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DE60131194T2 - Sequenzbestimmung in echtzeit - Google Patents

Sequenzbestimmung in echtzeit Download PDF

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DE60131194T2
DE60131194T2 DE60131194T DE60131194T DE60131194T2 DE 60131194 T2 DE60131194 T2 DE 60131194T2 DE 60131194 T DE60131194 T DE 60131194T DE 60131194 T DE60131194 T DE 60131194T DE 60131194 T2 DE60131194 T2 DE 60131194T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polymerase
tag
monomer
dna
labeled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60131194T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60131194D1 (de
Inventor
Susan H. Bellaire HARDIN
James M. Katy BRIGGS
Shiao-Chun Houston TU
Xiaolian Houston GAO
Richard Houston WILLSON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Life Technologies Corp
Original Assignee
Visigen Biotechnologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22807697&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE60131194(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Visigen Biotechnologies Inc filed Critical Visigen Biotechnologies Inc
Publication of DE60131194D1 publication Critical patent/DE60131194D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60131194T2 publication Critical patent/DE60131194T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

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  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
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  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
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  • Color Television Systems (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft (ein) Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät und -verfahren.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung (ein) Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät und -verfahren unter Verwendung von markierten Polymerisationsmitteln und/oder markierten Monomeren, wobei die markierten Polymerisationsmittel und/oder markierten Monomere eine Veränderung hinsichtlich einer nachweisbaren Eigenschaft vor, während und/oder nach der Monomereinfügung in eine wachsende Polymerkette erfahren. Das Gerät und die Verfahren sind für die Sequenzierung von DNA-, RNA-, Polypeptid-, Kohlenhydrat- oder ähnlichen biomolekularen Sequenzen unter Nahe-Echtzeit- oder Echtzeitbedingungen ideal geeignet. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem (ein) Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät und -verfahren unter Verwendung von markierten Depolymerisationsmitteln und/oder markiertem depolymerisierbarem Polymer, wobei das markierte Depolymerisationsmittel und/oder das markierte depolymerisierbare Polymer eine Veränderung hinsichtlich einer nachweisbaren Eigenschaft vor, während und/oder nach der Monomerentfernung aus der depolymerisierbaren Polymerkette erfahren. Das Gerät und die Verfahren eignen sich ideal zur Sequenzierung von DNA-, RNA-, Polypeptid-, Kohlenhydrat- oder ähnlichen biomolekularen Sequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Erfassung eines Signals, das Interaktionen zwischen dem markierten Polymerisationsmittel oder Depolymerisationsmittel und einer markierten oder nicht markierten Polymeruntereinheit wie einem Monomer oder einer Ansammlung von Monomeren bestätigt, wobei das erfasste Signal Informationen über die Monomerreihenfolge liefert. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die Verfahren in Echtzeit oder nahe Echtzeit durchgeführt.
  • 2. BESCHREIBUNG DER VERWANDTEN TECHNIK
  • Überblick über die konventionelle DNA-Sequenzierung
  • Die Entwicklung von Verfahren, die eine schnelle und zuverlässige Bestimmung der Reihenfolge von Basen oder der 'Sequenz' in einem DNA-Fragment ermöglichen, ist ein wesentlicher technischer Fortschritt, dessen Bedeutung nicht überbewertet werden kann. Die Kenntnis der DNA-Sequenz ermöglicht ein besseres Verständnis der molekularen Grundlage des Lebens. DNA-Sequenzinformationen liefern Wissenschaftlern die Informationen, die für eine große Auswahl biologischer Prozesse maßgeblich sind. Die Reihenfolge der Basen in DNA bestimmt die Reihenfolge der Basen in RNA, dem Molekül innerhalb der Zelle, das direkt den Informationsgehalt von Proteinen kodiert. DNA-Sequenzinformationen werden routinemäßig zum Ableiten von Proteinsequenzinformationen verwendet. Die Basenreihenfolge gibt die DNA-Struktur und ihre Funktion vor und liefert ein molekulares Programm, das eine normale Entwicklung, die Manifestation einer Erbkrankheit oder Krebs spezifizieren kann.
  • Die Kenntnis der DNA-Sequenz und die Fähigkeit zur Manipulation dieser Sequenzen haben die Entwicklung der Biotechnologie beschleunigt und zur Entwicklung von Molekulartechniken geführt, die die Werkzeuge zum Stellen und Beantworten wichtiger wissenschaftlicher Fragen liefern. Die Polymerasekettenreaktion (PCR), eine wichtige Biotechnik, die den sequenzspezifischen Nachweis von Nucleinsäure erleichtert, ist auf Sequenzinformationen angewiesen. DNA-Sequenzierungsverfahren ermöglichen es Wissenschaftlern zu bestimmen, ob eine Veränderung in der DNA stattgefunden hat, und den Effekt der Veränderung auf die Biologie des Organismus zu prüfen, und zwar unabhängig vom Typ des untersuchten Organismus. Letztendlich können DNA-Sequenzinformationen eine Möglichkeit zur eindeutigen Identifizierung von Individuen bieten.
  • Für das Verständnis des DNA-Sequenzierungsprozesses muss man sich verschiedene Fakten über die DNA in Erinnerung rufen. Zunächst einmal besteht ein DNA-Molekül aus vier Basen, und zwar Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Diese Basen interagieren miteinander auf sehr spezifische Weise über Wasserstoffbindungen, so dass A mit T und G mit C interagiert. Diese spezifischen Interaktionen zwischen den Basen werden als Basenpaarungen bezeichnet. In der Tat sind es diese Basenpaarungen (und Basenstapelungs-Interaktionen), die doppelsträngige DNA stabilisieren. Die beiden Stränge eines DNA-Moleküls kommen in einer antiparallelen Orientierung vor, wobei ein Strang in 5'-3'-Richtung und der andere Strang in 3'-5'-Richtung positioniert ist. Die Begriffe 5' und 3' beziehen sich auf die Direktionalität des DNA-Rückgrats und sind für die Beschreibung der Reihenfolge von Basen maßgeb lich. Im Rahmen der Konvention zur Beschreibung der Basenreihenfolge in einer DNA-Sequenz wird die 5'-3'-Richtung verwendet, wobei von links nach rechts geschrieben wird. Ist also die Sequenz eines DNA-Strangs bekannt, dann kann die komplementäre Sequenz abgeleitet werden.
  • Sanger-DNA-Sequenzierung (enzymatische Synthese)
  • Die Sanger-Sequenzierung ist derzeit das am häufigsten angewendete Verfahren zur Sequenzierung von DNA (Sanger et al., 1977). Dieses Verfahren macht sich verschiedene Merkmale einer DNA-Polymerase zunutze: ihre Fähigkeit zur Herstellung einer exakten Kopie eines DNA-Moleküls, ihre Synthesedirektionalität (5'-3'), ihren Bedarf an einem DNA-Strang (einen 'Primer'), von dem aus die Synthese begonnen wird, und ihren Bedarf an einem 3' OH am Ende des Primers. Ist ein 3' OH nicht verfügbar, kann der DNA-Strang durch die Polymerase nicht erweitert werden. Wird ein Didesoxynucleotid (ddNTP; ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP), ein Basenanalogon, dem ein 3' OH fehlt, zu einer enzymatischen Sequenzierungsreaktion hinzugefügt, dann wird es in den wachsenden Strang durch die Polymerase eingebaut. Nach dem Einbau des ddNTP kann die Polymerase jedoch keine zusätzlichen Basen am Ende des Stranges hinzufügen. Wichtig ist, dass ddNTPs durch die Polymerase in den DNA-Strang unter Verwendung der gleichen Baseneinbauregeln eingefügt werden, die den Einbau natürlicher Nucleotide vorgeben, wobei A den Einbau von T und G den Einbau von C (und umgekehrt) spezifiziert.
  • Fluoreszenz-DNA-Sequenzierung
  • Ein großer Fortschritt bei der Bestimmung von DNA-Sequenzinformationen trat mit der Einführung automatisierter DNA-Sequenzierungsmaschinen auf (Smith et al., 1986). Der automatisierte Sequenzer wird zum Trennen von Sequenzierungsreaktionsprodukten, Erfassen und Sammeln (per Computer) der Daten aus den Reaktionen und Analysieren der Reihenfolge der Basen verwendet, um die Basensequenz eines DNA-Fragments automatisch abzuleiten. Automatisierte Sequenzer ermitteln Erweiterungsprodukte, die ein fluoreszierendes Tag enthalten. Sequenzleselängen, die mit einem automatisierten Sequenzer erhalten werden, sind von einer Vielfalt von Parameter abhängig, liegen jedoch typischerweise zwischen 500 und 1000 Basen (3-18 Stunden der Datenerfassung). Bei maximaler Kapazität kann ein automatisierter Sequenzer Daten von 96 Proben parallel erfassen.
  • Wird Farbstoffmarkierungs-Terminator-Chemie zum Nachweisen der Sequenzierungsprodukte verwendet, dann wird die Basenidentität anhand der Farbe des am ddNTP angefügten fluoreszierenden Tags ermittelt. Wenn die Reaktion zusammengestellt ist und die geeignete Anzahl von Zyklen (3-12 Stunden) durchlaufen hat, werden die Erweiterungsprodukte zum Einfüllen in eine einzelne Bahn auf einem automatisierten Sequenzer vorbereitet (nicht eingebaute, farbstoffmarkierte ddNTPs werden entfernt und die Reaktion konzentriert; 1-2 Stunden). Ein Vorteil der Farbstoff-Terminator-Chemie besteht darin, dass Erweiterungsprodukte nur dann sichtbar gemacht werden, wenn sie mit einem farbstoffmarkierten ddNTP enden; vorzeitig beendete Produkte werden nicht erfasst. Folglich kommt es bei dieser Chemie typischerweise zu reduziertem Hintergrundrauschen.
  • Moderne Farbstoff-Terminator-Chemie setzt vier Energietransfer-Fluoreszenzfarbstoffe ein (Rosenblum et al., 1997). Diese Terminatoren schließen einen Fluorescein-Donor-Farbstoff (6-FAM) ein, der mit einem von vier verschiedenen Dichlorrhodamin-(dRhodamin)-Akzeptor-Farbstoffen verknüpft ist. Die mit den Terminatoren assoziierten d-Rhodamin-Akzeptor-Farbstoffe sind jeweils Dichloro[R110], Dichloro[R6G], Dichloro[TAMRA] oder Dichloro[ROX] für die G-, A-, T- oder C-Terminatoren. Der Donor-Farbstoff (6-FAM) absorbiert effizient Energie von dem Argonionenlaser in der automatisierten Sequenzierungsmaschine und überträgt diese Energie zum verknüpften Akzeptor-Farbstoff. Der die Donor- und Akzeptor-Abschnitte des Terminators verbindende Linker ist optimal beabstandet, um im Wesentlichen einen zu 100% effizienten Energietransfer zu erreichen. Die von diesen Akzeptor-Farbstoffen emittierten Fluoreszenzsignale weisen eine minimale Spektralüberlappung auf und werden durch einen DNA-Sequenzer ABI PRISM 377 unter Verwendung von virtuellen 10-nm-Filtern aufgefangen, die jeweils bei 540, 570, 595 und 625 nm für G-, A-, T- oder C-Terminatoren zentriert sind. Folglich produzieren farbstoffmarkierte Energietransferterminatoren hellere Signale und verbessern die Spektralauflösung. Diese Verbesserungen ergeben genauere DNA-Sequenzinformationen.
  • Das in automatisierten DNA-Sequenzierungsreaktionen verwendete prädominante Enzym ist eine gentechnisch manipulierte Form von DNA-Polymerase I von Thermus aquaticus. Dieses Enzym, AmpliTaq DNA-Polymerase, FS, wurde optimiert, um ddNTPs effizienter einzufügen und die 3'-5' und 5'-3' Exonucleaseaktivitäten zu beseitigen. Der Austausch eines natürlich vorkommenden Phenylalanins an Position 667 in T. aquaticus DNA-Polymerase durch ein Tyrosin reduzierte den bevorzugten Einbau eines dNTP im Vergleich zu einem ddNTP (Tabor und Richardson, 1995; Reeve und Fuller, 1995). Folglich ist eine einzelne Hydroxylgruppe innerhalb der Polymerase für die Unterscheidung zwischen dNTPs und ddNTPs verantwortlich. Die 3'-5' Exonucleaseaktivität, durch die die Polymerase eine falsch eingefügte Base aus dem neu replizierten DNA-Strang entfernen kann (Proofreading-Aktivität), wurde beseitigt, da sie der Polymerase auch ermöglicht, ein eingefügtes ddNTP zu entfernen. Die 5'-3' Exonucleaseaktivität wurde beseitigt, da sie Basen vom 5'-Ende der Reaktionsprodukte entfernt. Da die Reaktionsprodukte im Laufe der Gelelektrophorese nach Größe getrennt werden, werden interpretierbare Sequenzdaten nur dann erhalten, wenn die Reaktionsprodukte einen gemeinsamen Endpunkt haben. Im Spezielleren definiert der Primer das 5'-Ende des Erweiterungsprodukts und das eingebaute farbkodierte ddNTP definiert die Basenidentität am 3'-Ende des Moleküls. Folglich schließt die konventionelle DNA-Sequenzierung die Analyse einer Population von DNA-Molekülen ein, die den gleichen 5'-Endpunkt haben, jedoch im Hinblick auf den Standort des ddNTP am 3'-Ende der DNA-Kette unterschiedlich sind.
  • Genomsequenzierung
  • Sehr oft muss ein Forscher die Sequenz eines DNA-Fragments bestimmen, das größer als die durchschnittliche Sequenzierungsleselänge von 500-1000 Basen ist. Es überrascht nicht, dass Strategien entwickelt wurden, um dies zu bewerkstelligen. Diese Strategien sind in zwei Hauptklassen unterteilt – zufällig oder gerichtet – und die Auswahl der Strategie wird durch die Größe des zu sequenzierenden Fragments beeinflusst.
  • Bei der zufälligen oder Shotgun-DNA-Sequenzierung wird ein großes DNA-Fragment (typischerweise eines, das größer als 20.000 Basenpaare ist) in kleinere Fragmente zerbrochen, die in einen Klonierungsvektor eingefügt werden. Es wird davon ausgegangen, dass die Summe der in diesen kleineren Klonen enthaltenen Informationen äquivalent zu denen ist, die in dem ursprünglichen DNA-Fragment enthalten sind. Zahlreiche kleinere Klone werden zufällig selektiert, DNA-Templates werden für Sequenzierungsreaktionen präpariert und Primer, die mit der Vektor-DNA-Sequenz, die am Insert angrenzt, eine Basenpaarung eingehen, werden für den Beginn der Sequenzierungsreaktion verwendet (2-7 Tage für ein 20-kbp-Insert). Anschließend wird die Quali tät jedes „Base Call" untersucht (manuell oder automatisch per Software (PHRED, Swing et al., 1998); 1-10 Minuten pro Sequenzreaktion) und die Sequenz des ursprünglichen DNA-Fragments wird durch Computerassemblierung der von den kleineren DNA-Fragmenten erhaltenen Sequenzen rekonstruiert. Auf der Basis der bereitgestellten Zeitschätzungen ist ein 20-kbp-Insert, wenn eine Shotgun-Sequenzierungsstrategie angewendet wird, voraussichtlich in 3-10 Tagen abgeschlossen. Diese Strategie wurde ausgiebig angewendet, um die Sequenz geordneter Fragmente zu bestimmen, die das gesamte menschliche Genom repräsentieren (http://www.nhgri.nih.gov/HGP/). Diese Zufallsmethode reicht jedoch gewöhnlich nicht aus, um die Sequenzbestimmung abzuschließen, da nach der Computerassemblierung oft Lücken in der Sequenz verbleiben. Eine gerichtete Strategie (unten beschrieben) wird gewöhnlich zum Vervollständigen des Sequenzprojekts angewendet.
  • Eine gerichtete oder Primer-Walking-Sequenzierungsstrategie kann zum Ausfüllen von Lücken, die nach der Zufallsphase der Sequenzierung großer Fragmente zurückbleiben, und als eine effiziente Methode zur Sequenzierung kleinerer DNA-Fragmente angewendet werden. Diese Strategie verwendet DNA-Primer, die sich an das Template an einem einzelnen Ort anlagern und als ein Startort für die Kettenverlängerung dienen. Dieser Ansatz setzt die Kenntnis einiger Sequenzinformationen für den Entwurf des Primers voraus. Die aus der ersten Reaktion erhaltene Sequenz wird zum Entwerfen des Primers für die nächste Reaktion verwendet und diese Schritte werden wiederholt, bis die komplette Sequenz bestimmt ist. Folglich involviert eine primergestützte Strategie wiederholte Sequenzierungsschritte von bekannten in unbekannte DNA-Regionen, der Prozess minimiert die Redundanz und es sind keine zusätzlichen Klonierungsschritte erforderlich. Allerdings setzt diese Strategie die Synthese eines neuen Primers für jede Sequenzierungsrunde voraus.
  • Die Notwendigkeit des Entwurfs und der Synthetisierung neuer Primer, verbunden mit den Ausgaben und der für ihre Synthese benötigten Zeit, hat die routinemäßige Anwendung von Primer-Walking zur Sequenzierung großer DNA-Fragmente eingeschränkt. Forscher haben die Verwendung einer Bibliothek von kurzen Primern vorgeschlagen, um die Notwendigkeit einer maßgeschneiderten Primersynthese auszuschließen (Studier, 1989; Siemieniak und Slightom, 1990; Kieleczawa et al., 1992; Kotler et al., 1993; Burbelo und Iadarola, 1994; Hardin et al., 1996; Raja et al., 1997; Jones und Hardin, 1998a, b; Ball et al., 1998; Mei und Hardin, 2000; Kraltcheva und Hardin, 2001). Die Verfügbarkeit einer Primerbibliothek minimiert Primer-Vergeudung, da jeder Primer zum Ankurbeln mehrerer Reaktionen verwendet wird, und ermöglicht einen sofortigen Zugriff auf den nächsten Sequenzierungsprimer.
