CN111108219B - 使用的水凝胶珠和流动池的遗传物质的空间索引和文库制备 - Google Patents

Abstract

提供了用于在测序流动池的表面上播种序列文库的方法的实施方式，其允许文库在表面上的空间隔离。空间隔离可用于索引来自各个测序文库的序列读出，以提高后续数据分析的效率。在一些示例中，容纳包封的测序文库的水凝胶珠被捕获在测序流动池中，并在液体扩散屏障的存在下降解，以允许测序文库在流动池的表面上进行空间隔离和播种。另外，提供了与配置用于核酸文库制备和单细胞测序的流动池设备有关的系统、方法和组合物的示例。一些示例包括流动池设备，其具有其中装有遗传物质的水凝胶，并且在核酸加工期间将其保留在水凝胶内。

Description

使用的水凝胶珠和流动池的遗传物质的空间索引和文库制备

相关申请

本专利申请要求于2018年4月26日提交的美国临时专利申请号62/663,129和2017年8月1日提交的美国临时专利申请号62/539,949的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

背景技术

边合成边测序(SBS)技术提供高质量的测序数据。但是，SBS方法可能受序列读出长度的限制，因为在某些情况下，SBS测序读出的长度不超过300个核苷酸。SBS技术的短读长度可能涉及大量数据分析，以从SBS程序期间生成的多个重叠的短序列读出进行对齐和重建长核酸序列。预测序步骤(例如对特定核酸分子进行加条形码编码)可以简化数据分析，但也会增加SBS方法的复杂性。

发明内容

本文提供了用于在测序流动池上播种由遗传物质(例如靶核酸分子或含有靶核酸分子的细胞或细胞裂解物)产生的测序文库的方法的示例，其允许在流动池上各个文库的空间隔离。空间隔离可用于索引来自各个测序文库的序列读出，以提高后续数据分析的效率。测序文库的这种“空间索引”允许简化从中产生测序文库的遗传物质的处理和序列重建。在其他改进中，所公开的方法可以减少并且在某些情况下甚至消除对用于识别与特定遗传物质有关的序列读出的繁琐条形码步骤的需要。本文所述的示例还增加了用于靶核酸分子测序的数据分辨率，并进一步简化了基因组的组装(例如对于新的生物)，并提供了对罕见基因变异和靶核酸分子中突变共现的改进识别。

在一些示例中，提供了一种方法，其包括在足以将水凝胶珠捕获在测序流动池的表面上的条件下，将可降解水凝胶珠加载到测序流动池上。在一些示例中，可降解水凝胶珠容纳由包封的遗传物质制备的测序文库。在一些示例中，可降解水凝胶珠容纳包封的遗传物质，并且该方法进一步包括在所捕获的可降解水凝胶珠中从遗传物质制备测序文库。然后将包围所捕获的水凝胶珠的液体扩散屏障加载到测序流动池上，并在存在液体扩散屏障的情况下降解所捕获的水凝胶珠，以允许将测序文库转运和播种到测序流动池的表面上。

遗传物质可以是例如靶核酸分子，例如基因组DNA(例如人基因组DNA)，以及含有靶核酸分子的细胞和细胞裂解物。

在一些示例中，测序文库包含长度为至少150个核苷酸的DNA或RNA。

在一些示例中，液体扩散屏障是油、例如矿物油、硅酮油或全氟化油、或其两种或更多种的组合。在一些示例中，液体扩散屏障是粘稠水溶液，例如包含聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮、普罗尼克葡聚糖、蔗糖、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)/锂皂土、或两种或多种的组合。

在一些示例中，可降解水凝胶珠通过下述中的一种或多种降解：(a)与剪切可逆交联剂的试剂接触，所述交联剂将水凝胶的聚合物交联(例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、三(3-羟基丙基)膦(THP)或两种或多种的组合)；(b)加热至90℃左右；以及(c)将水凝胶珠暴露于剪切光可剪切交联剂的波长的光下，所述交联剂将水凝胶的聚合物交联。

在一些示例中，所述水凝胶珠的直径为约5μm至约120μm。

在一些示例中，所述水凝胶珠是包含容纳遗传物质的中空核的中空水凝胶珠。

水凝胶珠包含直径尺寸足够大的孔，以允许试剂扩散通过珠，同时在水凝胶珠中保留包封的遗传物质和测序文库。在一些示例中，孔的直径为约10nm至约100nm。

在一些示例中，制备测序文库包括对包封在水凝胶珠内的靶核酸分子实施标签化反应。例如，可以在将水凝胶珠捕获在测序流动池上时或在将水凝胶珠加载到测序流动池上之前进行标签化反应。在一些示例中，标签化反应包括使靶核酸分子与包含接头序列和转座体的转座酶混合物接触。

在一些示例中，测序流动池的表面上的水凝胶珠捕获包括下述中的一个或多个：测序流动池的表面上的水凝胶珠的物理约束；和水凝胶珠上的特异性结合对的第一成员对测序流动池表面上(例如位于图案化流动池的孔处)的特异性结合对的第二成员的特异性结合。在一些示例中，水凝胶珠的直径比流动池的高度大约5％至约30％，以将珠物理地约束在流动池中。在一些示例中，测序流动池是图案化流动池，并且特异性结合对的第二成员位于图案化流动池的孔处。

在公开的方法的一些示例中，水凝胶珠的直径为约110μm，且测序流动池的高度为约100μm。

所公开的方法的一些示例进一步包含：将用可降解水凝胶珠包封的靶核酸分子扩增。在一些示例中，扩增涉及多重置换扩增。在一些示例中，包封的靶核酸分子是基因组DNA，并且扩增涉及全基因组扩增。

在一些示例中，未对测序文库进行加条形码以识别各个水凝胶珠。在一些示例中，该方法进一步包括对播种在流动池表面上的测序文库进行测序。在一些示例中，从相应的可降解水凝胶珠播种的测序文库在流动池表面上的位置被用作空间索引，用于由序列文库测序产生的读出。

另外，本文提供了与配置用于核酸文库制备和用于单细胞测序的流动池设备有关的系统、方法和组合物的示例。在一些示例中，流动池设备包括固体载体，其包含具有在其上沉积的可降解水凝胶的表面。在一些示例中，可降解水凝胶包括孔，孔的尺寸设置成允许试剂扩散通过水凝胶，但是过小而不能使遗传物质穿过孔。本文提供的一些示例涉及系统，例如用于单细胞测序的系统。在一些示例中，该系统包括：被配置成保持如本文的流动池设备的台，所述流动池设备包括固体载体，其包含具有在其上沉积的可降解水凝胶的表面；流动池设备本身；以及用于获得测序数据的检测器。本文提供的一些示例涉及在流动池设备上制备核酸文库的方法。在一些示例中，该方法包括：提供如本文的流动池设备，所述设备包括固相载体，其包含具有在其上沉积的可降解水凝胶的表面；从在水凝胶中的遗传物质中分离核酸；和，从分离的核酸制备核酸文库。

应当理解，前述概念和下面更详细讨论的附加概念的所有组合(假设这样的概念并不相互矛盾)被认为是本文公开的发明主题的一部分。

从下面参考附图进行的几个示例的详细描述，本公开的前述和其他特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1是公开的方法的示例的示意图，该方法用于在测序流动池上播种由遗传物质(例如靶核酸分子，例如基因组脱氧核糖核酸(DNA))产生的测序文库，并对测序文库进行测序。

图2A和2B是用于将由遗传物质(例如靶核酸分子，例如基因组DNA)产生的测序文库播种到测序流动池上的所公开的方法的示例的流程图。

图3A-3D是示意图和显微照片，其显示了将容纳遗传物质的水凝胶珠的产生和加载到测序流动池上。(图3A)将与聚合物前体混合的靶核酸分子的溶液加载到液滴发生器盒的样品容器中，将该盒加载到液滴发生器上，并进行处理以产生包含靶核酸分子的聚合物前体的液滴。(图3B)容纳包封的靶核酸分子的水凝胶珠的显微照片。在该示例中，所述珠具有约120μm的平均直径。通过将使用液滴发生器制备的液滴暴露于溶解在油中的自由基引发剂，或将液滴暴露于使用UV自由基引发器的UV辐射下，从而形成水凝胶珠。(图3C)在测序流动池上捕获的水凝胶珠的图示和显微照片。在该示例中，珠具有约120μm的平均直径，并加载到其因物理约束在100μm高的流动池通道中而被捕获的测序流动池上。(图3D)将测序流动池插入SBS测序仪中以进行进一步处理和测序。

图4A-4C是显示珠内测序文库制备和流动池播种的示意图和显微照片。(图4A)示出了包含在测序流动池上捕获的包封的靶核酸分子的水凝胶珠的示意图。在该示例中，珠具有约120μm的平均直径，并加载到其因物理约束在100μm高的流动池通道中而被捕获的测序流动池上。所捕获的水凝胶珠的孔尺寸允许酶、化学物质和较小尺寸的寡核苷酸(例如少于50个碱基对)的扩散，但保留较大尺寸的核酸分子(例如大于300个碱基对)。(图4B)显示了从包封在水凝胶珠中的靶DNA珠中制备测序文库的示意图。将包含用于从靶核酸分子制备测序文库的酶和试剂的文库制备溶液加载至流动池，以在水凝胶珠中制备测序文库。在该示例中，测序文库制备通过标签化测定进行。(图4C)示意图和显微照片，其显示了加载到测序流动池上以填充珠之间的空隙体积并包围包含测序文库的所捕获的水凝胶珠的液体扩散屏障。在该示例中，液体扩散屏障是矿物油。然后将流动池加热以降解水凝胶珠，并允许将测序文库转运至捕获测序文库的流动池表面。在另一个示例中，代替或除了向珠加热外，还可以使用含有足够浓度的DTT以解聚珠并释放文库的矿物油。在几种实施方式中，在播种前加热流动池以使文库变性。矿物油的存在抑制了测序文库超出水凝胶珠的直径的扩散。因此，在油的存在下，播种在靠近各水凝胶珠的印迹处发生(根据120μm直径的水凝胶珠，文库播种被限制在约120μm直径区域)。

图5A-5C描绘了用于核酸分子测序的三个不同的工作流程的示意图。

图6描绘了用水凝胶珠播种的流动池的测序结果，所述水凝胶珠容纳具有～100kb的片段尺寸的人基因组DNA，每个珠具有～100个片段。

图7描绘了用水凝胶珠播种的流动池的测序结果，所述水凝胶珠容纳人基因组DNA，其具有～100kb的片段尺寸，每个珠具有～50个片段。在流动池捕获和珠内文库生成之前，通过MDA扩增来扩增水凝胶珠中的基因组DNA。

图8描绘了用水凝胶珠播种的流动池的测序结果，所述水凝胶珠容纳人基因组DNA，其具有～10kb的片段尺寸，每个珠具有～100个片段。在流动池捕获和珠内文库生成之前，通过MDA扩增来扩增水凝胶珠中的基因组DNA。

图9A-9C描绘了示意图(图9A)和一组显微照片(图9B和9C)，其图示了用于所公开的示例的中空水凝胶珠。图9A提供了说明中空水凝胶珠的构造的示意图。第一，形成内水凝胶层(内核)以容纳包封的样品(例如遗传物质，例如细胞或靶核酸分子)。然后将内核用外水凝胶层(外壳)包封。然后使用不使外水凝胶层解聚的试剂使内水凝胶层解聚，从而使外水凝胶层具有包含遗传物质的中空空间。

图10A-10C示出了示例工作流程的示意图(图10A)、岛尺寸分布图(图10B)和岛图(图10C)，其使用细胞裂解物输入来产生容纳遗传物质的水凝胶珠。

图11示出了由使用顺序播种策略处理的两个不同样品(每个样品带有在标签化步骤期间引入的不同DNA条形码)的叠加水凝胶DNA斑产生的图像。来自第一样品的簇斑用星号(*)标记；来自第二个样品的斑未标记。

图12A和12B显示一组显微照片，其示出用标准短读出文库对水凝胶珠簇之间的粒间空隙进行播种，以最大化流动池的利用率。该显微照片在用标准短读出文库对来自水凝胶珠的水凝胶珠簇之间的粒间空隙进行播种以最大化流动池的利用率之前(图12A)和之后(图12B)，使用用于空间索引的水凝胶珠播种的文库。

图13A和13B描绘了根据制备核酸文库的方法的一个示例的示意性概要。图13A示出了用于在流动池表面上制备包含细胞或基因组DNA的凝胶基质的步骤(a)-(d)。图13B描绘了用于在流动池表面上制备核酸文库的步骤(a)-(e)。

图14A-14F描绘了流动单元内的水凝胶珠俘获的示意性表示。在图14A-14C中，水凝胶珠显示为被俘获在流动池中，并用于使用不同试剂进行下游测定。在图14D中，DNA片段的样品显示为被俘获在水凝胶内，用于在流文库制备。在图14E中，微生物组显示为被俘获在水凝胶内，用于在流文库制备。在图14F中，哺乳动物细胞显示为被俘获在水凝胶珠内，用于流动池上文库制备。

图15A-15C描绘了捕获水凝胶珠的图案化表面的一个示例。图15A示出了在微阵列图案化的流动池上捕获的水凝胶珠的结构的截面图。图15B是位于图案化孔上并在其中心的再水合凝胶珠的明场图像。图15C是示出孔中再水合水凝胶珠的荧光成像的图像。比例尺为50μm。

图16A-16C描绘了本文描述的一个示例中水凝胶珠水合。在图16A中，水凝胶珠显示为脱水的，并且其初始尺寸为直径约70μm。在图16B中，来自图16A的珠被部分水合并开始增大。在图16C中，珠以约105μm的直径完全水合。比例尺为200μm。

图17显示了10-100μm尺寸的可逆水凝胶珠的显微照片，其说明了包封的遗传物质从水凝胶珠中的释放。带有染料染色细菌的可逆水凝胶珠在与还原剂接触后被降解，导致细菌释放。每个图像是300μm x 225μm。

图18A-18B描绘了使用可化学分解的水凝胶珠的流动池文库制备和簇产生的实验结果。在图18A中，油中的水凝胶珠显示为融合在一起。在图18B中，显示了衍生自图18A中所示的水凝胶珠的扩增DNA片段的簇。比例尺为100μm。

图19A-19B描绘了含有染色的人gDNA的水凝胶的荧光成像(图19A)和播种的扩增DNA的簇梯度密度(图19B)。比例尺为100μm。

图20A-20B提供了在流动池设备上制备并测序的人gDNA的测序结果。图20A是来自第一实验的读出的总体Q分数。图20B示出了来自相同实验的错配率。

图21A-21D描绘了流动池文库制备以及簇产生和DNA文库从水凝胶珠释放的示例，如用SYTOX嵌入剂染料所见。图21A是文库制备的示例的示意图。图21B是显微照片，其显示了用SYTOX嵌入剂染料染色的水凝胶珠中的剪切细菌细胞的DNA。图21C是在从水凝胶珠释放DNA期间水凝胶珠的显微照片。图21D是播种并聚集在流动池表面上的DNA文库的显微照片，如SYTOX嵌入剂染料染色所示。比例尺为100μm。

具体实施方式

本文提供的是用于在测序流动池上播种多个序列文库的方法的示例，所述方法允许空间隔离多个文库。空间隔离可用于索引来自各个测序文库的序列读出，以提高后续数据分析的效率。

另外的实施方式涉及用于在流动池设备上制备核酸文库的设备、系统和方法。例如，流动池设备可包括容纳遗传物质的水凝胶，其中水凝胶可被配置成保留遗传物质，同时允许试剂、酶、化学物质和小于约50个碱基对的较小尺寸的引物通过水凝胶。

在标准样品制备方法的一些示例中，每个模板在插入的任一端包含接头，并且经常若干步骤被用于修饰核酸和纯化修饰反应的所需产物两者。这些步骤是在溶液中进行的，然后将适应片段添加到流动池中，在此处通过引物延长反应将其偶联至表面，该引物延长反应将杂交的片段复制到共价附接于表面的引物末端上。这些播种模板然后通过数个扩增循环产生复制模板的单克隆簇。

通过使用转座酶介导的片段化和加标签，涉及在溶液中将核酸转化为接头修饰的模板以准备用于簇形成和测序的步骤数可以降低，或者在某些情况下甚至最小化。该过程在本文中称为“标签化”，涉及通过包含转座酶的转座体络合物对核酸的修饰，所述转座体络合物与包含转座子末端序列的接头复合。标签化可能同时导致DNA的片段化和接头对双链片段的两个链的5'端的连接。在一个示例中，在纯化步骤以去除转座酶之后，通过PCR在适应片段的末端添加额外的序列。在某些情况下，基于溶液的标签化具有缺点，并且可能涉及多个劳动密集型步骤。另外，可能在PCR扩增步骤期间引入偏差。

本文提出的设备、系统和方法克服了这些缺点，并允许在单个固体载体上进行无偏差的样品制备、簇形成和测序，而对样品操作或转移的要求最小化，并且还允许对不同的遗传物质进行测序，例如在固体载体上进行单细胞测序。在一些实施方案中，测序文库的空间索引允许从其产生测序文库的遗传物质(例如靶核酸分子)的简化处理和序列重建(例如通过减少对条形码步骤的需要)。本文所述的实施方式还提高了用于靶核酸分子测序的数据分辨率，并进一步简化了基因组的组装(例如对于新的生物)，并提供了对罕见基因变异和靶核酸分子中突变共现的改进识别。

I、术语总结

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”既指单数也指复数，除非上下文另外明确指出。如本文中所使用的，术语“包含(comprising)”与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放性的，并且不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。尽管可以使用与本文描述的那些相似或等同的许多方法和材料，但是本文描述了特定的合适的方法和材料。除非上下文另有说明，否则端点对数值范围的引用包括该范围内包含的所有数字(例如1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

在整个说明书中，对“一个示例”、“示例”、“某些示例”或“一些示例”等的引用意味着结合该示例描述的特定特征、配置、组成或特性包括在本公开的至少一个示例中。因此，在整个说明书中这些短语在各个地方的出现不一定是指本公开的相同示例。

在本公开中，参考形成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则相似的符号标识相似的组件。在具体的说明书、附图和权利要求中描述的说明性示例并不意味着是限制性的。在不脱离本文所呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他示例，并且可以进行其他改变。将容易理解的是，可以以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计如本文一般性地描述的以及在附图中示出的本公开的各方面，所有这些都被明确地预想在本文中。

对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进行。并且，适当地可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。此外，在一个或多个示例中，可以以任何合适的方式组合特定的特征、配置、组成或特性。

在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。为了便于查看各个示例，提供了以下术语解释：

接头：一种线性寡核苷酸，其可以通过例如连接或标签化而与核酸分子融合。在一些示例中，接头基本上不与样品中存在的任何靶序列的3'端或5'端互补。在一些示例中，合适的接头长度为约10-100个核苷酸、约12-60个核苷酸或约15-50个核苷酸的范围内。通常，接头可以包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些方面，接头可在一个或多个位置包括一个或多个可剪切基团。在另一方面，接头可以包含与引物的至少一部分互补的序列，所述引物例如是包含通用核苷酸序列、例如P5或P7序列的引物。在一些示例中，接头可以包括条形码(在本文中也称为标签或索引)以辅助下游纠错、识别或测序。术语“接头(adapter)”和“接头(adaptor)”可互换使用。

在一些示例中，可以修饰接头以防止多连体的形成，例如通过添加防止在一端或两端延长接头的封闭基团。3'封闭基团的示例包括3'-间隔子C3、双脱氧核苷酸和附接于基底。5'封闭基团的示例包括去磷酸化的5'核苷酸、和附接于基底。

在一些示例中，接头可以包含间隔子多核苷酸，其长度可以是1至20个核苷酸、例如1至15个、或1至10个核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。在一些示例中，间隔子包括10个核苷酸。在一些示例中，间隔子是多T间隔子，例如10T间隔子。间隔子核苷酸可以被包括在多核苷酸的5'端，其可以通过与多核苷酸的5'端的附接而附接至合适的载体。可以通过存在于多核苷酸的5'端的含硫亲核试剂、例如硫代磷酸酯来实现附接。在一些示例中，多核苷酸将包括多T间隔子和5'硫代磷酸酯基。

