CN111148509A

CN111148509A - 治疗呼吸系统疾病的方法和组合物

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Publication number: CN111148509A
Application number: CN201880050027.8A
Authority: CN
Inventors: G·史密斯; Y·刘; J·H·田; M·马萨尔; S·博达帕蒂; G·格伦; L·弗列斯; I·赵
Original assignee: Novavax Inc
Current assignee: Novavax Inc
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2020-05-12
Also published as: JP2020528883A; EP3658118B1; EP3658118A4; JP7317796B2; WO2019023196A1; JP2023134738A; US20210137845A1; US20240423926A1; EP3658118A1; JP7783222B2; US12083228B2; ES3028362T3

Abstract

本文公开了适合用于在减少COPD患者的恶化中使用的方法和纳米颗粒。所述方法和组合物有利地减少了COPD患者的住院发生率，所述住院发生率响应于环境危害例如暴露于RSV或被RSV感染而发生。还公开了用于制备所述疫苗和纳米颗粒的剂量、配制品和方法。

Description

治疗呼吸系统疾病的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年7月24日提交的美国临时申请号62/536,235的优先权，出于所有目的将其公开内容并入本文。

出于所有目的，本申请将2016年9月6日提交的美国申请号15/257,436以及以下美国临时申请系列号：2015年9月3日提交的62/213,947、2015年11月16日提交的62/255,786、2016年3月16日提交的62/309,216和2016年6月16日提交的62/350,973的公开内容以其整体并入。

电子提交的文本文件的说明

将与此一起以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：NOVV_075_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2018年7月19日，文件大小：约67千字节)。

技术领域

本公开文本总体上涉及可用于治疗呼吸系统疾病和预防与呼吸系统疾病相关的恶化的纳米颗粒、以及含有所述纳米颗粒的免疫原性组合物。纳米颗粒提供与去污剂核心缔合的抗原(例如糖蛋白抗原)，并且通常使用重组方法产生。纳米颗粒减少了慢性阻塞性肺病(COPD)恶化及相关住院，特别是在老年人群中如此。本公开文本还提供了包含所述纳米颗粒的组合物、生产所述纳米颗粒的方法、以及治疗呼吸系统疾病(例如COPD)并预防进一步恶化的方法。

背景技术

呼吸系统疾病和感染性疾病仍然是遍及全世界的问题。尽管在开发针对一些病原体的疫苗方面已取得进展，但许多病原体仍对人类健康构成威胁。最臭名昭著的是HIV，针对它的疫苗仍然遥不可及。已经尝试生产针对某些病原体的疫苗，但是已经以失败告终，导致另外的病理学。

世界卫生组织(World Health Organization)估计，每年全球全部死亡中有6％(超过300万死亡)归因于慢性阻塞性肺病(COPD)，这是世界上主要的呼吸系统疾病之一。COPD的恶化对患者具有深远的有害影响，并给医疗资源带来重大负担。有明确的证据表明每次恶化之后肺功能都不可挽回地下降。恶化的预防和治疗是COPD临床管理的主要目标(参见Decramer M等人,(2008)“Targeting the COPD Exacerbation”J Respir Med 102:S3-S15以及Rabe KF等人,(2007)“Global strategy for diagnosis,management,andprevention of chronic obstructive pulmonary disease:GOLD Executive Summary”AmJ Respir Crit Care Med 176:532-555)。

在其他治疗选择中，美国肺脏协会(American Lung Association)建议对COPD患者进行免疫接种，特别是每年进行流感和肺炎疫苗接种。因此，对生产减少或消除COPD人群的恶化的治疗性和预防性药物以降低疾病负担及相关花费存在持续的兴趣。

发明内容

本公开文本提供了适合用于治疗呼吸系统疾病和障碍的纳米颗粒。在特定方面，纳米颗粒治疗慢性阻塞性肺部障碍(COPD)。在其他方面，纳米颗粒预防响应于呼吸系统危害(例如，暴露于病原体)的COPD恶化。

在一些实施方案中，纳米颗粒诱导针对病原体的免疫应答。在一些实施方案中，病原体是病毒，并且通常用于生产病毒纳米颗粒的抗原是病毒糖蛋白。

在一方面，本公开文本提供了含有病毒蛋白的纳米颗粒，所述病毒蛋白具有增强的稳定性。在一些实施方案中，本公开文本包含含有纳米颗粒的疫苗组合物，其包含非离子型去污剂、病毒糖蛋白和药物缓冲液。在典型的实施方案中，非离子型去污剂可以选自PS20、PS40、PS60、PS65和PS80。在一些实施方案中，所述组合物不包含任何游离的非离子型去污剂。一个或多个糖蛋白抗原分子围绕着含有非离子型去污剂的一个去污剂核心，并且这提供了促进免疫原性并抑制抗原降解的纳米颗粒结构。

在一些实施方案中，抗原选自RSV F蛋白、流感HA蛋白、流感NA蛋白及其组合。通常，抗原是糖蛋白。

任选地，RSV F蛋白是三聚体RSV F蛋白。RSV F蛋白诱导中和抗体的产生。在另外的实施方案中，中和抗体识别呈融合后状态和/或融合前状态的RSV F蛋白。在另外的方面，每个PS80颗粒可以包含在4个与7个之间的RSV F蛋白。

在一些实施方案中，RSV F组合物可以包含浓度在15mM与25mM之间的磷酸钠；浓度在125mM与175mM之间的NaCl；在0.25％与2％w/v之间的组氨酸；并且所述组合物的pH在5.8与7.2之间。

在一些实施方案中，HA或NA流感组合物可以包含浓度在15mM与25mM之间的磷酸钠；浓度在125mM与300mM之间的NaCl；在0.25％与2％w/v之间的组氨酸；并且所述组合物的pH高于pH 6.8且通常低于约pH 8.0。

在一些实施方案中，组合物包含佐剂。在另外的实施方案中，佐剂是明矾或基于皂苷的基质佐剂。在一些实施方案中，组合物不包含佐剂。

在一些实施方案中，预防感染的方法包括给予一个或多个剂量的疫苗组合物。在所述方法的一些实施方案中，单剂量的组合物被给予并诱导保护性免疫应答。在所述方法的一些实施方案中，每个剂量由在约100μg与约150μg之间的蛋白质抗原组成。在所述方法的另外的实施方案中，皮下给予所述一个或多个剂量。在所述方法的一些实施方案中，组合物包含佐剂。在所述方法的另外的实施方案中，佐剂是明矾。在所述方法的一些实施方案中，组合物不含佐剂。

在所述方法的一些实施方案中，向成人给予一个或多个剂量的组合物。在所述方法的另外的实施方案中，成人的年龄超过75岁、超过70岁、超过65岁、超过60岁、超过55岁、超过50岁或超过45岁。因此，在特定方面，成人可以是约45岁至约75岁。

对于RSV疫苗，在一些实施方案中，组合物包含至少三种RSV F纳米颗粒类型的异质群体，其中每个纳米颗粒包含围绕着包含PS80的含去污剂核心的至少一个RSV F蛋白三聚体，并且其中第一RSV F纳米颗粒类型包含各向异性棒，其中第二RSV F纳米颗粒类型包含球形寡聚物，并且其中第三RSV F纳米颗粒类型包含各向异性棒和球形寡聚物的中间体。

在一些实施方案中，制造RSV F蛋白纳米颗粒的方法包括：使用第一去污剂从宿主细胞制备RSV F蛋白提取物，并将第一去污剂交换为第二去污剂，其中所述第二去污剂为PS80，并且由此纳米颗粒展现出增强的稳定性。在所述方法的另外的实施方案中，第一去污剂是NP-9。在所述方法的一些实施方案中，增强的稳定性选自蛋白酶抗性、氧化应激抗性、热应激抗性和对搅动的抗性。在所述方法的一些实施方案中，PS80:RSV F蛋白的摩尔比为约35至约65。

在一些实施方案中，RSV F纳米颗粒包含与PS80去污剂核心缔合的一个或多个RSVF蛋白三聚体。如通过动态光散射测量的，RSV F纳米颗粒，纳米颗粒具有约20nm至约60nm的平均直径。在RSV F纳米颗粒的一些实施方案中，每个RSV F蛋白三聚体含有选自以下的RSVF蛋白：具有与SEQ ID NO:2的残基137-146对应的1至10个氨基酸缺失的RSV F蛋白。在RSVF纳米颗粒的一些实施方案中，每个RSV F蛋白三聚体含有选自以下的RSV F蛋白：具有与SEQ ID NO:2的残基137-146对应的1至10个氨基酸缺失以及失活的初级融合切割位点的RSV F蛋白。