  • Eines der ursprünglichen Ziele des Humangenomprojekts war die Vervollständigung der Sequenzbestimmung des gesamten menschlichen Genoms bis 2005 (http://www.nhgri.nih.gov/HGP/). Es läuft jedoch schneller als geplant und im Februar 2001 wurde ein 'Arbeitsentwurf' des menschlichen Genoms veröffentlicht (Venter et al., 2001, „International Human Genome Sequencing Consortium 2001"). Infolge technologischer Fortschritte in verschiedenen Bereichen wird die fertiggestellte Genomsequenz im Jahre 2003 erwartet, zwei Jahre früher als vorgesehen. Fortschritt in allen Aspekten, einschließlich DNA-Manipulation (vor allem die Manipulation und Propagierung großer DNA-Fragmente), Entwicklung schnellerer und besserer DNA-Sequenzierungsverfahren (http://www.abrf.org), Entwicklung von Computerhardware und -software zum Manipulieren und Analysieren der Daten (Bioinformatik) und Automatisierung von Verfahren in Verbindung mit der Erzeugung und Analyse von DNA-Sequenzen (Engineering), ist für diesen beschleunigten Zeitrahmen verantwortlich.
  • Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung
  • Konventionelle DNA-Sequenzierungsstrategien und -verfahren sind zuverlässig, allerdings zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Um diese Probleme anzugehen, untersuchen einige Forscher derzeit Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren auf Fluoreszenzbasis, die einen enzymatischen Abbau nutzen, gefolgt von Einzel-dNMP-Nachweis und Identifizierung. Das fluoreszierend markierte, Nucleotide enthaltende DNA-Polymer wird durch eine Exonuclease verdaut und die markierten Nucleotide werden mit Durchflusszytometrie nachgewiesen und identifiziert (Davis et al., 1991; Davis et al., 1992; Goodwin et al., 1997; Keller et al., 1996; Sauer et al., 1999; Werner et al., 1999). Dieses Verfahren setzt voraus, dass der DNA-Strang synthetisiert wird, um die fluoreszierend markierte(n) Base(n) zu enthalten. Diese Voraussetzung begrenzt die Länge der bestimmbaren Sequenz und erhöht die Anzahl der Manipulationen, die durchgeführt werden müssen, bevor irgendwelche Sequenzdaten erhalten werden. Ein verwandter Ansatz schlägt vor, einzelne (nicht markierte) Nucleotide von einem DNA-Strang sequentiell zu trennen, sie in ihrer ursprünglichen Reihenfolge in einer festen Matrix zu begrenzen und die spektroskopische Emission der getrennten Nucleotide zu erfassen, um die DNA-Sequenzinformationen zu rekonstruieren (Ulmer, 1997; Mitsis und Kwagh, 1999; Dapprich, 1999). Dies ist der Ansatz, der derzeit von Praelux, Inc., einer Firma, die sich die Entwicklung der Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung zum Ziel gesetzt hat, entwickelt wird. Theoretisch dürfte dieses letztere Verfahren nicht so anfällig für Längenbeschränkungen wie das frühere enzymatische Abbauverfahren sein, allerdings setzt es zahlreiche Manipulationen voraus, bevor irgendwelche Sequenzinformationen erhalten werden können.
  • Li-cor. Inc. entwickelt derzeit eine Strategie für eine Einzelmolekülsequenzierung auf der Basis einer Enzymsynthese, wie in der PCT-Anmeldung WO 00/36151 dargelegt ist. Das Lic-cor-Verfahren beinhaltet das mehrfache Modifizieren jedes dNTP durch Anfügen eines fluoreszierenden Tags an das γ-Phosphat und eines Löschanteils an einem anderen Ort am dNTP, vorzugsweise an der Base. Der Löschanteil wird hinzugefügt, um eine Emission von dem fluoreszierenden Tag zu verhindern, das an einem nicht eingebauten dNTP angefügt ist. Nach dem Einbau werden das fluoreszierende Tag und der Löschanteil getrennt, wodurch es zu einer Emission von dem Tag kommt. Das Tag (am Pyrophosphat enthalten) strömt von der aktiven Stelle der Polymerase weg, aber die modifizierte (gelöschte) Base wird zu einem Bestandteil des DNA-Polymers.
  • Es wurden war einige Einzelmolekül-Sequenzierungssysteme offenbart, doch erwarten oder erfordern viele davon eine Basenmodifikation (siehe z. B. die Patentanmeldungs-Seriennummern WO 01/16375 A2 , WO 01/23610 A2 , WO 01/25480 , WO 00/06770 , WO 99/05315 , WO 00/60114 , WO 00/36151 , WO 00/36512 und WO 00/70073 ). Basenmodifikationen können die DNA-Struktur (die normalerweise aus der aktiven Stelle des Enzyms am nächsten liegenden A-Form-DNA besteht; Li et al., 1998a) verzerren. Da das dNTP und etwa 7 der 3'-nächsten Basen in dem neu synthetisierten Strang interne Regionen der Polymerase kontaktieren (Li et al., 1998a), ist die A-Form-DNA möglicherweise zum Maximieren kleiner Furchenkontakte zwischen Enzym und DNA wichtig. Wird die DNA-Struktur durch eine Basenmodifikation beeinflusst, dann kann die Enzymfidelität und/oder -funktion verändert werden. Es besteht folglich in der Technik noch immer Bedarf an einem schnellen und effizienten enzymatischen DNA-Sequenzierungssystem für Einzelmolekül-DNA-Sequenzen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • EINZELMOLEKÜLSEQUENZIERUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Polymerisationsmittel bereit, das mit wenigstens einem molekularen oder atomaren Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle am Polymerisationsmittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt. Die Monomere können organische, anorganische oder bioorganische Monomere wie Nucleotide für DNA, RNA, gemischte DNA/RNA-Sequenzen, Aminosäuren, Monosaccharide, synthetische Analoga natürlich vorkommender Nucleotide, synthetische Analoga natürlich vorkommender Aminosäuren oder synthetische Analoga natürlich vorkommender Monosaccharide, synthetische organische oder anorganische Monomere oder dergeichen sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Depolymerisationsmittel bereit, das mit wenigstens einem molekularen oder atomaren Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle am Depolymerisationsmittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomerentfernung erfährt. Die Polymere können DNA, RNA, gemischte DNA/RNA-Sequenzen, die nur natürlich vorkommende Nucleotide oder ein Gemisch aus natürlich vorkommenden Nucleotiden und synthetische Analoga davon enthalten, Polypeptidsequenzen, die nur natürlich vorkommende Aminosäuren oder ein Gemisch aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und synthetische Analoga davon enthalten, Polysaccharide oder Kohlenhydratsequenzen, die nur natürlich vorkommende Monossaccharide oder ein Gemisch aus natürlich vorkommenden Monosacchariden und synthetische Analoga davon enthalten, oder Polymere, die synthetische organische oder anorganische Monomere enthalten, oder dergleichen sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein System bereit, das das Erfassen eines Signals entsprechend einer nachweisbaren Eigenschaft, das Veränderungen hinsichtlich Interaktionen zwischen einem Synthetisierungs-/Polymerisationsmittel oder einem Depolymerisationsmittel (Molekül) und seinen Substraten (Monomere oder depolymerisierbare Polymere) bestätigt, sowie das Dekodieren des Signals in Monomerfolgen-spezifische Informationen oder Monomersequenzinformationen ermöglicht, vorzugsweise in Echtzeit oder nahe Echtzeit.
  • AN EINER EINZELNEN STELLE MARKIERTE POLYMERASE
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem molekularen oder atomaren Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle an der Polymerase befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt. Die Monomere können Nucleotide für DNA, RNA oder gemischte DNA/RNA-Monomere oder synthetische Analoga sein, die durch die Polymerase polymerisierbar sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Exonuclease bereit, die mit wenigstens einem molekularen oder atomaren Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle an der Exonuclease befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomerfreisetzung erfährt. Die Polymere können DNA, RNA oder gemischte DNA/RNA-Sequenzen sein, die aus natürlich vorkommenden Monomeren oder synthetischen Analoga bestehen, die durch die Exonuclease depolymerisierbar sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem molekularen oder atomaren Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die vor, während und/oder nach der Monomereinfügung eine Konformationsveränderung erfuhrt, wobei das Tag eine erste Nachweisneigung hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Nachweisneigung, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Chromophor modifiziert ist, der sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die vor, während und/oder nach der Monomereinfügung eine Konformationsveränderung erfährt, wobei eine Intensität und/oder Frequenz von emittiertem Licht des Chromophors einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem fluoreszierend aktiven molekularen Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die vor, während und/oder nach der Monomereinfügung eine Konformationsveränderung erfährt, wobei das Tag eine erste Fluoreszenzneigung hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Fluoreszenzneigung, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem molekularen Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die vor, während und/oder nach der Monomereinfügung eine Konformationsveränderung erfährt, wobei das Tag im Wesentlichen nachweisbar ist, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen nicht nachweisbar ist, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, oder im Wesentlichen nicht nachweisbar ist, wenn die Polymerase in dem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen nachweisbar ist, wenn die Polymerase in dem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem molekularen oder atomaren Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die mit einem Tag an der freigesetzten Pyrophosphatgruppe interagiert, wobei das Polymerase-Tag eine erste Nachweisneigung vor dem Interagieren mit dem Tag an der freigesetzten Pyrophosphatgruppe hat und eine zweite Erfassungsneigung beim Interagieren mit dem Tag an der freigesetzten Pyrophosphatgruppe hat. In einer bevorzugten Ausgestaltung tritt diese Veränderung der Erfassungsneigung zyklisch mit der Freisetzung der jeweiligen Pyrophosphatgruppen auf.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Chromophor modifiziert ist, der sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die mit einem Tag an der freigesetzten Pyrophosphatgruppe interagiert, wobei eine Intensität und/oder Frequenz von durch den Chromophor emittiertem Licht einen ersten Wert hat, bevor der Chromophor mit dem Tag an dem freigesetzten Pyrophosphat interagiert, und einen zweiten Wert beim Interagieren mit dem Tag an der freigesetzten Pyrophosphatgruppe hat. In einer bevorzugten Ausgestaltung tritt diese Veränderung der Erfassungsneigung zyklisch mit der Freisetzung der jeweiligen Pyrophosphatgruppen auf.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens ei nem fluoreszierend aktiven molekularen Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die mit einem Tag an der freigesetzten Pyrophosphatgruppe interagiert, wobei sich das Polymerase-Tag von einem ersten Zustand vor der Freisetzung der Pyrophosphatgruppe in einen zweiten Zustand verändert, wenn die Pyrophosphatgruppe von der Freisetzungsstelle weg diffundiert. In einer bevorzugten Ausgestaltung tritt diese Veränderung der Erfassungsneigung zyklisch mit der Freisetzung der jeweiligen Pyrophosphatgruppen auf.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit einem molekularen Tag modifiziert ist, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die mit einem Tag an der freigesetzten Pyrophosphatgruppe interagiert, wobei sich das Polymerase-Tag von einem im Wesentlichen nachweisbaren Zustand vor der Pyrophosphat-Freisetzung in einen im Wesentlichen nicht nachweisbaren Zustand verändert, wenn das Polymerase-Tag mit dem Tag an der Pyrophosphatgruppe nach der Gruppenfreisetzung interagiert, oder von einem im Wesentlichen nicht nachweisbaren Zustand vor der Pyrophosphatfreisetzung in einen im Wesentlichen nachweisbaren Zustand verändert, wenn das Polymerase-Tag mit dem Tag an der Pyrophosphatgruppe nach der Gruppenfreisetzung interagiert.
  • AN MEHREREN STELLEN MARKIERTE POLYMERISATIONS- ODER DEPOLYMERISATIONSMITTEL
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Monomerpolymerisationsmittel bereit, das mit wenigstens einem Paar von molekularen und/oder atomaren Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen an dem Polymerisationsmittel befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem Tag des Paares eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt oder wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem Tag des Paares eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung infolge einer Veränderung hinsichtlich der Zwischen-Tag-Interaktion erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Depolymerisationsmittel bereit, das mit wenigstens einem Paar von molekularen und/oder atomaren Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen an dem Depolymerisationsmittel befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem Tag des Paares eine Veränderung vor, während und/oder nach der Mono merfreisetzung erfährt oder wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem Tag des Paares eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomerfreisetzung infolge einer Veränderung hinsichtlich der Zwischen-Tag-Interaktion erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Monomerpolymerisationsmittel bereit, das mit wenigstens einem Paar von molekularen und/oder atomaren Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen an dem Polymerisationsmittel befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem Tag des Paares einen ersten Wert hat, wenn das Polymerisationsmittel in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn das Polymerisationsmittel in einem zweiten Zustand ist, wobei das Polymerisationsmittel von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Depolymerisationsmittel bereit, das mit wenigstens einem Paar von molekularen und/oder atomaren Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen an dem Polymerisationsmittel befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem Tag des Paares einen ersten Wert hat, wenn das Depolymerisationsmittel in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn das Depolymerisationsmittel in einem zweiten Zustand ist, wobei das Depolymerisationsmittel von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Vorzugsweise sind der erste und der zweite Zustand unterschiedlich, so dass eine Veränderung beim erfassten Signal auftritt. Zeigt das Ergebnis jedoch keine Veränderung an, dann werden möglicherweise andere Eigenschaften des Polymerisationsmediums oder Depolymerisationsmediums bestätigt.
  • AN MEHREREN STELLEN MARKIERTE POLYMERASE
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wenigstens eines der Tags eine Veränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Paares einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand ist, wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wenigstens eines der Tags eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei die nachweisbare Eigenschaft des Paares einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von Molekülen oder Atomen modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wenigstens eines der Tags eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei das Paar interagiert, um einen Chromophor zu bilden, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand oder einem zweiten Konformationszustand ist, wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wenigstens eines der Tags eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei die Tags eine erste Fluoreszenzneigung haben, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Fluoreszenzneigung haben, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wenigstens eines der Tags eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei das Paar im Wesentlichen aktiv ist, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen inaktiv ist, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, oder im Wesentlichen inaktiv ist, wenn die Polymerase in dem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen aktiv ist, wenn die Polymerase in dem zweiten Konformationszustand ist, wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wenigstens eines der Tags eine Veränderung während und/oder nach der Pyrophosphatfreisetzung im Laufe des Monomereinfügungsprozesses erfährt, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Paares einen ersten Wert hat, wenn das Tag in einem ersten Zustand vor der Pyrophosphatfreisetzung ist, und einen zweiten Wert hat, wenn das Tag in einem zweiten Zustand während und/oder nach der Pyrophosphatfreisetzung ist, wobei das Tag von seinem ersten Zustand in seinen zweiten Zustand und zurück in seinen ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wenigstens eines der Tags eine Positionsveränderung infolge einer Konformationsveränderung in der Polymerase während des Pyrophosphatfreisetzungsprozesses erfährt, wobei die nachweisbare Eigenschaft des Paares einen ersten Wert hat, wenn das Tag an seiner ersten Position ist, und einen zweiten Wert hat, wenn das Tag an seiner zweiten Position ist, wobei das Tag von seiner ersten Position in seine zweite Position und zurück in seine erste Position im Laufe eines Freisetzungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von Molekülen oder Atomen modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei sich die relative Trennung der Tags infolge einer Konformationsveränderung in der Polymerase während der Pyrophosphatfreisetzung verändert, wobei die Tags interagieren, um einen Chromophor zu bilden, der ein erstes Emissionsprofil hat, wenn die Tags um eine erste Dis tanz getrennt sind, und ein zweites Profil hat, wenn die Tags um eine zweite Distanz getrennt sind, wobei die Trennungsdistanz von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Pyrophosphatfreisetzungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei sich die relative Trennung der Tags infolge einer Konformationsveränderung in der Polymerase während der Pyrophosphatfreisetzung verändert, wobei die Tags eine erste Fluoreszenzneigung haben, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Fluoreszenzneigung haben, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, wobei die Neigung von ihrem ersten Wert in ihren zweiten Wert und wieder zurück im Laufe eines Pyrophosphatfreisetzungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Polymerase bereit, die mit wenigstens einem Paar von molekularen Tags modifiziert ist, die sich an oder nahe Stellen befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wo sich die relative Trennung der Tags infolge einer Konformationsveränderung in der Polymerase während der Pyrophosphatfreisetzung verändert, wobei das Paar im Wesentlichen fluoreszierend aktiv ist, wenn die Tags eine erste Trennung aufweisen, und im Wesentlichen fluoreszierend inaktiv ist, wenn die Tags eine zweite Trennung aufweisen, oder im Wesentlichen fluoreszierend inaktiv ist, wenn die Tags eine erste Trennung aufweisen, und im Wesentlichen fluoreszierend aktiv ist, wenn die Tags eine zweite Trennung aufweisen, wobei die Fluoreszenzaktivität einen Zyklus im Laufe eines Pyrophosphatfreisetzungszyklus durchläuft.
  • Es ist zu verstehen, dass, wenn eine Eigenschaft von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand und wieder zurück wechselt, die Eigenschaft dann einen Zyklus durchläuft. Vorzugsweise sind der erste und der zweite Zustand unterschiedlich, so dass es zu einer Veränderung in dem erfassten Signal kommt. Zeigt das Ergebnis jedoch keine Veränderung an, dann werden möglicherweise andere Eigenschaften des Polymerisationsmediums oder Depolymerisationsmediums bestätigt.
  • VERFAHREN UNTER VERWENDUNG EINES MARKIERTEN POLYMERISATIONSMITTELS
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, wann ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das den Schritt des Beobachtens einer nachweisbaren Eigenschaft eines atomaren oder molekularen Tags beinhaltet, wobei sich das Tag an oder nahe einer Stelle an einem Polymerisationsmittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei die nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, wann ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das den Schritt des Beobachtens einer nachweisbaren Eigenschaft eines atomaren oder molekularen Tags beinhaltet, wobei sich das Tag an oder nahe einer Stelle an einem Polymerisationsmittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei die nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn das Mittel in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn das Mittel in einem zweiten Zustand ist, wobei das Mittel von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Vorzugsweise sind der erste und der zweite Zustand unterschiedlich, so dass es zu einer Veränderung in dem erfassten Signal kommt. Zeigt das Ergebnis jedoch keine Veränderung an, dann werden möglicherweise andere Eigenschaften des Polymerisationsmediums bestätigt.
