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CN101161232A - 静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法 - Google Patents

静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法 Download PDF

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CN101161232A
CN101161232A CNA2007101446344A CN200710144634A CN101161232A CN 101161232 A CN101161232 A CN 101161232A CN A2007101446344 A CNA2007101446344 A CN A2007101446344A CN 200710144634 A CN200710144634 A CN 200710144634A CN 101161232 A CN101161232 A CN 101161232A
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Abstract

本发明是从经乙肝疫苗免疫的献血员的血浆中分离的一种含有高活性抗乙肝病毒抗体的药物。具体为静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法。其特点是：经过融化血浆、pH调节、20％－25％乙醇反应、压滤、沉淀的溶解、调节pH值、乙醇反应、压滤、调节pH值、25％－28％乙醇反应、压滤、沉淀溶解、调节pH、层析、超滤、分装、低pH病毒灭活、纳米膜过滤除病毒、分装、成品检定合格后包装。二十二个步骤实现人抗体免疫球蛋白纯度可达98％以上，杂质更少，副反应更低。此工艺条件温和，对产品没有损伤，而且病毒灭活效果好，优于其他单位采用的巴氏灭活法或单一的低pH孵育法。本发明采用的是一种低温乙醇分离法与层析法和超滤法相结合的方法，使生产成本大大降低。

