，其进一步包括聚嘌呤段(PPT)或聚腺苷酸化(polyA)信号序列。
11.根据条款1到10中任一项所述的表达盒，其进一步包括以下序列中的一个或多个：
i)包装信号序列；
ii)截短Gag序列；
iii)Rev应答元件(RRE)；
iv)中央聚嘌呤段(cPPT)；
v)中央末端序列(CTS)；以及
vi)上游序列元件(USE)，任选地来自猿猴病毒40(SV40-USE)。
12.根据条款1到11中任一项所述的表达盒，其进一步包括5'和3'长末端重复序列。
13.一种重组基因递送载体，其包括根据条款1到12中任一项所述的表达盒。
14.根据条款13所述的重组基因递送载体，其中所述重组基因递送载体是病毒或病毒载体。
15.根据条款14所述的重组基因递送载体，其中所述病毒或病毒载体是慢病毒(LV)。
16.一种细胞，其包括根据条款1到12中任一项所述的表达盒或根据条款13到15中任一项所述的重组基因递送载体。
17.根据条款16所述的细胞，其中所述细胞是造血干细胞。
18.根据条款16所述的细胞，其中所述细胞是定向造血红系祖细胞。
19.一种药物组合物，其包括药学上可接受的赋形剂和根据条款13到15中任一项所述的重组基因递送载体或根据条款16到18中任一项所述的细胞。
20.一种治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者提供根据条款19所述的药物组合物。
21.根据条款20所述的方法，其中所述疾病或病症是丙酮酸激酶缺乏症(PKD)，并且所述基因产物是丙酮酸激酶(PK)多肽，任选地丙酮酸激酶、肝脏和红细胞(PKLR)多肽。
22.根据条款20或条款21所述的方法，其中所述药物组合物包括所述重组基因递送载体。
23.根据条款20或条款21所述的方法，其中所述药物组合物包括所述细胞。
24.根据条款23所述的方法，其中所述细胞对所述受试者是自体的。
25.一种用于在红系细胞中表达转基因的方法，其包括使一种或多种红系细胞与有效量的重组病毒载体接触，其中所述载体包含人磷酸甘油酸激酶启动子、密码子优化的人丙酮酸激酶版本、肝脏和红细胞(PKLR)cDNA转基因和突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件，其中在所述接触后，PKLR在所述一种或多种红系细胞中以可检测的水平表达。
序列表
<110> Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y
Tecnologicas O.A, M.P.
Fundacion Instituto de Investigacion Sanitaria Fundacion
Jimenez Diaz
Centro de Investigacion Biomedica en Red
<120> 用于递送PKLR以治疗丙酮酸激酶缺乏症的慢病毒载体
<130> ROPA-004/01US 329592-2050
<150> US 62/573,037
<151> 2017-10-16
<160> 26
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Rev应答元件（RRE）
<400> 1
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234
<210> 2
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1包装信号（psi）
<400> 2
ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga 60
ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag 120
agcgtc 126
<210> 3
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1 5' LTR
<400> 3
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
a 181
<210> 4
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1自失活3' LTR
<400> 4
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234
<210> 5
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子
<400> 5
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 6
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1的中央聚嘌呤段和中央终止序列（cPPT/CTS）
<400> 6
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt 118
<210> 7
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人磷酸甘油酸激酶1（hPGK）启动子
<400> 7
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g 511
<210> 8
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 密码子优化的人PKLR cDNA版本（coRPK）
<400> 8
atgagcatcc aggaaaatat cagctctctg cagctgcggt cctgggtgtc caagagccag 60
agagacctgg ccaagagcat cctgatcgga gcccctggcg gaccagccgg atacctgaga 120
agggctagcg tggcccagct gacccaggaa ctgggcaccg cctttttcca gcagcagcag 180
ctgccagccg ccatggccga cacctttctg gaacacctgt gcctgctgga catcgactct 240
gagcccgtgg ccgccagaag caccagcatc attgccacca tcggccctgc cagcagaagc 300
gtggagcggc tgaaagagat gatcaaggcc ggcatgaata tcgcccggct gaacttctcc 360
cacggcagcc acgagtacca cgcagagagc attgccaacg tccgggaggc cgtggagagc 420
tttgccggca gccccctgag ctacagaccc gtggccattg ccctggacac caagggcccc 480
gagatcagaa caggaattct gcagggaggg cctgagagcg aggtggagct ggtgaagggc 540
agccaagtgc tggtgaccgt ggaccccgcc ttcagaacca gaggcaacgc caacacagtg 600
tgggtggact accccaacat cgtgcgggtg gtgcctgtgg gcggcagaat ctacatcgac 660
gacggcctga tcagcctggt ggtgcagaag atcggacctg agggcctggt gacccaggtc 720
gagaatggcg gcgtgctggg cagcagaaag ggcgtgaatc tgccaggcgc ccaggtggac 780
ctgcctggcc tgtctgagca ggacgtgaga gacctgagat ttggcgtgga gcacggcgtg 840
gacatcgtgt tcgccagctt cgtgcggaag gcctctgatg tggccgccgt gagagccgct 900
ctgggccctg aaggccacgg catcaagatc atcagcaaga tcgagaacca cgagggcgtg 960
aagcggttcg acgagatcct ggaagtgtcc gacggcatca tggtggccag aggcgacctg 1020
ggcatcgaga tccccgccga gaaggtgttc ctggcccaga aaatgatgat cggacggtgc 1080
aacctggccg gcaaacctgt ggtgtgcgcc acccagatgc tggaaagcat gatcaccaag 1140
cccagaccca ccagagccga gacaagcgac gtggccaacg ccgtgctgga tggcgctgac 1200