  • VERFAHREN UNTER VERWENDUNG VON MARKIERTER POLYMERASE
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, warm oder ob ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das den Schritt des Beobachtens einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags beinhaltet, wobei sich das Tag an oder nahe einer Stelle an einer Polymerase befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei die Stelle eine Veränderung während der Monomereinfügung erfährt und wobei die nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand ist, wobei die Werte anzeigen, dass die Stelle die Veränderung erfahren hat, und wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, wann oder ob ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das den Schritt des Beobachtens einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags beinhaltet, wobei sich das Tag an oder nahe einer Stelle an einer Polymerase befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei die Stelle eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt und wobei die nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, wobei die Werte anzeigen, dass die Stelle die Veränderung erfahren hat, und wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, wann oder ob ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das die folgenden Schritte beinhaltet: Belichten einer markierten Polymerase, Beobachten einer Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das durch die markierte Polymerase emittiert wird, wobei die markierte Polymerase eine Polymerase umfasst, die ein Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, und wobei das Tag fluoreszierendes Licht mit einer ersten Intensität und/oder Frequenz emittiert, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und mit einer zweiten Intensität und/oder Frequenz, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, wobei die Veränderung der Intensitäten und/oder Frequenzen anzeigt, dass die Stelle die Veränderung erfahren hat, und wobei die Polymerase von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand und zurück in den ersten Zustand im Laufe eines Monomereinfügungszyklus wechselt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die obigen Verfahren unter Verwendung einer Mehrzahl markierter Polymerasen bereit, die eine parallele und/oder massivparallele Sequenzierung gleichzeitig ermöglichen. Eine solche Parallelität kann zur Gewährleistung von Konfidenz verwendet werden. Eine solche Parallelität kann außerdem verwendet werden, um schnell den Grad an Homologie in DNA-Sequenzen für ein bestimmtes Gen speziesübergreifend zu erfassen oder um schnell Patienten-DNA im Hin blick auf spezifische genetische Merkmale zu screenen oder um schnell DNA-Sequenzen im Hinblick auf Polymorphismus zu screenen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Bestimmen bereit, ob oder warm ein Monomer in eine wachsende, mit einer Polymerase assoziierte DNA-Kette eingefügt wurde, wobei sich ein Tag an der Polymerase befindet, so dass mit der Freisetzung der Pyrophosphatgruppe, nachdem die Base eingefügt wurde und bevor sie von der Polymerase wegdiffundiert wird, das Polymerase-Tag mit dem Tag an dem Pyrophosphat interagiert, wodurch es zu einer Veränderung einer nachweisbaren Eigenschaft von einem der Tags oder einer nachweisbaren Eigenschaft in Verbindung mit beiden Tags im Falle eines Fluoreszenzpaares kommt.
  • Vorzugsweise sind der erste und der zweite Zustand unterschiedlich, so dass es zu einer Veränderung in dem erfassten Signal kommt. Zeigt das Ergebnis jedoch keine Veränderung an, dann werden möglicherweise andere Eigenschaften der Polymerisationsmedien bestätigt.
  • GERÄTE, DIE EIN MARKIERTES POLYMERISATIONSMITTEL VERWENDEN
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät bereit, das ein Substrat umfasst, auf dem wenigstens ein markiertes Polymerisationsmittel abgesetzt ist. Das markierte Polymerisationsmittel kann auf der Oberfläche des Substrats in einem angemessenen Polymerisationsmedium platziert werden oder das Polymerisationsmittel kann in einer Region, einem Bereich, einer Vertiefung, einer Furche, einem Kanal oder einer anderen ähnlichen Struktur auf dem Substrat begrenzt werden. Das Substrat kann außerdem eine Monomerregion, einen Bereich, eine Vertiefung, eine Furche, einen Kanal, ein Reservoir oder eine andere ähnliche Struktur beinhalten, die mit der Polymerisationsmittel-Begrenzungsstruktur durch wenigstens eine Verbindungsstruktur verbunden ist, die den molekularen Transport von Monomer zum Polymerisationsmittel unterstützen kann, wie ein Kanal, eine Furche oder dergleichen. Alternativ kann das Substrat Strukturen beinhalten, die jeweils Monomer enthalten, wobei jede Struktur mit der Polymerisationsmittel-Begrenzungsstruktur durch eine Verbindungsstruktur verbunden ist, die den molekularen Transport von Monomer zum Polymerisationsmittel unterstützen kann. Das Substrat kann außerdem in eine Mehrzahl von Polymerisationsmittel-Begrenzungsstrukturen unterteilt sein, wobei jede Struktur mit einem Monomerreservoir verbunden ist. Alternativ kann jede Polymerisationsmittel-Begrenzungsstruktur ihr eigenes Monomerreservoir oder ausreichend Monomerreservoirs haben, so dass jedes Reservoir ein spezifisches Monomer enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät bereit, das ein Substrat umfasst, wobei wenigstens ein markiertes Polymerisationsmittel an der Oberfläche des Substrats durch eine molekulare Bindungs- oder Verknüpfungsgruppe angefügt ist, wobei ein Ende der Bindungs- oder Verknüpfungsgruppe an eine Stelle auf der Oberfläche des Substrats gebunden ist und das andere Ende an eine Stelle des Polymerisationsmittels gebunden ist oder an eine Stelle eines Moleküls gebunden ist, das mit dem Polymerisationsmittel stark assoziiert ist. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „gebunden an" auf chemische und/oder physikalische Interaktionen, die ausreichen, um das Polymerisationsmittel innerhalb einer bestimmten Region des Substrats unter normalen Polymerisationsbedingungen zu halten. Zu den chemischen und/oder physikalischen Interaktionen gehören, ohne Begrenzung, kovalente Bindung, Innenbindung, Wasserstoffbindung, apolare Bindung, anziehende elektrostatische Interaktionen, Dipolinteraktionen oder eine beliebige andere elektrische oder quantenmechanische Interaktion, die in toto ausreicht, um das Polymerisationsmittel in einer gewünschten Region des Substrats zu halten. Das Substrat mit daran angefügtem gebundenem markiertem Polymerisationsmittel kann in einen Behälter gegeben werden, der ein geeignetes Polymerisationsmedium enthält. Alternativ kann das markierte Polymerisationsmittel an oder innerhalb einer Region, eines Bereichs, einer Vertiefung, einer Furche, eines Kanals oder einer anderen ähnlichen Struktur am Substrat gebunden oder verankert werden, die mit einem geeigneten Polymerisationsmedium gefüllt werden kann. Das Substrat kann außerdem eine Monomerregion, einen Bereich, eine Vertiefung, eine Furche, einen Kanal oder eine andere ähnliche Struktur beinhalten, die mit der Polymerisationsmittelstruktur durch wenigstens eine Verbindungsstruktur verbunden ist, die molekulare Transporte von Monomer zum Polymerisationsmittel unterstützen kann. Alternativ kann das Substrat Strukturen beinhalten, die jeweils Monomer enthalten, wobei jede Struktur mit der Polymerisationsmittelstruktur durch eine Verbindungsstruktur verbunden ist, die molekulare Transporte von Monomer zum Polymerisationsmittel unterstützen kann. Das Substrat kann außerdem in eine Mehrzahl von Polymerisationsmittelstrukturen unterteilt sein, die jeweils wenigstens ein gebundenes Polymerisationsmittel haben, wobei jede Struktur mit einem Monomerreservoir verbunden ist. Alternativ kann jede Polymerisationsmittelstruktur ihr eigenes Monomerreservoir oder ausreichend Monomerreservoirs haben, ein Reservoir von jedem spezifischen Monomer.
  • Zu den Monomeren, die in diesem Gerät verwendet werden können, gehören unter anderem dNTPs, markierte dNTPs, ddNTPs, markierte ddNTPs, Aminosäuren, markierte Aminosäuren, Monosaccharide, markierte Monosaccharide oder geeignete Gemische oder Kombinationen davon, je nach dem Typ des sequenzierten Polymers.
  • GERÄT, DAS MARKIERTE POLYMERASE VERWENDET
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät bereit, das ein Substrat umfasst, auf dem wenigstens eine markierte Polymerase abgesetzt ist. Die markierte Polymerase kann auf der Oberfläche des Substrats in einem angemessenen Polymerisationsmedium abgesetzt werden oder die Polymerase kann in einer Region, einem Bereich, einer Vertiefung, einer Furche, einem Kanal oder einer anderen ähnlichen Struktur auf dem Substrat begrenzt werden, die mit einem geeigneten Polymerisationsmittel gefüllt werden kann. Das Substrat kann außerdem eine Monomerregion, einen Bereich, eine Vertiefung, eine Furche, einen Kanal oder eine andere ähnliche Struktur auf dem Substrat beinhalten, die mit der Polymerasebegrenzungsstruktur durch wenigstens eine Verbindungsstruktur verbunden ist, die die molekularen Transporte von Monomer zur Polymerase unterstützen kann. Alternativ kann das Substrat Strukturen beinhalten, die jeweils Monomer enthalten, wobei jede Struktur mit der Polymerasebegrenzungsstruktur durch eine Verbindungsstruktur verbunden ist, die die molekularen Transporte des Monomers zur Polymerase in den Polymerasebegrenzungsstrukturen unterstützen kann. Das Substrat kann auch mehrere Polymerasebegrenzungsstrukturen unterteilt sein, wobei jede Struktur mit einem Monomerreservoir verbunden ist. Alternativ kann jede Polymerasebegrenzungsstruktur ihr eigenes Monomerreservoir oder vier Reservoirs haben, so dass jedes Reservoir ein spezifisches Monomer enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät bereit, das ein Substrat umfasst, wobei wenigstens eine markierte Polymerase an der Oberfläche des Substrats durch eine molekulare Bindungs- oder Verknüpfungsgruppe angefügt ist, wobei ein Ende der Bindungs- oder Verknüpfungsgruppe an eine Stelle auf der Oberfläche des Substrats gebunden ist und das andere En de an eine Stelle der Polymerase gebunden ist (entweder direkt oder indirekt) oder and eine Stelle eines Moleküls gebunden ist, das mit der Polymerase stark assoziiert ist. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „gebunden an" auf chemische und/oder physikalische Interaktionen, die ausreichen, um die Polymerase innerhalb einer bestimmten Region des Substrats unter normalen Polymerisationsbedingungen zu halten. Zu den chemischen und/oder physikalischen Interaktionen gehören unter anderem kovalente Bindung, Ionenbindung, Wasserstoffbindung, apolare Bindung, anziehende elektrostatische Interaktionen, Dipolinteraktionen oder eine beliebige andere elektrische oder quantenmechanische Interaktion, die in toto ausreicht, um die Polymerase in ihrer gewünschten Region zu halten. Das Substrat mit daran angefügtem gebundem markiertem Polymerisationsmittel kann in einen Behälter gegeben werden, der ein geeignetes Polymerisationsmedium enthält. Alternativ kann das markierte Polymerisationsmittel an oder in einer Region, eines Bereichs, einer Vertiefung, einer Furche, eines Kanals oder einer anderen ähnlichen Struktur am Substrat gebunden oder verankert werden, die mit einem geeigneten Polymerisationsmedium gefüllt werden kann. Das Substrat kann außerdem eine Monomerregion, einen Bereich, eine Vertiefung, eine Furche, einen Kanal oder eine andere ähnliche Struktur am Substrate beinhalten, die mit der Polymerasestruktur durch wenigstens einen Kanal verbunden ist. Alternativ kann das Substrat Strukturen beinhalten, die jeweils Monomer enthalten, wobei jede Struktur mit der Polymerasestruktur durch eine Verbindungsstruktur verbunden ist, die molekulare Transporte des Monomers zur Polymerase in den Polymerasebegrenzungsstrukturen unterstützen kann. Das Substrat kann außerdem in mehrere Polymerasestrukturen unterteilt sein, die jeweils wenigstens eine gebundene Polymerase haben, wobei jede Struktur mit einem Monomerreservoir verbunden ist. Alternativ kann jede Polymerasestruktur ihr eigenes Monomerreservoir oder vier Reservoirs haben, wobei jedes Reservoir ein spezifisches Monomer enthält.
  • Zu den Monomeren, die in diesem Gerät verwendet werden können, gehören unter anderem dNTPs, markierte dNTPs, ddNTPs, markierte ddNTPs oder Gemische oder Kombinationen davon.
  • VERFAHREN UNTER VERWENDUNG DER EINZELMOLEKÜLSEQUENZIERUNGSGERÄTE
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung bereit, das das Zuführen einer Mehrzahl von Monomeren zu einem markierten Polymerisationsmittel, das auf einem Substrat begrenzt oder daran gebunden ist, und das Beobachten einer nachweisbaren Eigenschaft des Tags im Laufe der Zeit beinhaltet. Das Verfahren kann außerdem den Schritt des Inbezugbringens von Veränderungen bei der nachweisbaren Eigenschaft mit dem Eintritt (Timing) der Monomerhinzufügung und/oder mit der Identität jedes eingefügten Monomers und/oder mit der nahezu simultanen Bestimmung der Sequenz eingefügter Monomere beinhalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung bereit, das das Zuführen mehrerer Monomere zu einem markierten Polymerisationsmittel, das auf einem Substrat begrenzt oder daran gebunden ist, und das Belichten des markierten Polymerisationsmittels entweder kontinuierlich oder periodisch und das Messen einer Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht beinhaltet, das von dem Tag im Laufe der Zeit emittiert wird. Das Verfahren kann ferner das Inbezugbringen der Veränderungen der gemessenen Intensität und/oder Frequenz von emittiertem fluoreszierendem Licht von dem Tag im Laufe der Zeit mit dem Eintritt (Timing) der Monomerhinzufügung und/oder mit der Identität jedes eingefügten Monomers und/oder mit der nahezu simultanen Bestimmung der Sequenz der eingefügten Monomere beinhalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung bereit, das das Zuführen mehrerer Monomere zu einer markierten Polymerase, die auf einem Substrat begrenzt oder daran gebunden ist, und das Beobachten einer nachweisbaren Eigenschaft des Tags im Laufe der Zeit beinhaltet. Das Verfahren kann außerdem den Schritt des Inbezugbringens von Veränderungen bei der nachweisbaren Eigenschaft im Laufe der Zeit mit dem Eintritt (Timing) der Monomerhinzufügung und/oder mit der Identität jedes eingefügten Monomers und/oder mit der nahezu simultanen Bestimmung der Sequenz eingefügter Monomere beinhalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung bereit, das das Zuführen mehrerer Monomere zu einer markierten Polymerase, die auf einem Substrat begrenzt ist, und das kontinuierliche oder periodische Belichten der markierten Polymerase und das Messen einer Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht beinhaltet, das von dem Tag im Laufe der Zeit emittiert wird. Das Verfahren kann ferner das Inbezugbringen der Veränderungen bei der gemessenen Intensi tät und/oder Frequenz von emittiertem fluoreszierendem Licht von dem Tag im Laufe der Zeit mit dem Eintritt (Timing) der Monomerzugabe und/oder mit der Identität jedes eingefügten Monomers und/oder mit der nahezu simultanen Bestimmung der Sequenz der eingefügten Monomere beinhalten.