扩增(amplify)、扩增(amplifying)和扩增(amplification)：一种动作或过程，通过其将至少一部分核酸分子复制或拷贝到至少一个其他核酸分子中。在一些示例中，可以使用等温条件进行这种扩增；在其他示例中，这种扩增可以包括热循环。在一些示例中，扩增是多重扩增，其包括在单个扩增反应中同时扩增多个靶序列。扩增反应的非限制性示例包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增反应(SDA)、滚环扩增反应(RCA)、基于多个退火和成环的扩增循环(MALBAC)、转录介导的扩增(TMA)方法(例如NASBA)、环介导的扩增方法(例如使用环形成序列的“LAMP”扩增)。被扩增的核酸分子可以是包含DNA或核糖核酸(RNA)、或DNA和RNA的混合物(包括修饰的DNA和/或RNA)的DNA，或者由上述组成的DNA，或者衍生自上述的DNA。一种或多种核酸分子扩增产生的产物(例如“扩增产物”或“扩增子”)无论起始核酸是DNA、RNA或两者，都可以是DNA或RNA、或者DNA和RNA核苷或核苷酸两者的混合物，或者它们可以包含修饰的DNA或RNA核苷或核苷酸。“拷贝”并不必然意味着对靶序列的完美序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物(例如脱氧肌苷或脱氧尿苷)、有意的序列改变(例如通过包含可与靶序列杂交但不互补的序列的引物而引入的序列改变)、和/或在扩增过程中发生的序列错误。

几个示例包括固相扩增，其是在固体载体上或与固体载体结合进行的扩增反应，使得全部或部分扩增产物在形成时被固定在固体载体上。固相扩增的非限制性示例包括固相聚合酶链式反应(固相PCR)和固相等温扩增，其是类似于标准溶液相扩增的反应，除了正向和反向扩增引物之一或两者被固定在固体载体上。

扩增位点：测序流动池表面上可产生一个或多个扩增反应扩增子的位点。扩增位点可以进一步配置为捕获、保持或附接于在该位点产生的至少一个扩增子。

阵列：可以根据相对位置彼此区分的多个位点的群。可以根据阵列中位点的位置将位于阵列的不同位点的不同分子彼此区分开。阵列的单个位点可包括一个或多个特定类型的分子。例如，位点可以包括具有特定序列的单个靶核酸分子，或者位点可以包括具有相同序列(和/或其互补序列)的几个核酸分子。阵列的位点可以是位于同一基底上的不同特征。示例特征包括但不限于基底中的孔、基底中或基底上的珠(或其他颗粒)、基底的突起、基底上的脊或基底中的通道。阵列的位点可以是各自带有不同分子的分开的基底。可以根据基底所结合的表面上的位置，或者根据基底在液体或凝胶中的位置，来识别附接在分开的基底上的不同分子。其中分开的基底位于表面上的示例阵列包括但不限于在孔中具有珠的那些阵列。

捕获：将靶实体(例如水凝胶珠)固定在目标表面(例如流动池表面)上。捕获位点是测序流动池表面上的位点，可在其中捕获一个或多个水凝胶珠或靶核酸分子的适应片段。

捕获剂：能够附接、保留或结合于靶分子(例如靶核酸)的材料、化学物质、分子或其部分。示例捕获剂包括但不限于与靶核酸的至少一部分互补的捕获核酸(本文也称为捕获寡核苷酸)、受体-配体结合对的成员(例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)、能够结合至靶核酸(或与其附接的连接部分)、或能够与靶核酸(或与其附接的连接部分)形成共价键的化学试剂。

水凝胶和水凝胶珠：一种由有机聚合物(天然或合成)形成的胶体凝胶，其通过共价键、离子键或氢键交联，以形成三维开放晶格结构，所述结构捕获水分子以形成凝胶。在几个示例中，水凝胶珠是球形的，尽管其他形状也是可能的。在一些示例中，在所公开的方法中使用的水凝胶和水凝胶珠包括60-90％的流体(例如水)和10-30％的聚合物。在某些示例中，水凝胶或水凝胶珠的水含量为约70-80％。

生物相容性水凝胶或水凝胶珠是对活细胞无毒的水凝胶或水凝胶珠，并且可以使氧气和营养物质充分扩散到捕获的细胞中，以保持活力。

可降解水凝胶或水凝胶珠是可以选择性地解聚的水凝胶或水凝胶珠。解聚减少或破坏了水凝胶的晶格结构，这增加了孔隙率至大核酸分子(例如大于1kb)可以扩散通过水凝胶的程度。降解时间是聚合物组成和形态的函数。

水凝胶孔隙率：由开放空间(例如孔或其他开口)组成的水凝胶的分数体积(无量纲)。因此，孔隙率衡量的是材料中的空隙空间，是空隙体积占总体积的比例，以0至100％之间的百分比(或0至1之间的分数)表示。在一些示例中，水凝胶的孔隙率可在约50％至约99％、约75％至约99％、或约80％至约95％的范围内。

索引：一种核苷酸序列，其可用作分子标识符和/或条形码以标签化核酸，和/或识别核酸来源。在一些示例中，索引可用于识别单个核酸或核酸的亚群。

液体扩散屏障：一种液体，其中多核苷酸几乎没有溶剂化。本文公开的测序文库难溶于液体扩散屏障。在一个非限制性示例中，液体扩散屏障是油、例如矿物油。其他的液体扩散屏障包括阻碍DNA文库扩散的粘稠溶液，例如含有聚合物的缓冲液，所述聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克葡聚糖、蔗糖等。液体扩散屏障也可以是温度响应性凝胶，其中它在非播种温度下是非粘稠溶液，并且在加热至播种条件后变成凝胶并形成DNA扩散的屏障。示例包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)/锂皂土纳米颗粒络合物。

核酸分子：任意长度的核苷酸的聚合形式，并且可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或它们的混合物。该术语应理解为包括由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物作为等价物，并且适用于单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。本文所用的术语还涵盖cDNA，其是由RNA模板例如通过逆转录酶的作用而产生的互补或复制DNA。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链DNA，以及三链、双链和单链RNA。术语核酸分子和多核苷酸在本文可互换使用。

当涉及核酸分子使用时，术语“靶”在本文阐述的方法的上下文中旨在作为核酸的语义标识符，并且不一定限制核酸的结构或功能，除非明确指出。

核酸分子中的核苷酸可以包括天然存在的核酸及其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性的方式与核酸杂交，或者能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的骨架。类似物结构可具有替代的骨架连接，包括本领域已知的各种骨架。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如在DNA中发现)或核糖(例如在RNA中发现)。核酸可包含本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任何类似物。核酸可包括天然或非天然碱基。在这方面，天然DNA可以具有一个或多个选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤中的碱基，而核糖核酸可以具有一个或多个选自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤中的碱基。可以包含在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。非天然碱基的示例包括锁定核酸(LNA)和桥连核酸(BNA)。可将LNA和BNA碱基整合到DNA寡核苷酸中，并增加寡核苷酸杂交的强度和特异性。

P5和P7：当提及通用P5或P7序列、或用于捕获和/或扩增目的的P5或P7引物时，可以使用P5和P7。P5'和P7'分别表示P5和P7的互补序列。将理解的是，任何合适的通用序列都可以用于本文提出的方法中，并且P5和P7的使用仅是示例。在一些示例中，P5序列包含由SEQ ID NO:1定义的序列(AATGATACGGCGACCACCGA)，并且P7序列包含由SEQ ID NO：2定义的序列(CAAGCAGAAGAGACGGCATACGA)。WO2007/010251、WO2006/064199、WO2005/065814、WO2015/106941、WO1998/044151和WO2000/018957的公开内容举例说明了P5和P7或其互补序列在流动池上的非限制性用途，其全部内容通过引用整体并入本文。

引物：可以与目标序列杂交的核酸分子。在一些实施方案中，引物用作基底，核苷酸可通过聚合酶在其上聚合。然而，在一些示例中，引物可掺入到合成的核酸链中并提供一个位点，另一引物可与该位点杂交以引发与合成的核酸分子互补的新链的引物合成。引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些示例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。

反应剂：一种试剂或两种或多种试剂的混合物，其可用于与样品反应、相互作用、稀释或添加至样品，并且可包括例如用于核酸扩增、标签化和测序反应中的试剂，包括例如缓冲液、化学试剂、酶、聚合酶、尺寸小于50个碱基对的引物、模板核酸、核苷酸、标记、染料或核酸酶。在一些示例中，反应剂包括溶菌酶、蛋白酶K、无规六聚体、聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲液或二价阳离子。在一些示例中，反应剂可包括裂解剂、核酸纯化剂、DNA扩增剂、标签化剂、PCR剂或用于遗传物质加工的其他试剂。

播种测序文库：将靶核酸分子的适应片段固定在测序流动池的固体载体上。

测序流动池：包括表面的腔室，一种或多种流体反应剂可以流过该表面，并且测序文库的适应片段可以在其上转运和结合。可以容易地在本公开的方法中使用的测序流动池和相关的流体系统以及检测平台的非限制性示例例如在Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)；WO04/018497；US7,057,026；WO91/06678；WO07/123744；7,329,492；US7,211,414；US7,315,019；US7,405,281和US2008/0108082中描述，通过引用将其全部内容合并于此。

测序流动池包括具有在其上结合测序文库的表面的固体载体。在一些示例中，表面包含捕获核苷酸的坪，其可以结合测序文库的适应片段。在一些示例中，该表面是图案化的表面。“图案化表面”是指固体载体的暴露表面中或表面上的不同区域(例如扩增位点)的布置(例如阵列)。例如，一个或多个区域可以是其中存在一种或多种扩增和/或捕获引物的特征。所述特征可以由不存在引物的间隙区域隔开。在一些示例中，图案可以是以行和列计的特征的x-y格式。在一些示例中，图案可以是特征和/或间隙区域的重复布置。在一些示例中，图案可以是特征和/或间隙区域的随机布置。在一些示例中，表面是图案化的表面，其包含具有与测序文库的适应片段结合的捕获和/或扩增核苷酸的孔的阵列，在孔之间的间隙区域缺少捕获和/或扩增核苷酸。

图案化表面中的特征可以是玻璃、硅、塑料或其他合适固体上的孔阵列中的孔(例如微孔或纳米孔)，其具有图案化的共价连接的凝胶(例如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺)(PAZAM，参见例如美国公开号2013/184796、WO2016/066586和WO2015/002813，通过引用将其全部内容并入本文)。该方法生成用于测序的凝胶垫，该凝胶垫在具有大量循环的测序运行中可以保持稳定。聚合物与孔的共价连接有助于在各种用途期间在结构化基底的整个寿命中将凝胶保持在结构化特征中。但是，在许多示例中，凝胶不必与孔共价连接。例如，在某些条件下，可以使用未共价附接于表面的孔的不含硅烷的丙烯酰胺(SFA，参见例如美国专利号8,563,477，其全部内容通过引用并入本文)作为凝胶材料。可以在本文阐述的方法中使用的具有图案化表面的流动池的示例在美国专利号8,778,848、8,778,849和9,079,148、以及美国公开号2014/0243224中描述，其全部内容通过引用整体并入本文。

图案化表面中的特征可以具有多种密度中的任一种，包括例如至少10(例如至少100、至少500、至少5,000、至少10,000、至少50,000、至少约100,000、至少约1,000,000或至少约5,000,000或更多)个特征/cm²。

测序文库：一个或多个靶核酸分子的核酸片段或片段的扩增子的集合。在几种实施方式中，测序文库的核酸片段在其3'和5'端与已知的通用序列(例如P5和P7序列)连接。在几个示例中，测序文库由如本文所述的包封在水凝胶或水凝胶珠内的一个或多个靶核酸分子制备。

标签化：通过转座体络合物对核酸分子的修饰，以使核酸分子片段化，并在单个步骤中将接头偶联至片段的5'和3'端。标签化反应可用于制备测序文库。标签化反应将随机片段化和接头连接合并为一个步骤，以提高测序文库制备过程的效率。

转运：分子在流体中的运动。该术语可以包括被动转运，例如分子沿其浓度梯度的移动(例如被动扩散)。该术语还可以包括主动转运，由此分子可以沿着分子的浓度梯度或逆着浓度梯度移动。因此，转运可包括施加能量以使一个或多个分子沿期望的方向运动或运动至期望的位置，例如扩增位点。

转座体络合物：包含整合识别位点的整合酶和核酸。转座体络合物是由转座酶和能够催化转座反应的转座酶识别位点形成的功能络合物(参见例如Gunderson et al.，WO2016/130704)。整合酶的示例包括但不限于整合酶或转座酶。整合识别位点的示例包括但不限于转座酶识别位点。

在足够……条件下：用于描述允许期望活动的任何环境的短语。

通用核苷酸序列：两个或更多个核酸分子共有的序列区域，其中分子也具有彼此不同的序列区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可以允许使用通用捕获核酸的群来捕获多种不同的核酸，所述通用捕获核酸例如为与通用序列、例如通用捕获序列的一部分互补的捕获寡核苷酸。通用捕获序列的非限制性示例包括与P5和P7引物相同或互补的序列。类似地，分子集合的不同成员中存在的通用序列可以允许使用的通用引物的群来扩增或复制(例如测序)多种不同的核酸，所述通用引物与通用序列、例如通用锚序列的一部分互补。因此，捕获寡核苷酸或通用引物包括可以与通用序列特异性杂交的序列。杂交的两个通用序列称为通用结合对。例如，杂交的捕获寡核苷酸和通用捕获序列是通用结合对。

II、靶核酸分子的空间索引和测序

本文提供的是用于在测序流动池上播种多个序列文库的方法的示例，其允许空间隔离多个文库。空间隔离可用于索引来自各个测序文库的序列读出，以提高后续数据分析的效率。测序文库的这种“空间索引”允许简化从中产生测序文库的遗传物质的处理和序列重建。在其他改进中，所公开的方法避免了繁琐的条形码步骤以识别与特定靶核酸分子有关的序列读出的需要。本文所述的实施方式还提高了用于靶核酸分子测序的数据分辨率，并进一步简化了基因组的组装(例如对于新的生物)，并提供了对罕见基因变异和靶核酸分子中突变共现的改进识别。

图1示出了所公开的示例的某些特征，在此对其进行详细描述。如图1所示，在所公开的方法的一些示例中，容纳包封的靶核酸分子的水凝胶珠被捕获在测序流动池上。从包封在水凝胶珠中的靶核酸分子制备测序文库，并在存在液体扩散屏障的情况下将测序文库播种到流动池表面，这会导致测序文库从各个水凝胶珠中空间隔离播种。在所示的示例中，两个播种测序文库通过簇扩增进行扩增，形成了两组称为“簇斑”的簇。在流动池表面上簇斑的空间索引使靶核酸分子序列得以从来自各个簇斑的较短序列读出进行重建。

图2A示出了用于将与特定遗传物质有关的测序文库播种到测序流动池上的示例方法100。

在步骤102，在测序流动池上捕获容纳包封的遗传物质(例如靶核酸分子或包含靶核酸分子的细胞)的可降解水凝胶珠。将珠在足以将水凝胶珠捕获到流动池上的条件下，加载到测序流动池上。珠在流动池上的捕获可以例如通过水凝胶珠在流动池上的物理约束来实现，例如其中水凝胶珠的直径比流动池的高度大约10％。

在步骤104，从所捕获的水凝胶珠中的遗传物质制备测序文库。在几个示例中，水凝胶珠包括孔，其允许试剂扩散通过水凝胶珠，同时将遗传物质保留在珠内。通过使合适的酶、试剂和组分流过流动池，从所捕获的水凝胶珠中的遗传物质制备测序文库。酶、试剂和组分穿过水凝胶珠的孔，用于测序文库的制备，而遗传物质(例如靶核酸分子)和所得的测序文库仍被包封在水凝胶珠中。其结果是，各个水凝胶珠容纳由包封的遗传物质产生的分离的测序文库。

在步骤106，将液体扩散屏障加载到测序流动池上以包围水凝胶珠。液体扩散屏障是液体，在其中包封在水凝胶珠中的测序文库几乎没有溶剂化。当在步骤108中降解珠时，用液体扩散屏障包围所捕获的水凝胶珠抑制了测序文库在珠体积之外的扩散。

在步骤108，使水凝胶珠降解，以允许通过例如被动扩散将测序文库转运至测序流动池的表面。测序文库与流动池表面的捕获剂结合。液体扩散屏障抑制测序文库扩散超过水凝胶珠的直径。因此，在液体扩散屏障的存在下，播种发生在每个水凝胶珠的印迹附近。在一些示例中，在测序步骤之前，进行簇扩增反应以扩增流动池表面上的测序文库。来自单个珠组的播种核酸分子一起作为流动池上的簇斑。已知每个簇斑内部的核酸分子都来自单个水凝胶珠，简化了序列读出的后续分析以及最初包封在水凝胶珠中的靶核酸序列的重建。

图2B示出了用于将与特定遗传物质(例如靶核酸分子)有关的测序文库播种到测序流动池上的示例方法200。

在步骤202，在测序流动池上捕获容纳包封的由遗传物质(例如靶核酸分子或含有靶核酸分子的细胞)制备的测序文库的可降解水凝胶珠。在将水凝胶珠捕获到测序流动池上之前，制备珠以包封遗传物质。水凝胶珠包括孔，其允许试剂扩散通过水凝胶珠，同时将遗传物质保留在珠内。通过用适当的酶、试剂和组分孵育包封遗传物质的珠以产生测序文库，从所捕获的水凝胶珠中的遗传物质制备测序文库。酶、试剂和组分穿过水凝胶珠的孔，用于测序文库的制备，而遗传物质和所得的测序文库仍包封在水凝胶珠中。其结果是，各个水凝胶珠容纳由包封的遗传物质产生的分离的测序文库。然后在足以捕获水凝胶珠在流动池上的条件下，将容纳包封的测序文库的可降解水凝胶珠加载到测序流动池上。珠在流动池上的捕获可以例如通过水凝胶珠在流动池上的物理约束来实现，例如，其中水凝胶珠的直径比流动池的高度大约10％。

在步骤204，将液体扩散屏障加载到测序流动池上以包围水凝胶珠。液体扩散屏障是液体，在其中包封在水凝胶珠中的测序文库几乎没有溶剂化。当在步骤206中降解珠时，用液体扩散屏障包围所捕获的水凝胶珠抑制了测序文库在珠体积之外的扩散。

在步骤206，使水凝胶珠降解，以允许通过例如被动扩散将测序文库转运至测序流动池的表面。测序文库与流动池表面的捕获剂结合。液体扩散屏障抑制测序文库扩散超过水凝胶珠的直径。因此，在液体扩散屏障的存在下，播种发生在每个水凝胶珠的印迹附近。在一些示例中，在测序步骤之前，进行簇扩增反应以扩增流动池表面上的测序文库。来自单个珠组的播种核酸分子一起作为流动池上的簇斑。已知每个簇斑内部的核酸分子都来自单个水凝胶珠，简化了序列读出的后续分析以及最初包封在水凝胶珠中的靶核酸序列的重建。

在一些示例中，对播种的测序文库进行测序。可以使用任何适当的测序技术，例如SBS。下面提供了所公开的方法的附加描述。

A.包封遗传物质的可降解水凝胶珠

本文提供的实施方式涉及包封遗传物质(例如靶核酸分子以及含有靶核酸分子的细胞和细胞裂解物)的可降解水凝胶珠。珠可以包括水凝胶聚合物和交联剂，其在存在遗传物质的情况下混合，并且形成包封的遗传物质的水凝胶珠。水凝胶珠可以包括包括孔，其允许试剂扩散通过水凝胶珠，同时将遗传物质保留在珠内，从而允许反应在珠内发生。