在RSV F纳米颗粒的一些实施方案中，RSV F蛋白包含与SEQ ID NO:2的残基137-146对应的十个氨基酸的缺失，以及由于在位置133、135和136处的精氨酸残基突变为谷氨酰胺而导致的初级弗林蛋白酶(furin)切割位点的失活。在RSV F纳米颗粒的另外的实施方案中，RSV F蛋白包含作为成熟肽的SEQ ID NO:19，或由其组成。在RSV F纳米颗粒的某些实施方案中，RSV F蛋白包含SEQ ID NO:8或由其组成。含有RSV F纳米颗粒的疫苗配制品基本上包含成熟肽和一些全长肽(SEQ ID NO:8)。随着时间的推移，由于蛋白水解作用，可能产生少量的截短的RSV F肽。然而，有利地，本文所公开的RSV F纳米颗粒使这种降解最小化并提供延长的稳定性。

类似地，提供了含有与流感蛋白(HA、NA或两者)组合的RSV F蛋白的纳米颗粒。

附图说明

图1描绘了经修饰的RSV F蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)；F1结构域为浅色文字(残基1-84)，F2结构域为深色文字(残基85-539)，黑线连接形成二硫键的半胱氨酸，带下划线的天冬酰胺指示N-连接的糖基化位点，浅色阴影竖直虚线指示弗林蛋白酶切割位点，并且深色竖直虚线指示主要切割位点。

图2表征具有与PS80核心缔合的RSV F蛋白三聚体的RSV F纳米颗粒的电子显微图。多个RSV F三聚体与每个颗粒(直径40-50nm)缔合。

图3描绘了E-301和E201研究中由于全因(与RSV检测无关)COPD恶化而住院的分析。

图4描绘了详细描述E-301研究中随着时间推移没有由于COPD恶化而住院的人群下降的图。

具体实施方式

本文公开了用于治疗呼吸系统疾病和障碍的纳米颗粒、产生和给予所述纳米颗粒的方法以及含有所述纳米颗粒的疫苗组合物。纳米颗粒提供了围绕着去污剂核心并与去污剂核心缔合的抗原，所述去污剂核心产生了通过多种措施提供增强的稳定性的结构。不受理论束缚，由所公开的纳米颗粒诱导的免疫应答及相关保护导致呼吸系统疾病或障碍(例如COPD)恶化的减少。去污剂核心和抗原通过由抗原和去污剂的特性介导的物理-化学相互作用缔合。此外，纳米颗粒向免疫系统提供尤其好的抗原呈递，不受理论束缚，所述尤其好的抗原呈递被认为由抗原在去污剂核心周围的取向引起。

在一方面，本公开文本提供了含有重组病毒糖蛋白纳米颗粒的组合物。在特定方面，糖蛋白在合适的宿主细胞中重组表达。在一个实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。在示例性实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。

在特定方面，本公开文本提供了在纳米颗粒结构中包含一种或多种病毒糖蛋白物质的免疫原性组合物，其中糖蛋白呈三聚体的形式，并且每个纳米颗粒含有与非离子型去污剂核心缔合的至少一个三聚体。在特定方面，纳米颗粒由来自仅一种病原体的抗原(如病毒糖蛋白)组成。

可以将纳米颗粒用于治疗呼吸系统疾病或障碍。在一些实施方案中，将纳米颗粒用于治疗COPD。在一些实施方案中，纳米颗粒降低了响应于呼吸系统危害(如病原体或其他环境COPD触发物)COPD恶化的发生率。

可以将纳米颗粒用于预防和/或治疗病毒感染。因此，在另一方面，本公开文本提供了用于引发针对病毒的免疫应答的方法。所述方法涉及向受试者给予免疫有效量的含有纳米颗粒的组合物。

本公开文本提供了包含纳米颗粒的疫苗组合物。组合物可以包含具有抗原的纳米颗粒，所述抗原来自多种病原体。在一些方面，疫苗组合物可以包含具有抗原的纳米颗粒，所述抗原来自同一病毒物种的超过一种病毒株。在多个方面，疫苗组合物可以包含具有抗原的纳米颗粒，所述抗原来自不同病毒物种。在另一个实施方案中，本公开文本提供了包含一个或多个容器的药物包装或试剂盒，所述一个或多个容器装有疫苗组合物的一种或多种组分。

在另一个实施方案中，本公开文本提供了配制疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物诱导针对哺乳动物的感染或其至少一种疾病症状的免疫力，所述方法包括向组合物中添加有效剂量的纳米颗粒。所公开的纳米颗粒可用于制备刺激免疫应答的组合物，所述免疫应答赋予针对感染原的免疫力或实质性免疫力。因此，在一个实施方案中，本公开文本提供了在受试者中诱导针对感染或其至少一种疾病症状的免疫力的方法，所述方法包括给予至少一个有效剂量的纳米颗粒。

在一些实施方案中，将纳米颗粒与佐剂一起给予。在其他方面，在没有佐剂的情况下给予纳米颗粒。在一些方面，佐剂可以例如通过非共价相互作用与纳米颗粒结合。在其他方面，将佐剂与纳米颗粒共同给予，但是佐剂和纳米颗粒基本上不相互作用。

本文还提供了制造纳米颗粒和疫苗组合物的方法。有利地，所述方法提供了基本上没有其他蛋白质污染的纳米颗粒，所述其他蛋白质例如为与在杆状病毒/Sf9系统中蛋白质的重组表达相关的蛋白质。

定义

如本文和所附权利要求所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。因此，例如，提及“蛋白质”可以是指一种蛋白质或这种蛋白质的混合物。

如本文所用，术语“佐剂”是指当与免疫原组合使用时增加或以其他方式改变或修饰针对所述免疫原诱导的免疫应答的药剂。免疫应答的修饰可以包括强化或扩大抗体免疫应答和细胞免疫应答中任一者或两者的特异性。疫苗组合物可以包括有效量的一种或多种佐剂。

如本文所用，当在数值之前时，术语“约”或“大约”表示所述值加或减10％的范围。例如，“约100”涵盖90和110。

如本文所用，术语“免疫原”、“抗原”和“表位”是指能够引发免疫应答的物质，例如蛋白质(包括糖蛋白)和肽。

如本文所用，“免疫原性组合物”是包含抗原的组合物，其中向受试者给予所述组合物导致在所述受试者中发展针对所述抗原的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。

如本文所用，“亚单位”组合物(例如疫苗)包括一种或多种选定抗原，但不是来自病原体的所有抗原。这样的组合物基本上不含完整的病毒或此类细胞或颗粒的裂解物，并且通常由至少部分纯化的(通常基本上纯化的)来自病原体的免疫原性多肽制备。通常使用杆状病毒系统，典型地以重组方式制备本文所公开的亚单位组合物中的抗原。

如本文所用，“基本上”是指这样的物质(例如化合物、多核苷酸或多肽)或加工步骤：使得所述物质形成包含其的样品的大多数百分比，或者加工步骤大体上完成了。例如，在样品中，基本上纯化的组分包含样品的85％，优选85％-90％，更优选至少95％-99.5％，以及最优选至少99％。如果组分基本上被替代，则在样品中剩余的量为小于或等于约0.5％至约10％，优选小于约0.5％至约1.0％。

如本文所用，术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指用于获得有益或希望的结果(例如临床结果)的方法。出于本公开文本的目的，有益或希望的结果可以包括抑制或压制感染或疾病的开始或进展；改善或降低感染或疾病的症状的发展；或其组合。

如本文所用，“预防”(prevention)与“防预”(prophylaxis)可互换使用，并且可以意指完全预防感染或疾病、或预防这种感染或疾病的症状的发展；延迟感染或疾病或其症状的发作；或降低随后发展的感染或疾病或其症状的严重性。

如本文所用，“有效剂量”或“有效量”是指免疫原的量，所述免疫原的量足以诱导减少病原体感染的至少一种症状的免疫应答。可以例如通过测量中和分泌抗体和/或血清抗体的量，例如通过噬斑中和、补体结合、酶联免疫吸附(ELISA)或微量中和测定来确定有效剂量或有效量。