  • KOOPERATIV MARKIERTE SYSTEME
  • Die vorliegende Erfindung stellt kooperativ markierte Polymerisationsmittel und markierte Monomere bereit, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn die Tags vor, während und/oder nach der Monomereinfügung interagieren. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Tag an der Polymerase so positioniert, dass die Tags vor, während und/oder nach jeder Monomereinfügung interagieren. Im Falle von Tags, die von den Monomeren nach der Monomereinfügung freigesetzt werden, wie β- und/oder γ-Phosphat-markierte dNTPs, d. h. die Tags befinden sich auf den β- und/oder γ-Phosphatgruppen, kann das Tag an dem Polymerisationsmittel so gestaltet sein, dass es mit dem Tag an dem Monomer erst interagiert, nachdem das Tag vom Polymerisationsmittel nach der Monomereinfügung freigesetzt wurde. Die Tag-Platzierung innerhalb eines Polymerisationsmittels kann optimiert werden, um die Interaktion zwischen Polymerase- und dNTP-Tags zu verbessern, indem das Polymerase-Tag an Stellen der Polymerase angefügt wird, die sich während eines Einfügungsereignisses bewegen, so dass die relative Trennung der beiden Tags verändert oder optimiert wird, um die Interaktion zwischen Polymerase-Tag und dem Tag an dem Pyrophosphat zu verbessern, während es im Laufe des Baseneinbaus freigesetzt wird und bevor es von dem Polymerisationsmittel weg diffundiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt kooperativ markierte Polymerisationsmittel und markierte Monomere bereit, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn sich die Tags innerhalb einer Distanz befinden, die ausreicht, um eine messbare Veränderung bei der nachweisbaren Eigenschaft zu bewirken. Ist die nachweisbare Eigenschaft Fluoreszenz, die in einem Tag durch einen Energietransfer zu dem anderen Tag hervorgerufen wird oder darauf zurückzuführen ist, dass ein Tag die Fluoreszenz des anderen Tags löscht oder eine messbare Veränderung der Fluoreszenzintensität und/oder -frequenz bewirkt, dann wird die messbare Veränderung dadurch herbeigeführt, dass die Tags sehr nahe zueinander hin gebracht werden, d. h. die Distanz, die die Tags voneinander trennt, wird verringert. Im Allgemeinen liegt die Dis tanz, die notwendig ist, um eine messbare Veränderung der nachweisbaren Eigenschaft herbeizuführen, innerhalb (weniger als oder gleich) etwa 100 Å, vorzugsweise innerhalb etwa 50 Å, insbesondere innerhalb etwa 25 Å, im Speziellen innerhalb etwa 15 Å und am bevorzugtesten innerhalb etwa 10 Å. Natürlich wird die Fachperson erkennen, dass eine Distanz, die ausreicht, um eine messbare Veränderung bei einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags herbeizuführen, von vielen Parameter abhängig sein wird, einschließlich des Standortes des Tags, der Beschaffenheit des Tags, des Lösungsmittelsystems, äußerer Felder, der Anregungsquellenintensität und der Frequenzbandbreite, der Temperatur, des Drucks, usw.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein markiertes Polymerisationsmittel und (einen) markierte(n) Monomervorläufer bereit, wobei sich eine Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von wenigstens einem Tag emittiert wird, verändert, wenn die Tags vor, während und/oder nach der Monomereinfügung interagieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt kooperativ markierte Depolymerisationsmittel und markiertes depolymerisierbares Polymer bereit, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn die Tags vor, während und/oder nach der Monomerfreisetzung interagieren. Das Tag an dem Depolymerisationsmittel kann so gestaltet sein, dass die Tags vor, während und/oder nach jeder Monomerfreisetzung interagieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt kooperativ markierte Depolymerisationsmittel und markierte Polymere bereit, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn sich die Tags innerhalb einer Distanz befinden, die ausreicht, um eine messbare Veränderung der nachweisbaren Eigenschaft herbeizuführen. Ist die nachweisbare Eigenschaft Fluoreszenz, die in einem Tag durch einen Energietransfer zu dem anderen Tag hervorgerufen wird, oder darauf zurückzuführen ist, dass ein Tag die Fluoreszenz des anderen Tags löscht oder eine messbare Veränderung der Fluoreszenzintensität und/oder -frequenz bewirkt, dann wird die messbare Veränderung dadurch herbeigeführt, dass die Tags in sehr nahe zueinander hin gebracht werden, d. h. die Distanz, die die Tags voneinander trennt, wird verringert. Im Allgemeinen liegt die Distanz, die notwendig ist, um eine messbare Veränderung bei der nachweisbaren Eigenschaft herbeizuführen, innerhalb (weniger als oder gleich) etwa 100 Å, vorzugsweise innerhalb etwa 50 Å, insbesondere innerhalb etwa 25 Å, im Speziellen innerhalb etwa 15 Å und am bevorzugtesten innerhalb etwa 10 Å. Natürlich wird die Fachperson erkennen, dass eine Distanz, die ausreicht, um eine messbare Veränderung einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags herbeizuführen, von vielen Parameter abhängig sein wird, einschließlich des Orts des Tags, der Beschaffenheit des Tags, des Lösungsmittelsystems, äußerer Felder, der Anregungsquellenintensität und der Frequenzbandbreite, der Temperatur, des Drucks, usw.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein markiertes Depolymerisationsmittel und ein markiertes Polymer bereit, wobei sich eine Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von wenigstens einem Tag emittiert wird, verändert, wenn die Tags vor, während und/oder nach der Monomerfreisetzung interagieren.
  • KOOPERATIV MARKIERTE SYSTEME UNTER VERWENDUNG EINER POLYMERASE
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine kooperativ markierte Polymerase und markierte Monomere bereit, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn die Tags vor, während und/oder nach der Monomereinfügung interagieren. Das Tag an der Polymerase kann so gestaltet sein, dass die Tags vor, während und/oder nach jeder Monomereinfügung interagieren. Im Falle von Tags, die von den Monomeren nach der Monomereinfügung freigesetzt werden, wie β- und/oder γ-Phosphat-markierte dNTPs, d. h. die Tags befinden sich auf den β- und/oder γ-Phosphatgruppen, kann das Tag an dem Polymerisationsmittel so gestaltet sein, dass es mit dem Tag an dem Monomer erst interagiert, nachdem das Tag von dem Polymerisationsmittel nach der Monomereinfügung freigesetzt wurde. Im ersten Fall muss sich das Polymerase-Tag an einer Stelle der Polymerase befinden, die es dem Polymerase-Tag ermöglicht, mit dem Monomer-Tag im Laufe des Monomereinfügungsprozesses zu interagieren – anfängliche Bindung und Einbindung in das wachsende Polymer. Im zweiten Fall muss sich das Polymerase-Tag hingegen an einer Stelle der Polymerase befinden, die es dem Polymerase-Tag ermöglicht, mit dem Monomer-Tag, jetzt auf dem freigesetzten Pyrophosphat, zu interagieren, bevor es von der Polymerase in das Polymerisationsmedium weg diffundiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt kooperativ markierte Polymerase und markierte Monomere bereit, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn sich die Tags innerhalb einer ausreichenden Distanz oder in nächster Nähe befinden, um eine messbare Veränderung der nachweisbaren Eigenschaft zu bewirken. Ist die nachweisbare Eigenschaft Fluoreszenz, die in einem Tag durch einen Energietransfer zu dem anderen Tag hervorgerufen wird oder darauf zurückzuführen ist, dass ein Tag die Fluoreszenz des anderen Tags löscht oder eine messbare Veränderung der Fluoreszenzintensität und/oder -frequenz bewirkt, dann wird die messbare Veränderung dadurch herbeigeführt, dass die Tags sehr nahe zueinander hin gebracht werden, d. h. die Distanz, die die Tags voneinander trennt, wird verringert. Im Allgemeinen ist die Distanz oder die nächste Nähe eine Distanz zwischen etwa 100 Å und etwa 10 Å. Alternativ ist die Distanz gleich oder kleiner als etwa 100 Å, vorzugsweise gleich oder kleiner als etwa 50 Å, insbesondere gleich oder kleiner als etwa 25 Å, im Speziellen gleich oder kleiner als etwa 15 Å und am bevorzugtesten gleich oder kleiner als etwa 10 Å. Natürlich wird die Fachperson erkennen, dass eine Distanz, die ausreicht, um eine messbare Veränderung einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags herbeizuführen, von vielen Parametern abhängig sein wird, einschließlich des Ortes der Tags, der Beschaffenheit der Tags, des Lösungsmittelsystems (Polymerisationsmedium), äußerer Felder, der Anregungsquellenintensität und der Frequenzbandbreite, der Temperatur, des Drucks, usw.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine markierte Polymerase und markierte Monomervorläufer bereit, wobei die Tags ein fluoreszierend aktives Paar wie ein Donor-Akzeptor-Paar bilden und sich eine Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von wenigstens einem Tag (im Allgemeinen das Akzeptor-Tag von Donor-Akzeptor-Paaren) emittiert wird, verändert, wenn die Tags interagieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine markierte Polymerase und markierte Monomervorläufer bereit, wobei die Tags ein fluoreszierend aktives Paar wie ein Donor-Akzeptor-Paar bilden und sich eine Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von wenigstens einem Tag (im Allgemeinen das Akzeptor-Tag von Donor-Akzeptor-Paaren) emittiert wird, verändert, wenn sich die Tags in einer ausreichenden Distanz oder sehr nahe beieinander befinden, um entweder die Intensität und/oder Frequenz des fluoreszierenden Lichts zu verändern. Im Allgemeinen ist die Distanz oder die nächste Nähe eine Distanz zwischen etwa 100 Å und etwa 10 Å. Alternativ ist die Distanz gleich oder kleiner als etwa 100 Å, vorzugsweise gleich oder kleiner als etwa 50 Å, insbesondere gleich oder kleiner als etwa 25 Å, im Speziellen gleich oder kleiner als etwa 15 Å und am bevorzugtesten gleich oder kleiner als etwa 10 Å. Natürlich wird die Fachperson erkennen, dass eine Distanz, die ausreicht, um eine messbare Veränderung bei einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags herbeizuführen, von vielen Parameter abhängig sein wird, einschließlich des Ortes des Tags, der Beschaffenheit des Tags, des Lösungsmittelsystems, äußerer Felder, der Anregungsquellenintensität und der Frequenzbandbreite, der Temperatur, des Drucks, usw.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Einzelmolekülsequenzierungsgerät bereit, das einen Behälter umfasst, wobei wenigstens eine markierte Polymerase auf eine Innenfläche davon begrenzt oder daran gebunden ist und wobei eine Lösung, die eine Mehrzahl von markierten Monomeren enthält, mit der Innenfläche in Kontakt ist.
  • VERFAHREN UND GERÄT ZUM LESEN MOLEKULARER DATENSTRÖME
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung bereit, das das Zuführen einer Mehrzahl markierter Monomere zu einer markierten Polymerase, die auf eine Innenfläche eines Behälters begrenzt ist, das Belichten der markierten Polymerase und das Messen einer Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von der markierten Polymerase im Laufe jeder aufeinander folgenden Monomerhinzufügung oder -einfügung in eine wachsende Polymerkette emittiert wird, beinhaltet. Das Verfahren kann ferner das Inbezugbringen der gemessenen Intensität und/oder Frequenz von emittiertem fluoreszierendem Licht mit Einfügungsereignissen und/oder mit der Identifizierung von jedem eingefügten oder hinzugefügten Monomer beinhalten, was in einer Nahe-Echtzeit- oder Echtzeitanzeige der Sequenz einer wachsenden Nucleinsäuresequenz – DNA-Sequenz, RNA-Sequenz oder gemischte DNA/RNA-Sequenzen – resultiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein System zum Wiedergewinnen gespeicherter Informationen bereit, das Folgendes umfasst: ein Molekül mit einer Sequenz bekannter Elemente, die einen Datenstrom repräsentiert, einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, mit der wenigstens ein Tag assoziiert ist, eine Anregungsquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein Tag an der Polymerase angeregt wird, und einen Detektor, der so gestaltet ist, dass eine Reaktion von dem angeregten Tag an der Polymerase erfasst wird, wobei sich die Reaktion von dem wenigstens einen Tag während der Polymerisation einer komplementären Sequenz von Elementen verändert und die Reaktionsveränderung einen Inhalt des Datenstroms repräsentiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein System zum Bestimmen von Sequenzinformationen anhand eines Einzelmoleküls bereit, das Folgendes umfasst: ein Molekül mit einer Sequenz bekannter Elemente, einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, mit der wenigstens ein Tag assoziiert ist, eine Anregungsquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein Tag an der Polymerase erregt wird, und einen Detektor, der so gestaltet ist, dass eine Reaktion von dem angeregten Tag an der Polymerase erfasst wird, wobei sich die Reaktion von wenigstens einem Tag während der Polymerisation einer komplementären Sequenz von Elementen verändert, so dass die Elementsequenz des Moleküls repräsentiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein System zur Bestimmung von Sequenzinformationen anhand eines Einzelmoleküls bereit, das Folgendes umfasst: ein Molekül mit einer Sequenz bekannter Elemente, einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, mit der wenigstens ein fluoreszierendes Tag assoziiert ist, eine Anregungslichtquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein fluoreszierendes Tag an der Polymerase und/oder dem Monomer angeregt wird, und einen Fluoreszenzlichtdetektor, der so gestaltet ist, dass wenigstens eine Intensität von emittiertem fluoreszierendem Licht von wenigstens einem fluoreszierenden Tag an der Polymerase und/oder dem Monomer erfasst wird, wobei sich die Signalintensität jedes Mal verändert, wenn ein neues Nucleotid oder ein Nucleotidanalogon in eine komplementäre Sequenz polymerisiert wird, und entweder die Dauer der Emission oder das Fehlen einer Emission oder der Wellenlängenbereich des emittierten Lichts das spezielle Nucleotid oder Nucleotidanalogon bestätigt, das in die Sequenz polymerisiert wurde, so dass nach Abschluss der Sequenzierung der Datenstrom wiedergewonnen wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein System zum Speichern und Wiedergewinnen von Daten bereit, das Folgendes umfasst: eine Sequenz von Nucleotiden oder Nucleotidanaloga, die einen bestimmten Datenstrom repräsentieren, einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, an die wenigstens ein fluoreszierendes Tag kovalent angefügt ist, eine Anregungslichtquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein fluoreszierendes Tag an der Polymerase und/oder dem Monomer angeregt wird, und einen Fluoreszenzlichtdetektor, der so gestaltet ist, dass emittiertes fluoreszierendes Licht von wenigstens einem fluoreszierenden Tag an der Polymerase und/oder dem Monomer erfasst wird, wobei wenigstens ein fluoreszierendes Tag jedes Mal, wenn ein neues Nucleotid oder Nucleotidanalogon in eine komplementäre Sequenz polymerisiert wird, fluoreszierendes Licht emittiert oder nicht emittiert, und entweder die Dauer der Emission oder das Fehlen einer Emission oder der Wellenlängenbereich des emittierten Lichts das spezielle Nucleotid oder Nucleotidanalogon bestätigt, das in die Sequenz polymerisiert wurde, so dass nach Abschluss der Sequenzierung der Datenstrom wiedergewonnen wird.
  • Der hierin verwendete Begriff Monomer bezieht sich auf jede beliebige Verbindung, die in eine wachsende Molekülkette durch eine bestimmte Polymerase eingefügt werden kann. Zu solchen Monomeren gehören, ohne Begrenzung, natürlich vorkommende Nucleotide (z. B. ATP, GTP, TTP, UTP, CTP, dATP, dGTP, dTTP, dUTP, dCTP, synthetische Analoga), Vorläufer für jedes Nucleotid, nicht natürlich vorkommende Nucleotide und ihre Vorläufer oder jedes beliebige andere Molekül, das in eine wachsende Polymerkette durch eine bestimmte Polymerase eingefügt werden kann. Darüber hinaus Aminosäuren (natürliche oder synthetische) für die Protein- oder Proteinanalogonsynthese, Monosaccharide für die Kohlenhydratsynthese oder andere Monomersynthesen.
  • Der hierin verwendete Begriff Polymerase bezieht sich auf jedes beliebige Molekül oder jede beliebige Molekülanordnung, das/die einen Satz Monomere in ein Polymer mit einer vorbestimmten Monomersequenz polymerisieren kann, wie unter anderem natürlich vorkommende Polymerasen oder reverse Transkriptasen, mutierte natürlich vorkommende Polymerasen oder reverse Transkriptasen, wobei die Mutation den Austausch von einer oder mehreren oder vielen Aminosäuren durch andere Aminosäuren, die Insertion oder Deletion von einer oder mehreren oder vielen Aminosäuren von den Polymerasen oder reversen Transkriptasen oder die Konjugation von Teilen von einer oder mehreren Polymerasen oder reversen Transkriptasen, nicht natürlich vorkommenden Polymerasen oder reversen Transkriptasen beinhaltet. Der Begriff Polymerase schließt außerdem synthetische Moleküle oder Molekülanordnungen ein, die ein Polymer mit einer vorbestimmten Sequenz von Monomeren polymerisieren können, oder jedes beliebige andere Molekül oder jede beliebige andere Molekülanordnung, die zusätzliche Sequenzen haben kann, die eine Reinigung und/oder Immobilisierung und/oder molekulare Interaktion der Tags erleichtern können, und die ein Polymer mit einer vorbestimmten oder spezifizierten oder schablonierten Sequenz von Monomeren polymerisieren kann.
  • An einer einzelnen Stelle markierte Polymerisations- oder Depolymerisationsmittel
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Polymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an dem Mittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Polymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an dem Mittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand während der Monomereinfügung ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Depolymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an dem Mittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomerentfernung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Polymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an dem Mittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand während der Monomerentfernung ist.
  • An einer einzelnen Stelle markierte Polymerase
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an der Polymerase befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an der Polymerase befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand während der Monomereinfügung ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Exonuclease umfasst, die wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an dem Mittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft des Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomerentfernung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Exonuclease umfasst, die wenigstens ein molekulares und/oder atomares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle an dem Mittel befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand während der Monomerentfernung ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Enzym umfasst, das so modifiziert ist, dass eine nachweisbare Reaktion vor, während und/oder nach einer Interaktion mit einem angemessen modifizierten Monomer produziert wird, wobei die Monomere Nucleotide, Nucleotidanaloga, Aminosäuren, Aminosäureanaloga, Monosaccharide, Monosaccharidanaloga oder Gemische oder Kombinationen davon sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein molekulares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei das Tag eine erste Nachweisneigung hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Nachweisneigung hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens einen Chromophor beinhaltet, der sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei eine Intensität und/oder Frequenz von emittiertem Licht von dem Tag einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein molekulares Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei das Tag eine erste Fluoreszenzneigung hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Fluoreszenzneigung hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die ein molekulares Tag einschließt, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei das Tag im Wesentlichen aktiv ist, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen inaktiv ist, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, oder im Wesentlichen inaktiv ist, wenn die Polymerase in dem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen aktiv ist, wenn die Polymerase in dem zweiten Konformationszustand ist.
  • An mehreren Stellen markierte Polymerisations- und Depolymerisationsmittel
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Polymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle des Mittels befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Polymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle des Mittels befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polyme rase in einem zweiten Zustand während der Monomereinfügung ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Depolymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle des Mittels befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomerentfernung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Depolymerisationsmittel umfasst, das wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle des Mittels befinden, damit assoziiert und kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand während der Monomerentfernung ist.
  • An mehreren Stellen markierte Polymerase
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle der Polymerase befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomereinfügung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle der Polymerase befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand während der Monomereinfügung ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Exonuclease umfasst, die wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle der Polymerase befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags eine Veränderung vor, während und/oder nach der Monomerentfernung erfährt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Exonuclease umfasst, die wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle der Polymerase befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, wobei eine nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand während der Monomerentfernung ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei die nachweisbare Eigenschaft des Paares einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein Paar von Molekülen oder Atomen beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei das Paar interagiert, um einen Chromophor zu bilden, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand oder in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei die Tags eine erste Fluoreszenzneigung haben, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Fluoreszenzneigung haben, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Polymerase umfasst, die wenigstens ein Paar von molekularen Tags beinhaltet, die sich an oder nahe einer Stelle befinden, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden sind, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, wobei das Paar im Wesentlichen aktiv ist, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen inaktiv ist, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist, oder im Wesentlichen inaktiv ist, wenn die Polymerase in dem ersten Konformationszustand ist, und im Wesentlichen aktiv ist, wenn die Polymerase in dem zweiten Konformationszustand ist.