Description

静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法
技术领域：本发明是从经乙肝疫苗免疫的献血员的血浆中分离的一种含有高活性抗乙肝病毒抗体的药物。具体为静脉注射乙型肝炎免疫球蛋白制备方法。
背景技术：“静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白”这一药物由于含有高活性的抗乙肝病毒抗体，临床上是一种专门针对乙肝的治疗药品，在国内还没有生产，目前国内市场上仅有一种供肌肉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白，该类产品有两方面缺点：一方面活性低-只有100、200、400IU/只，另一方面其纯度低-人抗体免疫球蛋白的纯度只有90％，杂质含量高而不能用于静脉注射用，由于以上缺点这种肌肉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白主要用于乙肝的预防上，因此国内市场上就需要一种纯度更高的可以进行静脉注射的高活性的人乙型肝炎免疫球蛋白制剂，目前多家生产和研发单位都在进行工艺开发，开发的重点和难点主要集中在：
1、如何提高产品的纯度和活性，产品纯度的提高意味着杂质更少，临床副反应也就更少。
2、选择合适的保护剂，使产品具有更长的稳定期。
3、选择合适的病毒灭活方法，充分保证产品的生物安全性
目前，根据国家药典要求，免疫球蛋白类药品中人抗体免疫球蛋白纯度达到95％就满足静脉注射要求。
在国际上血液制品的生产研发主要集中在欧洲、美国、日本等发达国家，“静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白”作为一种血液制品，上市的产品多采用全层析的方法进行生产，如美国百特和纽约血液中心，即用层析的方法直接从血浆中分离，此方法的缺点是生产成本高。
发明内容：本发明的目的在于提供一种成本低廉、人抗体免疫球蛋白纯度可达98％以上的静脉注射乙型肝炎免疫球蛋白制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
第一步、融化血浆：将抗-HBs抗体效价≥8IU/ml的原料血浆经75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1.0℃～3.0℃之间；
第二步、pH调节：用pH4.0醋酸缓冲液加入到血浆中，调节pH值到5.80～6.00反应，30分钟；
第三步、20％-25％乙醇反应：继上一步，加95％乙醇，使乙醇浓度达20％-25％(V/V)；加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-3.0℃～-5.0℃，反应30分钟；
第四步、压滤：继上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐，从压滤机回收沉淀进行下步；
第五步、沉淀的溶解：继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3-5倍量预冷到0.0℃～2.0℃的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至0.0℃～2.0℃，搅拌至溶解；
第六步、调节pH值：继上一步，加入pH4.0醋酸缓冲液，调节反应液pH值在5.05～5.25范围，反应30分钟；
第七步、16％-18％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达16％-18％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4.5℃～-5.5℃，继续搅拌1小时即可压滤；
第八步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐进行下步，压滤机的沉淀弃做他用；
第九步、调节pH值：继上一步，将上步的滤液缓慢加入1mol/L碳酸氢钠缓冲液，调节反应液pH值在7.20～7.60范围，反应30分钟，；
第十步、25％-28％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达到25％-28％，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7.0℃～-10.0℃，静止1小时以上，即可压滤；
第十一步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-10.0℃～-12.0℃，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；
第十二步、沉淀溶解：继上一步，将上一步备用的沉淀用6-8倍量注射用水溶解，温度是0.0℃～2.0℃；
第十三步、调节pH：继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6.5～6.8之间，继续搅拌反应15min；
第十四步、层析：继上一步，将溶胀好的凝胶用0.015M磷酸缓冲液平衡至出液pH6.5～6.8后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0.015M磷酸缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；
第十五步、酸处理：继上一步，缓慢加入3％HCl调节蛋白液pH至3.5～4.0，继续搅拌30min；
第十六步、.超滤：继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩，待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入2℃～10℃注射用水，稀释蛋白浓度至20～50g/L，透析6-8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达80g/L以上，抽入洁净不锈钢桶内称量；
第十七步、配制：用3％HCl调整浓缩后蛋白液的pH是3.8～4.4，加入麦芽糖后，补加注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、pH是3.8～4.4，称重；
第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记录除菌后制品量；
第十九步、继上一步，低pH病毒灭活：将除菌后制品置于21℃～25℃库放置21天，逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至2℃～8℃库保存；
第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒：经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜过滤器过滤于罐中；
第二十一步、继上一步，可分装不同规格：500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；
第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。
本发明的优点是：本发明提供一种可以静脉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白，其所含的人抗体免疫球蛋白纯度可达98％以上，杂质更少，副反应更低。此工艺条件温和，对产品没有损伤，而且病毒灭活效果好，优于其他单位采用的巴氏灭活法或单一的低PH孵育法。本发明采用的是一种低温乙醇分离法与层析法和超滤法相结合的方法，使生产成本大大降低。
具体实施方式：
第一步、融化血浆：将抗-HBs抗体效价≥8IU/ml的原料血浆经75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1.0℃～3.0℃之间；
第二步、pH调节：用pH4.0醋酸缓冲液加入到血浆中，调节pH值到5.80～6.00反应，30分钟；
第三步、20％-25％乙醇反应：继上一步，加95％乙醇，使乙醇浓度达20％-25％(V/V)；加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-3.0℃～-5.0℃，反应30分钟；
第四步、压滤：继上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐，从压滤机回收沉淀进行下步；
第五步、沉淀的溶解：继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3-5倍量预冷到0.0℃～2.0℃的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至0.0℃～2.0℃，搅拌至溶解；
第六步、调节pH值：继上一步，加入pH4.0醋酸缓冲液，调节反应液pH值在5.05～5.25范围，反应30分钟；
第七步、16％-18％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达16％-18％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4.5℃～-5.5℃，继续搅拌1小时即可压滤；
第八步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐进行下步，压滤机的沉淀弃做他用；
第九步、调节pH值：继上一步，将上步的滤液缓慢加入1mol/L碳酸氢钠缓冲液，调节反应液pH值在7.20～7.60范围，反应30分钟，；
第十步、25％-28％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达到25％-28％，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7.0℃～-10.0℃，静止1小时以上，即可压滤；
第十一步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-10.0℃～-12.0℃，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；
第十二步、沉淀溶解：继上一步，将上一步备用的沉淀用6-8倍量注射用水溶解，温度是0.0℃～2.0℃；
第十三步、调节pH：继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6.5～6.8之间，继续搅拌反应15min；
第十四步、层析：继上一步，将溶胀好的凝胶用0.015M磷酸缓冲液平衡至出液pH6.5～6.8后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0.015M磷酸缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；
第十五步、酸处理：继上一步，缓慢加入3％HCl调节蛋白液pH至3.5～4.0，继续搅拌30min；
第十六步、.超滤：继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩，待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入2℃～10℃注射用水，稀释蛋白浓度至20～50g/L，透析6-8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达80g/L以上，抽入洁净不锈钢桶内称量；
第十七步、配制：用3％HCl调整浓缩后蛋白液的pH是3.8～4.4，加入麦芽糖后，补加注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、pH是3.8～4.4，称重；
第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记录除菌后制品量；
第十九步、继上一步，低pH病毒灭活：将除菌后制品置于21℃～25℃库放置21天，逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至2℃～8℃库保存；
第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒：经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜过滤器过滤于罐中；
第二十一步、继上一步，可分装不同规格：500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；
第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。
下面举例进一步详述本发明的技术方案。
例1、第一步、融化血浆：将抗-HBs抗体效价8IU/ml的原料血浆经75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1.0℃；
第二步、pH调节：用pH4.0醋酸缓冲液加入到血浆中，调节pH值到5.80，反应30分钟；
第三步、20％乙醇反应：继上一步，加95％乙醇，使乙醇浓度达20％(V/V)加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-3.0℃，反应30分钟；