可以包封在水凝胶珠内的靶核酸分子的非限制性示例包括DNA，例如基因组或cDNA；RNA，例如mRNA，sRNA或rRNA；或DNA和RNA的杂交物。

可以从其获得遗传物质(例如靶核酸分子)的示例生物样品包括例如来自下述的那些：哺乳动物如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠；有蹄类动物、马、绵羊、猪、山羊、牛、猫、狗；灵长类动物、人或非人灵长类动物；植物，如拟南芥、玉米、高粱、燕麦、小麦、大米、菜籽或大豆；藻类，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；线虫，如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；昆虫，如果蝇、蚊子、果蝇、蜜蜂或蜘蛛；鱼，如斑马鱼；爬行动物；两栖动物，如青蛙或非洲爪蟾；粘菌；真菌，如卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、Takifugu rubripes、酵母菌、酿酒酵母(Saccharamoyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；或恶性疟原虫。遗传物质也可以从原核生物中获得，例如细菌、大肠杆菌、葡萄球菌或肺炎支原体；古细菌；丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒等病毒；或类病毒。靶核酸分子可以从上述生物的同质培养物或种群中获得，或替代地例如在社区或生态系统中，从几种不同生物的集合中获得。遗传物质不必从天然来源获得，而可以使用已知技术合成。

在一些示例中，可以从单细胞的遗传物质获得用于包封在水凝胶珠内的靶核酸分子。例如，单细胞可以被包封在水凝胶珠中，并且使用珠内分离测定从单细胞中分离出核酸分子(例如基因组DNA)。

在一些示例中，可从包封在水凝胶珠内的细胞裂解物获得用于包封在水凝胶珠内的靶核酸分子。从裂解物中在珠中制备靶核酸分子(例如基因组DNA)，并对其进行处理以产生测序文库，以用于本文提供的方法。

用水凝胶珠包封的遗传物质具有足够的尺寸，以使其被截留在水凝胶珠内，从而使其不能通过水凝胶珠的孔。在一些示例中，包封在水凝胶珠内的靶核酸分子的长度为至少100个核苷酸、长度为至少150个核苷酸、长度为至少200个核苷酸、长度为至少300个核苷酸、长度为至少500个核苷酸、长度为至少1,000个核苷酸、长度为至少5,000个核苷酸、长度为至少10,000个核苷酸、长度为至少20,000个核苷酸、长度为至少50,000个核苷酸、长度为至少100,000个核苷酸或更多个核苷酸。在几个示例中，包封在水凝胶珠中的核酸分子是基因组DNA片段，其长度为约1,000至约10,000个核苷酸、长度为约10,000至约20,000个核苷酸、长度为约10,000至约50,000个核苷酸、长度为约10,000个、长度为50,000至约100,000个核苷酸、或长度为约300、约500、约1000、约10,000、约20,000、约50,000或约100,000个核苷酸、或介于上述任意两个尺寸之间的范围、或比上述尺寸长的长度。在一些示例中，所包封的核酸分子的长度高达约3M个碱基。

用于所公开的方法中的水凝胶珠可以具有适合本文所述方法的任何直径。在一些示例中，水凝胶珠的直径为约2、约3、约4、约5、约10、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、或约150μm。在一些示例中，水凝胶珠的直径为2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μm，或由前述值的任意两个限定的范围内的尺寸。在一些示例中，珠的尺寸是不均匀的，因此珠的尺寸包括各种直径的珠。

可以通过在适当条件下交联亲水性生物聚合物或合成聚合物来制备水凝胶珠。因此，在一些示例中，水凝胶珠可包含交联剂。如本文所用，术语“交联剂”是指当与合适的基础单体反应时可以形成三维网络的分子。聚合物的示例可以包括一种或多种交联剂，包括但不限于透明质酸、壳聚糖、琼脂、肝素、硫酸盐、纤维素、藻酸盐(包括藻酸盐硫酸盐)、胶原蛋白、葡聚糖(包括硫酸葡聚糖)、果胶、角叉菜胶、聚赖氨酸、明胶(包括A型明胶)、琼脂糖、(甲基)丙烯酸酯-低聚乳酸-PEO-低聚乳酸-(甲基)丙烯酸酯、PEO-PPO-PEO共聚物(Pluronics)、聚(磷腈)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、PL(G)A-PEO-PL(G)A共聚物、聚(亚乙基亚胺)、聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟基乙酯(PHEMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯、或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯、或它们的组合或混合物。因此，例如组合可以包括聚合物和交联剂，例如聚乙二醇(PEG)-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)、或PEG/聚环氧丙烷(PPO)。

在一些示例中，交联剂在水凝胶珠的聚合物中形成二硫醚键。

在一些示例中，交联剂是可逆交联剂。在一些示例中，可逆交联剂能够使水凝胶聚合物可逆地交联，并且能够在裂解剂存在下不交联。在一些示例中，交联剂可通过还原剂的存在、通过升高的温度或通过电场来剪切。在一些示例中，可逆交联剂可以是N,N'-双(丙烯酰基)胱胺，一种聚丙烯酰胺凝胶的可逆交联剂，其中二硫醚键可以在合适的还原剂存在下剪切。使交联剂与还原剂接触会剪切交联剂的二硫醚键，从而破坏水凝胶珠。水凝胶珠降解并释放内容物，例如保留在其中的DNA文库。在一些示例中，通过将温度升高至大于约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃来剪切交联剂。在一些示例中，通过使水凝胶珠与还原剂接触来剪切交联剂。在一些示例中，还原剂包括膦化合物、水溶性膦、含氮膦及其盐和衍生物、二硫赤藓糖醇(DTE)、二硫苏糖醇(DTT)(分别是2,3-二羟基-1,4-二巯基丁烷的顺式和反式异构体)、2-巯基乙醇或β巯基乙醇(BME)、2-巯基乙醇或氨基乙硫醇、谷胱甘肽、巯基乙酸或巯基乙酸、2,3-二巯基丙醇、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、三(羟基甲基)膦(THP)或P[三(羟基甲基)膦]丙酸(THPP)、或这些中两种或多种的组合。在一些示例中，交联剂可以是N,N'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺，一种聚丙烯酰胺凝胶的可逆交联剂，其中1,2-二醇连接可以在氧化剂、例如高碘酸钠的存在下剪切，并且酰胺基羟甲基可连接可在强酸(如高碘酸)或强碱(如氢氧化钠)的存在下剪切，以降解珠。在一些示例中，通过将温度升高至大于约80、85、90、95或100℃来剪切交联剂。

在一些示例中，试剂包括用于处理遗传物质的试剂，例如用于从细胞中分离核酸、用于扩增或测序核酸、或用于制备测序文库的试剂。试剂穿过水凝胶珠的孔，而遗传物质(例如靶核酸分子)和由此产生的测序文库保留在水凝胶珠内。

在一些示例中，水凝胶珠的聚合物交联形成具有孔的水凝胶基质(例如多孔水凝胶基质)。这些孔能够在水凝胶珠中保留足够大的遗传物质，但允许小的物质(例如试剂)穿过孔，从而进出水凝胶珠。水凝胶可具有任何孔尺寸，其直径足以允许试剂扩散通过珠，同时保留包封的核酸分子。术语“孔尺寸”还可以指基于多个孔的测量值的孔截面的平均直径或平均有效直径。非圆形截面的有效直径等于具有与非圆形截面相同的截面积的圆形截面的直径。在一些示例中，当水凝胶水合时，水凝胶珠可溶胀。然后，孔尺寸可以根据水凝胶珠的水凝胶中的水含量而改变。在一些示例中，孔的直径为约10nm至约100nm。

在一些示例中，通过改变聚合物的浓度与交联剂的浓度之比来调节水凝胶珠的孔尺寸。在一些示例中，聚合物与交联剂的比例为30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1，12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20或1:30，或大约这些比例中的任何一个，或在上述比例中的任何两个所定义的范围内的比例。在一些示例中，可以将诸如DNA引物或带电化学基团的附加功能接枝到聚合物基质上，以满足不同应用的要求。

可以使用任何合适的方法来制备容纳包封的核酸分子的水凝胶珠。

在一些示例中，水凝胶珠是通过涡旋辅助乳液制备的。如本文所用，涡旋辅助乳液是指水凝胶单体或聚合物与长核酸分子在容器中、例如在管、小瓶或反应容器中涡旋。例如通过手动或机械涡旋或摇动来混合组分。

在一些示例中，通过微流体流动技术制备珠。微流体流动包括使用微流体设备来辅助凝胶乳液的产生，如图2所示。在一些实施方式中，微流体设备包括微通道，其配置成产生所需尺寸的水凝胶珠，并配置成包封每个珠选定量的遗传物质(例如单细胞或预定量的靶核酸分子)。除了微流体设备的尺寸和通道的宽度之外，水性通道和不混溶流体通道的流速也可能影响水凝胶珠的尺寸。在一些示例中，微流体设备的高度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190或约200μm，或在由上述任何两个值所限定的范围内的高度。在一些示例中，微流体设备包括一个或多个通道。在一些示例中，微流体设备包括用于水性物流的通道和用于诸如油的不混溶流体的通道。在一些示例中，一个或多个通道的宽度是相同的。在一些示例中，一个或多个通道的宽度是不同的。在一些示例中，一个或多个通道的宽度为约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、或约150μm，或在由上述任何两个值所限定的范围内的宽度。在一些示例中，水性通道的宽度为约75μm。在一些示例中，不混溶流体通道的宽度为约78μm。其他宽度值是可能的，因为宽度可以变化以微调珠的尺寸。除了微流体设备的尺寸和通道的宽度之外，水性通道和不混溶流体通道的流速也影响水凝胶珠的尺寸。在一些示例中，水相通道中溶液的流速为约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、或约150μL/min，或在由上述任何两个值所限定的范围内的流速。在一些示例中，不混溶流体通道中的不混溶流体的流速为约150、约160、约170、约180、约190、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约375或约400μL/min，或在由上述任何两个值所限定的范围内的流速。在一些示例中，水相中的溶液包括水凝胶聚合物、交联剂和遗传物质，其以流速小于不混溶流体的流速的方式经水性通道流入不混溶流体、例如载体油中，从而形成液滴。在一些示例中，将含容纳遗传物质的水凝胶液滴配制成均匀的尺寸分布。在一些示例中，通过调节微流体设备的尺寸、一个或多个通道的尺寸、或者水溶液或不混溶流体中的任一个或两者的流速来微调水凝胶珠的尺寸。在一些示例中，所得水凝胶珠的直径为2到150μm、例如约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约130μm、约140μm或约150μm，或在由上述任何两个值所限定的范围内的直径。

在一些示例中，包封遗传物质的水凝胶珠的尺寸和均匀性可以通过在珠形成之前使水凝胶聚合物与流体改性剂、例如与醇(包括异丙醇)接触来进一步控制。在不存在异丙醇的情况下形成的珠的直径大于在存在异丙醇的情况下形成的珠的直径。异丙醇影响水凝胶聚合物的流体性质，从而调节水凝胶珠。

在另一个示例中，水凝胶珠含有中空核和外壳，其中遗传物质(例如靶核酸分子)和/或测序文库包含在中空核中(参见例如图9A-9C)。中空核的直径在水凝胶珠直径的约5％至约75％的范围内。包含中空核和外壳的水凝胶珠可以例如通过将内水凝胶层包封在外水凝胶层中，然后选择性地降解内水凝胶层而不是外水凝胶层，从而制成。内水凝胶层是水凝胶珠，其如上所述容纳遗传物质(例如靶核酸分子)和/或测序文库。使用不使外水凝胶层解聚的方法使内水凝胶层解聚，以产生中空水凝胶珠。在一个示例中，内层由琼脂糖制成并且可通过加热至60℃解聚，并且外水凝胶层由具有化学可逆的交联剂的丙烯酰胺制成，并且是在60℃下耐受解聚的。在另一个示例，内层和外层均由丙烯酰胺制成，但两层均使用正交交联剂化学。例如，内层交联剂被氧化剂例如高碘酸钠剪切，而外层交联剂被还原剂例如DTT剪切。内层而不是外层的解聚产生具有中空核和外壳的水凝胶珠，其中遗传物质和/或测序文库容纳在中空核中。中空的内核提供了用于在包封的核酸上进行均匀的酶促和化学反应的水性介质。

在一些示例中，可通过稀释或浓缩输入样品内的遗传物质来控制珠内的遗传物质(例如靶核酸分子)的量。如本文所述，将包括遗传物质的样品与水凝胶聚合物混合，并且将容纳遗传物质的水凝胶聚合物置于涡旋辅助乳液或微流辅助乳液中。

水凝胶珠可以包括适合本文提供的方法的任何数量的遗传物质。例如，任何合适长度的任何合适数量的靶核酸分子可以被包封在水凝胶珠中。在一些示例中，所包封的核酸分子的长度高达约3M个碱基。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-1000个靶核酸分子，其长度为约1,000至约500,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-1000个靶核酸分子，其长度为1,000至100,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-1000个靶核酸分子，其长度为10,000至150,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-1000个靶核酸分子，其长度为50,000至150,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-1000个靶核酸分子，其长度为10,000至20,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-100个长度为1,000至500,000个核苷酸的靶核酸分子。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-100个长度为1,000至100,000个核苷酸的靶核酸分子。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-100个靶核酸分子，其长度为10,000至150,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-100个靶核酸分子，其长度为50,000至150,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均1-100个靶核酸分子，其长度为10,000至20,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均10-100个长度为1000至500,000个核苷酸的靶核酸分子。在一些示例中，水凝胶珠包封平均10-100个靶核酸分子，其长度为1000至100,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均10-100个靶核酸分子，其长度为10,000至150,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均10-100个靶核酸分子，其长度为50,000至150,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均10-100个靶核酸分子，其长度为10,000至20,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均50-150个长度为1,000至500,000个核苷酸的靶核酸分子。在一些示例中，水凝胶珠包封平均50-150个长度为1,000至100,000个核苷酸的靶核酸分子。在一些示例中，水凝胶珠包封平均50-150个靶核酸分子，其长度为10,000至150,000个核苷酸。在一些示例中，水凝胶珠包封平均50-150个长度为50,000至150,000个核苷酸的靶核酸分子。在一些示例中，水凝胶珠包封平均50-150个长度为10,000至20,000个核苷酸的靶核酸分子。

在一些示例中，在将靶核酸分子包封到水凝胶珠中之前，转座子与靶核酸分子(例如基因组DNA)结合，同时保持靶核酸分子完整。这可以通过例如在没有催化金属离子Mg²⁺的情况下使靶核酸分子与Tn5转座酶反应来完成(例如如Gunderson等人的美国专利公开2015/0368638中所述，通过引用整体并入本文)。将预标签化DNA包封在水凝胶珠中后，将其捕获在流动池表面上，并且将包含Mg²⁺离子的缓冲液流入流动池中以完成标签化过程。随后进行延长或间隔填充/连接反应，以完成将接头添加至DNA片段，以生成测序文库。然后将液体扩散屏障加载到流动池上，并且水凝胶珠降解，从而以空间受限的方式释放测序文库，用于播种到测序流动池上。

在另一示例中，靶核酸分子(例如基因组DNA)首先使用在珠表面上含有转座子的标签化珠(例如，0.5-20μm尺寸)米而在流动池外进行标签化(例如，如Gormley等人的美国公开号2014/0194324中描述，其通过引用并入本文)。在标签化反应之后，标签化的DNA与标签化珠结合。然后使用液滴发生器将这些珠包封成更大的水凝胶珠，用于捕获在流动池上。通过加载含有P5/P7引物的PCR混合物，以从标签珠中释放标签化的DNA并添加接头，从而继续在流动池上制备文库。在替代示例中，标签珠含有附接至转座子的完整接头序列，所述转座子通过杂交附接至标签珠，并且文库通过变性而从标签珠中释放。然后将液体扩散屏障加载到流动池上，并且水凝胶珠降解，从而以空间受限的方式释放测序文库，用于播种到测序流动池中。

B.水凝胶珠的流动池捕获

本文提供的实施方式包括在测序流动池上捕获容纳包封的遗传物质的水凝胶珠。在足以捕获水凝胶珠在测序流动池上的条件下，将容纳包封的遗传物质的水凝胶珠加载到测序流动池上。

可以使用任何合适的方法将水凝胶珠捕获在流动池表面上。在一些示例中，由于水凝胶珠的直径和流动池的高度之间的尺寸差异，水凝胶珠在流动池上的物理约束将水凝胶珠捕获在流动池上。例如，其中水凝胶珠的直径比流动池的高度大约5％至约30％(例如约5％、约10％、约15％、约20％、约25％或约30％)，从而约束流动池中的珠。在一些示例中，水凝胶珠的直径比流动池的高度大约10％，从而约束流动池中的珠，例如水凝胶珠的直径约为110μm，且流动池的高度约为100μm。这种尺寸差异会导致水凝胶珠“粘”在流动池上。

在一些示例中，通过流动池表面上的捕获剂与水凝胶珠的相互作用将水凝胶珠捕获在流动池上。在公开的方法中用于将水凝胶珠固定在流动池表面上的捕获剂的示例包括但不限于与连接于珠的水凝胶或交联剂的核酸中的至少一部分互补的捕获核酸、或能够与靶核酸(或与其附接的连接部分)结合的受体-配体结合对的成员(例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)、或能够与靶核酸(或与其附接的连接部分)形成共价键的化学试剂。

在一些示例中，捕获剂是位于测序流动池上的特异性结合对的第一成员，并且与位于水凝胶珠上的特异性结合对的第二成员结合。例如，流动池用特异性结合对的第一成员官能化，水凝胶珠用特异性结合对的第二成员官能化。

在一些示例中，捕获剂存在于流动池上的隔离位置处。例如，在流动池是包含孔阵列的图案化流动池的示例中，捕获剂可以存在于图案化流动池的孔中。

另外，流动池可包含珠俘获结构、例如柱/立柱、堰、杯形结构，以将珠固定/捕获在流动池内的限定位置。这些俘获结构可以通过在玻璃或硅酮中蚀刻、或通过可光图案化的材料的光刻法来制造。

C.珠内测序文库制备

在一些示例中，测序文库可以由包封在水凝胶珠内的遗传物质(例如靶核酸分子)制备。测序文库可以在测序流动池表面捕获珠之前、之中或之后制备。在几个示例中，当将珠捕获在测序流动池的表面上时，可以从包封在水凝胶珠中的遗传物质制备测序文库。

使包封在水凝胶珠中的遗传物质(例如靶核酸分子)与一种或多种试剂接触以制备测序文库。测序文库保留在水凝胶珠中，并且试剂能够穿过水凝胶珠的孔。因此，水凝胶珠为包封的遗传物质的受控反应提供了微环境，从而允许试剂进出水凝胶珠的屏障，同时将相应的测序文库保留在珠内。整个测序文库的制备过程可以在水凝胶珠内部完成，通过多孔水凝胶进行多次试剂交换，同时将测序文库产物保留在水凝胶基质中。

在几个示例中，制备测序文库包括使包封在水凝胶珠内的靶核酸分子片段化，以及将包括通用核苷酸序列的接头添加至靶核酸分子的片段。可以使用任何合适的方法来片段化靶核酸分子并添加接头。与一个或多个接头连接的靶核酸分子的片段称为“适应片段”。每个珠中靶核酸分子的适应片段共同提供了核酸文库，其代表来自可以固定然后测序的珠的靶核酸分子。

在几个示例中，靶核酸分子在水凝胶珠内经历标签化程序，用于片段化和添加接头。在一个非限制性示例中，使用Nextera^TM(Illumina，San Diego，CA)标签化方案和试剂来实施标签化程序。标签化反应将随机片段化和接头连接合并为一个步骤，以提高测序文库制备过程的效率。片段化的结果是包封在水凝胶珠中的靶核酸分子的片段群，其包括来自与一个或多个接头连接的水凝胶珠的亲本靶核酸分子的序列。在几种实施方式中，片段包括至少一个具有转座酶索引的链。洗掉转座酶，并且可以例如通过PCR、连接或任何其他合适的方法将另外的序列添加到适应片段的末端。