  • Verfahren unter Verwendung markierter Polymerase
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, wann ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das den Schritt des Beobachtens einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags beinhaltet, wobei sich das Tag an oder nahe einer Stelle einer Polymerase befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist oder mit einer Stelle des Monomers assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei die Stelle während der Monomereinfügung eine Veränderung erfährt und wobei die nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Zustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Zustand ist und im Laufe jeder Monomerhinzufügung zyklisch von dem ersten Wert in den zweiten Wert übergeht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, wann ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das den Schritt des Beobachtens einer nachweisbaren Eigenschaft eines Tags beinhaltet, wobei sich das Tag an oder nahe einer Stelle einer Polymerase befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, oder mit einer Stelle des Monomers assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei die Stelle eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt und wobei die nachweisbare Eigenschaft einen ersten Wert hat, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und einen zweiten Wert hat, wenn die Polymerase in einem zweiten Konformationszustand ist und im Laufe jeder Monomerhinzufügung zyklisch von dem ersten Wert in den zweiten Wert übergeht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bestimmen bereit, wann ein Monomer in eine wachsende Molekülkette eingefügt wurde, das die folgenden Schritte beinhaltet: Belichten einer markierten Polymerase, Beobachten einer Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von der markierten Polymerase und/oder dem Monomer emittiert wird, wobei die markierte Polymerase eine Polymerase umfasst, die ein Tag beinhaltet, das sich an oder nahe einer Stelle befindet, damit assoziiert oder kovalent daran gebunden ist, die eine Konformationsveränderung während der Monomereinfügung erfährt, oder mit einer Stelle des Monomers assoziiert oder kovalent damit verbunden ist, und wobei das Tag fluoreszierendes Licht mit einer ersten Intensität und/oder Frequenz emittiert, wenn die Polymerase in einem ersten Konformationszustand ist, und eine zweite Intensität und/oder Frequenz, wenn die Polymerase in ei nem zweiten Konformationszustand ist, wobei im Laufe jeder Monomerhinzufügung ein zyklischer Übergang vom ersten Wert zum zweiten Wert erfolgt.
  • Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät, das markierte Polymerase verwendet
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät umfasst [sic], umfassend ein Substrat mit einer Kammer- oder Chip-Oberfläche, wobei wenigstens eine markierte Polymerase darin begrenzt ist, und eine Mehrzahl von Kammern, die jeweils ein spezifisches Monomer enthalten, und eine Mehrzahl von Kanälen, die die Kammern miteinander verbinden, wobei jeder Replikationskomplex eine ausreichende Distanz aufweist, damit eine Datenerfassung von jedem Komplex individuell möglich ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung bereit, dass das Zuführen einer Mehrzahl von Monomeren zu einer markierten Polymerase, die auf einem Substrat begrenzt ist, das Belichten der markierten Polymerase und das Messen einer Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht beinhaltet, das von der markierten Polymerase emittiert wird. Das Verfahren kann ferner den Schritt des Inbezugbringens der gemessenen Intensität und/oder Frequenz von emittiertem fluorszierendem Licht mit der Einfügung eines spezifischen Monomers in eine wachsende DNA-Kette beinhalten.
  • Kooperativ markierte Monomere und markiertes Polymerisationsmittel
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein kooperativ markiertes Polymerisationsmittel und markierte Monomere umfasst, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn die Tags interagieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein kooperativ markiertes Depolymerisationsmittel und markierte Depolymerisationsmonomere umfasst, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn die Tags interagieren.
  • Kooperativ markierte Monomere und markierte Polymerase
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine kooperativ markierte Polymerase und markierte Monomere umfasst, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn die Tags interagieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine kooperativ markierte Polymerase und markierte Monomere umfasst, wobei sich eine nachweisbare Eigenschaft von wenigstens einem der Tags verändert, wenn die Tags innerhalb einer Distanz sind, die ausreicht, um eine Veränderung der Intensität und/oder Frequenz von emittiertem fluoreszierendem Licht zu bewirken.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine markierte Polymerase und markierte Monomervorläufer umfasst, wobei sich eine Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von wenigstens einem Tag emittiert wird, verändert, wenn die Tags interagieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine markierte Polymerase und markierte Monomervorläufer umfasst, wobei sich eine Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von wenigstens einem Tag emittiert wird, verändert, wenn die Tags innerhalb einer Distanz sind, die ausreicht, um eine Veränderung der Intensität und/oder Frequenz von emittiertem fluoreszierendem Licht zu bewirken.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Einzelmolekül-Sequenzierungsgerät bereit, das einen Behälter umfasst, bei dem wenigstens eine markierte Polymerase auf einer Innenfläche davon begrenzt ist, und der eine Lösung aufweist, die eine Mehrzahl von markierten Monomeren in Kontakt mit der Innenfläche oder eine Teilmenge von markierten Monomeren und eine Teilmenge von nicht markierten Monomeren enthält, die zusammen alle Monomervorläufer zur Polymerisation bereitstellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung bereit, das die folgenden Schritte beinhaltet: Zuführen einer Mehrzahl von markierten Monomeren zu einer markierten Polymerase, die auf einer Innenfläche eines Behälters eingegrenzt ist, Belichten der markierten Polymerase und Messen einer Intensität und/oder Frequenz von fluoreszierendem Licht, das von der markierten Polymerase emittiert wird. Das Verfahren kann ferner das Inbezugbringen der gemessenen Intensität und/oder Frequenz von emittiertem fluoreszierendem Licht mit der Einfügung eines spezifischen Monomers in eine wachsende DNA-Kette beinhalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein System zum Wiedergewinnen gespeicherter Informationen bereit, das Folgendes umfasst: (a) ein Molekül mit einer Sequenz von Elementen, die einen Datenstrom repräsentieren; (b) einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, mit der wenigstens ein Tag assoziiert ist; (c) eine Anregungsquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein Tag an der Polymerase angeregt wird; und (d) einen Detektor, der so gestaltet ist, dass eine Reaktion von dem Tag an der Polymerase oder an den Monomeren erfasst wird; wobei sich die Reaktion von wenigstens einem Tag im Laufe der Polymerisation einer komplementären Sequenz von Elementen verändert und die Reaktionsveränderung einen Datenstrominhalt repräsentiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein System zur Bestimmung von Sequenzinformationen anhand eines Einzelmoleküls bereit, das Folgendes umfasst: (a) ein Molekül mit einer Sequenz von Elementen; (b) einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, mit der wenigstens ein Tag assoziiert ist; (c) eine Anregungsquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein Tag an der Polymerase oder an den Monomeren angeregt wird; und (d) einen Detektor, der so gestaltet ist, dass eine Reaktion von dem Tag an der Polymerase erfasst wird; wobei sich die Reaktion von wenigstens einem Tag im Laufe der Polymerisation einer komplementären Sequenz von Elementen verändert, so dass die Elementsequenz des Moleküls repräsentiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein System zur Bestimmung von Sequenzinformationen anhand eines individuellen Moleküls bereit, das Folgendes umfasst: (a) ein Molekül mit einer Sequenz von Elementen; (b) einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, mit der wenigstens ein fluoreszierendes Tag assoziiert ist; (c) eine Anregungslichtquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein fluoreszierendes Tag an der Polymerase oder an den Monomeren angeregt wird; und (d) einen fluoreszierenden Lichtdetektor, der so gestaltet ist, dass wenigstens eine Intensität von emittiertem fluoreszierendem Licht von dem wenigstens einen fluoreszierenden Tag an der Polymerase erfasst wird; wobei die Intensitätsveränderung von wenigstens einem fluoreszierenden Tag fluoreszierendes Licht jedes Mal dann emittiert oder nicht emittiert, wenn ein neues Nucleotid oder Nucleotidanalogon in eine komplementäre Sequenz polymerisiert wird, und entweder die Dauer der Emission oder das Fehlen einer Emission oder der Wellenlängenbereich des emittierten Lichts das spezielle Nucleotid oder Nucleotidanalogon bestätigt, das in die Sequenz polymerisiert wurde, so dass nach Abschluss der Sequenzierung der Datenstrom wiedergewonnen wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein System zum Speichern und Wiedergewinnen von Daten bereit, das Folgendes umfasst: (a) eine Sequenz von Nucleotiden oder Nucleotidanaloga, die einen bestimmten Datenstrom repräsentieren; (b) einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, an die wenigstens ein fluoreszierendes Tag kovalent angefügt ist; (c) eine Anregungslichtquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein fluoreszierendes Tag an der Polymerase angeregt wird; und (d) einen Fluoreszenzlichtdetektor, der so gestaltet ist, dass emittiertes fluoreszierendes Licht von wenigstens einem fluoreszierenden Tag an der Polymerase erfasst wird; wobei wenigstens ein fluoreszierendes Tag fluoreszierendes Licht jedes Mal dann emittiert oder nicht emittiert, wenn ein neues Nucleotid oder Nucleotidanalogon in eine komplementäre Sequenz polymerisiert wird, und entweder die Dauer der Emission oder das Fehlen einer Emission oder der Wellenlängenbereich des emittierten Lichts das spezielle Nucleotid oder Nucleotidanalogon bestätigt, das in die Sequenz polymerisiert wurde, so dass nach Abschluss der Sequenzierung der Datenstrom wiedergewonnen wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein System zum Speichern und Wiedergewinnen von Daten bereit, das Folgendes umfasst: (a) eine Sequenz von Nucleotiden oder Nucleotidanaloga, die einen bestimmten Datenstrom repräsentieren; (b) einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, an die wenigstens ein fluoreszierendes Tag kovalent angefügt ist; (c) eine Anregungslichtquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein fluoreszierendes Tag an der Polymerase oder den Monomeren angeregt wird; und (d) einen Fluoreszenzlichtdetektor, der so gestaltet ist, dass emittiertes fluoreszierendes Licht von wenigstens einem fluoreszierenden Tag an der Polymerase oder den Monomeren erfasst wird; wobei wenigstens ein fluoreszierendes Tag fluoreszierendes Licht jedes Mal dann emittiert oder nicht emittiert, wenn ein neues Nucleotid oder Nucleotidanalogon in eine komplementäre Sequenz polymerisiert wird, und entweder die Dauer der Emission oder das Fehlen einer Emission oder der Wellenlängenbereich des emittierten Lichts das spezielle Nucleotid oder Nucleotidanalogon bestätigt, das in die Sequenz polymerisiert wurde, so dass nach Abschluss der Sequenzierung der Datenstrom wiedergewonnen wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Sequenzierung einer Molekülsequenz bereit, das die folgenden Schritte beinhaltet [sic]: (a) eine Sequenz von Nucleotiden oder Nucleotidanaloga, die einen bestimmten Datenstrom repräsentieren; (b) einen Einzelmolekülsequenzer, der eine Polymerase umfasst, an die wenigstens ein fluoreszierendes Tag kovalent angefügt ist; (c) eine Anregungslichtquelle, die so gestaltet ist, dass wenigstens ein fluoreszierendes Tag an der Polymerase oder den Monomeren angeregt wird; und (d) einen Fluoreszenzlichtdetektor, der so gestaltet ist, dass emittiertes fluoreszierendes Licht von wenigstens einem fluoreszierenden Tag an der Polymerase erfasst wird; wobei wenigstens ein fluoreszierendes Tag fluoreszierendes Licht jedes Mal dann emittiert oder nicht emittiert, wenn ein neues Nucleotid oder Nucleotidanalogon in eine komplementäre Sequenz polymerisiert wird, und entweder die Dauer der Emission oder das Fehlen einer Emission oder der Wellenlängenbereich des emittierten Lichts das spezielle Nucleotid oder Nucleotidanalogon bestätigt, das in die Sequenz polymerisiert wurde, so dass nach Abschluss der Sequenzierung der Datenstrom wiedergewonnen wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Synthetisieren eines γ-Phosphat-modifizierten Nucleotids bereit, das das Anfügen eines molekularen Tags an eine Pyrophosphatgruppe und das Inkontaktbringen des modifizierten Pyrophosphats mit einem dNMP beinhaltet, um ein γ-Phosphat-markiertes dNTP zu produzieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum 5'-Endmarkieren eines Biomoleküls bereit, das den Schritt des Inkontaktbringens des Biomoleküls mit einer Kinase beinhaltet, die ein γ-Phosphat eines γ-Phosphat-markierten ATP zum 5'-Ende des Biomoleküls übertragen kann, woraus sich ein kovalent modifiziertes Biomolekül ergibt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Endmarkieren eines Polypeptids oder Kohlenhydrats bereit, das den Schritt des Inkontaktbringens des Polypeptids oder Kohlenhydrats mit einem Mittel beinhaltet, das ein atomares oder molekulares Tag zu einem Carboxy- oder Aminoende eines Proteins oder Polypeptids oder das γ-Phosphat eines γ-Phosphat-markierten ATP zum 5'-Ende des Biomoleküls übertragen kann, woraus sich ein kovalent modifiziertes Biomolekül ergibt.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Erfindung lässt sich unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung sowie die beigefügten illustrativen Zeichnungen, in denen ähnliche Elemente die gleichen Ziffern aufweisen, besser nachvollziehen. Dabei zeigt:
  • 1 die FRET-Aktivität in Abhängigkeit von der den fluoreszierenden Donor und Akzeptor trennenden Distanz;
  • 2 die offenen und geschlossenen Ternärkomplexformen des großen Frag ments von Taq DNA Pol I (Klentaq 1);
  • 3A-C eine Überlagerung zwischen 3ktq (geschlossen 'schwarz') und 1tau (offen 'hellblau'), dem großen Fragment von Taq DNA Polymerase I;
  • 4 ein Bild eines 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgels, das nach Größe getrennte, radioaktiv markierte Produkte aus DNA-Erweiterungsexperimenten unter Einbeziehung von γ-ANS-Phosphat-dATP enthält;
  • 5 ein Bild von (A) dem tatsächlichen Gel, (B) einem beleuchteten Phosphorbild und (C) einem verstärkten Phosphorbild von Produkten, die in DNA-Erweiterungsreaktionen unter Verwendung von γ-ANS-Phosphat-dNTPs erzeugt wurden;
  • 6 ein Bild von (A) 6%igem denaturierendem Polyacrylamidgel, (B) einem belichteten Phosphorbild des tatsächlichen Gels und (C) einem verstärkten Phosphorbild des tatsächlichen Gels, das Produkte enthält, die in DNA-Erweiterungsreaktionen unter Verwendung von γ-ANS-Phosphat-dNTPs erzeugt wurden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder haben eine Methodik unter Verwendung von markierten Monomeren wie dNTPs und/oder markierten Polymerisationsmitteln wie Polymerase und/oder markierten Mitteln, die mit dem Polymerisationsmittel assoziiert sind, wie polymeraseassoziierte Proteine oder Sonden für eine direkte Anzeige der exakten Monomersequenz, wie eine Basensequenz einer RNA- oder DNA-Sequenz, während der Polymeraseaktivität entwickelt. Die erfindungsgemäße Methodik ist auf die Proteinsynthese oder Kohlenhydratsynthese oder auf die Synthese jeder beliebigen Molekülsequenz anpassbar, wobei die Sequenz von Monomeren nützliche Informationen wie die Sequenz eines RNA- oder DNA-Moleküls, eines Proteins, eines Kohlenhydrats, eines gemischten Biomoleküls oder eine anorganische oder organische Sequenz von Monomeren liefert, die einen Datenstrom speichert. Die Verfahren und die sie anwendenden Geräte sind so gestaltet, dass neue Möglichkeiten zur Behandlung grundlegender Forschungsfragen geschaffen werden, wie die Beobachtung von Konformationsveränderungen, die während der Replikation auftreten, und die Überprüfung der Polymeraseeinbaufidelität in einer Vielfalt von Sequenzkontexten. Die Einzelmolekülnachweissysteme der vorliegenden Erfindung sind so gestaltet, dass die Fluoreszenzmolekülchemie, Computermodellierung, „Base Calling"-Algorithmen und die technische Genmanipulation von Bio molekülen, vor allem für die Echtzeit- oder nahezu Echtzeitsequenzierung, verbessert werden. Die Erfinder haben außerdem gefunden, dass die Methodik auf Depolymerisationsmittel wie Exonucleasen anpassbar ist, wobei die Polymersequenz durch Depolymerisation anstelle von Polymerisation bestimmt wird. Ferner können die Einzelmolekülsysteme der vorliegenden Erfindung in Parallel- und/oder Massiv-Parallel-Assays abgeändert werden, bei denen markierte Polymerasen in Array-Muster auf einem Substrat angeordnet werden. Die von solchen Arrays gesammelten Daten können zum Erhöhen der Sequenzkonfidenz und/oder zum simultanen Sequenzieren von DNA-Regionen von vielen verschiedenen Quellen zum Identifizieren von Ähnlichkeiten oder Differenzen verwendet werden.
  • Die Einzelmolekül-DNA-Sequenzierungssysteme der vorliegenden Erfindung haben das Potential, aktuelle DNA-Sequenzierungstechnologien zu ersetzen, da die Methodik Zeit, Arbeitsaufwand und Kosten in Verbindung mit dem Sequenzierungsprozess verringern und zu hoch skalierbaren Sequenzierungssystemen führen kann, so dass der DNA-Sequenz-Aufdeckungsprozess um wenigstens eine bis zwei Größenordnungen pro Reaktion verbessert wird.
  • Das Emissionssignalmuster wird entweder direkt, z. B. mit einem Intensified Charge Coupled Devise (ICCD), oder über ein Intermediat oder eine Reihe von Intermediaten erfasst, um eine Signalverstärkung vor dem elektronischen Nachweis zu bewirken, wobei die Signale dekodiert werden und Konfidenzwerte jeder Base zugeordnet werden, um die Sequenz komplementär zu der des Template aufzudecken. Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch Techniken zum Verstärken des von einem fluoreszierenden Tag emittierten fluoreszierenden Lichts unter Anwendung von physikalischen Lichtverstärkungstechniken oder mit einem molekularen Kaskadierungsmittel bereit, um das durch Einzelmolekül-Fluoreszenzereignisse produzierte Licht zu verstärken.