tgcatcatgc tgtccggcga gacagccaag ggcaacttcc ccgtggaggc cgtgaagatg 1260
cagcacgcca ttgccagaga agccgaggcc gccgtgtacc accggcagct gttcgaggaa 1320
ctgcggagag ccgcccctct gagcagagat cccaccgaag tgaccgccat cggagccgtg 1380
gaagccgcct tcaagtgctg cgccgctgca atcatcgtgc tgaccaccac aggcagaagc 1440
gcccagctgc tgtccagata cagacccaga gccgccgtga tcgccgtgac aagatccgcc 1500
caggccgcta gacaggtcca cctgtgcaga ggcgtgttcc ccctgctgta ccgggagcct 1560
cccgaggcca tctgggccga cgacgtggac agacgggtgc agttcggcat cgagagcggc 1620
aagctgcggg gcttcctgag agtgggcgac ctggtgatcg tggtgacagg ctggcggcct 1680
ggcagcggct acaccaacat catgagggtg ctgtccatca gctga 1725
<210> 9
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人CMV增强子
<400> 9
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg 380
<210> 10
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 猿猴病毒40 (SV40) poly(A)信号
<400> 10
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 11
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SV40复制起点
<400> 11
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60
tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120
ggcttttttg gaggcc 136
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 中央聚嘌呤段（cPPT）
<400> 12
tttaaaagaa aaggggggat tggggggt 28
<210> 13
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> dNEF信号序列
<400> 13
gaattcgagc tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 60
ctttttaaaa gaaaaggggg gac 83
<210> 14
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NeoR/KanR序列
<400> 14
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggcgg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gtccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gcgacgacgg gcgttccttg cgcggctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgtc tatgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccacggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cgtctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
cttgtgcttt acggtatcgc cgcgcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 15
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> rrnG终止子（来自大肠杆菌核糖体RNA rrnG操纵子的转录终止子）
<400> 15
gcattggcgc agaaaaaaat gcctgatgcg acgctgcgcg tcttatactc ccacatatgc 60
cagattcagc aacggatacg gcttccccaa cttgcccact tccatacgtg tcctccttac 120
cagaaattta tccttaa 137
<210> 16
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ori（高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点）
<400> 16
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAP结合位点序列
<400> 17
taatgtgagt tagctcactc at 22
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 大肠杆菌lac启动子
<400> 18
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g 31
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> lac操作子序列
<400> 19
ttgtgagcgg ataacaa 17
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T3启动子（噬菌体T3 RNA聚合酶的启动子）
<400> 20
aattaaccct cactaaagg 19
<210> 21
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CMV增强子
<400> 21
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg 380
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T7启动子（噬菌体T7 RNA聚合酶的启动子）
<400> 22
cctatagtga gtcgtatta 19
<210> 23
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> f1 ori（f1噬菌体复制起点）
<400> 23
acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 60
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 120
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 180
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 240
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 300
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 360
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 420
acgcgaatt 429
<210> 24
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合wPRE RNA输出信号
<400> 24
cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 60
tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 120
tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 180
ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 240
taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 300
tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 360
ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 420
cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 480
tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 540
aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 600
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 660
ggccgcctcc ccgcctg 677
<210> 25
<211> 9087
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 自限制慢病毒基因递送载体
<400> 25
gtgtttaaac ctagatattg atagtctgat cggtcaacgt ataatcgagt cctagctttt 60
gcaaacatct atcaagagac aggatcagca ggaggctttc gcatgattga acaagatgga 120
ttgcacgcag gttctccggc ggcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 180
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgtccggtt 240
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg 300
ctatcgtggc tggcgacgac gggcgttcct tgcgcggctg tgctcgacgt tgtcactgaa 360
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 420
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 480
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 540
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 600
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg tctatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 660
acccacggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 720
atcgactgtg gccgtctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 780
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tccttgtgct ttacggtatc 840
gccgcgcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaccg 900
attctaggtg cattggcgca gaaaaaaatg cctgatgcga cgctgcgcgt cttatactcc 960
cacatatgcc agattcagca acggatacgg cttccccaac ttgcccactt ccatacgtgt 1020
cctccttacc agaaatttat ccttaacgat cggacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 1080
cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 1140
caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 1200
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 1260
cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 1320
cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 1380
gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 1440
aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 1500
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 1560
tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 1620
acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 1680
ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1740
ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 1800
tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1860
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1920
ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 1980
gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 2040
cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 2100
gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 2160
agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac 2220
tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 2280
aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag 2340
ctggagctgc aagcttggcc attgcatacg ttgtatccat atcataatat gtacatttat 2400
attggctcat gtccaacatt accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 2460
taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 2520
acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 2580
acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 2640
ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 2700
attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 2760
gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 2820
ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 2880
caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 2940
tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 3000