一些示例可以包括使用高活性的Tn5转座酶和Tn5型转座酶识别位点(参见例如Goryshin和Reznikoff，J.Biol.Chem.，273：7367(1998)，其通过引用整体并入本文)、或MuA转座酶和包含R1和R2末端序列的Mu转座酶识别位点(参见例如Mizuuchi，K.，Cell，35：785，1983和Savilahti，H等，EMBO J.，14：4893，1995，其全部内容通过引用整体并入本文)。也可以使用Tn5马赛克末端(ME)序列。

可以与本文提供的方法的某些示例一起使用的转座系统的更多示例包括金黄色葡萄球菌Tn552(参见例如Colegio et al.,J.Bacteriol,183:2384-8,2001和Kirby etal.,Mol.Microbiol,43:173-86,2002，其全部内容通过引用整体并入本文)、Tyl(参见例如Devine&Boeke,Nucleic Acids Res.,22:3765-72,1994和国际公开WO95/23875，其各自通过引用整体并入本文)、转座子Tn7(参见例如Craig,Science.271:1512,1996和Craig,Review in:Curr Top Microbiol Immunol,204:27-48,1996，其各自通过引用整体并入本文)、Tn/O和IS10(参见例如Kleckner et al.,Curr Top Microbiol Immunol,204:49-82,1996，其通过引用整体并入本文)、Mariner转座酶(参见例如Lampe,et al.,EMBO J.,15:5470-9,1996，其通过引用整体并入本文)、Tel(参见例如Plasterk,Curr.TopicsMicrobiol.Immunol,204:125-43,1996，其通过引用整体并入本文)、P元件(参见例如Gloor,Methods Mol.Biol,260:97-114,2004，其通过引用并入本文)、Tn3(参见例如Ichikawa&Ohtsubo,J Biol.Chem.265:18829-32,1990，其通过引用整体并入本文)、细菌插入序列(参见例如Ohtsubo&Sekine,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,204:1-26,1996，其通过引用整体并入本文)、逆转录病毒(参见例如Brown et al,Proc Natl Acad Sci USA,86:2525-9,1989，其通过引用整体并入本文)、和酵母的反转录转座子(参见例如Boeke&Corces,Annu Rev Microbiol.43:403-34,1989，其通过引用整体并入本文)。更多示例包括IS5、Tn1O、Tn903、IS911、和转座家族酶工程化形式(参见例如Zhang et al,PLoS Genet.5:el000689,2009,和Wilson et al,J.Microbiol.Methods 71:332-5,2007，其各自均通过引用整体并入本文)。

可用于本文所述方法的转座子序列的非限制性示例在美国专利申请公开号2010/0120098、美国专利申请公开号2012/0208705、美国专利申请公开号2012/0208724、和国际专利申请公开号WO2012/061832中提供(其全部内容通过引用整体并入本文)。在一些示例中，转座子序列包括第一转座酶识别位点、第二转座酶识别位点和存在于两个转座酶识别位点之间的索引序列。

在一些示例中，使用适当的方法将靶核酸分子片段化，随后将接头连接至片段以用于测序文库制备。一种示例方法包括：使靶标核酸分子的片段的5'端脱磷酸以防止在随后的连接步骤中形成多连体；使用连接酶将第一接头连接至去磷酸化靶的3'端，其中第一接头的3'端被封闭；将连接的靶的5'端重新磷酸化；使用单链连接酶将第二接头连接至去磷酸化靶的5'端，其中第二接头的5'端未磷酸化。

另一个示例包括用5'核酸外切酶部分消化靶核酸分子的片段以形成具有单链3'突出端的双链核酸。可以将含有3'封闭基团的接头连接到具有3'突出端的双链核酸的3'端。具有3'突出端且具有连接的接头的双链核酸可以被杂化以形成单链核酸。可以将含有非磷酸化5'端的接头连接至单链核酸的5'端。

使核酸例如核酸的5'核苷酸脱磷酸的方法包括使核酸与磷酸酶接触。磷酸酶的示例包括小牛肠磷酸酶、虾碱性磷酸酶、南极磷酸酶和APEX碱性磷酸酶(Epicentre)。

连接核酸的方法包括使核酸与连接酶接触。连接酶的示例包括T4 RNA连接酶1、T4RNA连接酶2、RtcB连接酶、甲烷杆菌RNA连接酶、和TS2126 RNA连接酶(Circligase^TM)。

使核酸例如核酸的5'核苷酸磷酸化的方法包括使核酸与激酶接触。激酶的示例包括T4多核苷酸激酶。

在几种实施方式中，与靶核酸分子的片段连接的接头包括用于随后的播种、测序和分析与靶核酸分子的片段有关的序列读出的序列。接头可以包括例如捕获序列、测序引物结合位点、扩增引物结合位点和索引。

在几个示例中，接头包括通用核苷酸序列，用于在测序流动池表面上捕获测序文库的核酸分子，所述测序流动池表面具有坪或孔，其具有与通用核苷酸序列结合的相应的捕获寡核苷酸。存在于片段末端的通用序列可用于结合通用锚序列，所述通用锚序列可用作引物并在扩增反应中延长。在几种实施方式中，使用两种不同的通用引物。一个引物与被索引核酸片段的一条链的3'端的通用序列杂交，并且第二引物与被索引核酸片段的另一条链的3'端的通用序列杂交。因此，每个引物的锚序列可以不同。合适的引物可各自包含另外的通用序列例如通用捕获序列、以及另一个索引序列。因为每个引物都可以包含索引，所以此步骤导致添加一个或两个索引序列，它们可以是彼此的反向互补序列，或可以具有不是彼此的反向互补序列的序列。

适应片段可以是用于随后的播种和测序步骤的任何合适的尺寸。在一些示例中，适应片段的长度为150至400个核苷酸、例如150至300个核苷酸。

在一些示例中，可以根据任何合适的扩增方法在水凝胶珠中扩增靶核酸分子或其片段、或适合的片段。

在一些示例中，扩增是等温扩增。可以使用的示例等温扩增方法包括但不限于多重置换扩增(MDA)，其是用于扩增少量DNA的广泛使用的技术，例如由Dean et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)举例说明；或等温链置换核酸扩增，例如由美国专利号6,214,587举例说明，其各自通过引用整体并入本文。

在另外的示例中，扩增可包括但不限于PCR、SDA、TMA和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如美国专利号8,003,354中所述，其全部内容通过引用合并于此。上述扩增方法可用于扩增一种或多种目标核酸。例如，可以利用包括多重PCR、SDA、TMA、NASBA等的PCR来扩增包封的核酸。在一些示例中，扩增反应中包括特异性针对目标核酸的引物。

在一些示例中，扩增方法可包括连接探针扩增或寡核苷酸连接测定(OLA)反应，其包含特异性针对目标核酸的引物。在一些示例中，扩增方法可包括引物延长-连接反应，其包含特异性针对目标核酸的引物，并且能够通过水凝胶孔。作为可以专门设计来扩增目标核酸的引物延长和连接引物的非限制性示例，扩增可以包括用于GoldenGate测定的引物(Illumina，Inc.，SanDiego，CA)，例如美国专利号7,582,420和7,611,869中距离的，其全部通过引用整体并入本文。

在本公开中有用的另一种核酸扩增方法是标签化PCR，其使用具有恒定的5'区域然后是随机的3'区域的两结构域引物的群，例如在Grothues et al.Nucleic AcidsRes.21(5):1321-2(1993)中描述，其通过引用整体并入本文。进行第一轮扩增，以基于来自随机合成的3'区域的各个杂交，在热变性DNA上进行大量启动。由于3'区域的性质，起始位点被认为在整个基因组中是随机的。此后，可以去除未结合的引物，并且可以使用与恒定5'区域互补的引物进行进一步的复制。

在一些示例中，包封在水凝胶珠内的适应片段可以被进一步修饰或反应，以准备播种在测序流动池上并测序。在一些示例中，使适应片段与对适应片段具有特异性的捕获寡核苷酸反应(例如通过结合至接头序列)，并且可以将捕获的寡核苷酸固定在固体基质的表面上。例如，捕获寡核苷酸可以包括通用结合对的第一成员，并且其中结合对的第二成员固定在固体基底的表面上。

D.珠降解和测序文库播种

水凝胶珠被液体扩散屏障包围时会降解，以从珠中释放测序文库，并将测序文库播种到测序流动池中。将液体扩散屏障加载到测序流动池上，以填充水凝胶珠之间的空隙体积并包围水凝胶珠。当珠降解时，用液体扩散屏障包围所捕获的水凝胶珠会抑制测序文库在珠体积之外扩散。珠降解后，包封的测序文库将转运到流动池的表面，并在此处被捕获。因此，在存在液体扩散屏障的情况下，在流动池上的播种在靠近每个水凝胶珠的印迹处发生。

各个水凝胶珠容纳由珠内的靶核酸分子产生的测序文库。因此，从各个水凝胶珠播种的测序文库对应于包封在该珠中的靶核酸分子。由于播种发生在每个水凝胶珠流动池上的印迹附近，因此，每个珠的播种测序文库会根据珠的位置在流动池上进行空间隔离(或“索引”)。

在一些示例中，液体扩散屏障可以是疏水液体，例如油、例如矿物油或硅酮油、或全氟化油、或其两种或更多种的组合。在其他示例中，液体扩散屏障可以是阻止DNA文库扩散的粘稠溶液，例如含有聚合物的缓冲液，例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮、普朗尼克葡聚糖、蔗糖等。在一些示例中，温度响应性材料可以用作液体屏障。温度响应性材料在非播种温度下为非粘稠液体，可轻松加载到流动池上并占据水凝胶珠之间的粒间空隙。加热到播种温度后，材料固化形成物理屏障并防止文库扩散。在一些示例中，温度响应性材料可以是聚(N-异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)/锂皂土纳米颗粒络合物。在一些示例中，在所公开的实施方式中使用的液体扩散屏障由以上讨论的任何两个或更多个液体扩散屏障的组合组成。

可以使用基本上不降低液体扩散屏障抑制测序文库扩散超过水凝胶珠直径的效力的任何适当方法降解水凝胶珠。水凝胶珠不需要完全降解即可从珠上释放测序文库并将测序文库播种到测序流动池上。充分的降解包括增加水凝胶珠的孔隙率，以允许包封的测序文库扩散和将测序文库转运到流动池的表面。

在一些示例中，通过向珠施加足够的热量，以破坏水凝胶基质，并允许测序文库在降解的水凝胶基质内扩散，以及将测序文库播种在流动池表面上，从而降解水凝胶珠。在一些示例中，可以通过将流动池加热到约90℃大约充分的时间(例如5分钟)以降解水凝胶基质，从而施加热。

在水凝胶基质包含可逆交联剂的示例中，可以通过用合适的裂解剂使基质解交联来降解基质。例如，在交联剂包含使水凝胶的聚合物交联的二硫醚键的情况下，裂解剂可以是还原剂，例如DTT。在一些示例中，交联剂包含1,2-二醇键，其可以被氧化剂、强碱或强酸、例如高碘酸钠和高碘酸剪切。在一些示例中，交联剂包含光可剪切部分，其剪切使水凝胶基质解交联。在这样的示例中，可以将水凝胶基质暴露于适当波长的光中以剪切光可剪切部分并使水凝胶基质降解。

在另一个示例中，还原剂被UV光激活。这些可光降解的还原部分可以存在于油相中，或者可以在熔融步骤之前通过扩散引入水凝胶珠中。

充分降解珠后，包封的测序文库转运到流动池的表面，并在其中捕获。可以使用任何合适的方法在流动池表面上捕获测序文库。

在一些示例中，通过在流动池上的捕获剂与测序文库的适应片段的相互作用，将测序文库捕获在流动池上。

在一些示例中，捕获剂是位于测序流动池上的特异性结合对的第一成员，并且与位于测序文库的适应片段上的特异性结合对的第二成员结合。例如，用特异性结合对的第一成员对流动池进行官能化，并且适应片段的接头包含特异性结合对的第二成员。

在一些示例中，捕获剂、例如捕获寡核苷酸可以附接到测序流动池的表面。例如，捕获剂可以附接到图案化流动池表面上的孔。附接可以通过中间结构、例如珠、颗粒或凝胶。捕获剂经由凝胶附接至测序流动池的表面的示例有可从Illumina Inc.(SanDiego，CA)商购或在WO2008/093098中描述，其通过引用整体并入本文。

在特定的示例中，图案化的流动池包含用于结合测序文库的表面，所述测序文库是通过用孔(例如微孔或纳米孔)对固体载体进行图案化；用凝胶材料(例如PAZAM、SFA或其化学修饰的变体，例如叠氮化的SFA(azido-SFA))覆盖图案化的载体；并通过化学或机械抛光等方法对凝胶涂层的载体进行抛光而制备的，从而将凝胶保留在孔中，但实际上将孔之间的结构化基底的表面上的间隙区域中的所有凝胶去除或使其失活。引物和捕获核酸可以附接到凝胶材料上，用于捕获和扩增测序文库。然后可将测序文库转运至图案化的表面，以使文库中的各个适应片段将通过与附接在凝胶材料上的引物相互作用而播种各个孔；然而，由于凝胶材料的缺乏或失活，适应片段将不会占据孔之间的间隙区域。由于孔之间的间隙区域中凝胶的缺乏或失活阻止了正在生长的核酸集落的向外迁移，因此将适应片段的扩增约束在孔中。该方法可以方便地制造，可规模化，并利用常规的μm或纳米制造方法。

在一些示例中，可以在测序之前扩增播种的测序文库。例如，可以使用接头序列中的引物位点扩增播种的测序文库，随后使用接头序列中的测序引物位点进行测序。

在一些示例中，通过固相扩增来扩增播种的测序文库。用于固相扩增的引物(例如作为捕获引物)优选通过在引物的5'端或附近单点共价附接于固体载体上而固定，使引物的模板特异性部分游离以退火为同源模板，并使用于引物延长的3'羟基游离。任何合适的共价连接手段均可用于此目的。所选择的附接化学将取决于固体载体的性质以及应用于其的任何衍生化或官能化。引物本身可以包括可以是非核苷酸化学修饰的部分，以促进连接。在特定的示例中，引物可在5'端包括含硫的亲核试剂，例如硫代磷酸酯或硫代磷酸酯。在固体负载的聚丙烯酰胺水凝胶的情况下，该亲核试剂将结合到水凝胶中存在的溴乙酰胺基团。将引物和模板附接至固体载体的一种更具体的方式是通过5'硫代磷酸酯附接至由聚合的丙烯酰胺和N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺(BRAPA)组成的水凝胶，如WO05/065814中所述，其通过引用全文并入。

尽管本发明涵盖固相扩增方法，其中仅固定了一种扩增引物(另一种引物通常存在于游离溶液中)，但在某些示例中，固体载体优选同时提供固定的正向和反向引物。在实践中，由于扩增过程使用过量的引物来维持扩增，因此将存在固定在固体载体上的“多个”正向引物和/或“多个”反向引物。除非上下文另外指出，本文对正向和反向引物的引用应相应地解释为涵盖此类引物的“多个”。

测序流动池的表面可以包括多个引物，用于从播种在流动池上的测序文库中产生扩增子。在一些示例中，引物可具有与连接于每个靶核酸的接头序列中存在的通用序列互补的通用引物序列。在特定的示例中，多个引物可以附接至扩增位点。引物可以附接至如上所述的用于捕获核酸的扩增位点。

在一些示例中，可以使用簇扩增方法来扩增播种的测序文库，如美国专利号7,985,565和7,115,400的公开所例示，其全部内容通过引用整体并入本文。美国专利号7,985,565和7,115,400的合并材料描述了核酸扩增的方法，其允许将扩增产物固定在固体载体上，以形成由固定的核酸分子的簇或“集落”组成的阵列。这种阵列上的每个簇或集落是由多个相同或基本相同的固定多核苷酸链和多个相同的固定互补多核苷酸链形成的。如此形成的阵列在本文中通常被称为“聚簇阵列”。固相扩增反应的产物，例如美国专利号7,985,565和7,115,400中所述的那些，是通过将成对的固定的多核苷酸链和固定的互补链退火而形成的所谓“桥联”结构，两个链均优选通过共价附接而在5'端固定于固体载体上。簇扩增方法学是其中使用固定的核酸模板产生固定的扩增子的方法的示例。

应当理解，在集落或簇中可能存在少量污染而不会不利地影响随后的测序反应。对于特定应用，在各个扩增位点处可接受的示例污染水平包括但不限于至多0.1％、0.5％、1％、5％、10％或25％的污染扩增子。

其他合适的方法也可以用于从根据本文提供的方法产生的固定的DNA片段产生固定的扩增子。例如，无论是否固定每对扩增引物中的一个或两个引物，都可以通过固相PCR形成一个或多个簇或集落。在一些示例中，将包封的核酸在珠中扩增，然后以阵列或簇中的固体载体形式沉积。

E.样品多路复用

在一些示例中，样品索引方法可用于询问单个测序流动池上的多个核酸样品。可以使用任何适当的复用方法。

例如，在一些示例中，为了从同一流动池泳道中的多个样品生成连接的长读信息，使用不同的索引转座子从每个样品中识别水凝胶斑。例如，可以在将珠捕获在流动池上之前标签化靶核酸分子。使用不同的索引转座子分别标签化不同的核酸样品(如本文所述包封在水凝胶珠中)，然后加载到流动池中，用于完成测序文库的制备和从水凝胶珠中释放文库。这提供了包含对应于不同样品的不同索引序列的播种斑，这些序列可以在测序后的读出分析过程中彼此分离。

替代地，在流动池上依次处理每个样品的水凝胶珠。将包含第一样品的珠加载到流动池上，并使用转座子标签化靶核酸。将第一样品的文库从珠中释放出来并播种到流动池后，将包含第二靶核酸样品的第二轮水凝胶珠加载到流动池中，并使用独特的转座子进行标签化，以生成第二索引文库，其以空间受限的方式释放，用于播种在流动池表面。这提供了包含对应于不同样品的不同DNA索引序列的播种斑，这些序列可以在测序后的读出分析过程中彼此分离。

在用于样品多路复用的另一种方法中，可以在珠包封步骤中将外源核酸分子掺入不同的靶核酸样品中。外源核酸分子可以是例如双链或单链DNA。可以掺入样品中作为标签化的外源DNA的非限制性示例包括Phi-X、λ1、λ3或λ3DNA。将多个样品分别加工成水凝胶珠(每个不同的样品都包含独特的掺入外源标记物)，然后将这些珠汇集起来以加载到流动池中。标签化和文库制备并在流动池中播种后，播种文库的每个所得簇斑均包含来自掺入DNA样品的簇/读出，其可用于在读出分析过程中识别样品来源。

在一些示例中，为了最大程度地利用流动池用于测序数据的产生，在从水凝胶珠播种测序文库之后，可以将额外的步骤添加到工作流程中。在该阶段，水凝胶珠印迹之间的粒间空隙具有较低的播种库密度。为了利用该粒间空隙，可以使用常规的短读文库，从在间隙区域中且水凝胶斑内的空白区域中的相同或不同的样品和文库播种，实施额外的播种步骤。该短读文库包含不同的DNA索引，以将来自连接的长读和短读文库的读出分开。

F.测序

在一些示例中，将播种测序文库全部或部分测序。播种的测序文库可以根据任何合适的测序方法进行测序，例如直接测序，包括SBS、边连接边测序、边杂交边测序、纳米孔测序等。用于确定固定的核酸片段的序列的方法的非限制性示例描述于例如Bignell etal.(U.S.8,053,192),Gunderson et al.(WO2016/130704),Shen et al.(U.S.8,895,249),和Pipenburg et al.(U.S.9,309,502)，其全部内容通过引用整体并入本文。