  • Die Einzelmolekül-DNA-Sequenzierungstechnologie der vorliegenden Erfindung kann: (1) die Klassifizierung eines Organismus oder Identifizierung von Variationen innerhalb eines Organismus erleichtern, indem einfach das Genom oder ein Teil davon sequenziert wird; (2) eine schnelle Identifizierung eines Pathogens oder eines genmanipulierten Pathogens erleichtern, vor allem unter extremen Umständen, wie z. B. Pathogene, die im Krieg zu Einsatz kommen; und (3) eine schnelle Identifizierung von Personen beim Gesetzesvollzug oder für Militäranwendungen erleichtern.
  • Eine Ausgestaltung der Einzelmolekül-Sequenzierungstechnologie der vorliegenden Erfindung beinhaltet das strategische Positionieren eines Paares von Tags auf einer DNA-Polymerase, so dass sich, während ein dNTP im Laufe der Polymerisationsreaktion eingefügt wird, die relative Trennung der Tags verändert. Diese relative Veränderung bewirkt eine Veränderung einer nachweisbaren Eigenschaft, wie die Intensität und/oder Frequenz von Fluoreszenz von einem oder von beiden der Tags. Ein Zeitprofil dieser Veränderungen hinsichtlich der nachweisbaren Eigenschaft bestätigt jedes Monomereinfügungsereignis und liefert einen Hinweis darauf, welches spezielle dNTP bei den jeweiligen Einfügungsereignissen eingefügt wird. Das Paar von Tags braucht nicht kovalent an die Polymerase angefügt zu werden, sondern kann an Moleküle angefügt werden, die sich mit der Polymerase in einer solchen Weise assoziieren, dass sich die relative Trennung der Tags während des Baseneinbaus verändert.
  • Eine weitere Ausgestaltung der Einzelmolekül-Sequenzierungstechnologie der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein an einer DNA-Polymerase strategisch positioniertes einzelnes Tag, das mit einem Tag an einem dNTP oder separaten Tags an jedem dNTP interagiert. Die Tags könnten für jedes dNTP unterschiedlich sein, wie z. B. farblich kodierte Tags, die eine unterschiedliche Farbe von fluoreszierendem Licht emittieren. Wenn das nächste dNTP im Laufe des Polymerisationsprozesses eingefügt wird, wird die Identität der Base durch ein Signatur-Fluoreszenzsignal (Farbe) oder eine Veränderung der Fluoreszenzsignalintensität und/oder -frequenz angegeben. Die Geschwindigkeit der Polymeraseeinfügung kann variiert und/oder geregelt werden, um eine im Wesentlichen „Echtzeit"- oder Nahe-„Echtzeit"- oder Echzeitanzeige der Polymeraseaktivität und Basensequenz zu erzeugen. Sequenzdaten können in einer Geschwindigkeit von > 100.000 Basen pro Stunde von jeder Polymerase erfasst werden.
  • In einer anderen Ausgestaltung der Einzelmolekül-Sequenzierungstechnologie der vorliegenden Erfindung beinhalten die markierten Polymerasen jeweils ein Donor-Tag und ein Akzeptor-Tag, das auf oder innerhalb der Polymerase gelegen oder platziert ist, wobei sich die Distanz zwischen den Tags im Laufe der dNTP-Bindung, dNTP-Einfügung und/oder Kettenerweiterung verändert. Diese Veränderung der Zwischen-Tag-Distanz resultiert in einer Veränderung der Intensität und/oder Wellenlänge von emittiertem fluoreszierendem Licht von dem fluoreszierenden Tag. Durch das Beobachten der Veränderungen der Intensität und/oder Frequenz des emittierten Lichts werden Informationen oder Daten über Polymerisationsereignisse und die Identität der eingefügten Basen erhalten.
  • In einer anderen Ausgestaltung sind die Tags an den Polymerasen so gestaltet, dass sie mit den Tags an den dNTPs interagieren, wobei die Interaktion eine nachweisbare Eigenschaft von einem der oder beiden Tags verändert. Jede fluoreszierend markierte Polymerase wird im Hinblick auf Polymerisation unter Verwendung von markierten dNTPs beobachtet, um die Wirksamkeit von davon abgeleiteten Baseneinbaudaten zu bestimmen. Spezifische Assays und Protokolle wurden zusammen mit spezifischen Analysegeräten entwickelt, um die Fluoreszenzdaten zu messen und zu quantifizieren, so dass die Bestimmung und Identifizierung jedes eingefügten dNTP ermöglicht wird. Gleichzeitig haben die Erfinder markierte dNTPs identifiziert, die durch geeignete Polymerasen polymerisiert werden, und Software entwickelt, die die von der Reaktion emittierte Fluoreszenz analysiert und die Basenidentität interpretiert. Die Fachperson wird erkennen, dass angemessene fluoreszierend aktive Paare in der Technik allgemein bekannt und im Handel von Lieferanten wie Molecular Probes aus Oregon oder Biosearch Technologies, Inc. aus Novato, CA erhältlich sind.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendete markierte DNA-Polymerase wird gentechnisch manipuliert, um eine oder mehrere Tag-Bindungsstellen zu erzeugen, die die Funktion der verschiedenen Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen. Nachdem ein geeigneter Polymerasekandidat identifiziert wurde, werden spezifische Aminosäuren innerhalb der Polymerase mutiert und/oder modifiziert solche Reaktionen in der Technik allgemein bekannt [sic]; allerdings unter der Voraussetzung, dass die Mutation und/oder Modifikation die Polymerisationseffizienz nicht wesentlich nachteilig beeinflusst. Die mutierten und/oder modifizierten Aminosäuren sind so gestaltet, dass die Tag-Anfügung, wie z. B. ein Farbstoff oder ein fluoreszierendes Donor- oder Akzeptormolekül im Falle von lichtaktivierten Tags, erleichtert wird. Nach der Bildung kann die konstruierte Polymerase mit einem oder mehreren geeigneten Tags in Kontakt gebracht und in den Geräten und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Konstruktion einer Polymerase, die als ein direkter molekularer Sensor der DNA-Basenidentität fungiert, bietet einen Weg zu einem schnellen, potentiell in Echtzeit arbeitenden enzymatischen DNA-Sequenzierungssystem. Das Einzelmolekül-DNA- Sequenzierungssystem der vorliegenden Erfindung kann Zeit- und Arbeitsaufwand sowie die Kosten in Verbindung mit dem Sequenzierungsprozess wesentlich reduzieren und ist hoch skalierbar. Das Einzelmolekül-DNA-Sequenzierungssystem der vorliegenden Erfindung: (1) kann den Sequenzaufdeckungsprozess um wenigstens zwei Größenordnungen je Reaktion verbessern; (2) ist nicht durch Längenbegrenzungen beschränkt, die mit den Einzelmolekülverfahren auf Abbaubasis verbunden sind; und (3) ermöglicht eine direkte Sequenzierung von gewünschten (Target-)DNA-Sequenzen, vor allem Genome, ohne dass eine Klonierung oder PCR-Amplifikation notwendig ist, die beide Fehler in die Sequenz einbringen. Die erfindungsgemäßen Systeme können die Aufgabe der Klassifizierung eines Organismus oder Identifizierung von Variationen innerhalb eines Organismus erleichtern, indem einfach das fragliche Genom oder ein gewünschter Teil des Genoms sequenziert wird. Das erfindungsgemäße System ist so gestaltet, dass Pathogene oder konstruierte Pathogene schnell identifiziert werden, was bei der Beurteilung von gesundheitsbezogenen Effekten und für die allgemeine DNA-Diagnostik von Bedeutung ist, inklusive des Nachweises und/oder der Charakterisierung von Krebs, der Genomanalyse oder einer umfassenderen Form des genetischen Variationsnachweises. Das Einzelmolekül-DNA-Sequenzierungssystem der vorliegenden Erfindung kann zu einer aktivierenden Plattformtechnologie für die Einzelmolekülgenanalyse werden.
  • Die erfindungsgemäßen Einzelmolekül-Sequenzierungssysteme haben die folgenden Vorteile: (1) die Systeme eliminieren die Sequenzierungsreaktionsverarbeitung, Gel- oder Kapillarladung, Elektrophorese und Datenassemblierung; (2) die Systeme führen zu wesentlichen Arbeits-, Zeit- und Kosteneinsparungen; (3) die Systeme ermöglichen eine Nahe-Echtzeit- oder Echtzeit-Datenbeschaffung, -Verarbeitung und -Bestimmung von Einfügungsereignissen (Timing, Dauer, usw.), Basensequenz usw.; (4) die Systeme ermöglichen eine parallele oder massiv-parallele Probenverarbeitung im Mikroarrayformat; (5) die Systeme ermöglichen eine schnelle Genomsequenzierung in einem Zeitrahmen von einem Tag oder weniger; (6) die Systeme setzen sehr geringe Materialmengen zur Analyse voraus; (7) die Systeme ermöglichen ein(e) schnelle(s) genetische(s) Identifizierung, Screening und Charakterisierung von Tieren, einschließlich des Menschen, oder Pathogenen; (8) die Systeme ermöglichen hohe Sequenzdurchsatzsteigerungen; (9) das System kann Fehler vermeiden, die bei PCR, RT-PCR und Transkriptionsprozessen eingebracht werden; (10) die Systeme können genaue Sequenz informationen für den allelespezifischen Mutationsnachweis ermöglichen; (11) die Systeme ermöglichen eine schnelle medizinische Diagnostik, z. B. einen Einzelnucleotid-Polymorphismus-(SNP)-Nachweis; (12) die Systeme ermöglichen eine Verbesserung der Grundlagenforschung, z. B. Untersuchung von Polymeraseeinbaugeschwindigkeiten in einer Reihe verschiedener Sequenzkontexte; Analyse von Fehlern in verschiedenen Kontexten; Epigenotypanalyse; Analyse der Proteinglycosylierung; Proteinidentifizierung; (13) die Systeme ermöglichen die Herstellung neuer robuster (stabiler) Einzelmolekülnachweisgeräte; (14) die Systeme ermöglichen die Entwicklung von Systemen und Verfahren, die mit Biomolekülen kompatibel sind; (15) die Systeme ermöglichen die Entwicklung von genetischen Nanomaschinen oder Nanotechnologie; (16) die Systeme ermöglichen den Aufbau großer Gendatenbanken und (17) das System hat eine hohe Empfindlichkeit für den Nachweis eines schwachen Mutationsereignisses.
  • KURZER ÜBERBLICK ÜBER DIE EINZELMOLEKÜL-DNA-SEQUENZIERUNG
  • In einer Ausgestaltung des Einzelmolekül-DNA-Sequenzierungssystems der vorliegenden Erfindung wird ein einzelnes Tag an eine geeignete Stelle einer Polymerase angefügt und ein einzigartiges Tag wird jeweils an die vier Nucleotide dATP, dTTP, dCTP und dGTP angefügt. Die Tags an den jeweiligen dNTPs sind so gestaltet, dass sie eine einzigartige Emissionssignatur haben (d. h. unterschiedliches Emissionsfrequenzspektrum oder unterschiedliche Farbe), die nach der Einfügung direkt erfasst wird. Wenn ein markiertes dNTP in ein wachsendes DNA-Polymer eingefügt wird, wird ein charakteristisches fluoreszierendes Signal oder eine Basenemissionssignatur infolge der Interaktion zwischen Polymerase-Tag und dNTP-Tag emittiert. Dann werden die fluoreszierenden Signale, d. h. die Emissionsintensität und/oder -frequenz, erfasst und analysiert, um die DNA-Basensequenz zu bestimmen.
  • Ein Kriterium für die Selektion der markierten Polymerase und/oder dNTPs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist, dass die Tags an der Polymerase und/oder den dNTPs nicht die Watson-Crick-Basenpaarung stören oder die Polymeraseaktivität wesentlich nachteilig beeinflussen. Die Erfinder haben gefunden, dass dNTPs, die Tags enthalten, die am terminalen (gamma)-Phosphat angefügt sind, durch eine native Taq-Polymerase entweder in Kombination mit nicht markierten dNTPs oder unter Verwendung von nur markierten dNTPs eingefügt werden. Das Markieren von dNTPs an der β- und/oder γ-Phosphatgruppe wird bevorzugt, da die resultierenden DNA-Stränge keines der dNTP-Tags in ihrem Molekülaufbau enthalten, so dass Enzymverzerrung und Hintergrundfluoreszenz minimiert werden.
  • Eine Ausgestaltung des Sequenzierungssystems der vorliegenden Erfindung schließt das Platzieren eines fluoreszierenden Donors wie Fluorescein oder ein fluoresceinartiges Molekül auf der Polymerase und einzigartiger fluoreszierender Akzeptoren wie ein d-Rhodamin- oder ein ähnliches Molekül auf jedem dNTP ein, wobei jeder einzigartige Akzeptor beim Interagieren mit dem Donor auf der Polymerase ein Fluoreszenzspektrum erzeugt, das wenigstens ein unterscheidbares Frequenz- oder Spektralmerkmal beinhaltet. Wenn ein ankommendes markiertes dNTP durch die Polymerase zur DNA-Verlängerung gebunden wird, dann wird das erfasste fluoreszierende Signal oder Spektrum analysiert und die Identität der eingefügten Base wird bestimmt.
  • Eine weitere Ausgestaltung des Sequenzierungssystems der vorliegenden Erfindung schließt ein fluoreszierendes Tag an der Polymerase und einzigartige Löscher an den dNTPs ein, wobei die Löscher vorzugsweise unterscheidbare Löschleistungen für das Polymerase-Tag aufweisen. Demzufolge wird die Identität von jedem ankommenden Löscher-markierten dNTP anhand seiner einzigartigen Löschleistung im Hinblick auf die Emission des Polymerase-Fluoreszenz-Tags bestimmt. Wieder werden die während der Einfügung produzierten Signale erfasst und analysiert, um jede eingefügte Base zu bestimmen, deren Sequenz die DNA-Basensequenz erzeugt.
  • REAGENZIEN
  • Zu Polymerisationsmitteln, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehört, ohne Begrenzung, jedes beliebige Polymerisationsmittel, das Monomere relativ zu einem spezifischen Template wie einer DNA- oder RNA-Polymerase, reversen Transkriptase oder dergleichen polymerisiert oder das Monomere schrittweise polymerisiert.
  • Zu Polymerasen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehört, ohne Begrenzung, jede Polymerase, die von ihrem Wirt in ausreichender Menge zur Reinigung und Verwendung isoliert und/oder gentechnisch in anderen Organismen zur Expression, Isolation und Reinigung in Mengen erzeugt werden kann, die für den Gebrauch in der vorliegenden Erfindung ausreichen, wie DNA- oder RNA-Polymerasen, die DNA, RNA oder gemischte Sequenzen in erweiterte Nucleinsäurepo lymere polymerisieren. Zu Polymerasen, die bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gehören Mutanten oder mutierte Varianten nativer Polymerasen, wobei bei den Mutanten eine oder mehrere Aminosäuren durch Aminosäuren ersetzt sind, die zum Anfügen eines atomaren oder molekularen Tags geeignet sind, das eine nachweisbare Eigenschaft hat. Zu beispielhaften DNA-Polymerasen gehören, ohne Begrenzung, die HIV1 reverse Transkriptase unter Verwendung von RNA- oder DNA-Templaten, DNA Pol I von T. aquaticus oder E. coli, Bakteriophage T4 DNA Pol, T7 DNA Pol oder dergleichen. Zu Beispielen für RNA-Polymerasen gehören, ohne Begrenzung, T7 RNA-Polymerase oder dergleichen.
  • Zu Depolymerisationsmitteln, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehört, ohne Begrenzung, jedes Depolymerisationsmittel, das Monomere schrittweise depolymerisiert, wie Exonucleasen im Falle von DNA, RNA oder gemischten DNA/-RNA-Polymeren, Proteasen im Falle von Polypeptiden und Enzyme oder Enzymsysteme, die sequentiell Polysaccharide depolymerisieren.
  • Zu Monomeren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehört, ohne Begrenzung, jedes Monomer, das schrittweise in ein Polymer unter Verwendung eines Polymerisationsmittels polymerisiert werden kann. Zu Nucleotiden, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehören, ohne Begrenzung, natürlich vorkommende Nucleotide, synthetische Analoga davon, Analoga mit daran angefügten atomaren und/oder molekularen Tags oder Gemische oder Kombinationen davon.
  • Zu atomaren Tags, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehört, ohne Begrenzung, jedes atomare Element, das zur Anfügung an eine bestimmte Stelle eines Polymerisationsmittels oder dNTP geeignet ist, insbesondere Europium-Verschiebungsmittel, NMR-aktive Atome oder dergleichen.
