CN111166877A

CN111166877A - 一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN111166877A
Application number: CN201911397005.1A
Authority: CN
Inventors: 赵军; 张泓喆; 常祎; 张华平; 王宇学; 李翠
Original assignee: Xian Huitian Blood Products Co Ltd
Current assignee: Xian Huitian Blood Products Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-05-19

Abstract

本发明公开了一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，经过低温乙醇法分离提取免疫球蛋白、再经Capto DEAE离子交换层析纯化、超滤、巴氏灭活、深层过滤、低pH孵放灭活病毒后，配制分装成狂犬病人免疫球蛋白。本发明在保证产品质量和病毒安全性的同时简化生产流程，降低了生产成本，提高了产品收率。

Description

一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法。

背景技术

狂犬病是一种典型的人畜共患病，是由狂犬病病毒感染所致的自然疫源性或动物源性传染病，其临床特征为脑炎、脊椎炎，表现为兴奋、恐水、怕风、怕声响、咽肌痉挛及进行性瘫痪等，死亡率几乎100％。据世界卫生组织统计，我国和东南亚等地区是狂犬病高发地区。

目前对于狂犬病的治疗尚无特效药，临床曾应用多种抗病毒药物及免疫增强剂均未获得显著疗效，发病后仍以对症综合治疗为主。尽管狂犬病致死率极高，但采取有效的方法还是能够起到关键作用。目前主要的治疗方法为接种狂犬病疫苗辅助注射被动免疫制剂。注射疫苗至伤者产生抗体需要14— 40天时间(称窗口期)，一旦在产生抗体前发病，将使患者处于极其危险的境地。因此，在未产生中和抗体或者抗体效价未达到抵御病毒侵袭水平的这一时间间隙，需要被动免疫来补充。

被动免疫制剂主要有马抗狂犬病血清(ERIG)和狂犬病人免疫球蛋白 (HRIG)。ERIG为异源性蛋白，使用时易发生不良反应，且须作皮试，操作麻烦，对皮试的结果判断又存在人为误差；HRIG是一种高效价特异性免疫球蛋白被动免疫制剂，为人源性蛋白，不含异体蛋白，不会引起过敏性休克反应，且避免了异源性血清的不良反应。使用HRIG不需作皮试，安全方便，不良反应少，无禁忌症，效果好，且能够增强局部伤口免疫力，减轻伤口感染程度，促进伤口愈合。

国内狂犬病人免疫球蛋白的产量有限，致使狂犬病人免疫球蛋白一直处于供不应求状态，无法满足患者的用药需求。因此，对于治疗狂犬病的特效药狂犬病人免疫球蛋白的研究及制备很有必要。

现有技术中，中国专利CN201410454232.4公开了一种狂犬病人免疫球蛋白制备工艺，所述方法为检疫期合格的免疫血浆，经离心、分离组分I、组分II+III、精制组分II+III、去除组分III、Sapharose FF离子交换层析法纯化、超滤、低pH孵放灭活病毒处理、DV50膜过滤除病毒等工序获得狂犬病人免疫球蛋白，制备分离过程较复杂。组分I、II、III、IV、V是上世纪四五十年代低温乙醇法(Cohn法)提出，每个组分都是由多种蛋白质成分组成的，属血液制品专用名词。

中国专利CN200710114839.8公开了高纯度狂犬病人免疫球蛋白及其原料生产方法，采用串联的Q-Sapharose FF、DEAE Sapharose FF强/弱阴离子交换层析法纯化产品，生产成本较高，同时产品从低温乙醇法组分III中分离，收率较低；又有中国专利CN200910088039公开了一种狂犬病、破伤风双效价人免疫球蛋白及其制备方法以及其在制药物中的应用，所用产品辅料为葡萄糖，患者用药时代谢压力较大。此外，现有技术中的病毒灭活方法一般为低pH孵放灭活病毒法加DV50膜过滤除病毒法，其中DV50膜孔径较大(50nm)，不能有效地去除制品中的细小病毒如B19，同时纳米膜成本极高，且受过滤条件的限制，药液的微小变化可能引起操作过程的较大变化，稳定性和重现性差。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，在保证产品品质的基础上提高产品收率，降低成本。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，包括以下操作：

1)原料处理：

将冷冻的袋装含狂犬病免疫球蛋白的原料血浆破袋混和，混合血浆狂犬病抗体效价≥10IU/ml，混合后加入生理盐水稀释；

2)分离组分I+II+III：

混合血浆被稀释后调节pH至5.8～6.1，然后加入乙醇至体积浓度 19～21％，再加入助滤剂，于温度-8～-3℃下压滤得组分I+II+III，压滤压力不高于0.5MPa；