本文描述的方法可以与多种核酸测序技术结合使用。特别适用的技术是其中核酸附接在阵列中的固定位置以使它们的相对位置不变的技术，并且其中阵列被反复成像。特别适用其中以不同颜色通道获得图像的实施方式，例如与用于区分一种核苷酸碱基类型与另一种核苷酸碱基类型的不同标签化相吻合。在一些示例中，确定片段的核苷酸序列的过程可以是自动化过程。

一种测序方法是SBS。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板(例如靶核酸或其扩增子)的延长，以确定模板中核苷酸的序列。潜在的化学过程可以是聚合反应(例如通过聚合酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方式中，将荧光标记的核苷酸以模板依赖的方式添加到引物中(从而延长引物)，使得检测添加到引物中的核苷酸的顺序和类型可以用于确定模板的序列。

在一个示例中，核苷酸单体包括锁核酸(LNA)或桥联核酸(BNA)。在核苷酸单体中使用LNA或BNA可提高核苷酸单体与固定的片段上存在的测序引物序列之间的杂交强度。

SBS可以使用具有终止子部分或没有任何终止子部分的核苷酸单体。使用缺少终止子的核苷酸单体的方法包括例如焦磷酸测序和使用γ-磷酸酯标记的核苷酸的测序，如本文中进一步详述。在使用缺少终止子的核苷酸单体的方法中，每个循环中添加的核苷酸数量通常是可变的，并且取决于模板序列和核苷酸递送的模式。对于利用具有终止子部分的核苷酸单体的SBS技术而言，在使用双脱氧核苷酸的传统Sanger测序的情况下，终止子在使用的测序条件下可以有效地不可逆，或者在Solexa(现为Illumina，Inc.)开发的测序方法的情况下，终止子可以是可逆的。

SBS技术可以使用具有标记部分或没有标记部分的核苷酸单体。因此，可以基于标记的特性、例如标记的荧光；核苷酸单体的特性，例如分子量或电荷；核苷酸掺入的副产物，例如焦磷酸盐的释放等来检测掺入事件。在测序试剂中存在两个或多个不同核苷酸的实施方案中，不同的核苷酸可以彼此区分，或者在使用的检测技术下，两个或多个不同的标记可能无法区分。例如，测序试剂中存在的不同核苷酸可以具有不同的标记，并且可以使用适当的光学器件来区分它们，如Solexa(现在为Illumina，Inc.)开发的测序方法所举例说明的。

一些示例包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序检测到无机焦磷酸盐(PPi)的释放，因为特定的核苷酸被掺入到新生链中(Ronaghi et al.,Analytical Biochemistry,242(1):84-9,1996,Ronaghi,Genome Res.,11(1):3-11,2001,Ronaghi,Uhlen,and Nyren,Science,281(5375),363,1998,和美国专利号6,210,891；6,258,568和6,274,320，其各自通过引用整体并入本文。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且通过萤光素酶产生的光子检测所产生的ATP的水平。可以将待测序的核酸附接到阵列中的特征上，并且可以对该阵列进行成像以捕获由于在该阵列的特征上掺入核苷酸而产生的化学发光信号。用特定的核苷酸类型(例如A，T，C或G)处理阵列后，可以获得图像。添加每种核苷酸类型后获得的图像在检测阵列中的特征方面会有所不同。图像中的这些差异反映了阵列上特征的不同序列内容。但是，每个特征的相对位置在图像中将保持不变。可以使用本文阐述的方法来存储、处理和分析图像。例如，可以以与本文示例的相同方式处理在用每种不同核苷酸类型的阵列处理后获得的图像，所述图像是针对基于可逆终止子的测序方法从不同检测通道获得的图像。

在SBS的另一种示例类型中，循环测序是通过逐步添加可逆的终止子核苷酸来完成的，所述可逆的终止子核苷酸包含例如可剪切的或光可剪切的染料标记，其如例如在WO04/018497、WO91/06678、WO07/123,744和美国专利号7,057,026中记载的，其全部内容通过引用整体并入本文。终止子均可被逆转并且荧光标记被剪切的荧光标记的终止子的可用性促进有效的循环可逆终止(CRT)测序。聚合酶也可以被共同工程化以有效地掺入并从这些修饰的核苷酸延长。

在一些基于可逆终止子的测序实施方式中，标记在SBS反应条件下基本不会抑制延长。但是，检测标记可以例如通过剪切或降解而去除。在将标记掺入阵列的核酸特征中之后可以捕获图像。在特定示例中，每个循环涉及将四种不同核苷酸类型同时递送至阵列，并且每种核苷酸类型具有光谱上不同的标记。然后可以获得四个图像，每个图像都使用对四个不同标记之一具有选择性的检测通道。替代地，可以顺序添加不同的核苷酸类型，并且可以在每个添加步骤之间获得阵列的图像。在这样的示例中，每个图像将显示已掺入特定类型核苷酸的核酸特征。由于每个特征的序列内容不同，在不同的图像中将存在或不存在不同的特征。但是，特征的相对位置在图像中将保持不变。如本文所述，可以存储、处理和分析从这种可逆终止子-SBS方法获得的图像。在图像捕获步骤之后，可以去除标记并且去除可逆终止子部分，用于随后的核苷酸添加和检测循环。在特定的周期中检测到标记之后以及随后的周期之前去除标记可以提供减少背景信号和周期之间的串扰的优点。本文阐述了有用的标签和去除方法的示例。

在特定的示例中，一些或所有核苷酸单体可以包括可逆终止子。在这样的示例中，可逆终止子/可剪切的荧光团可包括通过3'酯键连接至核糖部分的荧光团(参见例如Metzker,Genome Res.,15:1767-1776,2005，其通过引用整体并入本文)。其他方法已将终止子化学与荧光标记的剪切分开(参见例如Ruparel et al.,Proc Natl Acad Sci USA102:5932-7,2005，通过引用将其全部内容并入本文)。Ruparel等描述了可逆终止子的发展，其使用小3'烯丙基来封闭延长，但是很容易通过用钯催化剂的短时处理而被解封。荧光团通过可光剪切的接头而连接到碱基上，该接头很容易被暴露于长波长紫外线30秒而剪切。因此，二硫醚还原或光剪切都可以用作可剪切的接头。可逆终止的另一种方法是使用自然终止，该终止是在dNTP上放置大量染料后进行的。dNTP上带电的大分子染料的存在可通过空间位阻和/或静电位阻充当有效的终止子。除非去除染料，否则一个掺入事件的存在会阻止进一步的结合。染料的剪切去除了荧光团并有效地逆转了终止。修饰核苷酸的示例还描述于美国专利号7,427,673和7,057,026中，其全部通过引用整体并入本文。

可以与本文描述的方法和系统一起使用的另外的示例性SBS系统和方法在美国专利公开号2007/0166705、2006/0188901、2006/0240439、2006/0281109、2012/0270305和2013/0260372、美国专利号7,057,026、PCT公开号WO05/065814、美国专利申请公开号2005/0100900、以及PCT公开号WO06/064199和WO07/010,251中描述，通过引用将其全部内容并入本文。

一些示例使用少于四个不同标签检测四个不同核苷酸。例如，SBS可以使用美国专利申请公开号2013/0079232中描述的方法和系统来实施，其全部内容通过引用合并于此。作为第一示例，可以在相同波长下检测一对核苷酸类型，但是基于该对中的一个成员相对于另一个成员的强度差异来区分，或基于与检测到的该对中的其他成员的信号相比导致明显的信号出现或消失的该对中的一个成员的变化(例如通过化学修饰、光化学修饰或物理修饰)来区分。作为第二示例，可以在特定条件下检测四种不同核苷酸类型中的三种，而第四种核苷酸类型缺少在那些条件下可检测到的标记，或者在那些条件下被最少检测(例如由于背景荧光而导致的最少检测等)。可以基于它们各自信号的存在来确定将前三种核苷酸类型掺入核酸中，并且可以根据对任何信号的不存在或最小检测来确定将第四种核苷酸类型掺入核酸中。作为第三示例，一种核苷酸类型可包括在两个不同通道中检测到的一个或多个标记，而在不多于一个通道中检测到其他核苷酸类型。前述的三个示例配置不被认为是互斥的，并且可以以各种组合使用。结合所有三个示例的示例是基于荧光的SBS方法，其使用在第一通道中检测到的第一核苷酸类型(例如dATP，其具有被第一激发波长激发时在第一通道中检测到的标记)、在第二通道中检测到的第二种核苷酸类型(例如dCTP，其具有被第二激发波长激发时在第二通道中检测到的标记)、在第一通道和第二通道中均检测到的第三核苷酸类型(例如dTTP，其具有当被第一和/或第二激发波长激发时在两个通道中都检测到的至少一个标记)、和在任一通道中均缺少标记或者都没有检测到或最少检测到的第四核苷酸类型(例如dGTP，其没有标记)。

此外，如在美国公开专利号2013/0079232的合并材料中所述，可以使用单个通道获得测序数据。在这种所谓的单染料测序方法中，标记第一核苷酸类型，但是在产生第一图像之后将标记去除，并且仅在产生第一图像之后才标记第二核苷酸类型。第三核苷酸类型在第一图像和第二图像中均保留其标记，而第四核苷酸类型在两个图像中均未被标记。

一些示例可以使用边连接边测序技术。这样的技术使用DNA连接酶掺入寡核苷酸并识别这种寡核苷酸的掺入。在几种实施方式中，寡核苷酸具有不同的标签，这些标签与寡核苷酸杂交的序列中的特定核苷酸的鉴别相关。与其他SBS方法一样，在用标记的测序试剂处理核酸特征的阵列后，可以获得图像。每个图像将显示已合并了特定类型标记的核酸特征。由于每个特征的序列内容不同，因此在不同的图像中将存在或不存在不同的特征，但是特征的相对位置在图像中将保持不变。如本文所述，可以存储、处理和分析从基于连接的测序方法获得的图像。可以与本文描述的方法和系统一起使用的示例性SBS系统和方法在美国专利号6,969,488、6,172,218和6,306,597中描述。

一些示例可以使用纳米孔测序(例如参见Deamer&Akeson,“Nanopores andnucleic acids:prospects for ultrarapid sequencing,”Trends Biotechnol.,18,147-151,2000,Deamer and Branton,“Characterization of nucleic acids by nanoporeanalysis”,Acc.Chem.Res.,35:817-825,2002,Li,Gershow,Stein,Brandin,andGolovchenko,“DNA molecules and configurations in a solid-state nanoporemicroscope,”Nat.Mater.,2:611-615,2003，其全部内容通过引用整体并入本文。在这样的示例中，片段穿过纳米孔。纳米孔可以是合成的孔或生物膜蛋白，例如α-溶血素。当片段通过纳米孔时，可以通过测量孔的电导率的波动来识别每个碱基对(参见例如美国专利号7,001,792,Soni&Meller,“A.Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores,”Clin.Chem.53,1996-2001,2007,Healy,“Nanopore-based single-molecule DNA analysis,”Nanomed.,2,459-481,2007,Cockroft,Chu,Amorin,andGhadiri,“A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activitywith single-nucleotide resolution,”J.Am.Chem.Soc.,130,818-820,2008，通过引用将其全部内容并入本文。如本文所述，可以存储、处理和分析从纳米孔测序获得的数据。特别地，根据本文阐述的光学图像和其他图像的示例处理，可以将数据处理为图像。

一些示例可以使用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。可以通过载有荧光团的聚合酶和γ-磷酸酯标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测核苷酸的掺入，如例如在美国专利号7,329,492和7,211,414中所述(其全部内容通过引用整体并入本文)；或者，核苷酸掺入可通过零模波导，例如在美国专利号7,315,019中所述(其全部内容通过引用并入本文)，并使用荧光核苷酸类似物和工程化的聚合酶，例如在美国专利号7,405,281和美国公开号2008/0108082中所述(其全部内容通过引用整体并入本文)，从而检测。可以将照明限制在表面束缚的聚合酶周围的普托升级规模的体积，这样可以在低背景下观察到荧光标记的核苷酸的掺入(参见例如Levene et al.,Science,299,682-686,2003,Lundquist et al.,Opt.Lett.,33:1026-1028,2008,Korlach et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105:1176-1181,2008，其各自通过引用整体并入本文)。如本文所述，可以存储、处理和分析从这种方法获得的图像。

一些SBS示例包括检测核苷酸掺入延长产物后释放的质子。例如，基于对释放的质子的检测进行的测序可以使用电检测器、和可从Ion Torrent(Guilford，CT，LifeTechnologies子公司)商购的相关技术、或在美国专利公开号2009/0026082；2009/0127589；2010/0137143；和2010/0282617中描述的测序方法和系统，其各自通过引用整体并入本文。本文阐述的使用动力学排斥来扩增靶核酸的方法可以容易地应用于用于检测质子的基底。更具体地，本文阐述的方法可以用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群。

G.数据分析

任何适当的生物信息学工作流程都可用于分析和处理使用公开的方法获得的序列读出。

在一些示例中，源自相同长DNA片段的读出用相同条形码标记，以使得能够进行连接阅读分析。由于属于同一DNA片段的簇在空间上共同位于流动池中，并落在容纳该片段的珠边界内，因此准确的条形码分配可以基于对流动池上珠位置(或“簇块”)的识别。可以直接使用实时分析(RTA)图像(例如在Illumina MiSeq^TM平台上可用)和/或使用通过RTA报告的簇坐标来完成珠位置识别。因此，该工作流程可以在例如支持查询簇坐标的平台上使用。

在一些示例中，给定RTA(x，y)读出每个图块上的坐标(在适当时考虑两个表面和所有图块条带)，可以实施基于密度的空间聚簇来识别每个图块上的珠位置，其中假设每个珠与泄漏到粒间空隙中的读出所创建的较低密度背景相比，对应于读出的高密度簇。聚簇程序检测未知数目的簇(因为每个图块上的珠数量不固定)，处理可变的簇形状和尺寸(在珠尺寸不一致且融化后呈圆形的情况下)，并将间隙读出归类为噪音。可以使用任何适当的基于密度的聚簇算法来定义簇，例如DBSCAN聚簇算法。在几种实施方式中，通过找到归属于簇的点的凸包，从每个所得簇计算珠边界。为了增强聚簇结果，可以在聚簇之前应用基于密度的读出筛选程序，其基于图块上邻域的稀疏性来消除读出(例如，如果在图层上包围其的半径r内少于n个其他读出，则将该读出过滤掉，其中n和r是可配置参数)。在一些示例中，可以实施用于评估和校正聚簇流程的最终结果的手动管理步骤。

在其他示例中，使用深度学习由RTA坐标确定珠位置。例如，用于图像隔离的U-Net卷积神经网络体系结构或适当的CNN模型可用于确定簇斑边界和相应的珠位置。在一些这样的示例中，训练数据集包括从基于坐标的描点获得的手动注释的图像、以及合成生成的图像。通过对手动注释的图像应用一组转换来实现合成数据的增强；这些转换包括形状变形、尺寸、数量和位置变化、以及珠间和珠内密度变化。

对来自已知参考基因组的DNA进行测序时，基因组对齐信息可用于进一步精修珠识别，挽救间质性读出并改善所得的条形码分配。例如，可以通过考虑读出所映射的基因组窗口以及它们的空间接近度，进一步分离归属于同一簇的珠。替代地，可以通过计数映射到相邻珠中相同基因组窗口的读出来量化珠间的串扰；然后可以合并具有显著高串扰的珠对，以在某些靶应用(例如定相)中改善岛连续性和性能。还考虑了概率或“软”条形码分配，以在某些靶应用(例如定相和组装)中进一步提高性能。

在一些示例中，在后识别中，每个检测到的珠都与唯一的条形码相关联，并且包含在珠边界内的读出用该条形码标记。其结果是，源自最初俘获在同一珠中的长DNA片段的读出将分配给相同的条形码，并可以在后续分析中进行连接。特别地，对于人基因组定相，条形码读出可以使用其基因组排列位置上的邻近性(例如如果在人基因组上映射相近，则可以连接同一条形码中的读出)而连接到岛(对应于从读出的起始位置起较长的DNA片段)，使得能够重建大得多的相块。在基因组组装中，条形码信息可用于消除重复序列的歧义，并显着提高组装连续性，例如通过首先将读出映射到部分组装的重叠群，然后使用条形码信息连接重叠群。定相和组装管线已作为数据分析工作流程的后续步骤，遵循链接读出分析的最佳实践并在适当时应用特定于水凝胶的性能优化。

III、流动池设备及其使用

在一些实施方式中，本公开涉及用于在流动池设备上制备核酸文库的设备、系统和方法。例如，流动池设备可包括容纳遗传物质的水凝胶，其中水凝胶可被配置成保留遗传物质，同时允许试剂、酶、化学物质和小于约50个碱基对的较小尺寸的引物通过水凝胶。流动池设备可用于制备流动池设备内的核酸文库，并用于对保留在水凝胶中的遗传物质进行测序，包括单细胞测序。

在一些示例中，所述设备、系统和方法通过使用流动池表面来捕获单细胞的基因组内容并将其原位转化为测序文库，从而消除了复杂的单细胞捕获和文库制备方法。由于簇在空间上的接近性，因此可以将来自文库的读出映射回原始细胞。与其他流动池文库制备方法相反，本文提供的示例从捕获流动池表面上的单个单细胞开始，而不是从捕获末端带有P5/P7接头的细胞中的长DNA分子开始。因此，本文提供的示例降低了针对长基因组片段的DNA提取、尺寸选择和测序文库制备的复杂性。设备、系统和方法的某些示例还可以使用长DNA分子(从数10到数100千个碱基)作为输入进行合成长读组装，而无需接头连接。

A.水凝胶流动池设备

一些示例涉及其上沉积有水凝胶材料的流动池设备。在一些示例中，水凝胶包括置于其中的遗传物质。在一些示例中，水凝胶包括孔，该孔允许少于约50个碱基对的试剂、酶、化学物质和寡核苷酸或引物通过孔扩散，同时将遗传物质保留在其中。

在一些示例中，所述流动池设备的通道高度为50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、或150μm、或在由上述任何两个值定义的范围内的量。

本文中的术语“固体表面”、“固体载体”和其他语法上的等同物是指适合于或可以被修饰以适合于用于核酸加工的材料的附接的任何材料，包括例如用于核酸文库制备的材料、包括转座体络合物。如本领域技术人员将理解的，可能的固体载体材料的数量非常大。可能的材料包括但不限于玻璃和改性或官能化玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon^TM等)、多糖、尼龙或硝基纤维、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光纤束以及各种其他聚合物。对于某些示例，特别有用的固体载体和固体表面位于流动池设备内。

在一些示例中，固体载体包括基于二氧化硅的基底，例如玻璃、熔融二氧化硅或其他含二氧化硅的材料。在一些示例中，基于二氧化硅的基底也可以是硅、二氧化硅、氮化硅或硅酮氢化物。在一些示例中，固体载体包括塑料，例如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物或聚(甲基丙烯酸甲酯)。在一些示例中，固体载体是基于二氧化硅的材料或塑料材料。在一些示例中，固体载体具有至少一个包含玻璃的表面。

在一些示例中，固体载体可以是或可以包含金属。在一些这样的示例中，金属是金。在一些示例中，固体载体具有至少一个包括金属氧化物的表面。在一示例中，固体载体包括氧化钽或氧化锡。

丙烯酰胺、烯酮或丙烯酸酯也可用作固体载体材料。其他固体载体材料可包括但不限于砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物和共聚物。前述列表旨在说明而不是限制本申请。

在一些示例中，固体载体和/或固体表面可以是石英。在一些示例中，固体载体和/或固体表面可以是半导体，例如GaAs或铟锡氧化物(ITO)。

固体载体可包括单一材料或多种不同的材料。固体载体可以是复合材料或层压体。实心载体可以是平面、圆形、纹理和图案化的。图案可以例如由在非金属表面上形成特征的金属垫形成，例如如美国专利号8,778,849中所述，其在此引入作为参考。另一种有用的图案化表面是具有形成在表面上的孔特征的表面，例如如美国专利申请公开号2014/0243224A1、美国专利申请公开号2011/0172118A1、或美国专利申请号7,622,294中所述，其每个通过引用整体并入本文。对于使用图案化表面的示例，可以将凝胶与图案特征相关联或沉积在图案特征上，或者可以将凝胶均匀地沉积在图案特征和间隙区域两者上。