  • Zu atomaren Tags, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehört, ohne Begrenzung, jedes atomare Element, das zur Anfügung an einer bestimmten Stelle eines Polymerisationsmittels oder dNTP geeignet ist, insbesondere fluoreszierende Farbstoffe wie d-Rhodamin-Akzeptor-Farbstoffe wie Dichloro[R110], Dichloro[R6G], Dichloro[TAMRA], Dichloro[ROX] oder dergleichen, Fluorescein-Donor-Farbstoffe wie Fluorescein, 6-FAM oder dergleichen; Acridin wie Acridinorange, Acridingelb, Proflavin, pH 7, oder dergleichen; aromatische Kohlenwasserstoffe wie 2- Methylbenzoxazol, Ethyl-p-dimethylaminobenzoat, Phenol, Pyrrol, Benzol, Toluol oder dergleichen; Arylmethin-Farbstoffe wie Auramin O, Kristallviolett, H2O, Kristallviolett, Glycerol, Malachitgrün oder dergleichen; Cumarin-Farbstoffe wie 7-Methoxycumarin-4-essigsäure, Cumarin 1, Cumarin 30, Cumarin 314, Cumarin 343, Cumarin 6 oder dergleichen; Cyanin-Farbstoffe wie 1,1'-Diethyl-2,2'-cyaniniodid, Cryptocyanin, Indocarbocyanin-(C3)-Farbstoff, Indodicarbocyanin-(C5)-Farbstoff, Indotricarbocyanin-(C7)-Farbstoff, Oxacarbocyanin-(C3)-Farbstoff, Oxadicarbocyanin-(C5)-Farbstoff, Oxatricarbocyanin-(C7)-Farbstoff, Pinacyanoliodid, Stains-All, Thiacarbocyanin-(C3)-Farbstoff, Ethanol, Thiacarbocyanin-(C3)-Farbstoff, n-Propanol, Thiadicarbocyanin-(C5)-Farbstoff, Thiatricarbocyanin-(C7)-Farbstoff oder dergleichen; Dipyrrin-Farbstoffe wie N,N'-Difluorboryl-1,9-dimethyl-5-(4-iodphenyl)-dipyrrin, N,N'-Difluorboryl-1,9-dimethyl-5-[(4-(2-trimethylsilylethynyl), N,N'-Difluorboryl-1,9-dimethyl-5-phenyldipyrrin oder dergleichen; Merocyanine wie 4-(Dicyanomethylen)-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran (DCM), Acetonitril, 4-(Dicyanomethylen)-2-methyl-o-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran (DCM), Methanol, 4-Dimethylamino-4'-nitrostilben, Merocyanin 540 oder dergleichen; diverse Farbstoffe wie 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Dimethylsulfoxid, 7-Benzylamino-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, Dansylglycin, H2O, Dansylglycin, Dioxan, Hoechst 33258, DMF, Hoechst 33258, H2O, Lucifergelb CH, Piroxicam, Chininsulfat, 0,05 M H2SO4, Chininsulfat, 0,5 M H2SO4, Squarylium-Farbstoff III oder dergleichen; Oligophenylene wie 2,5-Diphenyloxazol (PPO), Biphenyl, POPOP, p-Quaterphenyl, p-Terphenyl oder dergleichen; Oxazine wie Cresylviolettperchlorat, Nilblau, Methanol, Nilrot, Nilblau, Ethanol, Oxazin 1, Oxazin 170 oder dergleichen; polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe wie 9,10-Bis(phenylethynyl)anthracen, 9,10-Diphenylanthracen, Anthracen, Naphthalen, Perylen, Pyren oder dergleichen; Polyen/Polyyne wie 1,2-Diphenylacetylen, 1,4-Diphenylbutadien; 1,4-Diphenylbutadien, 1,6-Diphenylhexatrien, Betacaroten, Stilben oder dergleichen; redoxaktive Chromophore wie Anthrachinon, Azobenzol, Benzochinon, Ferrocen, Riboflavin, Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II), Tetrapyrrol, Bilirubin, Chlorophyll a, Diethylether, Chlorophyll a, Methanol, Chlorophyll b, diprotoniertes Tetraphenylporphyrin, Hämatin, Magnesiumoctaethylporphyrin, Magnesiumoctaethylporphyrin (MgOEP), Magnesiumphthalocyanin (MgPc), PrOH, Magnesiumphthalocyanin (MgPc), Pyridin, Magnesiumtetramesitylporphyrin (MgTMP), Magnesiumtetraphenylporphyrin (MgTPP), Octaethylporphyrin, Phthalocyanin (Pc), Porphin, Tetra-t-butylazaporphin, Tetra-t-butylnaphthalocyanin, Tetra kis(2,6-dichlorphenyl)porphyrin, Tetrakis(o-aminophenyl)porphyrin, Tetramesitylporphyrin (TMP), Tetraphenylporphyrin (TPP), Vitamin B12, Zinkoctaethylporphyrin (ZnOEP), Zinkphthalocyanin (ZnPc), Pyridin, Zinktetramesitylporphyrin (ZnTMP), Zinktetramesitylporphyrin-Radikalkation, Zinktetraphenylporphyrin (ZnTPP) oder dergleichen; Xanthene wie Eosin Y, Fluorescein, alkalisches Ethanol, Fluorescein, Ethanol, Rhodamin 123, Rhodamin 6G, Rhodamin B, Bengal-Rose, Sulforhodamin 101 oder dergleichen; oder Gemische oder Kombinationen davon oder synthetische Derivate davon oder FRET-Fluorophor-Löscher-Paare wie DLO-FB1 (5'-FAM/3'-BHQ-1) DLO-TEB1 (5'-TET/3'-BHQ-1), DLO-JB1 (5'-JOE/3'-BHQ-1), DLO-HB1 (5'-HEX/3'-BHQ-1), DLO-C3B2(5'-Cy3/3'-BHQ-2), DLO-TAB2 (5'-TAMRA/3'-BHQ-2), DLO-RB2(5'-ROX/3'-BHQ-2), DLO-C5B3 (5'-Cy5/3'-BHQ-3), DLO-C55B3 (5'-Cy5.5/3'-BHQ-3), MBO-FB1 (5'-FAM/3'-BHQ-1), MBO-TEB1 (5'TET/3'-BHQ-1), MBO-JB1 (5'-JOE/3'-BHQ-1), MBO-HB1 (5'-HEX/3'-BHQ-1), MBO-C3B2 (5'-Cy3/3'-BHQ-2), MBO-TAB2 (5'-TAMRA/3'-BHQ-2), MBO-RB2 (5'-ROX/3'-BHQ-2), MBO-C5B3 (5'-Cy5/3'-BHQ-3), MBO-C55B3 (5'-Cy5.5/3'-BHQ-3) oder ähnliche FRET-Paare, die von Biosearch Technologies, Inc. aus Novato, CA erhältlich sind, Tags mit NMR-aktiven Gruppen, Tags mit Spektralmerkmalen, die leicht identifiziert werden können, wie IR, fernes IR, sichtbares UV, fernes UV oder dergleichen.
  • ENZYMAUSWAHL
  • Die Erfinder haben gefunden, dass sich die DNA-Polymerase von Thermus aquaticus-Taq DNA-Polymerase I-ideal zur Verwendung in den Einzelmolekülgeräten, Systemen und Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet. Taq-DNA-Polymerase, die gelegentlich hierin einfach als Taq bezeichnet wird, hat viele Merkmale, die die Erfinder zur Konstruktion markierter Polymerasen zur Verwendung in den in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Erfindungen nutzen können. Natürlich wird die durchschnittliche Fachperson erkennen, dass andere Polymerasen für den Gebrauch in den erfindungsgemäßen Einzelmolekül-Sequenzierungssystemen angepasst werden können.
  • Da Taq-DNA-Polymerase I so viele Mutationen in oder nahe ihrer aktiven Stelle toleriert (wie in Patel et al., J. Mol Biol., Bd 308, Seiten 823-837 besprochen), ist das Enzym gegenüber (einer) Enzymmarkierungsmodifikation(en) toleranter und kann außerdem eine größere Palette an modifizierten Nucleotidsubstraten einfügen.
  • Kristallstrukturen sind für Taq-DNA-Polymerase verfügbar
  • Es gibt 13 für Taq-DNA-Polymerase gelöste Strukturen, mit oder ohne DNA-Template/Primer, dNTP oder ddNTP, die ausreichend Informationen für die Selektion von Aminosäurestellen innerhalb der Polymerase ermöglichen, an die ein atomares und/oder molekulares Tag wie ein fluoreszierendes Tag angefügt werden kann, ohne die Polymeraseaktivität nachteilig zu beeinflussen (siehe z. B. Eom et al., 1996; Li et al., 1998a; Li et al., 1998b). Darüber hinaus verfügen die Erfinder über ein geschriebenes Programm, das bei der Identifizierung optimaler Tag-Hinzufügungsstellen behilflich ist. Das Programm vergleicht Strukturdaten, die mit der Taq-Polymerase in ihrer offenen und geschlossenen Form assoziiert sind, um Regionen in der Polymerasestruktur zu identifizieren, die optimal positioniert sind, um die Differenz bei Konformationsextremen zwischen einem Tag an der Polymerase und dem dNTP zu optimieren oder um eine Veränderung bei der Trennung zwischen zwei Tags an der Polymerase zu optimieren, so dass Veränderungen hinsichtlich einer nachweisbaren Eigenschaft von einem der Tags oder des Tag-Paares erhöht oder maximiert werden.
  • Taq-DNA-Polymerase wird effizient in E. coli exprimiert
  • Die Taq-DNA-Polymerase wird in E. coli effizient exprimiert, so dass eine effiziente Produktion und Reinigung der naszierenden Polymerase und von Varianten davon für eine schnelle Identifizierung, Charakterisierung und Optimierung einer konstruierten Taq-DNA-Polymerase zur Verwendung in den Einzelmolekül-DNA-Sequenzierungssystemen der vorliegenden Erfindung möglich ist.
  • In der Proteinsequenz sind keine Cysteine vorhanden
  • Die Taq-DNA-Polymerase enthält keine Cysteine, so dass eine leichte Erzeugung von cysteinhaltigen Mutanten möglich ist, in denen ein einzelnes Cystein an strategischen Stellen platziert ist oder eine existierende Aminosäure ersetzt, wobei das eingefügte Cystein als eine Tag-Anfügungsstelle dient.
  • Die Prozessivität des Enzyms kann modifiziert werden
  • Obschon native Taq-DNA-Polymerase möglicherweise keine optimale Polymerase für das Sequenzierungssystem der vorliegenden Erfindung darstellt, da sie keine sehr prozessive Polymerase ist (50-80 Nucleotide werden vor der Dissoziation eingefügt), kann die geringe Prozessivität durch angemessenes Modifizieren der „Base Calling"-Software kompensiert werden. Alternativ kann die Prozessivität der Taq-DNA-Polymerase durch gentechnische Manipulation verbessert werden, indem eine Sequenz zum Erhöhen der Prozessivität in das Polymerasegen eingefügt wird. Hochprozessive Polymerasen minimieren voraussichtlich Komplikationen, die aus Template-Dissoziationseffekten entstehen können, die die Polymerisationsgeschwindigkeit verändern können. Die Prozessivität von Taq kann gentechnisch verändert werden, indem die 76 Aminosäuren-'Prozessivitätsdomäne' von T7 DNA-Polymerase zwischen die H und H1 Helices (an der Spitze der 'thumb'-Region innerhalb der Polymerase) von Taq eingeführt wird. Die Prozessivitätsdomäne beinhaltet außerdem die Thioredoxin-Bindungsdomäne (TBD) von T7 DNA-Polymerase, wodurch bewirkt wird, dass die Taq-Polymerase Thioredoxin-abhängig ist, wodurch sowohl die Prozessivität als auch die spezifische Aktivität der Taq-Polymerase erhöht werden (siehe z. B. Redford et al., 1997; Redford et al., 1999).
  • Taq-DNA-Polymerase besitzt eine 5'-3'Exonucleaseaktivität und ist thermostabil
  • Einzelsträngige M13 DNA und synthetische Oligonucleotide werden in den anfänglichen Studien verwendet. Nach dem Optimieren der Polymeraseaktivität kann das Sequenzierungssystem verwendet werden, um direkt Sequenzinformationen von einem isolierten Chromosom – einem doppelsträngigen DNA-Molekül – zu bestimmen. Im Allgemeinen reicht das Erhitzen einer Probe von doppelsträngiger DNA aus, um doppelsträngige DNA in strängiger DNA-Form zur Sequenzierung zu produzieren oder beizubehalten.
  • Um den einzelsträngigen Zustand zu begünstigen, wird die 5'-3' Exonucleaseaktivität der nativen Taq-DNA-Polymerase in dem für die Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung konstruierten Enzym beibehalten. Diese Aktivität der Polymerase wird vom 'TaqMan'-Assay ausgenutzt. Die Exonucleaseaktivität entfernt einen Duplexstrang, der stromabwärts von der Replikationsstelle renaturieren kann, und zwar unter Verwendung eines Nick-Translationsreaktionsmechanismus. Die Synthese anhand der konstruierten Polymerase wird entweder durch einen synthetischen Oligonucleotidprimer (wenn ein spezifischer Reaktionsstart erforderlich ist) oder durch einen Bruch im DNA-Molekül (wenn mehrere Reaktionen verarbeitet werden) initiiert, um die Sequenz eines gesamten DNA-Moleküls zu bestimmen.
  • Die Polymerase ist frei von 3'-5' Exonucleaseaktivität
  • Die Taq-DNA-Polymerase enthält keine 3'-5' Exonucleaseaktivität, was bedeutet, dass die Polymerase keine Base, für die ein fluoreszierendes Signal erfasst wurde, durch eine andere Base ersetzen kann, die ein anderes Signatur-Fluoreszenzsignal produzieren würde.
  • Alle Polymerasen machen Replikationsfehler. Die 3'-5' Exonucleaseaktivität wird zum Korrekturlesen des neu replizierten DNA-Strangs verwendet. Da Taq-DNA-Polymerase diese Korrekturlesefunktion fehlt, wird ein Fehler beim Baseneinbau zu einem Fehler bei der DNA-Replikation. Die Fehlerraten für Taq-DNA-Polymerase liegen bei 1 Fehler je ~100.000 synthetisierten Basen, was ausreichend gering ist, um eine relativ hohe Fidelität zu gewährleisten (siehe z. B. Eckert und Kunkel, 1990; Cline et al., 1996). Für eine Polymerase wurde vorgeschlagen und verifiziert, dass die Beseitigung dieser Exonucleaseaktivität eine verringerte Fidelität im Laufe der Einfügung aufdeckt. Folglich muss Taq-Polymerase – zwangsläufig – während der anfänglichen Nucleotidselektion und/oder -einfügung genauer sein und ist daher eine ausgezeichnete Wahl für die vorliegenden Erfindungen.
  • Die Fehlerrate konstruierter Polymerasen der vorliegenden Erfindung wird geprüft, indem ihre Fehlerraten bei der Synthetisierung bekannter Sequenzen ermittelt werden. Die Fehlerrate bestimmt die optimale Anzahl von Reaktionen, die parallel laufen müssen, so dass Sequenzierungsinformationen vertrauensvoll zugeordnet werden können. Die optimale Anzahl kann 1 oder 10 oder mehr sein. Die Erfinder haben zum Beispiel entdeckt, dass der Basenkontext die Polymerasegenauigkeit und Reaktionskinetik beeinflusst, und diese Informationen werden zum Zuordnen von Konfidenzwerten zu individuellen „Base Calls" verwendet. Je nach der Zielsetzung eines jeweiligen Sequenzierungsprojekts ist es jedoch möglicherweise wichtiger, eine Genomsequenz möglichst schnell zu erzeugen. Es kann zum Beispiel bevorzugt werden, die Genomsequenz eines Pathogens mit reduzierter Genauigkeit für anfängliche Identifikationszwecke oder für ein schnelles Screenen potentieller Pathogene zu erzeugen oder auszuarbeiten.
  • Taq-DNA-Polymerase ist das ausgewählte Enzym für die Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung
  • Durch das Konstruieren der Polymerase so, dass sie als direkter molekularer Sensor der DNA-Basenidentität fungiert, wird das schnellstmögliche enzymatische DNA-Sequenzierungssystem bereitgestellt. Aus den oben detaillierten Gründen ist Taq-DNA-Polymerase das optimale Enzym zur genetischen Modifikation und Anpassung für die Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung. Des Weiteren können grundlegende Forschungsfragen bezüglich Struktur und Funktion der DNA-Polymerase im Laufe der Replikation mittels dieser Technologie behandelt werden, wodurch Einzelmolekülnachweissysteme und Molekülmodelle in anderen Disziplinen gefördert werden. Die Erfinder haben gefunden, dass native Taq-DNA-Polymerase gamma-markierte dNTPs einfügt, so dass erweiterte DNA-Polymere gewonnen werden. Wichtig ist, dass der Einbau eines modifizierten Nucleotids für die Polymeraseaktivität nicht von Nachteil ist und die Erweiterung von Primersträngen durch das Einfügen eines γ-markierten Nucleotids mit den Watson-Crick-Basenpaarungsregeln übereinstimmt.
  • ERFASSUNG VON INTERAKTIONEN ZWISCHEN MARKIERTER POLYMERASE UND NUCLEOTID
  • Ein bevorzugtes Verfahren für die Erfassung von Polymerase-Nucleotid-Interaktionen schließt ein Verfahren auf der Basis eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET-gestütztes Verfahren) ein, um Signale zu maximieren und Rauschen zu minimieren. Ein FRET-gestütztes Verfahren existiert, wenn die Emission von einem Akzeptor intensiver ist als die Emission von einem Donor, d. h. der Akzeptor hat eine höhere Fluoreszenzquantenausbeute als der Donor bei der Anregungsfrequenz. Die Effizienz des FRET-Verfahrens kann anhand von Rechenmodellen beurteilt werden (siehe z. B. Furey et al., 1998; Clegg et al., 1993; Mathies et al., 1990). Die Effizienz des Energietransfers (E) wird mit der Gleichung (1) berechnet: E = 1/(1 + [R/R0]6) (1)wobei R0 die kritische Förster-Distanz bei E = 0,5 ist. R0 wird mit der Gleichung (2) berechnet: R0 = (9,79 × 103)(κ2n–4QDJDA)1/6 (2) wobei n der Brechungsindex des Mediums ist (n = 1,4 für wässrige Lösung), κ2 ein geometrischer Orientierungsfaktor bezogen auf den relativen Winkel der beiden Übergangsdipole ist (allgemein wird angenommen, dass κ2 2/3 ist), JDA [M–1cm3] das Überlappungsintegral ist, das die normalisierte Spektralüberlappung der Donoremission und Akzeptorabsorption repräsentiert, und QD die Quantenausbeute ist. Das Überlappungsintegral wird mit der Gleichung (3) berechnet: JDA = [∫FD(λ)εA(λ)λ4dλ]/[∫FD(λ)dλ] (3)wobei FD die Donoremission ist, εA die Akzeptorabsorption ist. QD wird mit der Gleichung (4) berechnet: QD = QRF(ID/IRF)(ARF/AD) (4)wobei ID und IRF die Fluoreszenzintensitäten des Donors und einer Referenzverbindung (Fluorescein in 0,1 N NaOH) sind und ARF und AD die Absorbanzen von Referenzverbindung und Donor sind. QRF ist die Quantenausbeute von Fluorescein in 0,1 N NaOH und wird mit 0,90 angenommen.