3)组分Ⅰ+Ⅲ的分离：

将组分I+II+III用10～16倍体积的注射用水溶解，调整pH至4.9～5.3，调整乙醇最终浓度15±1％，控制温度在-4±1℃，搅拌1h以上后静置；加入助滤剂，压滤分离组分I+III，取上清液用于制作组分Ⅱ；

4)组分Ⅱ的制作：

调整上清液pH值至7.00～7.40，调整乙醇浓度25±1％，制品最终温度控制在-11±1℃，加入助滤剂，压滤组分Ⅱ沉淀；

5)组分Ⅱ精制：

用6～10倍注射用水的将组分Ⅱ沉淀溶解，控制温度1-5℃，完全溶解后调pH至6.5～7.2，调整电导率至1.0～1.8ms/cm，搅拌1h以上后静置；

溶解液用滤板深层过滤，维持过滤压力不高于0.2MPa，出液温度小于 5℃；

6)离子交换层析纯化：

深层过滤澄清后的滤液进行Capto DEAE离子交换层析柱进行纯化，用醋酸-氯化钠混合溶液洗脱，收集洗脱后的流穿液；

7)透析、灭活：

用6～10倍体积的注射用水透析流穿液，调整pH至4.8～5.2，控制蛋白质含量15～30g/L，添加山梨醇320～340g/L作为保护剂，于60±0.5℃保温10h 进行巴氏灭活；

8)低pH孵放：

巴氏灭活后超滤去除山梨醇，调整pH至3.80～4.40，控制蛋白质浓度50 ±2g/L，添加麦芽糖至95～105g/L，然后用0.22μm滤芯进行除菌过滤；

除菌过滤后于进行低pH孵放，控制温度在23～25℃，放置21天，进行二次病毒灭活，孵放结束将制品降温至2～8℃。

9)分装制剂：

超滤去除麦芽糖，调整pH值至6.4～7.2，超滤浓缩制品至狂犬病抗体效价应不低于120IU/ml，添加甘氨酸至20～30g/L，控制蛋白质浓度≤140g/L；经除菌过滤后分装。

所述的助滤剂为硅藻土和/或珍珠岩，硅藻土和珍珠岩混合时的质量比为 1:0.5～1.5。

所述组分Ⅰ+Ⅲ的分离时用pH4.0的醋酸缓冲液调整pH至4.9～5.3。

所述组分Ⅱ精制时用碳酸氢钠溶液调pH至6.5～7.2，用氯化钠溶液调整电导率至1.0～1.8ms/cm。

所述离子交换层析纯化时，醋酸-氯化钠混合溶液中醋酸的浓度为0.4～ 0.8mol/L，氯化钠的浓度为0.5～0.6mol/L，线性速度流速为60-150cm³/h，洗脱3倍柱体积的醋酸-氯化钠混合溶液。

所述在透析、灭活时，用0.1mol/L的盐酸调整pH至4.8～5.2，控制蛋白质含量时先浓缩出浓溶液，再用水和山梨醇调整蛋白质浓度。

所述低pH孵放时，用0.1mol/L的盐酸调整pH至3.80～4.40。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，采用更简便的低温乙醇法分级分离，对组分II进行纯化可获得IgG纯度在98％以上的中间品，产品收率高；采用CaptoDEAE离子交换层析去除IgA、IgM、白蛋白等杂蛋白，进一步提高产品纯度；而病毒灭活工艺采用巴氏灭活，在保证灭活病毒效果的同时可促进部分杂蛋白变性，通过后续深滤工艺进一步纯化制品减少蛋白质杂质；再采用低pH孵放法(pH4.1±0.3，23～25℃孵育放置21天)二次灭活病毒；因没有采用50纳米的纳米膜过滤，生产成本明显降低。本发明在保证产品质量和病毒安全性的同时简化生产流程，降低了生产成本，提高了产品收率。

附图说明

图1为本发明的工艺流程示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明采用经狂犬病免疫的合格人血浆，经过低温乙醇法分离提取免疫球蛋白、再经Capto DEAE离子交换层析纯化、超滤、巴氏灭活、深层过滤、低pH孵放灭活病毒后，配制分装成狂犬病人免疫球蛋白。

在此过程中，采用低温乙醇法分离出IgG纯度98％以上的免疫球蛋白中间品；采用Capto DEAE离子交换层析去除IgA、IgM、白蛋白等杂蛋白，进一步提高产品纯度；采用巴氏灭活法灭活病毒，随后深层过滤进一步减少蛋白质杂质，再采用低pH孵放法(pH4.1±0.3，23～25℃孵育放置21天)二次灭活病毒。