在一些示例中，固体载体包括图案化的表面。“图案化表面”是指固体载体的暴露层中或之上的不同区域的布置。在一些示例中，图案可以是以行和列计的特征的x-y格式。在一些示例中，图案可以是特征和/或间隙区域的重复布置。在一些示例中，图案可以是特征和/或间隙区域的随机布置。可以在本文阐述的方法和组合物中使用的示例性图案化表面在美国申请号13/661,524或美国专利公开号2012/0316086 A1中描述，其每个都通过引用并入本文。可以在本文阐述的方法和组合物中使用的示例性图案化表面在美国申请号13/661,524或美国专利公开号2012/0316086 A1中描述，其每个都通过引用并入本文。

在一些示例中，固体载体包括表面上的孔或凹坑阵列。可以如本领域中公知的那样使用多种技术来制造该器件，包括但不限于光刻、压印技术、模制技术和微蚀刻技术。如本领域技术人员将理解的，所使用的技术将取决于阵列基底的组成和形状。在一些示例中，该孔或凹坑的阵列的直径是约10μm至约50μm，例如直径为约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、或约50μm，或在由上述任何两个值定义的范围内的直径。在一些示例中，孔或凹坑的深度为约0.5μm至约1μm、例如约0.5μm、约0.6μm、约0.7μm、约0.8μm、约0.9μm或约1μm，或在由上述任何两个值定义的范围内的深度。在一些示例中，孔或凹坑由疏水材料制成。在一些示例中，疏水材料包括非晶含氟聚合物，包括例如CYTOP、或参见例如PCT申请号PCT/US2017/033169，其全部内容通过引用合并于此。

在一些示例中，本文所述的固体载体形成流动池的至少一部分或位于流动池中。在一个示例中，在流动池设备中的固体载体涂覆有表面聚合物，该表面聚合物包含能够与寡核苷酸或修饰的寡核苷酸形成共价键的官能团，例如在PCT公开号WO2013/184796或WO2016/066586号中描述的那些。在一些示例中，表面聚合物包含式(I)的重复单元和式(II)的重复单元：

其中

R¹和R¹'各自独立地为氢、卤素、烷基、烷氧基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基或其任选取代的变体；

R²和R³各自独立地为氢、烷基、烷基氨基、烷基酰胺基、烷硫基、芳基或其任选取代的变体；

R⁴、R⁴'、R⁵和R⁵'各自独立地为氢、R⁶、OR⁶、-C(O)OR⁶、-C(O)R⁶、-OC(O)R⁶、-C(O)NR⁷R⁸或-NR⁷R⁸；

其中R⁶为氢、羟基、烷基、环烷基、羟烷基、芳基、杂芳基、杂环基或其任选取代的变体；且

R⁷和R⁸各自独立地为氢或烷基，或者R⁷和R⁸与它们所连接的一个或多个原子一起形成杂环。

在一些示例中，R¹、R¹'、R³、R⁵和R⁵'各自为氢。在一些示例中，R⁴'为氢或烷基。在一些示例中，R⁴为-C(O)NR⁷R⁸。在一些示例中，R²为-(CH₂)₅-NHC(O)CH₂N₃。在一些示例中，表面聚合物是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)或不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)。在一些示例中，表面聚合物共价结合至固体载体。在其他示例中，表面聚合物非共价结合至固体载体。在该示例中，流动池设备包括具有表面聚合物涂层的固体载体，在其上包括遗传物质的水凝胶可以流动。

如本文所用，术语“烷基”是指完全饱和的直链或支链的烃链。在一些示例中，烷基包含1至20个碳原子、或1至6个碳原子、或1至4个碳原子。“低级烷基”具有1-4个碳原子，并且可以被称为C_1-4烷基。1-6个碳烷基的示例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基或己基。

如本文所用，术语“烯基”是指含有一个或多个双键的烷基。

如本文所用，术语“环烷基”是指完全饱和的单环或多环体系。当存在多个环时，它们可以是稠合、桥联或螺环体系。环烷基可包含3至10个碳环原子、或3至8个碳环原子、或3至6个碳环原子。示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

如本文所用，术语“芳基”是指碳环、单环或多环芳族环体系。芳基环可包括稠合的非芳族环。在一些示例中，芳基具有6、10或14个碳环原子。芳基的示例是苯、萘和蒽。

术语“杂环基”和“杂环”是指包括至少一个杂原子、例如氧、氮或硫的环体系。这样的体系可以是不饱和的、部分饱和的、芳族的或它们的组合。

如本文所用，“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子、例如氮、氧或硫的单环或多环芳族环体系。“杂芳基”基团包括稠合体系，其包含至少一个芳族的含杂原子的环，而另一个环可以是碳环或杂环，并且是芳族的或非芳族的。杂芳基的示例包括呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、噁唑、苯并噁唑、1,2,3-噁二唑、1,2,4-噁二唑、噻唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、异噁唑、苯并异噁唑、异噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、异喹啉，喹唑啉、喹喔啉、噌啉、和三嗪。

如本文所用，“烷基氨基”是指其中一个或多个氢原子被氨基取代的烷基。示例性的烷基氨基包括但不限于氨基甲基、2-氨基乙基、3-氨基乙基。

如本文所用，“烷基酰胺基”是指其中一个或多个氢原子被C-酰胺基或N-酰胺基取代的烷基。

术语“卤代”是指氟、氯、溴和碘取代基，即氟代、氯代、溴代和碘代。

每当基团被描述为“任选地被取代”时，该基团可以未被取代或被一个或多个所示取代基取代。

因此，本文提供的一些示例涉及水凝胶流动池设备。如本文所用，水凝胶流动池设备是具有如本文所述的固体载体的流动池设备，并且还包括水凝胶，其中所述水凝胶包括水凝胶聚合物和遗传物质。

可以通过使亲水性生物聚合物或合成聚合物交联来制备水凝胶。因此，在一些示例中，水凝胶可包括交联剂。用于水凝胶流动池设备的水凝胶聚合物的示例可以包括一种或多种交联剂，包括但不限于以上针对水凝胶珠所描述的那些。

在一些示例中，交联剂是可逆交联剂，例如如上文针对水凝胶珠所述。在一些示例中，水凝胶层是可逆水凝胶层，其可根据所暴露的化学物质而交联或未交联。在一些示例中，可逆水凝胶层用含有二硫醚键的交联剂、如双丙烯酰胺交联剂制备，其可以被还原剂如DTT、TCEP或THP(膦)破坏。如图17所示，包封染料染色的细菌的载量的10-100μm尺寸的可逆水凝胶聚合物(上图)在暴露于还原剂THP时可降解，导致细菌释放(下图)。

在一些示例中，升高温度或与还原剂接触使交联剂降解，从而从水凝胶聚合物中释放包封的遗传物质。

在一些示例中，交联剂的交联在水凝胶聚合物内建立孔，例如如上文针对水凝胶珠所述。在一些示例中，水凝胶聚合物中的孔的尺寸是可调节的，并且被配制为包封遗传物质、例如大于约300个碱基对的细胞或核酸，但允许较小的颗粒、例如试剂、酶、化学物质、或小于约50个碱基对的较小尺寸的核酸(例如引物)穿过孔。在一些示例中，试剂包括用于处理遗传物质的试剂，例如用于从细胞中分离核酸、用于扩增或测序核酸、或用于制备核酸文库的试剂。水凝胶可具有任何孔尺寸和任何孔隙度，例如以上针对水凝胶珠所述的孔尺寸或孔隙度。

如本文所用，“遗传物质”是指细胞、微生物组或核酸。在一些示例中，细胞是单细胞，包括原核或真核细胞。在一些示例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些示例中，细胞是人细胞。在一些示例中，细胞是细菌细胞。在一些示例中，遗传物质是病毒颗粒。在一些示例中，核酸是长DNA分子、基因组DNA、病毒核酸、细菌核酸或哺乳动物核酸。在一些示例中，遗传物质保留在水凝胶中，而试剂、酶、化学物质和小于约50个碱基对的小核酸能够进入和离开水凝胶。

在一些示例中，水凝胶是覆盖流动池设备的固体表面的水凝胶层。在一些示例中，水凝胶层由包括遗传物质的水凝胶前体溶液制备，并且该水凝胶前体溶液流到流动池设备的表面上，并且可以在流动池设备的表面上进一步交联以形成聚合的水凝胶层。在一些示例中，水凝胶前体溶液包括粘度调节剂，例如PEG或葡聚糖，以调节溶液的粘度。在一些示例中，水凝胶前体溶液包括容纳遗传物质的样品。

在一些示例中，水凝胶是被捕获在流动池设备内的水凝胶珠。例如，在一些示例中，水凝胶珠沿着流动池设备内的通道形成柱。在一些示例中，水凝胶珠包括遗传物质。在一些示例中，水凝胶珠包括水凝胶聚合物、交联剂和遗传物质。在一些示例中，水凝胶聚合物包括60-90％的流体(例如水)和10-30％的聚合物。在某些示例中，水凝胶的水含量为约70-80％。

可以使用任何合适的方法来制备水凝胶珠，例如如上所述的用于水凝胶珠的制备方法，例如涡旋辅助乳液或微流体流动技术。

在一些示例中，无论是通过涡流辅助乳液还是微流体惯性流辅助乳液来制备，水凝胶珠都包封了单一或不同的遗传物质。例如，在一些示例中，水凝胶珠包封单细胞。在一些示例中，可以通过稀释包含遗传物质的样品来控制水凝胶珠内遗传物质的量。如本文所述，将包括遗传物质的样品与水凝胶聚合物混合，并将容纳遗传物质的水凝胶聚合物置于涡流辅助乳液或微流体惯性流辅助乳液中。

在一些示例中，在制备容纳遗传物质的水凝胶珠之后，将水凝胶珠脱水以减小水凝胶珠的尺寸。在一些示例中，所述水凝胶珠的尺寸减小约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、或50％、或在由上述任何两个值定义的范围内的量。因此，例如水凝胶珠可以从直径105μm的水合尺寸减小到直径小于100μm的脱水尺寸。在一些示例中，具有遗传物质布置在其中的脱水水凝胶珠流动到流动池设备上，并且再水合至大于流动池设备的通道高度的直径，导致水凝胶珠被捕获在流动池设备内。

B.制备水凝胶流动池设备的方法

本文提供的一些示例涉及制备水凝胶流动池设备的方法。在一些示例中，提供了具有固体表面的流动池设备。在一些示例中，流动池设备的表面涂覆有表面聚合物，例如本文所述的那些，或例如PAZAM或SFA。在一些示例中，具有水凝胶聚合物、交联剂和遗传物质的本文所述的水凝胶前体溶液流入流动池设备中，覆盖了流动池设备的固体表面。在一些示例中，通过使不混溶流体流过流动池设备来去除大量的水凝胶前体溶液，其置换了大部分的水凝胶前体溶液，并在流动池设备中留下了具有遗传物质的水凝胶前体溶液的残留层。在一些示例中，不混溶流体是油、例如矿物油、烃油、硅酮油或聚二甲基硅氧烷油、或它们的混合物。在一些示例中，保留在残留层中的水凝胶前体溶液的厚度可以通过水凝胶前体溶液的粘度来控制，该粘度可以在非反应性聚合物物种、例如PEG或葡聚糖的存在下进行调节。在一些示例中，将包含交联剂、例如四甲基乙二胺(TEMED)的油添加到流动池设备中，其引发水凝胶前体溶液的残留层的交联。在一些示例中，去除含有交联剂的油，在流动池设备的表面上留下具有遗传物质的交联的水凝胶层。在一些示例中，交联的水凝胶层覆盖流动池的表面。在一些示例中，具有交联的水凝胶层的流动池设备可用于加工遗传物质，如本文所述。

本文提供的一些示例涉及制备其中布置有水凝胶层柱的流动池设备的方法。在一些示例中，该方法包括提供如本文的流动池设备。在一些示例中，该方法包括提供如本文所述的包封遗传物质的水凝胶珠。在一些示例中，将水凝胶珠脱水至小于流动池设备的通道高度的直径。在一些示例中，流动池的通道高度在约50μm至约100μm的范围内，例如50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm或150μm、或在由上述任何两个值定义的范围内的量。在一些示例中，脱水水凝胶珠的直径为约2至约140μm，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35，40、4％、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、或140μm、或或在由上述任何两个值定义的范围内的直径。因此，通过举例的方式，流动池设备可以包括具有100μm的高度的通道且相应的脱水的水凝胶珠的直径小于100μm，例如70μm的直径。脱水的水凝胶珠能够再水合，并且这样做时直径增加了1％-50％、例如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％或50％、或在由上述任何两个值定义的范围内的量。容纳遗传物质的脱水水凝胶珠流入流动池设备并再水合，从而固定在流动池设备内。在一些示例中，固定的水凝胶珠在流动池设备内形成柱结构。在一些示例中，如本文所述，具有固定的水凝胶珠的流动池设备可用于处理遗传物质，其中所述固定的水凝胶珠具有包封在其中的遗传物质。

C.在流动池设备中的水凝胶中处理遗传物质的方法

本文提供的一些示例涉及处理包封在流动池设备的固体表面上的水凝胶中的遗传材料的方法。在一些示例中，流动池设备包括覆盖流动池设备的表面的水凝胶层。在一些示例中，流动池设备包括在流动池设备内的所俘获的水凝胶珠或柱。因此，沉积在流动池设备内的水凝胶可包括捕获在流动池设备内的水凝胶层或水凝胶珠。在一些示例中，将包封在水凝胶内的遗传物质与一种或多种试剂接触以进行核酸加工。在一些示例中，遗传物质被保留在水凝胶中，并且试剂能够穿过水凝胶的孔，而同时将遗传物质保留在水凝胶层中，从而允许试剂在遗传材料加工期间进出试剂的进出。试剂可包括裂解剂、核酸纯化剂、DNA扩增剂、标签化剂、PCR剂或用于遗传物质加工的其他试剂。因此，水凝胶通过允许试剂出入水凝胶屏障而将遗传物质自身保留在水凝胶中，从而将遗传物质保留在水凝胶中用于遗传物质的有效处理。

在一些示例中，整个DNA文库的制备可以通过使试剂流入流动池设备中同时将gDNA及其文库产物保留在水凝胶中，从而在水凝胶内部通过多次试剂交换无缝完成。

在一些示例中，使试剂通过流动池设备，接触包封细胞或病毒颗粒的水凝胶，以以从细胞或颗粒中纯化和分离核酸。因此，例如裂解缓冲液流过流动池设备。如本文所用，“剪切”是指对细胞壁或病毒颗粒的扰动或改变，从而有助于接近或释放细胞RNA或DNA。整体打扰和细胞壁的破裂通常没有必要的。术语“裂解缓冲液”是指包含至少一种裂解剂的缓冲液。典型的酶裂解剂包括但不限于溶菌酶、葡糖苷酶、酶解糖、剪切酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒内溶素和外溶素。因此，例如，以通过将诸如溶菌酶和蛋白酶K的裂解剂引入流动池设备中来进行水凝胶中细胞的剪切。在一些示例中，在剪切处理之后，分离的核酸保留在流动池设备中的水凝胶中，并且可以用于进一步处理。

如本文所用，除非另有说明，否则本文所用的术语“分离的”、“用于分离”、“分离”、“纯化的”、“用于纯化”、“纯化”及其语法等同物除非另有说明，是指减少从样品或从中分离出该物质的来源(例如细胞)中获得的至少一种污染物(例如蛋白质和/或核酸序列)的量。因此，纯化导致样品中“富集”或所需蛋白质和/或核酸序列数量的增加。

在一些示例中，可以通过如本文所述的扩增技术来扩增细胞裂解后分离的DNA。在一些示例中，例如对于单细胞mRNA测序，可以进行细胞裂解后的cDNA合成和第二链合成核糖体RNA、以及双链DNA消耗和第二链合成。在一些示例中，例如对于合成加载读出，不需要剪切步骤，因为水凝胶前体溶液或水凝胶珠中的遗传物质是已经分离的核酸，并且可以通过本文所述的扩增技术进行扩增。本领域技术人员将认识到，本文提供的步骤可根据特定应用和特定应用的步骤进行修改，并且本文的公开内容总体上涵盖核酸文库制备物。

可以根据本领域已知的任何合适的扩增方法，包括本文所述的方法，扩增在水凝胶中分离的包封的核酸。在一些示例中，包封的核酸在水凝胶内扩增。在一些示例中，水凝胶被降解，其中包封的核酸被释放到流动池设备的固体载体上，并且核酸在流动池设备内被扩增。扩增可以通过诸如多重置换扩增(MDA)之类的技术来进行，该技术广泛用于扩增少量DNA，尤其是从单细胞中扩增出的DNA。在一些示例中，将扩增引物和酶引入到流动池设备中，穿过水凝胶的孔并与包封的核酸杂交。因此，本文所述或本领域通常已知的任何扩增方法可与通用或靶标特异性引物一起使用，以通过使合适的扩增试剂流过流动池设备来扩增包封的核酸，从而扩增包封在流动池设备的水凝胶中的核酸。

在一些示例中，使用簇扩增方法来扩增被包封的核酸，如美国专利号7,985,565和7,115,400的公开所例示，其全部内容通过引用整体并入本文。美国专利号7,985,565和7,115,400的合并材料描述了核酸扩增的方法，其允许将扩增产物固定在固体载体上，以形成由固定的核酸分子的簇或“集落”组成的阵列。这种阵列上的每个簇或集落是由多个相同或基本相同的固定多核苷酸链和多个相同的固定互补多核苷酸链形成的。如此形成的阵列在本文中通常被称为“聚簇阵列”。固相扩增反应的产物，例如美国专利号7,985,565和7,115,400中所述的那些，是通过将成对的固定的多核苷酸链和固定的互补链退火而形成的所谓“桥联”结构，两个链均优选通过共价附接而在5'端固定于固体载体上。簇扩增方法学是其中使用固定的核酸模板产生固定的扩增子的方法的示例。其他合适的方法学也可以用于由根据本文提供的方法产生的固定的DNA片段生产固定的扩增子。例如，无论是否固定每对扩增引物中的一个或两个引物，都可以通过固相PCR形成一个或多个簇或集落。在一些示例中，被包封的核酸在水凝胶内扩增，然后以阵列或簇的形式沉积在流动池设备上。单个播种DNA分子在流动池表面上的聚簇可以例如通过标准聚簇进行。

在一些示例中，水凝胶是可逆水凝胶，其可在如本文所述的适当条件下降解，包括在升高的温度下或与还原剂接触。例如，如图18A-18B所示，水凝胶可以是可降解水凝胶珠，从而以簇形式释放遗传物质。在图18A中，将水凝胶珠分别包封，并且珠化学破裂以释放用于聚簇的DNA。如图18B所示，DNA聚簇在流动池表面上，并准备进行测序。

其他扩增方法包括等温扩增。可以在本公开中使用的其他基于非PCR的方法包括例如链置换扩增(SDA)，其在例如Walker et al.,Molecular Methods for VirusDetection,Academic Press,Inc.,1995；美国专利号5,455,166和5,130,238；以及Walkeret al.,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)中描述的；或超支链置换扩增，其在例如Lageet al.,Genome Research 13:294-307(2003)中描述的，其各自通过引用整体并入本文。等温扩增方法可与置换链的Phi29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段(5'->3'exo-)一起使用，用于基因组DNA的随机引物扩增。这些聚合酶的使用利用了它们的高生产力和链置换活性。高生产力允许聚合酶产生长度为10-20kb的片段。如上所述，使用具有低生产力和链置换活性的聚合酶、例如Klenow聚合酶，可以在等温条件下产生较小的片段。扩增反应、条件和组分的其他描述在美国专利号7,670,810中公开，其全部内容通过引用合并于此。在一些示例中，用于实施这些扩增反应的聚合酶、试剂和组分被引入到流动池设备，并能够穿过水凝胶孔的以与包封的核酸相互作用，从而扩增水凝胶内的核酸(如本文所述，无论水凝胶是涂覆流动池设备表面的层、还是水凝胶珠或柱)。