第四步、压滤：继上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐，经压滤机回收沉淀；
第五步、沉淀的溶解：继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3倍量预冷到0.0℃的注射用水，搅拌3小时，制冷反应液温度至0.0℃，搅拌至溶解；
第六步、调节pH值：继上一步，加入pH4.0醋酸缓冲液，调节反应液pH值5.05，反应30分钟；
第七步、16％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达16％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4.5℃，继续搅拌1小时即可压滤；
第八步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐，压滤机的沉淀弃做他用；
第九步、调节pH值：继上一步，将上步的滤液缓慢加入1mol/L碳酸氢钠缓冲液，调节反应液pH值达7.20，反应30分钟；
第十步、25％-28％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度是25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7.0℃，静止1小时，即可压滤；
第十一步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-10.0℃，压滤时控制前压1.5Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；
第十二步、沉淀溶解：继上一步，将上一步备用的沉淀用6倍量注射用水溶解，温度是0.0℃；
第十三步、调节pH：继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH6.5，继续搅拌反应15min；
第十四步、层析：继上一步，将溶胀好的凝胶用0.015M磷酸缓冲液平衡至出液pH6.5后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0.015M磷酸缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；
第十五步、酸处理：继上一步，缓慢加入3％HCl调节蛋白液pH3.5，继续搅拌30min；
第十六步、.超滤：继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入2℃注射用水稀释蛋白浓度至20g/L，透析6倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达80g/L，抽入洁净不锈钢桶内称量；
第十七步、配制：用3％HCl调整浓缩后蛋白液的pH是3.8，加入麦芽糖后，补加注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、pH是3.8，称重；
第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记录除菌后制品量；
第十九步、继上一步，低pH病毒灭活：将除菌后制品置于21℃库放置21天，逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至2℃库保存；
第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒：经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜过滤器过滤于罐中；
第二十一步、继上一步，可分装不同规格：500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；
第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。
例2、第一步、融化血浆：将抗-HBs抗体效价10IU/ml的原料血浆经75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度3.0℃；
第二步、pH调节：用pH4.0醋酸缓冲液放入到血浆中，调节pH值到6.00，反应30分钟；
第三步、25％乙醇反应：继上一步，加入95％乙醇，使乙醇浓度达到25％(V/V)，加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-5.0℃，反应30分钟；
第四步、压滤：继上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压1.0Kg/cm2，上清回收到反应罐，经压滤机回收沉淀；
第五步、沉淀的溶解：继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入5倍量预冷到2.0℃的注射用水，搅拌4小时，制冷反应液温度至2.0℃，搅拌至溶解；
第六步、调节pH值：继上一步，加入pH4.0醋酸缓冲液，调节反应液pH值5.25，反应30分钟；
第七步、18％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达18％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-5.5℃，继续搅拌1小时即可压滤；
第八步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压1.3Kg/cm2，上清回收到反应罐，压滤机的沉淀弃做他用；
第九步、调节pH值：继上一步，将上步的滤液缓慢加入1mol/L碳酸氢钠缓冲液，反应30分钟，反应液pH值在7.6；
第十步、28％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达到28％，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-10.0℃，静止1.5小时，即可压滤；
第十一步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-12.0℃，压滤时控制前压1.3Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；
第十二步、沉淀溶解：继上一步，将上一步备用的沉淀用8倍量注射用水溶解，温度是2.0℃；
第十三步、调节pH：继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH6.8，继续搅拌反应15min；
第十四步、层析：继上一步，将溶胀好的凝胶用0.015M磷酸缓冲液平衡至出液pH6.8后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0.015M磷酸缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；
第十五步、酸处理：继上一步，缓慢加入3％HCl调节蛋白液pH4.0，继续搅拌30min；
第十六步、.超滤：继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入10℃注射用水，稀释蛋白浓度至50g/L，透析8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达90g/L，抽入洁净不锈钢桶内称量；
第十七步、配制：用3％HCl调整浓缩后蛋白液的pH是4.4，加入麦芽糖后，补加注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、pH是4.4，称重；
第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记录除菌后制品量；
第十九步、继上一步，低pH病毒灭活：将除菌后制品置于25℃库放置21天，逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至8℃库保存；
第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒：经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜过滤器过滤于罐中；
第二十一步、继上一步，可分装不同规格：500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；
第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。
例3、第一步、融化血浆：将抗-HBs抗体效价8IU/ml的原料血浆经75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度2.0℃；
第二步、pH调节：用pH4.0醋酸缓冲液放入到血浆中，调节pH值到5.90，反应30分钟；
第三步、23％乙醇反应：继上一步，加95％乙醇，使乙醇浓度达到23％(V/V)，加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-4.0℃，反应30分钟；
第四步、压滤：继上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压1.1Kg/cm2，上清回收到反应罐，经压滤机回收沉淀；
第五步、沉淀的溶解：继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入4倍量预冷到1.0℃的注射用水，搅拌3.5小时，制冷反应液温度至1.0℃，搅拌至溶解；
第六步、调节pH值：继上一步，加入pH4.0醋酸缓冲液，调节反应液pH值5.15，反应30分钟；
第七步、17％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达17％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-5.0℃，继续搅拌1小时即可压滤；
第八步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压1.1Kg/cm2，上清回收到反应罐，压滤机的沉淀弃做他用；
第九步、调节pH值：继上一步，将上步的滤液缓慢加入1mol/L碳酸氢钠缓冲液，调节反应液pH值在7.30，反应30分钟；
第十步、26％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度是26％，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-8.0℃，静止1.5小时，即可压滤；
第十一步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-11.0℃，压滤时控制前压1.1Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；
第十二步、沉淀溶解：继上一步，将上一步备用的沉淀用7倍量注射用水溶解，温度是0.1℃；
第十三步、调节pH：继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6.6，继续搅拌反应15min；
第十四步、层析：继上一步，将溶胀好的凝胶用0.015M磷酸缓冲液平衡至出液pH6.6后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0.015M磷酸缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；
第十五步、酸处理：继上一步，缓慢加入3％HCl调节蛋白液pH至3.6，继续搅拌30min；
第十六步、.超滤：继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入4℃注射用水稀释蛋白浓度至30g/L，透析7倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达90g/L，抽入洁净不锈钢桶内称量；
第十七步、配制：用3％HCl调整浓缩后蛋白液的pH是4.0，加入麦芽糖后，补加注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、pH是4.0，称重；
第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记录除菌后制品量；
第十九步、继上一步，低pH病毒灭活：将除菌后制品置于22℃库放置21天，逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至3℃库保存；
第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒：经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜过滤器过滤于罐中；
第二十一步、继上一步，可分装不同规格：500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；
第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。