本发明在保证产品质量和病毒安全性的同时简化生产流程，降低了生产成本，提高了产品收率。

参见图1，本发明的方法包括以下步骤：

1、一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，包括以下操作：

1)将冷冻的袋装含狂犬病免疫球蛋白的原料血浆破袋混和，混合血浆狂犬病抗体效价≥10IU/ml，混合后加入生理盐水稀释；

2)分离组分I+II+III：pH5.9±0.1、加入95％的乙醇，至乙醇体积浓度 19-21％、温度-5±1℃，加入助滤剂(硅藻土、珍珠岩)，压滤(压力不高于0.5MPa)得组分I+II+III。

3)组分Ⅰ+Ⅲ的制作与分离：将I+II+III用10～16倍的注射用水溶解，调整pH(用pH4.0的醋酸缓冲液来调整)至4.9～5.3，调整乙醇最终浓度15 ±1％，控制温度在-4±1℃，搅拌1小时以上后静置；加入助滤剂，压滤分离组分I+III，取上清液用于制作组分Ⅱ；

低温乙醇法是利用蛋白质在溶液中，因不同溶剂、温度、离子强度、pH 值条件下溶解度的变化，通过物理方法分离不同种类的蛋白质，其中组分II 是富集丙种球蛋白的产物，即含有目标产品的组分)

4)组分Ⅱ的制作与分离：调整上清液pH值至7.00～7.40，调整乙醇浓度25±1％，制品最终温度控制在-11±1℃，加入助滤剂，压滤组分Ⅱ沉淀；

5)组分Ⅱ精制：用6～10倍注射用水的将组分Ⅱ沉淀溶解，控制温度 1-5℃，完全溶解后调pH6.5～7.2(用碳酸氢钠溶液来调整)，调整(用氯化钠溶液来调整)电导率至1.0～1.8ms/cm(用于杂质的析出)，搅拌1小时以上后静置；

溶解液深层过滤(用滤板过滤)，压滤过程维持过滤压力不高于0.2MPa，出液温度小于5℃；

6)深层过滤后的滤液的澄清药液进行Capto DEAE离子交换层析纯化，用醋酸-氯化钠混合溶液洗脱，收集洗脱后的流穿液；其中，醋酸-氯化钠混合溶液中醋酸的浓度为0.4～0.8mol/L，氯化钠的浓度为0.5～0.6mol/L，线性速度流速为60-150cm³/h，洗脱3倍柱体积的醋酸-氯化钠混合溶液；

该层析过程中，杂质吸附于凝胶，未被凝胶吸附的蛋白质才是目标物质，因此上样后流穿层析柱的药液被收集起来，上样结束后收集到的流穿液即为目标物，洗脱的物质为杂质，收集流穿液；

7)用6～10倍的注射用水进行透析流穿液，调整pH4.8～5.2(用盐酸 0.1mol/L来调整)，控制蛋白质含量15～30g/L(先浓缩出浓溶液，再加水、加山梨醇调整)，添加山梨醇320～340g/L作为保护剂，60±0.5℃保温10h(即巴氏灭活)后进行深层过滤(用滤板过滤)。

8)超滤去除山梨醇，调整pH值3.80～4.40(用盐酸0.1mol/L来调整)，控制蛋白质浓度50±2g/L(先浓缩出浓溶液，再加水调整)，添加麦芽糖至 95～105g/L；

用0.22μm滤芯进行除菌过滤后开始低pH孵放(pH是3.80～4.40)，控制温度在23～25℃，放置21天灭活病毒(目标蛋白在该条件下不会变性)；孵放结束将制品降温至2～8℃。

所谓低pH孵放灭活病毒方法，即控制蛋白含量、保护剂(麦芽糖)含量和药液pH值在规定的范围内，控制温度在24±1℃的条件下，放置21天。，

9)超滤去除麦芽糖，调整pH值至6.4～7.2，超滤浓缩制品至狂犬病抗体效价应不低于120IU/ml，添加20～30g/L甘氨酸，控制蛋白质浓度≤140g/L。

10)将配制好的药液经除菌过滤后，分装为成品。

下面给出具体的实施例。

一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，包括以下操作：

1、获取用于生产狂犬病人免疫球蛋白所用的原料血浆，将冷冻血浆破袋混和，温度控制在0～5℃，混合血浆狂犬病抗体效价≥10IU/ml，混合后加入适量生理盐水稀释。

2、分离组分I+II+III：pH5.9±0.1、加入95％的乙醇至乙醇浓度19-21％、温度-5±1℃，加入助滤剂，压滤得组分I+II+III。

3、组分Ⅰ+Ⅲ的制作与分离：将组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ用10～16倍的注射用水溶解，调整pH4.9～5.3，调整乙醇最终浓度15±1％，控制温度在-4±1℃，搅拌一段时间后静置；加入助滤剂，压滤分离组分I+III，取上清液用于制作组分Ⅱ。

低温乙醇法是利用蛋白质在溶液中，因不同溶剂、温度、离子强度、pH 值条件下溶解度的变化，通过物理方法分离不同种类的蛋白质，其中组分II 是富集丙种球蛋白的产物，即含有目标产品的组分。