如本文所用，术语“疫苗”是指用于诱导针对病原体的免疫应答的免疫原性组合物(例如源自病原体的免疫原)，所述免疫应答提供保护性免疫力(例如，保护受试者免于病原体感染和/或降低由病原体感染引起的疾病或病症的严重性的免疫力)。保护性免疫应答可以包括抗体和/或细胞介导的应答的形成。取决于上下文，术语“疫苗”也可以是指给予至受试者以产生保护性免疫力的免疫原悬浮液或溶液。

如本文所用，术语“受试者”包括人和其他动物。通常，受试者是人。例如，受试者可以是成人、青少年、儿童(2岁至14岁年龄)、婴儿(1个月至24个月)或新生儿(多至1个月)。在一些方面，成人是约65岁以上、或约60岁以上的年长者。在一些方面，受试者是孕妇或打算怀孕的妇女。在其他方面，受试者不是人；例如为非人灵长类动物；例如，狒狒、黑猩猩、大猩猩或猕猴。在某些方面，受试者可以是宠物，如狗或猫。

如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由美国联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典、欧洲药典或其他公认药典中列出用于哺乳动物，并且更特别地用于人。可以将药学上可接受的载体或赋形剂包括在本文所公开的组合物中。

如本文所用，“呼吸系统疾病”或“呼吸系统障碍”意指肺的气道和/或其他结构的疾病或障碍。这包括但不限于慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、变应性鼻炎和鼻窦炎、支气管扩张和肺动脉高压。COPD是指共享包括气流阻塞和呼吸有关问题(包括肺气肿、慢性支气管炎、以及在一些情况下哮喘)中的一种或多种在内的症状的一组疾病(参见www.cdc.gov/tobacco/campaign/tips/diseases/copd.html)。

如本文所用，术语“约”意指所指数值加或减10％。

概述

COPD症状通常在受试者已经具有显著的肺损伤时出现，并且症状通常随着时间的推移恶化。对于展现出患有肺气肿或慢性支气管炎的受试者，COPD是常见的结果。在慢性支气管炎中，主要症状是每年至少三个月每天咳嗽和产生粘液(痰液)，持续连续两年。肺气肿是其中肺的最小空气通道(细支气管)末端的肺泡被破坏(通常由吸烟引起)的一种病症。COPD的其他症状可以包括：气促(尤其在体育活动期间)、喘息、胸部紧迫感、慢性咳嗽(常伴有粘液)以及嘴唇或指甲床发青(发绀)。

患有COPD的受试者也可能经历称为恶化的发作，在此期间，这些症状变得比平常的日常变化更严重，并持续至少几天。恶化通常响应于受试者遇到的环境危害而发生。各种生物学和非生物学环境危害可导致COPD患者恶化，这些环境危害包括二手香烟烟雾、汽油烟雾、细菌和病毒感染。

可以将本文使用的方法和组合物用于降低或消除恶化或与恶化相关的一种或多种症状的严重性。本公开文本的免疫原性组合物含有呈纳米颗粒形式的源自病原体的一种或多种抗原。

将源自病原体的抗原与非离子型去污剂组合，以提供围绕去污剂核心的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有改进的稳定性和优异的免疫原性并且治疗呼吸系统疾病和障碍。本公开文本还提供了用于针对病原体使受试者接种疫苗以治疗呼吸系统疾病和障碍的方法和组合物。抗原通常是病毒蛋白，通常为糖蛋白。还公开了含有纳米颗粒的组合物，所述组合物可用作疫苗组合物以治疗呼吸系统疾病和障碍。

在特定方面，所述组合物含有诱导仅针对RSV的免疫应答的纳米颗粒。在其他方面，所述组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒含有针对RSV的糖蛋白(例如RSV-F蛋白)、以及一种或多种流感HA糖蛋白株系(例如包含来自1、2、3或4种不同流感株系的HA糖蛋白的纳米颗粒)。

除了纳米颗粒之外，还可以向受试者给予另外的免疫原性组合物。例如，可以向受试者给予用以诱导针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(百日咳剂)、b型流感嗜血杆菌(Hib)和麻疹中的一种或多种的免疫应答的组合物。

本文所公开的免疫原性组合物的显著结果是，给予含有RSV F糖蛋白的纳米颗粒组合物减少“全因”COPD恶化的住院，这意味着对所述组合物的应答确实不仅减少了RSV刺激的恶化，而且具有更普遍的益处，从而减少恶化的全因。参见图4和图5。因此，含有纳米颗粒的组合物可用于给予至患有COPD的受试者，以预防响应于环境危害的恶化。

纳米颗粒结构和形态

本公开文本的纳米颗粒包含与非离子型去污剂核心缔合的糖蛋白抗原。图2示出了与去污剂核心缔合的多种RSV F抗原的例子。

在特定实施方案中，纳米颗粒由围绕非离子型去污剂核心的多个蛋白质三聚体构成。例如，每个纳米颗粒可以含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或15个三聚体。通常，每个纳米颗粒含有2至9个三聚体。在特定实施方案中，每个纳米颗粒含有2至6个三聚体。本文所公开的组合物可以包含具有不同数量的三聚体的纳米颗粒。例如，组合物可包含其中三聚体的数量在2-9范围内的纳米颗粒；在其他实施方案中，组合物中的纳米颗粒可包含2-6个三聚体。在特定实施方案中，组合物包含纳米颗粒的异质群体，每个纳米颗粒具有2至6个三聚体，或者每个纳米颗粒具有2至9个三聚体。在其他实施方案中，组合物可包含纳米颗粒的基本上均质的群体。例如，群体可包含约95％的具有5个三聚体的纳米颗粒。

抗原与纳米颗粒的含非离子型去污剂的核心缔合。通常，去污剂选自聚山梨醇酯-20(PS20)、聚山梨醇酯-40(PS40)、聚山梨醇酯-60(PS60)、聚山梨醇酯-65(PS65)和聚山梨醇酯-80(PS80)。去污剂的存在通过形成组织并呈现抗原的核心促进纳米颗粒的形成。因此，在某些实施方案中，纳米颗粒可包含组装成多寡聚糖蛋白-PS80蛋白-去污剂纳米颗粒的抗原，其中头部区域向外突出并且疏水区域和PS80去污剂形成被抗原包围的中央核心。

本文所公开的纳米颗粒的Z-ave尺寸范围为从约20nm至约60nm、约20nm至约50nm、约20nm至约45nm或约25nm至约45nm。除非另有规定，否则使用Malvern Zetasizer通过动态光散射(DLS)来测量粒度(Z-ave)。

在本文所公开的疫苗组合物中可以包括若干种纳米颗粒类型。在一些方面，纳米颗粒类型呈各向异性棒的形式，其可以是二聚体或单体。在其他方面，纳米颗粒类型是球形寡聚物。在又其他方面，纳米颗粒可以被描述为中间体纳米颗粒，具有介于前两种类型之间的沉降特性。在生产过程期间，可以通过控制去污剂和蛋白质浓度来调节纳米颗粒类型的形成。可以通过测量沉降系数来确定纳米颗粒类型。

纳米颗粒产生

本公开文本的纳米颗粒是非天然存在的产物，其组分在自然界中不会一起出现。通常，本文所公开的方法使用去污剂交换方法，其中使用第一去污剂来分离蛋白质，并且然后将所述第一去污剂交换成第二去污剂以形成纳米颗粒。

纳米颗粒中包含的抗原通常是通过在宿主细胞中的重组表达而产生的。可以使用标准的重组技术。通常，使用杆状病毒系统在昆虫宿主细胞中表达所述蛋白质。在优选实施方案中，所述杆状病毒是组织蛋白酶-L敲除的杆状病毒。在其他优选实施方案中，所述杆状病毒是几丁质酶敲除的杆状病毒。在又其他优选实施方案中，所述杆状病毒是对于组织蛋白酶-L和几丁质酶两者的双重敲除。在昆虫细胞表达系统中可以获得高水平的表达。昆虫细胞的非限制性例子是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)细胞(例如Sf9、Sf21)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如High Five细胞(也称为BTI-TN-5B1-4)、和果蝇(Drosophila)S2细胞。

可以将典型的转染和细胞生长方法用于培养所述细胞。可以根据本领域中熟知的方法将载体(例如包含编码融合蛋白的多核苷酸的载体)转染到宿主细胞中。例如，可以通过磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染和使用多胺转染试剂的转染来实现将核酸引入真核细胞中。在一个实施方案中，所述载体是重组杆状病毒。