tatataagca gagctcgttt agtgaaccgg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 3060
gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 3120
tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 3180
ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa 3240
agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag 3300
aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga 3360
gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa 3420
aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag 3480
cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag 3540
acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt 3600
atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa 3660
ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaccaccg cacagcaagc 3720
ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat 3780
ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa 3840
gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg 3900
gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat 3960
tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc 4020
atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg 4080
aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt 4140
gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga 4200
atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact 4260
ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag 4320
ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat 4380
tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta 4440
tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc 4500
cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca 4560
gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt aacttttaaa agaaaagggg 4620
ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa 4680
ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt tatcgatcac gagactagcc 4740
tcgagaagct tgatatcgaa ttccacgggg ttggggttgc gccttttcca aggcagccct 4800
gggtttgcgc agggacgcgg ctgctctggg cgtggttccg ggaaacgcag cggcgccgac 4860
cctgggtctc gcacattctt cacgtccgtt cgcagcgtca cccggatctt cgccgctacc 4920
cttgtgggcc ccccggcgac gcttcctgct ccgcccctaa gtcgggaagg ttccttgcgg 4980
ttcgcggcgt gccggacgtg acaaacggaa gccgcacgtc tcactagtac cctcgcagac 5040
ggacagcgcc agggagcaat ggcagcgcgc cgaccgcgat gggctgtggc caatagcggc 5100
tgctcagcag ggcgcgccga gagcagcggc cgggaagggg cggtgcggga ggcggggtgt 5160
ggggcggtag tgtgggccct gttcctgccc gcgcggtgtt ccgcattctg caagcctccg 5220
gagcgcacgt cggcagtcgg ctccctcgtt gaccgaatca ccgacctctc tccccagggg 5280
gatccgtcga caccggtgcc accatgagca tccaggaaaa tatcagctct ctgcagctgc 5340
ggtcctgggt gtccaagagc cagagagacc tggccaagag catcctgatc ggagcccctg 5400
gcggaccagc cggatacctg agaagggcta gcgtggccca gctgacccag gaactgggca 5460
ccgccttttt ccagcagcag cagctgccag ccgccatggc cgacaccttt ctggaacacc 5520
tgtgcctgct ggacatcgac tctgagcccg tggccgccag aagcaccagc atcattgcca 5580
ccatcggccc tgccagcaga agcgtggagc ggctgaaaga gatgatcaag gccggcatga 5640
atatcgcccg gctgaacttc tcccacggca gccacgagta ccacgcagag agcattgcca 5700
acgtccggga ggccgtggag agctttgccg gcagccccct gagctacaga cccgtggcca 5760
ttgccctgga caccaagggc cccgagatca gaacaggaat tctgcaggga gggcctgaga 5820
gcgaggtgga gctggtgaag ggcagccaag tgctggtgac cgtggacccc gccttcagaa 5880
ccagaggcaa cgccaacaca gtgtgggtgg actaccccaa catcgtgcgg gtggtgcctg 5940
tgggcggcag aatctacatc gacgacggcc tgatcagcct ggtggtgcag aagatcggac 6000
ctgagggcct ggtgacccag gtcgagaatg gcggcgtgct gggcagcaga aagggcgtga 6060
atctgccagg cgcccaggtg gacctgcctg gcctgtctga gcaggacgtg agagacctga 6120
gatttggcgt ggagcacggc gtggacatcg tgttcgccag cttcgtgcgg aaggcctctg 6180
atgtggccgc cgtgagagcc gctctgggcc ctgaaggcca cggcatcaag atcatcagca 6240
agatcgagaa ccacgagggc gtgaagcggt tcgacgagat cctggaagtg tccgacggca 6300
tcatggtggc cagaggcgac ctgggcatcg agatccccgc cgagaaggtg ttcctggccc 6360
agaaaatgat gatcggacgg tgcaacctgg ccggcaaacc tgtggtgtgc gccacccaga 6420
tgctggaaag catgatcacc aagcccagac ccaccagagc cgagacaagc gacgtggcca 6480