Claims (1)

1.一种静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法，其特征在于：
第一步、融化血浆：将抗-HBs抗体效价≥8IU/ml的原料血浆经75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1.0℃～3.0℃之间；
第二步、pH调节：用pH4.0醋酸缓冲液加入到血浆中，调节pH值到5.80～6.00反应，30分钟；
第三步、20％-25％乙醇反应：继上一步，加95％乙醇，使乙醇浓度达20％-25％(V/V)；加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-3.0℃～-5.0℃，反应30分钟；
第四步、压滤：继上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐，从压滤机回收沉淀进行下步；
第五步、沉淀的溶解：继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3-5倍量预冷到0.0℃～2.0℃的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至0.0℃～2.0℃，搅拌至溶解；
第六步、调节pH值：继上一步，加入pH4.0醋酸缓冲液，调节反应液pH值在5.05～5.25范围，反应30分钟；
第七步、16％-18％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达16％-18％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4.5℃～-5.5℃，继续搅拌1小时即可压滤；
第八步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐进行下步，压滤机的沉淀弃做他用；
第九步、调节pH值：继上一步，将上步的滤液缓慢加入1mol/L碳酸氢钠缓冲液，调节反应液pH值在7.20～7.60范围，反应30分钟，；
第十步、25％-28％乙醇反应：继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达到25％-28％，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7.0℃～-10.0℃，静止1小时以上，即可压滤；
第十一步、压滤：继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-10.0℃～-12.0℃，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；
第十二步、沉淀溶解：继上一步，将上一步备用的沉淀用6-8倍量注射用水溶解，温度是0.0℃～2.0℃；
第十三步、调节pH：继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6.5～6.8之间，继续搅拌反应15min；
第十四步、层析：继上一步，将溶胀好的凝胶用0.015M磷酸缓冲液平衡至出液pH6.5～6.8后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0.015M磷酸缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；
第十五步、酸处理：继上一步，缓慢加入3％HCl调节蛋白液pH至3.5～4.0，继续搅拌30min；
第十六步、.超滤：继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩，待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入2℃～10℃注射用水，稀释蛋白浓度至20～50g/L，透析6-8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达80g/L以上，抽入洁净不锈钢桶内称量；
第十七步、配制：用3％HCl调整浓缩后蛋白液的pH是3.8～4.4，加入麦芽糖后，补加注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、pH是3.8～4.4，称重；
第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记录除菌后制品量；
第十九步、继上一步，低pH病毒灭活：将除菌后制品置于21℃～25℃库放置21天，逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至2℃～8℃库保存；
第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒：经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜过滤器过滤于罐中；
第二十一步、继上一步，可分装不同规格：500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；
第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。
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