使宿主细胞生长的方法包括但不限于分批、补料分批、连续和灌注细胞培养技术。细胞培养意指细胞在生物反应器(发酵室)中的生长和繁殖，在所述生物反应器中细胞繁殖并表达蛋白质(例如重组蛋白)以用于纯化和分离。通常，细胞培养是在生物反应器中在无菌、受控温度和大气条件下进行。生物反应器是在其中可以监测环境条件如温度、大气、搅动和/或pH的用于培养细胞的室。在一个实施方案中，生物反应器是不锈钢室。在另一个实施方案中，生物反应器是预灭菌的塑料袋(例如，

Wave Biotech公司，新泽西州布里奇沃特)。在其他实施方案中，预灭菌的塑料袋是约50L至3500L的袋。

纳米颗粒的去污剂提取和纯化

在宿主细胞生长之后，可以使用去污剂和纯化方案从宿主细胞中收获所述蛋白质。一旦宿主细胞已经生长48至96小时，就从培养基中分离细胞，并添加含去污剂的溶液以溶解细胞膜，从而使蛋白质释放到去污剂提取物中。Triton X-100和tergitol(也称为NP-9)是用于提取的各自优选去污剂。可以将去污剂添加至约0.1％至约1.0％的最终浓度。例如，浓度可以为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.5％、约0.7％、约0.8％或约1.0％。在某些实施方案中，范围可以是约0.1％至约0.3％。优选地，所述浓度为约0.5％。

在其他方面，可以使用不同的第一去污剂从宿主细胞中分离所述蛋白质。例如，第一去污剂可以是双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])、壬苯醇醚-9、双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])、

十乙二醇单十二烷基醚、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正癸基α-D吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、正十二酰基-N-甲基葡糖酰胺、正十二烷基α-D-麦芽糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十二烷基醚、七乙二醇单十四烷基醚、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630、Igepal CA-630、甲基-6-0-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、N-壬酰基N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二环氧甘油醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油烯基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯双(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、来自皂树(Quillaja)树皮的皂苷、

Tergitol类型15-S-12、Tergitol类型15-S-30、Tergitol类型15-S-5、Tergitol类型15-S-7、Tergitol类型15-S-9、Tergitol类型NP-10、Tergitol类型NP-4、Tergitol类型NP-40、Tergitol,类型NP-7Tergitol类型NP-9、Tergitol类型TMN-10、Tergitol类型TMN-6、Triton X-100、或其组合。

然后可以使用离心从细胞碎片中分离纳米颗粒。在一些实施方案中，可以使用例如采用氯化铯、蔗糖和碘克沙醇的梯度离心。其他技术可以用作替代或补充，例如标准纯化技术，包括例如离子交换色谱、亲和色谱和凝胶过滤色谱。

例如，第一柱可以是离子交换色谱树脂，如

EMD TMAE(EMDMillipore)，第二柱可以是小扁豆(Lens culinaris)凝集素亲和树脂，并且第三柱可以是阳离子交换柱，如

EMD SO3(EMD Millipore)树脂。在其他方面，阳离子交换柱可以是MMC柱或Nuvia C Prime柱(Bio-Rad Laboratories,Inc)。优选地，本文所公开的方法不使用去污剂提取柱；例如疏水相互作用柱。这样的柱通常在纯化期间用于去除去污剂，但可对此处公开的方法产生负面影响。

去污剂交换

为了形成纳米颗粒，用于从宿主细胞中提取蛋白质的第一去污剂基本上被第二去污剂替代以得到纳米颗粒结构。NP-9是优选的提取去污剂。通常，当通过HPLC测量时，纳米颗粒不含有可检测的NP-9。第二去污剂通常选自PS20、PS40、PS60、PS65和PS80。优选地，第二去污剂是PS80。为了保持纳米颗粒配制品的稳定性，第二去污剂与蛋白质之比保持在某一范围内。

在特定方面，使用亲和色谱以结合糖蛋白(经由其碳水化合物部分)来进行去污剂交换。例如，亲和色谱可以使用豆类凝集素柱。豆类凝集素是最初在植物中鉴定出的蛋白质，并且发现其与碳水化合物残基特异性地且可逆地相互作用。参见例如，Sharon和Lis,“Legume lectins--a large family of homologous proteins,”FASEB J.1990Nov；4(14):3198-208；Liener,“The Lectins:Properties,Functions,and Applications inBiology and Medicine,”Elsevier,2012。合适的凝集素包括伴刀豆球蛋白A(con A)、豌豆凝集素、红豆草凝集素和小扁豆凝集素。小扁豆凝集素由于其结合特性是用于去污剂交换的优选柱。参见例如实施例10。凝集素柱可商购获得；例如，Capto小扁豆凝集素可从GEHealthcare获得。在某些方面，小扁豆凝集素柱可以使用重组凝集素。在分子水平上，认为碳水化合物部分与小扁豆凝集素结合，释放蛋白质的氨基酸以在去污剂周围聚结，导致形成去污剂核心，从而提供具有多个抗原拷贝(例如糖蛋白寡聚体)的纳米颗粒，所述糖蛋白寡聚体可以是锚定在去污剂中的二聚体、三聚体或四聚体。

当在去污剂交换期间与蛋白质一起孵育形成纳米颗粒时，去污剂在早期纯化步骤期间能以多至约0.1％(w/v)存在，并且使此量降低以获得具有最佳稳定性的最终纳米颗粒。例如，非离子型去污剂(例如，PS80)可以为约0.03％至约0.1％。优选地，为了改进稳定性，纳米颗粒含有约0.03％至约0.05％的PS80。配制品中低于约0.03％PS80的量未表现出良好的稳定性。此外，如果PS80以高于约0.05％存在，则形成聚集体。因此，约0.03％至约0.05％PS80提供了结构和稳定性益处，这允许纳米颗粒的长期稳定性和降低的降解。

可以使用如下蛋白质进行去污剂交换，将所述蛋白质如上所讨论地纯化、并且纯化、冷冻保存进行存储，并且然后解冻以进行去污剂交换。

纳米颗粒的增强的稳定性和增强的免疫原性

不受理论束缚，认为将抗原与非离子型去污剂核心缔合提供了优异的稳定性和抗原呈递。本文所公开的纳米颗粒提供出乎意料好的稳定性和免疫原性。

认为糖蛋白锚定在去污剂核心中的位置通过减少不希望的相互作用而提供增强的稳定性。例如，可以通过屏蔽作用来实现针对基于蛋白酶的降解的改进的保护，由此以本文所公开的摩尔比将糖蛋白锚定在所述核心中导致了空间位阻，从而阻断蛋白酶进入。

纳米颗粒抗原

在典型的实施方案中，用于产生纳米颗粒的抗原是病毒蛋白。在一些方面，可以将蛋白质修饰，但保留刺激针对天然肽的免疫应答的能力。在一些方面，所述蛋白质固有地含有或适于含有跨膜结构域以促进将所述蛋白质缔合到去污剂核心中。通常，所述蛋白质天然地是糖蛋白。

RSV抗原

在一方面，病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)，并且病毒抗原是融合(F)糖蛋白。RSV F蛋白的结构和功能已得到很好的表征。用于在本文所述的组合物中使用的合适的RSV-F蛋白可源自RSV株系，如A2、Long、ATCC VR-26、19、6265、E49、E65、B65、RSB89-6256、RSB89-5857、RSB89-6190、和RSB89-6614。在某些实施方案中，RSV F蛋白与其天然变体相比发生了突变。这些突变赋予所需的特征，例如改进的蛋白质表达、增强的免疫原性等。可以在Swanson等人AMonomeric Uncleaved Respiratory Syncytial Virus F Antigen RetainsPrefusion-Specific Neutralizing Epitopes.Journal of Virology,2014,88,11802-11810；Jason S.McLellan等人Structure of RSV Fusion Glycoprotein Trimer Boundto a Prefusion-Specific Neutralizing Antibody.Science,2013,340,1113-1117中找到描述RSV-F蛋白结构的另外信息。

初级融合切割位于与SEQ ID NO:2对应的残基131至136。初级融合切割位点的失活可以通过使位点中的残基突变来实现，结果是弗林蛋白酶不再能够识别共有位点。例如，初级弗林蛋白酶切割位点的失活可以通过在与野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO:2)的精氨酸133、精氨酸135和精氨酸136对应的位置处引入至少一个氨基酸取代来实现。在特定方面，一个、两个或全部三个精氨酸均被突变成谷氨酰胺。在其他方面，失活是通过使野生型位点突变成以下序列之一来实现：KKQKQQ(SEQ ID NO:14)、QKQKQQ(SEQ ID NO:15)、KKQKRQ(SEQID NO:16)、和GRRQQR(SEQ ID NO:17)。