在一些示例中，将包封的核酸在水凝胶内全部或部分测序。可以根据任何合适的测序方法对包封的核酸进行测序，包括本文所述的那些方法，例如直接测序，包括边合成边测序、边连接边测序、边杂交边测序、纳米孔测序等。

在一些示例中，可以对一种或多种扩增的包封的核酸进行SBS或其他检测技术，所述技术涉及在循环中重复地递送试剂。例如，为了启动第一个SBS循环，可将一个或多个被标记的核苷酸、DNA聚合酶等流入/流过容纳通过本文所述方法制备的核酸阵列的流动池。可以检测出引物延长导致被标记的核苷酸要参入的那些阵列位点。任选地，核苷酸可以进一步包括可逆的终止特性，其一旦将核苷酸添加到引物中，则终止进一步的引物延长。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加至引物，使得随后的延长直到递送解封闭剂以去除该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以(在检测之前或之后)将解封闭剂递送至流动池。可以在各个输送步骤之间进行洗涤。然后可以重复该循环n次以将引物延长n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。例如，在Bentley et al.,Nature456:53-59(2008)；WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281；和US 2008/0108082中描述了可以容易地适于与通过本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台，其通过引用整体合并于此。

根据本公开的可用于检测的基于阵列的表达和基因型分析的示例方法背描述语美国专利号7582420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美国专利公开号2005/0053980A1；2009/0186349A1或US2005/0181440A1，其各自通过引用整体合并于此。

在本文所述的分离核酸、扩增和测序的方法中，各种试剂用于核酸分离和制备。这样的试剂可以包括例如溶菌酶、蛋白酶K、无规六聚体、聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲液或二价阳离子。根据每个处理步骤的需要，将这些试剂单独或组合地引入到流动池设备中，并通过流动池设备中水凝胶的孔，而遗传物质则保留在水凝胶中并在其中进行处理。本文阐述的方法的优点在于它们提供了包封的微环境，用于在流动池设备上的水凝胶中处理核酸，从而提供了简化的核酸处理系统。这使得能够进行单细胞处理，以快速有效地处理流动池设备中的靶核酸。接头可包括测序引物位点、扩增引物位点和索引。在一些示例中，可以在流动池设备上的水凝胶内制备核酸文库。在一些示例中，例如包封在水凝胶中的遗传物质可以用于单细胞的组合索引，例如使用邻接保留转位(CPTSeq)方法。在一些示例中，来自单细胞的核酸可以在用条形码转座子的WGA扩增之后通过包封单细胞而条形编码，所述转座子通过使其与还原剂接触而溶解水凝胶，例如以释放用于条形编码的基因组DNA。

此外，本文所述的“空间索引”方法和技术的示例缩短了数据分析并简化从单细胞和长DNA分子制备文库的方法。对于单细胞测序，现有方案涉及细胞的高效物理分离、以及独特的对各分离的细胞进行条形编码、以及汇集所有物质回到一起以实施测序。当前用于合成长读的方案通常利用繁琐的条形码步骤，并将每个条形码片段汇聚在一起用于测序，并使数据分析区分来自每个条形码细胞的遗传信息。在这些漫长的过程中，还会丢失遗传物质，从而导致序列缺失。本文描述的示例不仅缩短了过程，而且还提高了单细胞的数据分辨率。此外，本文提供的示例简化了新的生物的基因组的组装。本文所述的示例可用于揭示罕见的遗传变异和突变共现。在一些示例中，约束在水凝胶珠中直至释放的DNA文库提供了通过控制释放过程和水凝胶制剂来控制在表面上释放的片段尺寸的机会。

D.在水凝胶内的流动池设备上制备核酸文库

在一些示例中，测序文库可以由包封在流动池设备上的水凝胶内的遗传物质(例如靶核酸分子)制备。例如，可以如上所述制备测序文库以用于在水凝胶珠中制备测序文库。在几个示例中，从包封在流动池设备上的水凝胶内的单细胞分离靶核酸。

在一些示例中，剪切在水凝胶流动池设备上的水凝胶内截留的遗传物质(例如单细胞)，并通过扩增、标签化或其他核酸文库制备方法进一步处理分离的核酸，然后播种到流动池设备的表面上。在一些示例中，固体载体包括表面中的孔或凹坑的阵列。其可以如本领域中公知的那样使用多种技术来制造，包括但不限于光刻、压印技术、模制技术和微蚀刻技术。如本领域技术人员将理解的，所使用的技术将取决于阵列基底的组成和形状。在一些示例中，孔或凹坑的阵列的直径是约10μm至约50μm，例如直径为10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、或50μm，或在由上述任何两个值定义的范围内的直径。在一些示例中，孔或凹坑的深度为0.5μm至1μm、例如0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm，或在由上述任何两个值定义的范围内的深度。在一些示例中，孔或凹坑由疏水材料制成。在一些示例中，疏水材料包括非晶含氟聚合物，包括例如CYTOP、或在一些示例中，孔的疏水性质改善了酶促加工期间各个细胞基因组DNA的分离，并减少了播种DNA群之间的串扰。

本文提供的系统和方法的示例包括试剂盒，其包含用于制备包封遗传物质的水凝胶珠的水凝胶聚合物、交联剂或微流体设备中的任何一种或多种，还包括可用于处理遗传物质的组分，包括用于细胞裂解、核酸扩增和测序、或用于核酸文库制备的组分，包括本文所述且分别用于遗传物质加工的溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、聚合酶(例如Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(例如Tn5)、引物(例如P5和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲液或二价阳离子。

其他示例

条目1、一种用于实施单细胞测序的流动池设备，其包括：

固体载体，其包括具有沉积在其上的可降解水凝胶的表面，其中可降解水凝胶包括孔，所述孔的尺寸允许试剂扩散通过所述水凝胶、过小从而无法使遗传物质穿过孔。

条目2、条目1的流动池设备，其中所述固体载体被表面聚合物官能化。

条目3、条目2的流动池设备，其中表面聚合物是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)或不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)。

条目4、条目1-3中任一项的流动池设备，其中流动池包括图案化表面。

条目5、条目4的流动池设备，其中图案化表面包括孔。

条目6、条目5的流动池设备，其中孔的直径是约10μm至约50μm，例如直径为10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm或50μm、或在由上述任何两个值所限定的范围内，其中孔的深度为约0.5μm至约1μm、例如0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、或1μm、或在由上述任何两个值所限定的范围内。

条目7、条目5-6中任一项的流动池设备，其中所述孔由疏水性材料组成。

条目8、条目7的流动池设备，其中所述疏水材料包括非晶含氟聚合物，例如CYTOP、或

条目9、条目1-8中任一项的流动池设备，其中可降解水凝胶是水凝胶珠或水凝胶层。

条目10、条目9所述的流动池的设备，其中水凝胶珠的直径为约2μm至约120μm。

条目11、条目1-10中任一项的流动池设备，其中水凝胶包含聚乙二醇(PEG)-硫醇、PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺、N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)、PEG、聚环氧丙烷(PPO)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟基乙酯(PHEMA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、聚己内酯(PCL)，聚(乙烯基磺酸)(PVSA)、聚(L-天冬氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、壳聚糖、纤维素、胶原蛋白、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯、或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯、或它们的组合或混合物。

条目12、条目11的流动池设备，其中水凝胶包含PEG-硫醇/PEG-丙烯酸酯、丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)或PEG/PPO。

条目13、条目1-12中任一项的流动池设备，其中遗传物质包括细胞、核酸或微生物组。

条目14、条目13的流动池设备，其中细胞是哺乳动物细胞或细菌细胞。

条目15、条目13的流动池设备，其中细胞是人细胞。

条目16、条目13-14中的任一项的流动池设备，其中细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、嗜水气单胞菌细胞、或成纤维细胞。

条目17、条目13的流动池设备，其中核酸是300个碱基对或更大的DNA或RNA。

条目18、条目1-17中任一项的流动池设备，其中试剂包括具有小于50个碱基对的尺寸的酶、化学物质和引物。

条目19、条目1-18中任一项的流动池设备，其中试剂包括溶菌酶、蛋白酶K、无规六聚体、聚合酶(Φ29DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶)、转座酶(Tn5)、引物(P5)和P7接头序列)、连接酶、催化酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲液或二价阳离子。

条目20、胰脏用于单细胞测序的系统，包括：

台，其被配置为保持条目1至19中任一项的流动池设备；条目1-19中任一项的流动池设备；和

用于获得测序数据的检测器。

条目21、一种在流动池设备上制备核酸文库的方法，其包括：

提供条目1-19中任一项的流动池设备；

从水凝胶中的遗传物质中分离核酸；和，从分离的核酸制备核酸文库。

条目22、条目21的方法，其还包括：

从水凝胶中释放核酸文库，从而将核酸文库播种在流动池设备的表面上；和

扩增和测序核酸文库。

条目23、条目21-22中的任一项的方法，其中从水凝胶中的遗传物质中分离核酸包括使遗传物质与裂解剂接触以提取核酸。

条目24、条目23的方法，其中裂解剂包括溶菌酶或蛋白酶K。

条目25、条目21-24中任一项的方法，其中制备核酸文库包括使遗传物质与包含接头序列和转座体的转座酶混合物接触。

条目26、条目22-25中的任一项的方法，其中从水凝胶中释放核酸文库包括通过使水凝胶与剪切混合物接触或通过将水凝胶加热至约90℃的温度来分解水凝胶，从而释放核酸文库。

条目27、条目26所述的方法，其中剪切混合物包含二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、或三(3-羟基丙基)膦(THP)。

工作实施例

提供以下示例以说明某些示例的特定特征，但是权利要求的范围不应限于所例示的那些特征。

实施例1

容纳包封的核酸分子的可降解水凝胶珠的流动池捕获

该实施例说明了使用手动涡旋和微流体液滴发生器制备包封核酸分子的水凝胶珠。

选择水凝胶珠的孔尺寸以允许酶、化学物质和较小尺寸的引物(<50bps)扩散，但保留较大尺寸的DNA(>300bps)，从而使基因组DNA和产生的DNA文库在文库制备过程中保留在凝胶微珠内。

由用去离子水稀释的40％丙烯酰胺/双19:1(BioRad#161-0144)制备12％的水凝胶溶液。制备40％(w/v)丙烯酰胺/N,N'双(丙烯酰基)胱胺(BACy)(19:1)单体原液(3.8g丙烯酰胺，0.2g BACy和6mL双重蒸馏(dd)H2O)。使混合物达到10mL的最终体积。为了制备溶液，将丙烯酰胺溶解在6mL的ddH2O中，并将所得溶液用于溶解BACy。单体的溶解是吸热的，因此稍微加热混合物将有助于完全溶解单体。将水凝胶溶液保持在4℃直至使用。将35μL的饱和过硫酸钾溶液(KPS；Sigma)添加到200μL的12％水凝胶溶液中并充分混合。

将基因组DNA样品转移到无菌的1.7mL试管中。将235μL水凝胶-KPS溶液添加到每个容纳基因组DNA样品的试管中。然后将水凝胶基因组DNA溶液加载到具有表面活性剂(4.5％Span80、0.4％Tween20和0.05％Triton X-100)的600μL矿物油中。将该溶液涡旋30秒以产生液滴乳液，并立即加入25μL的TEMED(Sigma)，然后再涡旋30秒。

为了用丙烯酰胺/BACy比为19:1(2mL)制备10％的凝胶，将0.96mL的ddH2O、0.5mL的40％丙烯酰胺/BACy(19:1)、0.5mL的10x tris/硼酸盐/EDTA缓冲液(TBE)、20μLTEMED和20μLKPS(饱和)混合。

为了用丙烯酰胺/BACy比为19:1(2mL)制备5％凝胶，将1.21mL的ddH2O、0.25mL40％丙烯酰胺/BACy(19：I)、0.5mL的I Ox TBE、20μLTEMED、20μLKPS(饱和)混合。使反应聚合直至胶凝(6分钟)。

然后产生包封基因组DNA的水凝胶珠。孵育15分钟以使水凝胶珠完全交联后，将约900μL石油醚添加到每个试管中。将试管涡旋以洗去油，并去除上清液。洗涤水凝胶珠，然后涡旋，并且旋转珠。将珠重悬，并可以在4℃下保存至少3周。

使用如上所述使用手动乳液的方法，以产生具有从约2μm至约100μm直径的尺寸分布的水凝胶珠。

为了产生均匀尺寸分布的水凝胶珠，使用了微流体液滴发生器(见图3)。将容纳水凝胶聚合物和基因组DNA片段的水溶液加载到微流液滴发生器的药筒上，并引入微流液滴发生器的矿物油中(图3A)。微流体设备的高度为120μm，水性通道宽度为75μm，且载体油通道宽度为78μm。使用该设备时，水性通道的流速为60μL/min，载体油通道的流速为300μL/min。使用该设备，产生直径约120μm的水凝胶珠(图3B)。珠的尺寸可以通过调节通道宽度、微流体设备尺寸和流速来微调。

将容纳基因组DNA片段的水凝胶珠固定在MiSeq^TM测序流动池上(图3C)(Illumina，San Diego，CA)。由于物理约束，珠被捕获在流动池中。水凝胶珠的直径为约120μm，并且测序流动池的通道的高度为约100μm。将具有捕获的珠的流动池插入MiSeq^TM测序仪中，用于进一步处理(图3D)。

实施例2

珠内测序文库制备和流动池播种

该实施例说明了由捕获在测序流动池上的水凝胶珠中容纳的基因组DNA制备测序文库的方法，以及随后将所制备的核酸文库播种在流动池上的方法。

如实施例1中所述，在MiSeq^TM流动池的表面上捕获容纳包封的基因组DNA片段的水凝胶珠。将含有用于从测序流动池上捕获的珠中的基因组DNA制备DNA文库的酶和试剂的溶液流到流动池上，以在水凝胶珠中制备DNA文库(图4A和4B)。所捕获的水凝胶珠的孔尺寸允许酶、化学物质和较小尺寸的引物(<50bps)扩散，但保留较大尺寸的DNA(>300bps)。然后将矿物油加载到测序流动池上，以填充珠之间的空隙，并包围捕获的包含DNA文库的水凝胶珠。然后将MiSeq^TM流动池的温度以升至90℃3分钟，以使DNA文库变性并降解水凝胶珠。如图4C所示，变性的DNA文库从水凝胶珠中扩散出来，并且由于矿物油的存在，保留在由珠直径限定的区域中。因此，在油存在的情况下，播种在靠近各水凝胶珠的印迹处发生(根据120μm直径的水凝胶珠，文库播种被限制在约120μm直径区域)。将MiSeq^TM流动池的温度分别以降低至60℃6分钟、40℃2分钟和20℃2分钟，以使单链DNA文库与流动池上的表面P5/P7引物杂交，从而将文库播种到流动池的表面上。

随后，可以对播种文库进行聚簇，并使用标准SBS化学方法进行测序。

实施例3

使用水凝胶珠测序核酸

该实施例提供了使用水凝胶珠对流动池表面上的核酸分子进行空间索引的测序测定的结果。

测定了三种不同的工作流程，用于进行长DNA分子的测序(见图5A-5C)。测试了两个不同的DNA片段长度(～100kb和～10kb)，以及在测序文库制备之前的珠内MDA步骤以扩增水凝胶珠中的基因组DNA。

如实施例1中所述，产生了含有～100kb或～10kb的包封的基因组DNA片段的水凝胶珠。对于每个片段长度，评估文库生成之前的珠内MDA。

将所得的水凝胶珠加载到MiSeq^TM测序流动池上，并使用Nextera^TM(Illumina，SanDiego，CA)试剂和流程，通过标签化反应生成测序文库。然后将矿物油加载到流动池，以包围所捕获的珠。然后将流动池的温度升至90℃3分钟，以使DNA文库变性并降解水凝胶珠。变性的DNA文库从水凝胶微珠中扩散出来，由于存在矿物油，因此保留在微珠直径所限定的区域中。将MiSeq^TM流动池的温度分别降低至60℃6分钟、40℃2分钟和20℃2分钟，以使单链DNA文库与流动池上的表面P5/P7引物杂交，从而将文库播种到流动池的表面上。随后，将播种文库进行聚簇，并使用标准SBS化学方法进行测序，并使用选通和链接读出分析对读出进行处理。

在第一测定中(参见图6)，产生了水凝胶珠，其容纳具有～100kb的片段尺寸的人(Corriell)基因组DNA，每个珠具有～100个片段。珠内测序文库生成之前，未实施珠内MDA扩增。对得到的序列读出进行选通读出分析(每328或400bp读出1个)显示平均每个珠～405个序列岛，平均岛尺寸为64kb，每个岛平均33个簇。

在第二测定中(参见图7)，产生了水凝胶珠，其包含具有～100kb的片段尺寸的人(Corriell)基因组DNA，每个珠具有～50个片段。珠内测序文库生成之前，实施了MDA扩增。对所得序列读出进行链接读出分析显示，平均每个珠～166个序列岛，平均岛尺寸为58kb，每个岛平均85个簇。

在第三测定中(参见图8)，产生了水凝胶珠，其包含具有～10kb的片段尺寸的人(Corriell)基因组DNA，每个珠具有～100个片段。珠内测序文库生成之前，实施了珠内MDA扩增。对所得序列读出进行链接读出分析显示，平均每个珠～85个序列岛，平均岛尺寸为10.4kb，每个岛平均57个簇。

总而言之，结果证明使用水凝胶珠的测定法的实用性为长DNA分子的播种和测序提供了空间索引。此外，在流动池表面上簇斑的空间隔离使得靶核酸分子能够从来自各个簇斑的较短序列读出重建。

实施例4

中空水凝胶珠

该实施例说明了具有中空核的水凝胶珠的构造，所述中空核容纳所包封的靶核酸分子。

图9A提供了说明中空水凝胶珠的构造的示意图。首先，形成内水凝胶层，其容纳包封的遗传物质，例如靶核酸分子。然后将内水凝胶层用外水凝胶层包封。然后使用不使外水凝胶层解聚的试剂使内水凝胶层解聚，从而使外水凝胶层具有容纳遗传物质的中空空间。

图9B显示了在用聚丙烯酰胺外壳包封，并且使用剪切用于形成内水凝胶的交联剂的解聚剂对核水凝胶解聚之前(左)和之后(右)，容纳所包封的核酸分子的内聚丙烯酰胺水凝胶核的显微照片。图9C显示了在用外聚丙烯酰胺壳包封，并且通过加热至60℃将核水凝胶解聚之前(左侧)和之后(右)，容纳所包封的核酸分子的内琼脂糖凝胶核的显微照片。

如本文所述，可以将所得的容纳所包封的核酸分子的中空水凝胶珠加载到测序流动池上以对核酸分子进行测序。

实施例5

使用细胞裂解物产生包封靶核酸分子的可降解水凝胶微珠

该实施例提供了使用水凝胶珠对流动池表面上的核酸分子进行空间索引的测序测定的结果，其中水凝胶珠容纳从细胞裂解物在珠中制备的包封的靶核酸分子。

将来自组织培养物的人细胞直接加入到裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0、5mMEDTA、0.5％SDS和50μg/ml RNA酶A)中，并温育5分钟。然后，将实施例1中所述的水凝胶前体溶液以1:1的比例添加至裂解物中，并将所得溶液提供至液滴发生器的输入端以产生水凝胶珠。将珠加载到测序流动池上，制备测序文库，并将其播种到流动池表面上，并且如实施例2和3中所述实施测序测定。岛尺寸分布和观察到的最长岛显示在图10B和10C中。