acgccgtgct ggatggcgct gactgcatca tgctgtccgg cgagacagcc aagggcaact 6540
tccccgtgga ggccgtgaag atgcagcacg ccattgccag agaagccgag gccgccgtgt 6600
accaccggca gctgttcgag gaactgcgga gagccgcccc tctgagcaga gatcccaccg 6660
aagtgaccgc catcggagcc gtggaagccg ccttcaagtg ctgcgccgct gcaatcatcg 6720
tgctgaccac cacaggcaga agcgcccagc tgctgtccag atacagaccc agagccgccg 6780
tgatcgccgt gacaagatcc gcccaggccg ctagacaggt ccacctgtgc agaggcgtgt 6840
tccccctgct gtaccgggag cctcccgagg ccatctgggc cgacgacgtg gacagacggg 6900
tgcagttcgg catcgagagc ggcaagctgc ggggcttcct gagagtgggc gacctggtga 6960
tcgtggtgac aggctggcgg cctggcagcg gctacaccaa catcatgagg gtgctgtcca 7020
tcagctgacc gcggtctaga ggatcccccg ggctgcagga attcgagcat cttaccgcca 7080
tttattccca tatttgttct gtttttcttg atttgggtat acatttaaat gttaataaaa 7140
caaaatggtg gggcaatcat ttacattttt agggatatgt aattactagt tcaggtgtat 7200
tgccacaaga caaacatgtt aagaaacttt cccgttattt acgctctgtt cctgttaatc 7260
aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactgatat tcttaactat gttgctcctt 7320
ttacgctgtg tggatatgct gctttaatgc ctctgtatca tgctattgct tcccgtacgg 7380
ctttcgtttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 7440
ccgttgtccg tcaacgtggc gtggtgtgct ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggct 7500
ggggcattgc caccacctgt caactccttt ctgggacttt cgctttcccc ctcccgatcg 7560
ccacggcaga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct aggttgctgg 7620
gcactgataa ttccgtggtg ttgtcgggga agggcctgct gccggctctg cggcctcttc 7680
cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg 7740
gaattcgagc tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca 7800
ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct 7860
gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 7920
ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt 7980
gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt 8040
gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc 8100
aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 8160
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 8220
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta 8280
actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 8340
ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag 8400
tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggg acgtacccaa ttcgccctat agtgagtcgt 8460
attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 8520
cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 8580
cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct 8640
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 8700
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 8760
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 8820
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 8880
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 8940
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 9000
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 9060
ttaacaaaat cgttccctca ggacgtc 9087
<210> 26
<211> 2890
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PKD表达盒序列(5`-3`)
<400> 26
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccg tcgacaccgg tgccaccatg 540
agcatccagg aaaatatcag ctctctgcag ctgcggtcct gggtgtccaa gagccagaga 600
gacctggcca agagcatcct gatcggagcc cctggcggac cagccggata cctgagaagg 660
gctagcgtgg cccagctgac ccaggaactg ggcaccgcct ttttccagca gcagcagctg 720
ccagccgcca tggccgacac ctttctggaa cacctgtgcc tgctggacat cgactctgag 780
cccgtggccg ccagaagcac cagcatcatt gccaccatcg gccctgccag cagaagcgtg 840
gagcggctga aagagatgat caaggccggc atgaatatcg cccggctgaa cttctcccac 900
ggcagccacg agtaccacgc agagagcatt gccaacgtcc gggaggccgt ggagagcttt 960
gccggcagcc ccctgagcta cagacccgtg gccattgccc tggacaccaa gggccccgag 1020
atcagaacag gaattctgca gggagggcct gagagcgagg tggagctggt gaagggcagc 1080
caagtgctgg tgaccgtgga ccccgccttc agaaccagag gcaacgccaa cacagtgtgg 1140