在特定方面，可以缺失与SEQ ID NO:2的酸137至145对应的1至10个氨基酸，包括下面所示的合适RSV F蛋白的特定例子。可以任选地使用活性初级融合切割位点KKRKRR(SEQ ID NO:18)来制备SEQ ID NO 3-13中的每一个。SEQ ID NO:2中的野生型株系具有测序错误(A测成P、V测成I、和V测成M)，所述测序错误已在SEQ ID NO:3-13中改正。在宿主细胞中表达RSV-F蛋白后，将N末端信号肽切割以提供最终序列。通常，信号肽被宿主细胞蛋白酶切割。然而，在其他方面，可以从宿主细胞中分离出全长蛋白质，并且随后切割信号肽。N末端RSV F信号肽由SEQ ID NO:20的氨基酸(MELLILKANAITTILTAVTFCFASG)组成。因此，例如，在表达和纯化期间从SEQ ID NO:8切割信号肽后，获得具有SEQ ID NO:19的序列的成熟蛋白，并将其用于产生RSV F纳米颗粒疫苗。参见图1。任选地，可以将一个或多个、多至全部RSV F信号肽氨基酸缺失、突变，或者可以将整个信号肽缺失并用不同的信号肽替代以增强表达。保持起始的甲硫氨酸残基以起始表达。

在一些方面，本文所公开的RSV F蛋白仅通过融合结构域中的缺失(任选地其中初级切割位点失活)从野生型株系改变。在其他方面，可以对RSV F蛋白进行另外的改变。通常，将半胱氨酸残基突变。通常，不将N连接的糖基化位点突变。参见图1。另外，保留了抗原位点II，因为帕利珠单抗(Palivizumab)抗体能够结合所述位点，所述抗原位点II在本文中也称为帕利珠单抗位点。莫他韦珠单抗(Motavizumab)抗体也在位点II结合。通过引用并入的另外的合适RSV-F蛋白发现于美国公开案US 2011/0305727中，具体地包括含有跨越在此文献图1C中所披露的残基100至150的序列的RSV-F蛋白。

在某些其他方面，RSV F1或F2结构域可以具有相对于如SEQ ID NO:2所示的野生型株系的修饰。例如，F1结构域可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个改变，其可以是突变或缺失。类似地，F2结构域可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个改变，其可以是突变或缺失。F1和F2结构域可以各自独立地保留与野生型序列至少90％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

在特定的例子中，RSV纳米颗粒药物产品可以含有约0.025％至约0.03％PS80，以及在约270μg/mL至约300μg/mL、或约60μg/mL至约300μg/mL范围内的RSV F。在其他方面，纳米颗粒药物产品可以在组合物中含有约0.035％至约0.04％PS80、以及在300μg/mL至约500μg/mL的RSV F。在又其他方面，纳米颗粒药物产品可以在组合物中含有约0.035％至约0.04％PS80、以及在350-500μg/mL的RSV F。

因为抗原和去污剂的浓度可以变化，所以各自的量能以非离子型去污剂:蛋白质的摩尔比提及。例如，通过使用通过ELISA/A280测量的PS80浓度和抗原的蛋白质浓度以及它们各自的分子量来计算PS80与蛋白质的摩尔比。用于计算的PS80的分子量为1310，并且使用RSV F为例，RSV F的分子量为65kD。将摩尔比计算如下：(PS80浓度×10×65000)÷(1310×以mg/mL计的RSV F浓度)。因此，例如，通过蛋白质测量的纳米颗粒浓度为270μg/mL，并且PS80浓度为0.015％和0.03％。这些分别具有如下的PS80与RSV F蛋白的摩尔比：27:1(即0.015x 10x 65000/(1310x 0.27))和55:1。

在特定方面，摩尔比在约30:1至约80:1、约30:1至约70:1、约30:1至约60:1、约40:1至约70:1、或约40:1至约50:1范围内。通常，替代非离子型去污剂是PS80，并且PS80:蛋白质的摩尔比为约30:1至约50:1。对于RSV-F糖蛋白，具有在35:1至约65:1范围内的摩尔比(以及特别是约45:1的比率)的纳米颗粒是尤其稳定的。

经修饰的抗原

本文所公开的抗原涵盖那些抗原的变异和突变体。在某些方面，抗原可以与所公开的抗原共享同一性。通常，并且除非在具体鉴定的抗原的上下文中特别定义，否则百分比同一性可以为至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。可以使用比对程序ClustalW2(可获自www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)来计算百分比同一性。可以将以下默认参数用于配对比对：蛋白权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet；空位开放＝10；空位延伸＝0.1。

在特定方面，纳米颗粒中所含的蛋白质由此蛋白质组成。在其他方面，纳米颗粒中所含的蛋白质包含此蛋白质。向蛋白质本身的添加可能是出于多种目的。在一些方面，抗原可以在N末端、C末端或两者处延伸。在一些方面，所述延伸物是对诸如纯化或检测等功能有用的标签。在一些方面，所述标签含有表位。例如，所述标签可以是聚谷氨酸标签、FLAG标签、HA标签、聚组氨酸标签(具有约5-10个组氨酸)、Myc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、绿色荧光蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、硫氧还蛋白标签或Fc标签。在其他方面，所述延伸物可以是与蛋白质融合以增强表达的N末端信号肽。尽管此类信号肽通常在细胞中表达期间被切割，但是一些纳米颗粒可包含具有完整信号肽的抗原。因此，当纳米颗粒包含抗原时，所述抗原可含有延伸物，并且因此当掺入纳米颗粒中时可以是融合蛋白。出于计算与序列的同一性的目的，不包括延伸物。

在一些方面，抗原可以是截短的。例如，N末端可被截短约10个氨基酸、约30个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或约200个氨基酸。代替N末端或除了N末端之外，C末端可以是截短的。例如，C末端可被截短约10个氨基酸、约30个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或约200个氨基酸。出于计算与具有截短的蛋白质的同一性的目的，在蛋白质的剩余部分上测量同一性。

组合纳米颗粒

如本文所用，组合纳米颗粒是指诱导针对两种或更多种不同病原体的免疫应答的纳米颗粒。取决于特定的组合，病原体可以是同一物种的不同株系或亚型，或者病原体可以是不同的物种。为了制备组合纳米颗粒，可以通过在去污剂交换阶段将来自多种病原体的糖蛋白结合，从而将它们组合到单个纳米颗粒中。在去污剂交换前使糖蛋白与柱结合允许在去污剂核心周围形成多种糖蛋白类型，以提供组合纳米颗粒。

本公开文本还提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物通过组合各自诱导针对不同病原体的应答的两种或更多种纳米颗粒来诱导针对两种或更多种不同病原体的免疫应答。任选地，疫苗组合物可以含有单独的或与另外的纳米颗粒组合的一种或多种组合纳米颗粒，与另外的纳米颗粒组合的目的是最大化针对多种病原体的免疫应答，同时减少向受试者给予的疫苗组合物的数量。

当在一些方面将病原体连接时，此类组合物是特别令人希望的。在一个例子中，组合物可以含有针对官方每年鉴定为形成特定年份的季节性流感的株系的纳米颗粒。通常，对于季节性流感疫苗，疫苗组合物含有与诱导针对三种、四种或五种流感亚型的株系的免疫应答的HA和/或NA纳米颗粒组合的RSV抗原。因此，可以在疫苗组合物中组合不同的流感株系。在一些方面，组合纳米颗粒可以含有来自第一株系的HA蛋白和来自第二株系的NA蛋白。在其他方面，纳米颗粒可以含有来自相同或不同亚型的一种或多种HA蛋白以及一种或多种NA蛋白。例如，纳米颗粒可以含有选自以下亚型的一种或多种HA纳米颗粒：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16，和/或选自以下亚型的一种或多种NA纳米颗粒：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。在系统发育上，HA蛋白和NA蛋白被分成多个组。对于HA，组1含有H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16，并且组2含有H3、H4、H7、H10、H14和H15。NA蛋白也形成两个组：组1含有N1、N4、N5和N8，并且组2含有N2、N3、N6、N7和N9。在某些方面，抗原可以具有与天然流感HA蛋白和/或与NA蛋白至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少97％的同一性、或至少99％的同一性。