4、组分Ⅱ的制作与分离：调整上清液pH值至7.00～7.40，调整乙醇浓度25±1％，制品最终温度控制在-11±1℃，加入助滤剂，压滤组分Ⅱ沉淀。

5、组分Ⅱ精制：用6～10倍注射用水的将组分Ⅱ沉淀溶解，控制温度 1-5℃，完全溶解后调pH6.5～7.2，调整电导率至1.0～1.8ms/cm(为了让部分杂质析出)，搅拌一段时间后静置。溶解液深层过滤，压滤过程维持过滤压力不高于0.2MPa，出液温度小于5℃。

6、澄清后的药液进行Capto DEAE离子交换层析纯化，收集流穿液。

该层析过程中，杂质吸附于凝胶，未被凝胶吸附的蛋白质是目标物质，因此上样后流穿层析柱的药液被收集起来，上样结束后收集到的流穿液即为目标；

7、用6～10倍的注射用水进行透析，调整pH4.8～5.2，控制蛋白质含量 15～30g/L，添加山梨醇320～340g/L作为保护剂，60±0.5℃保温10h后进行深层过滤。

8、超滤去除山梨醇，调整pH值3.80～4.40，控制蛋白质浓度50±2g/L，添加麦芽糖95～105g/L。

9、用0.22μm滤芯进行除菌过滤后开始低pH孵放，控制温度在23～25℃，放置21天灭活病毒，孵放结束将制品降温至2～8℃。低pH孵放灭活病毒方法，即控制蛋白含量、保护剂(麦芽糖)含量和药液pH值在规定的范围内，控制温度在24±1℃的条件下，放置21天；该方法是血液行业已经证实安全有效的方法。

10、超滤去除麦芽糖，调整pH值至6.4～7.2，浓缩制品至狂犬病抗体效价应不低于120IU/ml，添加20～30g/L甘氨酸，控制蛋白质浓度≤140g/L。

11、将配制好的药液经除菌过滤后，分装为成品。

下面给出本发明的产品产率、抗体效价的检测结果

三批规格为200IU/瓶的狂犬病人免疫球蛋白产品(说明：装量为2.0ml) 的产率(每吨血浆对应的产品瓶数)及狂犬病抗体效价检测结果如下

批号	产率	狂犬病抗体效价
			20170501	21680瓶/吨血浆	134IU/ml
20170602	21856瓶/吨血浆	122IU/ml
			20170703	19817瓶/吨血浆	134IU/ml

综上，本发明在保证产品质量和病毒安全性的同时简化生产流程，降低了生产成本，提高了产品收率。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

1)原料处理：

2)分离组分I+II+III：

混合血浆被稀释后调节pH至5.8～6.1，然后加入乙醇至体积浓度19～21％，再加入助滤剂，于温度-8～-3℃下压滤得组分I+II+III，压滤压力不高于0.5MPa；

3)组分Ⅰ+Ⅲ的分离：

4)组分Ⅱ的制作：

5)组分Ⅱ精制：

溶解液用滤板深层过滤，维持过滤压力不高于0.2MPa，出液温度小于5℃；

6)离子交换层析纯化：

7)透析、灭活：

用6～10倍体积的注射用水透析流穿液，调整pH至4.8～5.2，控制蛋白质含量15～30g/L，添加山梨醇320～340g/L作为保护剂，于60±0.5℃保温10h进行巴氏灭活；

8)低pH孵放：

巴氏灭活后超滤去除山梨醇，调整pH至3.80～4.40，控制蛋白质浓度50±2g/L，添加麦芽糖至95～105g/L，然后用0.22μm滤芯进行除菌过滤；

9)分装制剂：

2.如权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述的助滤剂为硅藻土和/或珍珠岩，硅藻土和珍珠岩混合时的质量比为1:0.5～1.5。

3.如权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，组分Ⅰ+Ⅲ的分离时用pH4.0的醋酸缓冲液调整pH至4.9～5.3。

4.如权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，组分Ⅱ精制时用碳酸氢钠溶液调pH至6.5～7.2，用氯化钠溶液调整电导率至1.0～1.8ms/cm。

5.如权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，离子交换层析纯化时，醋酸-氯化钠混合溶液中醋酸的浓度为0.4～0.8mol/L，氯化钠的浓度为0.5～0.6mol/L，线性速度流速为60-150cm³/h，洗脱3倍柱体积的醋酸-氯化钠混合溶液。

6.如权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，在透析、灭活时，用0.1mol/L的盐酸调整pH至4.8～5.2，控制蛋白质含量时先浓缩出浓溶液，再用水和山梨醇调整蛋白质浓度。

7.如权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，低pH孵放时，用0.1mol/L的盐酸调整pH至3.80～4.40。