gtggactacc ccaacatcgt gcgggtggtg cctgtgggcg gcagaatcta catcgacgac 1200
ggcctgatca gcctggtggt gcagaagatc ggacctgagg gcctggtgac ccaggtcgag 1260
aatggcggcg tgctgggcag cagaaagggc gtgaatctgc caggcgccca ggtggacctg 1320
cctggcctgt ctgagcagga cgtgagagac ctgagatttg gcgtggagca cggcgtggac 1380
atcgtgttcg ccagcttcgt gcggaaggcc tctgatgtgg ccgccgtgag agccgctctg 1440
ggccctgaag gccacggcat caagatcatc agcaagatcg agaaccacga gggcgtgaag 1500
cggttcgacg agatcctgga agtgtccgac ggcatcatgg tggccagagg cgacctgggc 1560
atcgagatcc ccgccgagaa ggtgttcctg gcccagaaaa tgatgatcgg acggtgcaac 1620
ctggccggca aacctgtggt gtgcgccacc cagatgctgg aaagcatgat caccaagccc 1680
agacccacca gagccgagac aagcgacgtg gccaacgccg tgctggatgg cgctgactgc 1740
atcatgctgt ccggcgagac agccaagggc aacttccccg tggaggccgt gaagatgcag 1800
cacgccattg ccagagaagc cgaggccgcc gtgtaccacc ggcagctgtt cgaggaactg 1860
cggagagccg cccctctgag cagagatccc accgaagtga ccgccatcgg agccgtggaa 1920
gccgccttca agtgctgcgc cgctgcaatc atcgtgctga ccaccacagg cagaagcgcc 1980
cagctgctgt ccagatacag acccagagcc gccgtgatcg ccgtgacaag atccgcccag 2040
gccgctagac aggtccacct gtgcagaggc gtgttccccc tgctgtaccg ggagcctccc 2100
gaggccatct gggccgacga cgtggacaga cgggtgcagt tcggcatcga gagcggcaag 2160
ctgcggggct tcctgagagt gggcgacctg gtgatcgtgg tgacaggctg gcggcctggc 2220
agcggctaca ccaacatcat gagggtgctg tccatcagct gaccgcggtc tagaggatcc 2280
cccgggctgc aggaattcga gcatcttacc gccatttatt cccatatttg ttctgttttt 2340
cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat ggtggggcaa tcatttacat 2400
ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac aagacaaaca tgttaagaaa 2460
ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 2520
agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta 2580
atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa 2640
tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg 2700
tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc 2760
ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc 2820
cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg 2880
gggaagggcc 2890

Claims (21)

1.一种用于丙酮酸激酶缺乏症的表达盒，所述表达盒包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：
a）启动子序列；
b）对人PKLR基因产物进行编码的密码子优化的序列；和
c）对突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件进行编码的序列；
其中所述启动子序列与所述对人PKLR基因产物进行编码的密码子优化的序列可操作地连接，
其中所述对人PKLR基因产物进行编码的密码子优化的序列如SEQ ID NO: 8所示，并且
其中所述对突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件进行编码的序列如SEQ ID NO:24所示。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述启动子是磷酸甘油酸激酶启动子。
3.根据权利要求1所述的表达盒，其进一步包括聚嘌呤段。
4.根据权利要求1所述的表达盒，其进一步包括聚腺苷酸化信号序列。
5.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒的序列如SEQ ID NO: 26所示。
6.一种重组基因递送载体，其包括根据权利要求1到5中任一项所述的表达盒，其中所述重组基因递送载体是慢病毒载体。
7.根据权利要求6所述的重组基因递送载体，其按5'到3'顺序包括以下序列：
a）5' LTR，任选地经过修饰的5' LTR；
b）HIV-1 ψ序列；
c）RRE；
d）cPPT/CTS序列；
e）PGK启动子序列；
f）对人PKLR基因产物进行编码的密码子优化的序列，所述对人PKLR基因产物进行编码的密码子优化的序列如SEQ ID NO: 8所示；
g）突变wPRE序列，所述突变wPRE序列如SEQ ID NO: 24所示；以及
i）经过修饰的3' LTR。
8.根据权利要求7所述的重组基因递送载体，其中所述重组基因递送载体是治疗性基因递送载体。
9.根据权利要求8所述的重组基因递送载体，其中所述重组基因递送载体能够在临床应用中实现长期稳定性和安全性。
10.根据权利要求7所述的重组基因递送载体，其中所述PGK启动子是人PGK启动子。
11.一种细胞，其包括根据权利要求1到5中任一项所述的表达盒。
12.一种细胞，其包括根据权利要求6所述的重组基因递送载体。
13.根据权利要求11所述的细胞，其中所述细胞是造血干细胞。
14.根据权利要求13所述的细胞，其中所述细胞是定向造血红系祖细胞。
15.一种药物组合物，其包括药学上可接受的赋形剂和根据权利要求6所述的重组基因递送载体。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求11所述的细胞。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗或预防丙酮酸激酶缺乏症的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物组合物包括所述重组基因递送载体。
19.根据权利要求17所述的用途，其中所述药物组合物包括所述细胞。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述细胞对受试者是自体的。
21.一种用于在红系细胞中表达人PKLR基因的体外或离体方法，其包括使一种或多种红系细胞与有效量的重组病毒载体接触，其中所述载体包括人磷酸甘油酸激酶启动子、密码子优化的PKLR转基因和突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件，其中所述密码子优化的PKLR转基因的序列如SEQ ID NO: 8所示，其中所述突变的土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件的序列如SEQ ID NO: 24所示，并且其中在所述接触之后，PKLR在所述一种或多种红系细胞中以可检测的水平表达。
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