在另一个例子中，如上所讨论，流感和RSV二者都引起呼吸系统疾病恶化，并且因此可以将HA、NA和/或RSV F混合到组合纳米颗粒中，或者可以将多种纳米颗粒组合在免疫原性组合物中，以诱导针对RSV和一种或多种流感株系的应答。

疫苗组合物

本文所公开的组合物可以预防性地或治疗性地使用，但是通常将是预防性的。因此，本公开文本包括用于治疗或预防感染的方法。所述方法涉及向受试者给予治疗量或预防量的本公开文本的免疫原性组合物。优选地，药物组合物是提供保护作用的疫苗组合物。在其他方面，所述保护作用可以包括在一定百分比的暴露人群中改善与感染相关的症状。例如，与未经治疗的受试者相比，取决于病原体，所述组合物可以预防或减少选自以下的一种或多种病毒疾病症状：发热疲劳、肌肉疼痛、头痛、喉咙痛、呕吐、腹泻、皮疹、肾和肝功能受损的症状、内出血和外出血。

可以在各种赋形剂、缓冲液等的存在下将纳米颗粒配制用于作为疫苗给予。例如，疫苗组合物可以含有磷酸钠、氯化钠和/或组氨酸。磷酸钠可以按约10mM至约50mM、约15mM至约25mM、或约25mM存在；在特定情况下，存在约22mM的磷酸钠。组氨酸可以按约0.1％(w/v)、约0.5％(w/v)、约0.7％(w/v)、约1％(w/v)、约1.5％(w/v)、约2％(w/v)、或约2.5％(w/v)存在。氯化钠(当存在时)可以为约150mM。在某些组合物(例如流感疫苗)中，氯化钠可以按更高的量存在，包括约200mM、约300mM、或约350mM。

某些纳米颗粒(特别是RSV F纳米颗粒)在弱酸性pH水平下具有改进的稳定性。例如，含有纳米颗粒的组合物的pH范围可以为约pH 5.8至约pH 7.0、约pH 5.9至约pH 6.8、约pH 6.0至约pH 6.5、约pH 6.1至约pH 6.4、约pH 6.1至约pH 6.3、或约pH 6.2。通常，RSV F蛋白纳米颗粒的组合物为约pH 6.2。在其他纳米颗粒中，组合物可以趋于中性；例如，流感纳米颗粒可以为约pH7.0至pH 7.4；通常为约pH 7.2。

佐剂

在某些实施方案中，本文所公开的组合物可以与一种或多种佐剂组合以增强免疫应答。在其他实施方案中，所述组合物是在没有佐剂的情况下制备的，并且因此可以用来作为无佐剂组合物给予。有利地，当作为单剂量给予时，本文所公开的无佐剂组合物可以提供保护性免疫应答。诱导稳健的免疫应答的无明矾组合物尤其可用于约60岁以上的成人。

基于铝的佐剂

在一些实施方案中，佐剂可以是明矾(例如AlPO₄或Al(OH)₃)。通常，纳米颗粒基本上与明矾结合。例如，纳米颗粒可以是至少80％结合、至少85％结合、至少90％结合或至少95％结合至明矾。通常，在组合物中，纳米颗粒是92％至97％结合至明矾。每剂量存在的明矾的量通常在约400μg至约1250μg之间的范围内。例如，明矾可以按每剂量约300μg至约900μg、约400μg至约800μg、约500μg至约700μg、约400μg至约600μg、或约400μg至约500μg的量存在。通常，对于120μg蛋白纳米颗粒的一个剂量，明矾以约400μg存在。

基质佐剂

使用仅一种皂苷级分来形成本公开文本的基质颗粒。用于产生皂苷级分以形成基质颗粒的几种方法是合适的。级分A、B和C描述于美国专利号6,352,697中并且可以如下进行制备。通过色谱法分离来自Quil A(一种粗制水性皂树(Quillaja saponaria Molina)提取物)的亲脂级分，并将其用水中的70％乙腈洗脱以回收亲脂级分。然后通过半制备型HPLC分离这种亲脂级分，使用在酸性水中的从25％至60％乙腈的梯度进行洗脱。在本文中称为“级分A”或“QH-A”的级分是在约39％乙腈下洗脱的级分。在本文中称为“级分B”或“QH-B”的级分是或对应于在大约47％乙腈下洗脱的级分。在本文中称为“级分C”或“QH-C”的级分是或对应于在大约49％乙腈下洗脱的级分。关于级分纯化的另外信息可以在美国专利号5,057,540中找到。当如本文所述制备时，皂树(Quillaja saponaria Molina)的级分A、B和C各自代表具有可定义特性的化学上紧密相关分子的组或家族。获得所述级分的色谱条件使得就洗脱曲线和生物活性而言批次间重现性是高度一致的。

已经描述了其他可用的皂苷级分。级分B3、B4和B4b描述于EP 0436620中。级分QA1-QA22是描述的EP03632279B2，Q-VAC(Nor-Feed,AS Denmark)，皂树(Quillajasaponaria Molina)Spikoside(lsconova AB,Ultunaallén 2B,756 51乌普萨拉,瑞典)。可以使用EP 0 3632 279B2中的级分QA-1、QA-2、QA-3、QA-4、QA-5、QA-6、QA-7、QA-8、QA-9、QA-10、QA-11、QA-12、QA-13、QA-14、QA-15、QA-16、QA-17、QA-18、QA-19、QA-20、QA-21、和QA-22，尤其是QA-7、QA-17、QA-18、和QA-21。如EP0 3632 279B2中(尤其是在第6页以及在第8和9页中的实施例1中)所述获得它们。在实施方案中，来自皂树(Quillaja saponaria Molina)的皂苷级分选自QA 1-21中的任一个。

其他皂苷级分(如QS-7和QS-21级分)，它们的产生和使用描述于美国专利号5,057,540；6,231,859；6,352,697；6,524,584；6,846,489；7,776,343，和8,173,141中。这些级分可以用于生产用于在本文所公开的方法和组合物中使用的基质。

在一些方面，含有基质颗粒的组合物仅具有一种皂苷级分。在其他方面，组合物可以含有多种类型的基质颗粒，所述多种类型的基质颗粒各自含有一种皂苷级分/颗粒类型，但是所述颗粒具有不同的级分。

各自具有一种皂苷级分的基质颗粒可以按任何重量％组合存在于组合物中。在特定方面，组合物可以含有按重量计0.1％至99.9％、按重量计5％至95％、按重量计10％至90％、按重量计15％至85％、按重量计20％至80％、按重量计25％至75％、按重量计30％至70％、按重量计35％至65％、按重量计40％至60％、按重量计45％至55％、按重量计40至60％、或按重量计50％的含有第一皂苷级分的基质颗粒，其余部分由含有不同皂苷级分的基质颗粒组成。

组合物中每种基质的量可作为占总组合物的百分比而变化。例如，级分A基质的量可以为约80％(w/w)、约85％(w/w)、约90％(w/w)、约92％(w/w)或约95％(w/w)，在每种情况下其余部分为级分C基质。通常，级分A基质的范围为约80％(w/w)至约95％(w/w)，组合物的其余部分为级分C基质。通常，使用约85％(w/w)的级分A基质，其余部分为级分C基质(即，85:15)。85:15级分A基质和级分C基质组合的具体例子是Matrix-M^TM(Novavax AB,乌普萨拉,瑞典)，其为一种比率为约85比约15的级分A基质和级分C基质的混合物。

其他佐剂

在一些组合物中，可以另外或替代地使用其他佐剂。包括在以下文献中所述的任何佐剂设想在本公开文本的范围内：Vogel等人,“A Compendium of Vaccine Adjuvantsand Excipients(第2版),”(出于所有目的通过引用以其整体并入本文)。其他佐剂包括完全弗氏佐剂(免疫应答的非特异性刺激剂，含有杀死的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis))、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其他佐剂包括GMCSP、BCG、MDP化合物(如thur-MDP和nor-MDP)、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)、MF-59、RIBI(其含有从细菌中提取的三种组分)、MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和在2％角鲨烯/

80乳剂中的细胞壁骨架(CWS)。在一些实施方案中，佐剂可以是少层状脂质囊泡(paucilamellarlipid vesicle)；例如

是在从约100nm至约500nm范围内的少层状非磷脂囊泡。它们包含Brij 72、胆固醇、油酸和角鲨烯。已经显示Novasomes是有效的佐剂(参见，美国专利号5,629,021、6,387,373、和4,911,928)。