实施例6

样品多路复用

该实施例说明了可用于在单个测序流动池上询问多个核酸样品的样品索引方法的示例。

为了从同一流动池泳道中的多个样品生成链接长读信息，具有不同索引的转座子可用于标记具有不同索引的每个样品，其随后依赖所述索引来识别与每个样品相对应的簇斑。在将珠捕获到流动池上之前，将每个样品的靶核酸分子用唯一索引标签化。如实施例1中所述，将不同的人基因组DNA样品包封在水凝胶珠中，并在将珠加载到流动池之前，使用不同的索引转座子分别标签化。汇聚容纳标签化DNA的水凝胶珠并捕获到测序流动池上，然后完成测序文库的制备，将液体扩散屏障加载到序列流动池上，并在存在液体扩散屏障的情况下降解水凝胶珠，以将测序文库播种到流动池表面上。播种的斑包含对应于不同样品的不同DNA索引序列，并且可以在测序后的读出分析过程中彼此分离。

在另一个示例中，为了从同一流动池泳道中的多个样品生成链接长读信息，对每个样品使用索引不同的转座子，在流动池上依次处理每个样品的水凝胶珠，以标识对应于每个样品的簇斑。将容纳第一样品的珠加载到流动池上，并使用索引转座子标签化靶核酸。将第一样品的文库从珠中释放并播种到流动池上后，将第二轮的容纳第二靶核酸样品的水凝胶珠加载到流动池中，并使用不同的索引转座子进行标签化，以生成第二索引文库，其以空间受限的方式释放，用于播种在流动池表面上。这提供了包含对应于不同样品的不同DNA索引序列的播种斑，其可以在测序后的读出分析过程中彼此分离。图11示出了使用该顺序播种策略处理的来自两个不同样品(每个样品带有在标签化步骤中引入的不同DNA条形码)的叠加水凝胶DNA斑生成的图像。来自第一样品的簇斑用星号(*)标记；来自第二样品的斑未标记。

在另一个实施例中，为了从相同流动池泳道中的多个样品产生链接长读信息，可以在包封步骤中将外源核酸分子掺入不同的靶核酸样品中。将不同的人基因组DNA样品与不同的外源DNA标志物(例如Phi-X、λ1、λ3或λ3DNA)混合，并将混合物如实施例1所述包封在水凝胶珠中。将由各样品产生的水凝胶珠汇聚，加载到测序流动池上，标签化以生成测序文库，并在存在液体扩散屏障的情况下降解，以将测序文库播种在流动池表面上。外源性核酸分子用作标记以识别对应于每个样品的播种的斑。

在另一个实施例中，为了最大程度地利用流动池进行测序数据生成，并可选地从同一流动池通道中的多个样品中生成读出信息，在从水凝胶珠中接种测序文库后，将附加步骤添加到工作流程中。在此阶段，流动池上水凝胶珠印迹之间的粒间空隙具有较低的播种文库密度。为了利用该粒间空隙，使用常规的短读测序文库实施额外的播种步骤，该文库由与包封在水凝胶珠中的靶核酸样品相同的靶核酸样品产生。使用标准方法将该短读文库播种到测序流动池中，并包含与包封在水凝胶珠中的文库所使用的DNA索引不同的DNA索引，以从连接的长读和短读文库中分离读出。图12示出了来自粒间空隙播种之前和之后的对应伪图像。使用这种方法，可以实现靶DNA样品更大的覆盖范围，从而提高了SNP识别的准确性。

实施例7

具有水凝胶层的流动池设备的制造方法

以下实施例说明制造其上沉积有水凝胶层的流动池设备的方法。

如图1所示，在具有表面的流动池设备上涂覆了表面聚合物，例如PAZAM或SFA。参照图13A步骤(a)。如步骤(b)中所示，将具有水凝胶聚合物、交联剂和细胞的水凝胶前体溶液流入流动池设备中，覆盖流动池设备的固体表面。用油置换大部分水凝胶前体溶液，以产生残留的容纳遗传物质的水凝胶膜。然后，如步骤(c)所示，将含TEMED的油(在600μL的矿物油中含25μL的TEMED)流过表面，以引发残留水凝胶膜的交联。如步骤(d)所示，去除含有交联剂的油、在交联的水凝胶基质中留下细胞。

实施例8

在具有水凝胶层的流动池设备中将播种DNA分子聚簇的方法

下面的实施例说明了在实施例7中制造的流动池设备中将播种DNA分子聚簇的方法，其具有包封在水凝胶层中的细胞。

制备实施例7的流动池设备，其具有其中沉积有细胞的水凝胶层。将裂解缓冲液引入流动池设备，如图13B步骤(a)所示。裂解缓冲液中的裂解剂渗透了交联水凝胶层中细胞的细胞壁。使用的裂解剂包括溶菌酶或去污剂。将蛋白酶K引入流动池设备以从结合的络合物中释放核酸。

接下来，如图13B的步骤(b)所示，通过将MDA试剂引入到流动池设备中，使用MDA扩增单细胞基因组DNA分子以产生DNA的几个拷贝。然后用缓冲液洗涤流动池设备的表面，以使短的扩增子从水凝胶层中扩散出来，然后将油引入流动池设备中，覆盖该层。将表面加热到80℃以促进DNA分子的侧向扩散，以将其从初始捕获位置播种出去，如图13B步骤(c)所示。一旦将DNA播种到PAZAM层上，就使用还原剂如THP、TCEP或DTT洗去交联的凝胶，所述还原剂使凝胶解交联，如图13B步骤(d)所示。

最后，使用eXAMP或标准聚簇对单个播种DNA分子进行聚簇，如图13B步骤(e)所示。使用簇的空间信息组装所得测序数据，由于来自相同细胞的簇以相同的物理邻近度进行播种，因此可以获得该序列数据。

实施例9

用水凝胶柱制造流动池设备的方法

以下实施例说明了制造以柱状形式沉积有水凝胶的流动池设备的方法。

制备其中包封有遗传物质的水凝胶珠。为了制备水凝胶珠，使用以下方法。

由用去离子水稀释的40％丙烯酰胺/双19:1(BioRad#161-0144)制备12％(w/v)的水凝胶溶液。制备40％(w/v)丙烯酰胺/N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BACy)(19:1)单体原液(3.8g丙烯酰胺、0.2gBACy和6mL双重蒸馏(dd)H2O)，并将最终体积调至10mL。通过首先将丙烯酰胺溶解在6mL的ddH2O中来制备溶液，然后将其用于溶解BACy。单体的溶解是吸热的，因此稍微加热混合物有助于完全溶解单体。将水凝胶溶液保持在4℃直至使用。将35μL的饱和过硫酸钾溶液(KPS；Sigma)添加到200μL的12％水凝胶溶液中并充分混合。如本文所述，该水凝胶溶液可用于包封遗传物质，包括DNA或细胞。

对于DNA包封，将20μL的Coriell DNA溶液(10ng/μL)添加到235μL的水凝胶/KPS溶液中。将20μL的含Coriell DNA的水凝胶溶液添加到液滴发生器板(BioRAD QX200)的每个样品孔中，并将70μL油添加到每个孔中。将板加载到液滴发生器2分钟后，形成20,000个液滴。将50μL的TEMED油(25μL TEMED在600μL矿物油中)添加到收集的每个液滴中，以使珠交联。孵育15分钟后，水凝胶完全交联。将含有Coriell DNA的水凝胶珠直接加载到MiSeq^TM流动池(Illumina，Inc.，San Diego，CA)中，然后用PR2洗涤，如图14所示。水凝胶珠的直径约为120μm，这使它们固定在100μm的流动池通道内，在流动池设备内形成柱子。然后制备其中捕获有水凝胶珠的流动池设备，准备进行DNA处理。

为了进行细胞包封，在室温下解冻在-80℃下保存的包含大肠杆菌细胞的样品。100μL的细菌溶液被转移到无菌的1.7毫升试管中，并将样品用1mL 0.85％NaCl洗涤一次。将样品沉淀并去除洗涤液。如下所述保存细菌沉淀以与水凝胶溶液混合。

5μL大肠杆菌在PR2中的重悬液转移到干净的PCR管中，加入200μL水凝胶加KPS混合物，并混合孔。将如上所述的20μL大肠杆菌聚合物混合溶液添加到液滴发生器板(BioRADQX200)的每个样品孔中，并在每个油孔中添加70μL油。将板加载到液滴发生器后，在2分钟内形成约20,000个液滴，并将50μL的TEMED油(25μL TEMED在600μL矿物油中)添加到收集的每个液滴中。孵育15分钟后，水凝胶完全交联。将珠直接加载到MiSeq^TM流动池，然后PR2洗涤，并且凝胶珠的直径为约120μm，并在100μm高的流动池通道中卡住。流动池可随后被用于处理细菌细胞和核酸，用于核酸文库制备。

可以将容纳Coriell DNA或细菌细胞的水凝胶微珠脱水，以缩小微珠尺寸，然后再将微珠引入流动池设备。如图16A-16C中所示，将包含样品的脱水珠工程化以通过调整其水合水平来动态地调节。可以将约70μm的脱水珠(图16A)轻松装入通道高度为100μm的流动池中。随着水凝胶珠的水合，它们开始增大(图16B)，并在完全水合时最终达到其原始尺寸105μm(图16C)。

如图15A至图15C所示，流动池设备可包括蚀刻的表面，其包括图案以便单独地分离和定位每个水凝胶珠。图案化的微孔阵列可用于捕获处于脱水状态的水凝胶珠。然后可以使试剂流过流动池以使水凝胶珠再水合，以将其固定在通道中，并继续进行下游测定。该设备可以是涂覆有疏水性材料(可以是CYTOP、或或其他疏水性材料)的基于硅的或玻璃基底，然后用微孔阵列进行光刻图案化(直径和间距随目标水凝胶珠尺寸而异)，并蚀刻掉，从而可以蚀刻孔或对表面进行官能化以用阵列捕获水凝胶珠。流动池设备的图案化表面可用于增加流动池设备内水凝胶珠的数量，并用于在流动池设备内指定位置处精确地释放DNA。

实施例10

流动池设备中的DNA文库制备

以下实施例说明了在流动池设备上制备DNA文库的方法，在其中以水凝胶柱的形式沉积有水凝胶。

如实施例9所述的流动池设备具有固定在其中的水凝胶珠，形成水凝胶柱，用于DNA文库制备。将Tn5转座体试剂(NexteraTM，Illumina Inc.)加载到流动池中，并在55℃下孵育5分钟。将含有P5和P7末端的接头插入DNA。将50μL终止缓冲液加载到流动池中，以敲除Tn5酶。将Bsu聚合酶和用于填充缺口的核苷酸的盐城混合物加载到流动池设备中，以制备核酸文库，将其制备并固定在水凝胶珠基质中。将PR2洗涤缓冲液加载到流动池设备上，并将温度升至90℃3分钟以使DNA文库变性，该DNA文库从水凝胶珠中扩散出来。然后将温度降低至60℃6分钟，40℃2分钟和20℃2分钟，以使单链DNA文库与表面P5/P7引物杂交以进行簇扩增。流动池直接用于30循环桥联扩增、线性化和测序引物制备。然后进行2x 150个测序循环，并将确定的序列与Coriell序列进行对齐。

图19A和19B显示了含有Coriell DNA的染色水凝胶珠的荧光成像(图19A)和播种的扩增DNA的簇梯度密度(图19B)。人gDNA的测序结果在图20中提供。图20A是单个实验读出的总体Q分数。图20B示出了来自相同实验的错配率。测序结果包括151,101个簇/块，92％簇，67％对齐，0.41％错配率和186的中位长度。

实施例11

在流动池设备中细菌细胞的DNA分离和文库制备

以下实施例说明了从流动池设备中的细菌细胞中分离DNA并在流动池设备上制备DNA文库的方法，该DNA文库中以包封细菌细胞的水凝胶柱的形式沉积有水凝胶。

提供了具有水凝胶珠并包封在其中的细菌细胞的实施例9的流动池设备。100μL的细菌裂解剂(Life Technologies公司，在100μL重悬浮缓冲液Charge Switch试剂盒中0.5mg溶菌酶)加载到流动池中，并在37℃下孵育10分钟。然后将蛋白酶K试剂加载到流动池中，并在55℃下孵育20分钟，以完全消化蛋白质。在此步骤中，大肠杆菌gDNA暴露但固定在水凝胶珠内，其被俘获在流动池设备中。用PR2洗涤后，将Tn5转座体试剂(Nextera^TM，Illumina Inc.)装入流动池，并在55℃下孵育5分钟。含有P5和P7末端的接头被插入到该DNA中。50μL的终止缓冲液加载到流动池设备，以使该Tn5酶失活。将包含Bsu聚合酶和用于填补缺口的核苷酸的延长混合物加载到设备上，从而制备了大肠杆菌核酸文库，该文库固定在捕获在流动池设备内的水凝胶珠内。然后加入PR2洗涤缓冲液，并将温度升至90℃3分钟以使DNA文库变性，该文库从水凝胶珠中扩散出来。然后将温度降低至60℃6分钟，40℃2分钟和20℃2分钟，以使单链DNA文库与表面P5/P7引物杂交以进行簇扩增。流动池直接用于30循环桥联扩增、线性化和测序引物制备。然后进行2x150个测序循环，并将确定的序列与大肠杆菌序列进行对齐。

图21A示意性地示出了与实施例11一致的制备核酸文库的方法。将细胞分离成水凝胶珠，加载到流动池设备上，并再水合以将水凝胶珠固定在流动池设备内。裂解剂裂解了水凝胶珠中的细胞，并在细菌DNA上进行了文库制备。然后释放DNA，并将其播种在包围珠的流动池设备表面。如图21B中所示，DNA文库在释放之前被包封在水凝胶珠中，并且在释放之后从水凝胶珠扩散(图21C)。SYTOX染料簇的荧光成像显示与原始凝胶珠非常接近的独特簇(图21D)。比例尺＝50μm。

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在整个说明书中使用的术语“基本上”和“大约”用于描述和解释小的波动。例如，它们可以指小于或等于±5％、例如小于或等于±2％、例如小于或等于±1％、例如小于或等于±0.5％、例如小于或等于±0.2％、例如小于或等于±0.1％、例如小于或等于±0.05％。

所有与前述概念的组合的所有物质出现在本公开结尾要求保护的主题的组合被预期作为本发明主题物的部分在此公开。还应理解，本文明确采用的、也可能出现在通过引用并入的任何公开中的术语应被赋予与本文公开的特定概念最一致的含义。

显而易见的是，在不脱离所描述示例的精神的情况下，可以改变或修饰所公开方法的精确细节。我们要求保护落入以下权利要求的范围和精神内的所有此类修饰和变化。

Claims (29)

1.一种方法，其包括：

在足以将可降解水凝胶珠捕获在测序流动池的表面上的条件下，将可降解水凝胶珠加载到测序流动池上，其中：

可降解水凝胶珠容纳由包封的遗传物质制备的测序文库；或

可降解水凝胶珠容纳包封的遗传物质，并且所述方法进一步包括在所捕获的可降解水凝胶珠中从遗传物质制备测序文库；和

将液体扩散屏障加载到测序流动池上，其包围水凝胶珠；和

在存在液体扩散屏障的情况下降解所捕获的水凝胶珠，以抑制测序文库扩散超过相应水凝胶珠的直径并且允许将测序文库转运和播种到相对靠近相应水凝胶珠印迹的测序流动池的表面上。

2.权利要求1的方法，其中在足以将可降解水凝胶珠捕获在测序流动池的表面上的条件下，将可降解水凝胶珠加载到测序流动池上，包括在足以将可降解水凝胶珠固定在测序流动池表面上的条件下将可降解水凝胶珠加载到测序流动池上，并且其中将扩散屏障加载到包围水凝胶珠的测序流动池上包括将液体扩散屏障加载到测序流动池表面上的固定的可降解水凝胶珠上，使得液体扩散屏障包围水凝胶珠。

3.权利要求1或2的方法，其中遗传物质选自靶核酸分子、或含有靶核酸分子的细胞和细胞裂解物中的至少一种。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中测序文库包含长度为至少150个核苷酸的DNA或RNA。

5.权利要求3的方法，其中靶核苷酸分子是基因组DNA。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中液体扩散屏障是油、粘稠水溶液、或其组合。

7.权利要求6的方法，其中油是矿物油、硅酮油、全氟化油、或它们中两种或更多种的组合。

8.权利要求6的方法，其中粘稠水溶液是包含聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮、普罗尼克葡聚糖、蔗糖、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)/锂皂土、或它们中两种或多种的组合的溶液。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中水凝胶珠通过下述中的一种或多种降解：

(a)使水凝胶珠与剪切可逆交联剂的试剂接触，所述交联剂将水凝胶的聚合物交联；

(b)将水凝胶珠加热至约90℃；

(c)将水凝胶珠暴露于剪切光可剪切交联剂的波长的光下，所述交联剂将水凝胶的聚合物交联；或

(d)(a)和(b)；(a)和(c)；(b)和(c)；或(a)、(b)和(c)的组合。

10.权利要求9的方法，其中试剂包含二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、三(3-羟基丙基)膦(THP)、或它们中两种或更多种的组合。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中水凝胶珠的直径为约5μm至约120μm。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中水凝胶珠是包含容纳遗传物质的中空核的中空水凝胶珠。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中水凝胶珠包含直径尺寸足够大的孔，以允许试剂扩散通过水凝胶珠，同时保留包封的测序文库。

14.权利要求13的方法，其中孔的直径为约10nm至约100nm。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中制备测序文库包括对在水凝胶珠内的靶核酸分子实施标签化反应。

16.权利要求15的方法，其中标签化反应包括使靶核酸分子与包含接头序列和转座体的转座酶混合物接触。

17.前述权利要求中任一项的方法，其中在测序流动池的表面上捕获水凝胶珠包括下述中的一个或多个：

水凝胶珠在测序流动池的表面上的物理约束；和

水凝胶珠上的特异性结合对的第一成员对测序流动池表面上的特异性结合对的第二成员的特异性结合。

18.权利要求17的方法，其包括水凝胶珠在测序流动池的表面上的物理约束，其中水凝胶珠的直径比流动池的高度大约5％至约30％，以将珠约束在流动池中。

19.前述权利要求中任一项的方法，其中水凝胶珠的直径为约110μm，且测序流动池的高度为约100μm。

20.权利要求17的方法，其中测序流动池是图案化流动池，并且特异性结合对的第二成员位于图案化流动池的孔处。

21.前述权利要求中任一项的方法，其中未对测序文库进行加条形码以识别各个水凝胶珠。

22.前述权利要求中任一项的方法，其还包括将用可降解水凝胶珠包封的靶核酸分子进行扩增。

23.权利要求22的方法，其中扩增涉及多重置换扩增。

24.权利要求22的方法，其中包封的靶核酸分子是基因组DNA，并且扩增涉及全基因组扩增。

25.前述权利要求中任一项的方法，其还包括对测序文库进行测序。

26.权利要求25的方法，其中从相应的可降解水凝胶珠播种的测序文库在流动池表面上的位置被用作空间索引，用于由序列文库测序产生的读出。

27.一种流动池设备，其包括：

基底，其具有表面；

固定在所述基底表面的可降解水凝胶珠，其中可降解水凝胶珠包括孔，孔的尺寸设置成允许试剂扩散通过水凝胶珠，但是过小而不能使遗传物质穿过孔；

其中，水凝胶珠被配置为在液体扩散屏障存在下降解，所述液体扩散屏障填充了水凝胶珠之间的空隙体积，以抑制测序文库扩散超过相应水凝胶珠的直径并且允许将测序文库转运和播种到相对靠近相应水凝胶珠印迹的基底表面。

28.一种系统，其包括：

用于保持权利要求27的流动池设备的台；

流动池设备；和

用于获得测序数据的检测器。

29.一种方法，其包括：

提供权利要求27的流动池设备；

从水凝胶珠中的遗传物质中分离核酸；和

从分离的核酸制备核酸文库。