给予和剂量

本文所公开的组合物可以经由系统途径或粘膜途径或透皮途径给予或直接给予到特定组织中。如本文所用，术语“系统给予”包括肠胃外给予途径。具体地，肠胃外给予包括皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌内或胸骨内注射、静脉内或肾脏透析输注技术。通常，系统的肠胃外给予是肌内注射。如本文所用，术语“粘膜给予”包括口服、鼻内、阴道内、直肠内、气管内、肠和眼部给予。优选地，给予是肌内的。

可以按单剂量方案或多剂量方案给予组合物。可以在初次免疫方案或在加强免疫方案中使用多剂量。在多剂量方案中，各个剂量可以通过相同或不同的途径给予，所述途径例如为肠胃外初次和粘膜加强、粘膜初次和肠胃外加强等。在一些方面，在先前剂量之后约2周、约3周、约4周、约5周或约6周给予后续加强剂量。然而，通常，将本文所公开的组合物仅给予一次，但仍提供保护性免疫应答。

在一些实施方案中，以μg测量的剂量可以是包括溶质的剂量的总重量，或RSV F纳米颗粒的重量、或RSV F蛋白的重量。使用蛋白质浓度测定(A280或ELISA)来测量剂量。

包括用于小儿给予的抗原剂量可以在约30μg至约300μg、约90μg至约270μg、约100μg至约160μg、约110μg至约150μg、约120μg至约140μg、或约140μg至约160μg的范围内。在特定实施方案中，剂量为约120μg，与明矾一起给予。可以在使用或不使用佐剂的情况下给予某些人群。例如，当给予至年长者时，优选地没有明矾。在某些方面，组合物可以不含添加的佐剂。在此类情况下，可以将剂量增加约10％或约20％。

在一些实施方案中，可以将剂量在约0.1mL至约1.5mL、约0.3mL至约1.0mL、约0.4mL至约0.6mL、或约0.5mL的体积中给予，这是典型的量。

在用于RSV疫苗的特定实施方案中，剂量可以包含约175μg/mL至约325μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约220μg/mL至约280μg/mL、或约240μg/mL至约260μg/mL的RSV F蛋白浓度。

通过引用并入

出于所有目的，将本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请通过引用以其整体并入。

实施例

实施例1

RSV F蛋白的表达和纯化

在杆状病毒表达系统中表达具有SEQ ID NO:8的RSV F蛋白，并且挑选并确认表达RSV F蛋白的重组噬斑。然后通过感染Sf9昆虫细胞扩增重组病毒。在约3MOI(感染复数＝病毒ffu或pfu/细胞)下用杆状病毒感染昆虫细胞培养物。感染后48-72小时收获培养物和上清液。通过以大约800x g离心15分钟来澄清大约30mL的粗制细胞收获物。如下所述纯化含有RSV F蛋白的所得粗制细胞收获物。

在膜蛋白提取方案中使用非离子表面活性剂

NP-9(壬基酚聚氧乙烯醚)。NP-9为粗提取物，使其通过阴离子交换色谱、小扁豆凝集素亲和/HIC和阳离子交换色谱进一步纯化。将洗涤过的细胞通过去污剂处理来裂解，然后进行低pH处理，这导致BV和Sf9宿主细胞DNA和蛋白质沉淀。使中和的低pH处理裂解液澄清，并在进行第二次低pH处理之前在阴离子交换和亲和色谱上进一步纯化。

将亲和色谱用于去除Sf9/BV蛋白、DNA和NP-9，并且浓缩RSV F蛋白。简言之，小扁豆凝集素是含有钙和锰的一种金属蛋白，其可逆地结合含有葡萄糖或甘露糖的多糖和糖基化蛋白。将含RSV F的阴离子交换流过级分加载到小扁豆凝集素亲和色谱树脂(Capto小扁豆凝集素，GE Healthcare)上。糖基化RSV F蛋白选择性地与树脂结合，而非糖基化蛋白和DNA在柱流过中被去除。通过含有高盐和低摩尔浓度的甲基α-D-吡喃甘露糖苷(MMP)的缓冲液去除弱结合的糖蛋白。

此外，还将柱洗涤物用于将NP-9去污剂用表面活性剂聚山梨醇酯80(PS80)进行去污剂交换。为了进行去污剂交换，在RSV F糖蛋白与小扁豆凝集素柱结合之后将柱与0.1％PS80一起孵育。用高浓度的MMP将RSV F蛋白从小扁豆凝集素柱中洗脱。在洗脱之后，将RSVF蛋白三聚体组装成由在去污剂核心中包含的RSV F蛋白三聚体和PS80构成的胶束纳米颗粒。在去污剂交换之后，存在低pH灭活步骤，随后在具有0.1％PS80的缓冲液的存在下在硫酸盐柱上孵育。

将洗脱的材料稀释在含有PS80的溶液中，所述溶液足以按约50的PS80:RSV F蛋白摩尔比提供用于大量储存的药物物质(DS)。通过在包含22mM磷酸钠、0.03％PS80和pH 6.2的磷酸盐缓冲液的溶液中合并RSV F纳米颗粒来获得DS的足够组合物。在去污剂交换期间和之后的每个步骤中，组合物中抗原与PS80的比率保持在35与60之间的摩尔比。使用通过ELISA/A280测量的PS80浓度和RSV F浓度以及它们各自的分子量来计算摩尔比。PS80的分子量为1310，并且RSV的分子量为65kD。

实施例2

疫苗组合物的制备

为了提供用于给予的疫苗产品的纳米颗粒，将药物物质稀释成药物产品，PS80:RSV蛋白摩尔比为约50。在给予之前，将药物物质解冻、稀释并填充到玻璃小瓶或预填充的注射器中，以便在2℃-8℃下储存。纳米颗粒与明矾佐剂结合。添加明矾佐剂并混合以确保约95％的纳米颗粒与明矾结合，意味着在0.5mL体积中每120μg剂量的RSV F纳米颗粒中有约0.4mg。

实施例3

纳米颗粒中的RSV F减少COPD恶化住院

在一项针对年龄在60岁以上的11856名受试者的随机安慰剂对照研究中，在不存在明矾的情况下包含135μg RSV F纳米颗粒的疫苗减少了全因COPD恶化住院(在图3和图4中称为“E-301”)。对受试者跟踪一年以确定疫苗的安全性、免疫原性和功效。令人惊讶的是，RSV F纳米颗粒疫苗的给予在研究的一般人群(p＝0.017)和先前鉴定为具有基线COPD的受试者的研究的亚群(p＝0.14)中均减少了由于COPD恶化而导致的住院。

在由年龄在60岁以上的1600名受试者组成的较小规模的可比较研究中，被给予了RSV F纳米颗粒疫苗的组未经历COPD恶化住院(图3中称为“E-201”)。数据显示，在E-201研究中，与接受安慰剂的801名受试者中有4名相比，接受疫苗的798名受试者中有0名具有住院事件，得到疫苗功效百分比为100％(VE％)。

序列表

<110> Novavax, Inc.

<120> 治疗呼吸系统疾病的方法和组合物

<130> NOVV-075/01WO 305047-2831

<150> US 62/536,235

<151> 2017-07-24

<160> 20

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1725

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 1

atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60

tgttttgctt ctggtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120

agcaaaggct atcttagtgc tctgagaact ggttggtata ccagtgttat aactatagaa 180

ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 240

caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300

ccaccaacaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360

aatgccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt 420

ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcgttgctg tatctaaggt cctgcaccta 480

gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc 540

ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat 600

aaacaattgt tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaatat agaaactgtg 660

atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720

gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttaacta atagtgaatt attgtcatta 780

atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840

gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta 900

gtacaattac cactatatgg tgttatagat acaccctgtt ggaaactaca cacatcccct 960

ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtcc aacatctgtt taacaagaac tgacagagga 1020

tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac aagctgaaac atgtaaagtt 1080

caatcaaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaaataaat 1140

ctctgcaatg ttgacatatt caaccccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca 1200

gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260

aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat 1320

tatgtatcaa ataaagggat ggacactgtg tctgtaggta acacattata ttatgtaaat 1380

aagcaagaag gtaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440

ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaacga gaagattaac 1500

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<210> 2

<211> 574

<212> PRT

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 2

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

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Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

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Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

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Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

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Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

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Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

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Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

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Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

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Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

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Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

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Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

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Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

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Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

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<211> 573

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137（Δ1）缺失

<400> 3

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

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Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

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Leu Ser Lys Lys Gln Lys Gln Gln Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly

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Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu

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Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala

165 170 175

Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137-138（Δ2）缺失

<400> 4

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1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

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Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

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Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu

245 250 255

Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met

260 265 270

Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser

275 280 285

Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr

290 295 300

Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys

305 310 315 320

Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp

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Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln

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Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly

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Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr

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Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val

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Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser

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Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val

465 470 475 480

Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys

485 490 495

Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His

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Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile

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Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 5

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137-139（Δ3）缺失

<400> 5

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

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Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

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Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val

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Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu

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Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser

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Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn

210 215 220

Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val

225 230 235 240

Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser

245 250 255

Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser

260 265 270

Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile

275 280 285

Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly

290 295 300

Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr

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Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg

325 330 335

Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala

340 345 350

Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn

355 360 365

Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe

370 375 380

Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser

385 390 395 400

Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys

405 410 415

Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe

420 425 430

Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser

435 440 445

Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu

450 455 460

Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe

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Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile

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Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln

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Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 6

<211> 570

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137-140（Δ4）缺失

<400> 6

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

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Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

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Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

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Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

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Leu Ser Lys Lys Gln Lys Gln Gln Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile

130 135 140

Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val

145 150 155 160

Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser

165 170 175

Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys

180 185 190

Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys

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Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn

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Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile

275 280 285

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Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly

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Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu

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Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser

355 360 365

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Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser

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Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr

405 410 415

Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser

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Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val

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Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn

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Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu

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<220>

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Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu

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180 185 190

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Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp

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340 345 350

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385 390 395 400

Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys

405 410 415

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<212> PRT

<213> 人工序列

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275 280 285

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305 310 315 320

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Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile

485 490 495

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Ala Phe Ser Asn

<210> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137-142（Δ6）缺失

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Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly

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Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn

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Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser

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Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala

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Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile

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Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys

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Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565

<210> 10

<211> 567

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137-143（Δ7）缺失

<400> 10

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

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Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn

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Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile

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Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser

195 200 205

Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu

210 215 220

Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val

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Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp

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Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln

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Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu

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Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr

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Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr

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Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys

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Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr

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Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly

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Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu

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Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu

485 490 495

Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly

500 505 510

Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile

515 520 525

Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys

530 535 540

Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile

545 550 555 560

Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565

<210> 11

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137-144（Δ8）缺失

<400> 11

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

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Leu Ser Lys Lys Gln Lys Gln Gln Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val

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Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly

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Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp

180 185 190

Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn

195 200 205

Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu

210 215 220

Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met

245 250 255

Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile

260 265 270

Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val

275 280 285

Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro

290 295 300

Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu

305 310 315 320

Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp

325 330 335

Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val

340 345 350

Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro

355 360 365

Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp

370 375 380

Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr

385 390 395 400

Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala

405 410 415

Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp

420 425 430

Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu

435 440 445

Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu

450 455 460

Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe

465 470 475 480

Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala

485 490 495

Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys

500 505 510

Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val

515 520 525

Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala

530 535 540

Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn

545 550 555 560

Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565

<210> 12

<211> 565

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 137-145（Δ9）缺失

<400> 12

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Gln Lys Gln Gln Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala

130 135 140

Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser

145 150 155 160

Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val

165 170 175

Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys

180 185 190

Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile

195 200 205

Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile

210 215 220

Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr

225 230 235 240

Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro

245 250 255

Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val

260 265 270

Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu

275 280 285

Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

290 295 300

Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn

325 330 335

Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln

340 345 350

Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser

355 360 365

Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys

370 375 380

Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser

385 390 395 400

Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser

405 410 415

Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr

420 425 430

Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr

435 440 445

Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro

450 455 460

Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp

465 470 475 480

Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe

485 490 495

Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser

500 505 510

Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile

515 520 525

Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg

530 535 540

Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn

545 550 555 560

Ile Ala Phe Ser Asn

565

<210> 13

<211> 565

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有野生型融合切割位点的137-145（Δ9）缺失

<400> 13

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala

130 135 140

Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser

145 150 155 160

Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val

165 170 175

Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys

180 185 190

Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile

195 200 205

Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile

210 215 220

Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr

225 230 235 240

Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro

245 250 255

Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val

260 265 270

Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu

275 280 285

Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys

290 295 300

Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn

325 330 335

Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln

340 345 350

Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser

355 360 365

Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys

370 375 380

Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser

385 390 395 400

Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser

405 410 415

Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr

420 425 430

Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr

435 440 445

Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro

450 455 460

Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp

465 470 475 480

Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe

485 490 495

Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly Lys Ser

500 505 510

Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile

515 520 525

Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg

530 535 540

Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn

545 550 555 560

Ile Ala Phe Ser Asn

565

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的弗林蛋白酶切割位点

<400> 14

Lys Lys Gln Lys Gln Gln

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的弗林蛋白酶切割位点

<400> 15

Gln Lys Gln Lys Gln Gln

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的弗林蛋白酶切割位点

<400> 16

Lys Lys Gln Lys Arg Gln

1 5

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的弗林蛋白酶切割位点

<400> 17

Gly Arg Arg Gln Gln Arg

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 弗林蛋白酶切割位点

<400> 18

Lys Lys Arg Lys Arg Arg

1 5

<210> 19

<211> 539

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 经修饰的RSV F蛋白

<400> 19

Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser

1 5 10 15

Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile

20 25 30

Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp

35 40 45

Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala

50 55 60

Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn

85 90 95

Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Gln Lys Gln Gln Ala

100 105 110

Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu

115 120 125

Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val

130 135 140

Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu

145 150 155 160

Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser

165 170 175

Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn

180 185 190

Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val

195 200 205

Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser

210 215 220

Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser

225 230 235 240

Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile

245 250 255

Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly

260 265 270

Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr

275 280 285

Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg

290 295 300

Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala

305 310 315 320

Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn

325 330 335

Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe

340 345 350

Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser

355 360 365

Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys

370 375 380

Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe

385 390 395 400

Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser

405 410 415

Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu

420 425 430

Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe

435 440 445

Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile

450 455 460

Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn

465 470 475 480

Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile

485 490 495

Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu

500 505 510

Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln

515 520 525

Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

530 535

<210> 20

<211> 25

<212> PRT

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 20

Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly

20 25

Claims

1.一种减少人受试者的慢性阻塞性肺病(COPD)恶化的方法，所述方法包括向所述受试者给予纳米颗粒疫苗，其中所述纳米颗粒包含：非离子型去污剂核心和病毒糖蛋白，其中所述病毒糖蛋白与所述核心缔合并且所述去污剂以约0.03％至约0.05％存在。

2.权利要求1所述的方法，其中所述恶化由环境危害引起。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述环境危害是病原体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述病原体是病毒病原体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒病原体选自RSV病毒和流感病毒。

6.根据权利要求1所述的方法，其中如通过住院率确定，恶化的发生率降低了约50％。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述人是至少75岁、至少65岁、优选至少60岁。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子型去污剂选自PS20、PS40、PS60、PS65和PS80。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述病毒糖蛋白选自RSV F蛋白、流感HA蛋白、流感NA蛋白、及其组合。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒糖蛋白是RSV F蛋白，并且非离子型去污剂与病毒糖蛋白的摩尔比为约30:1至约60:1。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述RSV F蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸137-146对应的1至10个氨基酸的缺失以及与SEQ ID NO:2的氨基酸131至136对应的失活的初级弗林蛋白酶切割位点，其中所述初级弗林蛋白酶切割位点通过突变而失活。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组合物基本上不含任何其他去污剂。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述RSV-F蛋白选自SEQ ID NO:1-13、以及SEQID NO:1-13的缺少部分或全部N末端信号肽的变体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述RSV F蛋白包含SEQ ID NO:19。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述RSV F蛋白由SEQ ID NO:19组成。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述非离子型去污剂是PS80。

17.一种减少患有慢性阻塞性肺病(COPD)的人响应于环境危害的COPD恶化的方法，所述方法包括向所述人给予免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含第一纳米颗粒，其中所述第一纳米颗粒包含PS80非离子型去污剂核心和第一病毒糖蛋白，其中所述病毒糖蛋白与所述核心缔合并且所述去污剂以约0.03％至约0.05％存在。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一病毒糖蛋白是RSV F糖蛋白。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述免疫原性组合物包含第二纳米颗粒，其中所述第二纳米颗粒包含PS80非离子型去污剂核心和第二病毒糖蛋白，其中所述第二病毒蛋白是流感HA蛋白。

20.一种用于在治疗患有COPD的人受试者的COPD恶化的方法中使用的免疫原性组合物，其中所述疫苗组合物包含第一纳米颗粒，其中所述第一纳米颗粒包含PS80非离子型去污剂核心和第一病毒糖蛋白，其中所述病毒糖蛋白与所述核心缔合并且所述去污剂以约0.03％至约0.05％存在。