  • R, die Distanz zwischen Donor und Akzeptor, wird durch Betrachten verschiedener Konfigurationen (z. B. Konformationen) der Polymerase gemessen, um einen konformationsgemittelten Wert zu erhalten. Wenn sich beide Tags an der Polymerase befinden, dann ist R die Distanz zwischen Donor und Akzeptor in der offenen und geschlossenen Konformation, während dann, wenn der Donor an der Polymerase und der Akzeptor am dNTP ist, R die Distanz zwischen Donor und Akzeptor ist, wenn das dNTP an die Polymerase gebunden ist und die Polymerase in ihrer geschlossenen Form vorliegt.
  • Die Distanz zwischen dem markierten γ-Phosphat und den selektierten Aminosäurestellen zur Markierung umreißt in der offenen-versus-geschlossenen Polymerasekonformation optimale Farbstoffkombinationen. Ist die Distanz (R) zwischen Donor und Akzeptor gleich R0 (R0 ist die kritische Förster-Distanz), dann beträgt die FRET-Effizienz (E) 50%. Ist R größer als 1,5 R0, dann wird die Transfereffizienz unbedeutend (E < 0,02). Stellen innerhalb des Enzyms, an denen R/R0 um mehr als 1,6 in den offenen-versus-geschlossenen Formen differieren, werden identifiziert und bei Bedarf können diese Distanzen und/oder Distanzunterschiede gentechnische erhöht werden. Ein Diagramm, das die FRET-Effizienz gegenüber der Distanz dar stellt, ist in 1 enthalten.
  • Fluoreszenzfarbstoff-Selektionsprozess
  • Farbstoffsätze werden ausgewählt, um die Energietransfereffizienz zwischen einem markierten dNTP und einem Tag an der Polymerase zu maximieren, wenn die Polymerase in ihrer geschlossenen Konfiguration ist, und um die Energietransfereffizienz zwischen dem Tag an dem dNTP (entweder nicht-produktiv gebunden oder in Lösung) und dem Tag an der Polymerase zu minimieren, wenn die Polymerase in ihrer offenen Konfiguration ist. Bei einer Molarität jedes Nucleotids in dem Reaktionsmedium von nicht mehr als etwa 1 μM wird eine durchschnittliche Distanz zwischen markierten Nucleotiden berechnet, die gleich oder größer als etwa 250 Å ist. Da diese Distanz um ein Mehrfaches größer als die Distanz ist, die Stellen auf der Polymerase in ihrer offenen bis geschlossenen Konformation trennt, wird ein minimaler FRET-Hintergrund zwischen Polymerase und freien dNTPs beobachtet. Vorzugsweise werden die Nucleotidkonzentrationen unter 1 μM reduziert. Durch das Reduzieren der dNTP-Konzentrationen auf Werte von wenigstens < 10% des Km-Wertes wird die Hintergrundfluoreszenz weiter minimiert und es wird ein praktisches Verfahren zum Regeln der Geschwindigkeit der Polymerasereaktion für die Echtzeitüberwachung bereitgestellt. Unter solchen Bedingungen ist die Geschwindigkeit der Polymerisationsreaktion linear proportional zur dNTP-Konzentration und folglich gegenüber einer Regelung äußerst empfindlich. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung einer einzelnen Anregungswellenlänge eine verbesserte Identifikation einzigartiger Tags an jedem dNTP. Ein einzelner Anregungslaser geringerer Wellenlänge wird zum Erzielen einer hohen Selektivität verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung wird ein Fluoreszenzdonor an eine Stelle der Polymerase angefügt, die eine ausgetauschte Aminosäure umfasst, die für eine Donoranfügung geeigneter ist, wie Cystein, und vier einzigartige Fluoreszenzakzeptoren werden an jedes dNTP angefügt. Fluorescein wird zum Beispiel an eine Stelle der Polymerase angefügt und Rhodamin, Rhodaminderivate und/oder Fluoresceinderivate werden an jedes dNTP angefügt. Jedes Donor-Akzeptor-Fluorophorpaar ist so gestaltet, dass es ein Absorptionsspektrum hat, das sich genügend von den anderen Paaren unterscheidet, um eine separate Identifizierung nach der Anregung zu ermöglichen. Vorzugsweise wird der Donor so ausgewählt, dass das Anregungslicht den Donor aktiviert, der dann die Anregungsenergie effizient zu einem der Akzeptoren überträgt. Nach dem Energietransfer emittiert der Akzeptor seine einzigartige Fluoreszenzsignatur. Die Emission des Fluoreszenzdonors muss sich mit den Absorptionsspektren der Fluoreszenzakzeptoren für einen effizienten Energietransfer signifikant überlappen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können jedoch auch mit zwei, drei oder vier einzigartigen Fluoreszenz-Donor-Akzeptor-Paaren durchgeführt werden, indem Parallelreaktionen laufen gelassen werden.
  • Die Wahl des Fluorophors ist nicht nur von seiner Enzymkompatibilität, sondern auch von seinen spektralen und photophysikalischen Eigenschaften abhängig. Es ist zum Beispiel ausschlaggebend, dass der Akzeptorfluorophor keinerlei signifikante Absorption bei der Anregungswellenlänge des Donorfluorophors hat, und es ist weniger ausschlaggebend (aber auch wünschenswert), dass der Donorfluorophor keine Emission bei der Nachweiswellenlänge des Akzeptorfluorophors hat. Diese Spektraleigenschaften können durch chemische Modifikationen der Fluorophorringsysteme abgeschwächt werden.
  • Obwohl die dNTPs für eine Markierung an mehreren Stellen, einschließlich der Base, der Zucker- und der Phosphatgruppen, geeignet sind, werden die dNTPs bevorzugt am β- und/oder γ-Phosphat markiert. Das Markieren der terminalen Phosphate von dNTP hat einen eindeutigen Vorteil. Wenn das ankommende, markierte dNTP an die aktive Stelle der Polymerase gebunden wird, dann kommt es zu einem bedeutenden FRET vom Donor an der Polymerase zum Akzeptor am dNTP. Die einzigartige Fluoreszenz des Akzeptors kennzeichnet, welches dNTP eingefügt ist. Nach dem Einfügen des markierten dNTP in die wachsende DNA-Kette wird der Fluoreszenzakzeptor, der nun an die Pyrophosphatgruppe angefügt ist, in das Medium mit der gespaltenen Pyrophosphatgruppe freigesetzt. In der Tat enthält die wachsende DNA-Kette überhaupt keine Fluoreszenzakzeptormoleküle. Im Wesentlichen findet FRET nur zwischen dem Donor an der Polymerase und ankommendem Akzeptor-markiertem dNTP statt, einem nach dem anderen. Dieser Ansatz ist besser als die alternative Anfügung des Akzeptors an eine Stelle innerhalb des dNMP-Anteils des dNTP oder die Verwendung mehrfach modifizierter dNTPs. Wird der Akzeptor an eine andere Stelle als der β- oder γ-Phosphatgruppe angefügt, dann wird er Teil der wachsenden DNA-Kette und die DNA-Kette wird mehrere Fluoreszenzakzeptoren enthalten. Es käme wahrscheinlich zu einer Störung der Polymerisationsreaktion und FRET-Messungen.
  • Ist die Fluoreszenz von den markierten dNTPs in dem Polymerisationsmedium (Hintergrund) problematisch, dann können Kollisionslöscher zum Polymerisationsmedium gegeben werden, die mit den Akzeptoren an den dNTPs nicht kovalent interagieren und die Fluoreszenz von den markierten dNTPs in dem Medium löschen. Natürlich sind die Löscher auch so gestaltet, dass sie einen unbedeutenden Kontakt mit dem Donor an der Polymerase haben. Zum Minimieren der Interaktion zwischen Kollisionslöschern und dem Donor an der Polymerase befindet sich das Polymerase-Tag vorzugsweise innen und von den Kollisionslöschern abgeschirmt oder die Kollisionslöscher können sterisch voluminös gemacht oder mit einer sterisch voluminösen Gruppe assoziiert werden, um die Interaktion zwischen Löscher und Polymerase zu verringern.
  • Ein weiteres bevorzugtes Verfahren für den Nachweis von Polymerase-Nucleotid-Interaktionen schließt die Verwendung von Nucleotid-spezifischen Löschmitteln ein, um die Emission eines fluoreszierenden Tags an der Poylmerase zu löschen. Folglich wird die Polymerase mit einem Fluorophor markiert, wohingegen jedes dNTP mit einem Löscher für den Fluorophor markiert wird. Typischerweise ist DABCYL (4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure ein Universallöscher, der Energie von einem Fluorophor wie 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalen-1-sulfonsäure (AEANS) absorbiert und Wärme abführt. Vorzugsweise wird für jedes dNTP ein Löscher ausgewählt, so dass, wenn die jeweiligen Löscher in unmittelbare Nähe zum Fluorophor gebracht werden, eine unterscheidbare Löscheffizienz erhalten wird. Folglich wird der Löschgrad zum Identifizieren jedes dNTP verwendet, während es in die wachsende DNA-Kette eingebaut wird. Ein Vorteil dieses bevorzugten Nachweisverfahrens ist, dass die Fluoreszenzemission von einer einzelnen Quelle kommt, wodurch Hintergrundrauschen unerheblich wird. Wenn auch weniger bevorzugt, so werden, wenn nur zwei oder drei geeignete Löscher identifiziert werden, zwei oder drei der vier dNTPs markiert und eine Reihe von Polymerisationsreaktionen findet jedes Mal mit einem unterschiedlichen Paar der markierten dNTPs statt. Durch Kombinieren der Ergebnisse aus diesen Läufen wird eine komplette Sequenz des DNA-Moleküls erzeugt.
  • SELEKTION DER STELLE ZUM MARKIEREN DER TAQ-POLYMERASE UND dNTPs
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zwar das Anfügen eines beliebigen Typs eines atomaren und/oder molekularen Tags mit einer nachweisbaren Eigenschaft, doch werden die Verfahren zur Selektion der Stelle und Tag-Anfügung anhand einer bevorzugten Klasse von Tags veranschaulicht, und zwar anhand von fluoreszierenden Tags.
  • Fluoreszenzmarkierung von Polymerase und/oder dNTPs
  • Die an die Polymerase oder dNTPs angefügten Fluoreszenzsonden oder Löscher haben die Aufgabe, nachteilige Effekte auf die DNA-Polymerisationsreaktion zu minimieren. Die Erfinder haben Syntheseverfahren zum chemischen Markieren der Polymerase und dNTPs mit Fluoreszenzsonden oder Löschern entwickelt.
  • Im Allgemeinen wird die Polymerase durch Austauschen eines ausgewählten Aminosäurecodons in der DNA-Sequenz, die die Polymerase kodiert, durch ein Codon für eine Aminosäure markiert, die leichter mit einem molekularen Tag reagiert, wie Cystein, und zwar durch Mutagenese. Nach dem Präparieren einer mutierten DNA-Sequenz wird der Mutant in E. coli zur Expression eingefügt. Nach der Expression wird die mutierte Polymerase isoliert und gereinigt. Die gereinigte mutierte Polymerase wird dann im Hinblick auf Polymeraseaktivität getestet. Nach der Aktivitätsverifizierung wird die mutierte Polymerase mit einem leichten molaren Überschuss eines gewünschten Tags zur Reaktion gebracht, um eine annähernd stöchiometrische Markierung zu erreichen. Alternativ kann die Polymerase mit einer überschüssigen Menge des Tags behandelt werden und die Markierung in Abhängigkeit von der Zeit folgen. Die Markierungsreaktion wird dann gestoppt, wenn eine annährend stöchiometrische Markierung erhalten wird.
  • Wenn die mutierte Polymerase mehrere Stellen einschließlich des Targetrests beinhaltet, die einer Markierung mit dem gewünschten molekularen Tag unterzogen werden können, dann kann die Markierungsreaktion auch unter speziellen Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, wie zum Beispiel unter Verwendung einer Schutzgruppe oder eines kompetitiven Inhibitors und einer reversiblen Blockierungsgruppe, die später entfernt werden. Wenn der Targetaminosäurerest in der mu tierten Polymerase nahe bei der aktiven dNTP-Bindungsstelle ist, dann wird ein sättigendes Niveau einer Schutzgruppe oder eines kompetitiven Inhibitors zuerst zugegeben, um den Targetrest zu schützen, danach wird eine reversible Blockierungsgruppe hinzugefügt, um Nicht-Targetreste zu inaktivieren. Die Schutzgruppe oder der kompetitive Inhibitor wird dann von dem Targetrest entfernt und die mutierte Polymerase wird mit dem gewünschten Tag behandelt, um den Targetrest zu markieren. Schließlich werden die Blockierungsgruppen von den Nicht-Targetresten in der mutierten Polymerase chemisch entfernt und entfernt, um eine markierte mutierte Polymerase zu erhalten, wobei das Tag wesentlich bis vollständig auf dem Targetrest isoliert ist.
  • Wenn der Targetrest nicht in der Nähe der aktiven Stelle ist, dann kann die Polymerase alternativ mit einer Blockierungsgruppe behandelt werden, um Nicht-Targetreste zu inaktivieren. Nach dem Entfernen der unreagierten Blockierungsgruppe wird die mutierte Polymerase mit dem gewünschten Tag zum Markieren des Targetrests behandelt. Schließlich werden die Blockierungsgruppen von den Nicht-Targetresten in der mutierten Polymerase chemisch entfernt und entfernt, um die markierte mutierte Polymerase zu erhalten.
  • Selektion der Aminosäurestelle für die Taq-Polymerase
  • Die Erfinder haben Aminosäuren in der Taq-Polymerase identifiziert, die wahrscheinlich einer Mutation und anschließenden Tag-Anfügung, wie der Anfügung eines fluoreszierenden Tags, standhalten. Zwar kann an vielen Stellen ein Cysteinaustausch und eine Tag-Anfügung erfolgen, doch wurden bevorzugte Stellen in der Polymerase anhand der folgenden Kriterien ermittelt: (1) sie sind nicht mit anderen Proteinen in Kontakt; (2) sie verändern nicht die Konformation oder Faltung der Polymerase und (3) sie sind nicht an der Funktion des Proteins beteiligt. Die Selektionen wurden mit einer Kombination von Mutationsstudien, einschließlich Sequenzanalysedaten, Rechenstudien, einschließlich Moleküldockingdaten, und Prüfungen im Hinblick auf Polymeraseaktivität und -fidelität erreicht. Nach der Mutation einer Stelle werden Rechenstudien angewendet, um die Molekülmodelle zu verfeinern und dazu beizutragen, andere potentielle Mutationsstellen zu identifizieren.
  • Regionen der Proteinoberfläche, die für die Funktion nicht wichtig sind, wur den indirekt identifiziert, indem die Sequenzvariation in Abhängigkeit des Entwicklungszeitraums und der Proteinfunktion unter Anwendung der evolutionären Trace-Methode untersucht wurde (siehe z. B. Lichtarge et al., 1996). In diesem Ansatz werden Aminosäurereste, die für die Struktur oder Funktion wichtig sind, durch einen Vergleich von Entwicklungsmutationen und Strukturhomologien gefunden. Die Polymerasen sind ideale Systeme für diesen Studientyp, da viele Kristall- und Kokristallstrukturen und viele verfügbare Sequenzen vorliegen. Die Erfinder haben Regionen von struktureller/funktioneller Bedeutung von der Stellenselektion für Mutation/Markierung ausgeschlossen. Darüber hinaus lieferten eine visuelle Prüfung und Überlagerungen verfügbarer Kristallstrukturen der Polymerase in verschiedenen Konformationszuständen weitere Unterstützung bei der Identifizierung von Aminosäurestellen in der Nähe der Bindungsstelle für dNTPs. Einige der gewählten Aminosäurestellen liegen ein wenig innen und umgeben vorzugsweise aktive Regionen in der Polymerase, die im Laufe des Baseneinbaus Veränderungen erfahren, wie die dNTP-Bindungsregionen, Baseneinbauregionen, Pyrophosphatfreisetzungsregionen usw. Diese innen liegenden Stellen werden bevorzugt, da ein Tag an diesen Stellen während des Nachweises reduzierte Hintergrundsignale aufweist, d. h. eine reduzierte Interaktion zwischen Polymeraseenzym und nicht spezifisch assoziierten markierten dNTPs, wenn fluoreszierend markierte dNTPs verwendet werden.
  • Nach dem Präparieren markierter mutierter Polymerasen und dem Minimieren der Energie in einer kompletten Lösungsmittelumgebung werden Schätzungen des Effekts auf die Struktur der Polymerase infolge der Mutation und/oder Markierung generiert, um Informationen über die relative Tag-Positionierung und -Trennung zu liefern. Diese Daten werden dann zur Beurteilung von FRET-Effizienzen vor der Messung verwendet. Werden die dNTPs mit Löschern markiert, dann sind diese Überlegungen natürlich nicht so wichtig.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die Aufstellung von Molekülmechanik-Kraftfeldparametern für atomare und/oder molekulare Tags wie fluoreszierende Tags, die zum Markieren der dNTPs und der Polymerase verwendet werden, und von Parameter für die fluoreszierend markierte Aminosäure an der Polymerase und/oder dem dNTP ein. Kraftfeldparameter setzen quantenmechanische Studien ein, um partielle Ladungsverteilungen und Energien für relevante intramole kulare Konformationen zu erhalten (d. h. für die Flächenwinkeldefinitionen), die von bekannten Polymerasekristallstrukturen abgeleitet werden.
  • Ionisationszustände jedes ionisierbaren Rests werden mit einem elektrostatischen Modell, in dem das Protein als eine schwache dielektrische Region und das Lösungsmittel als ein hohes Dielektrikum behandelt wird, mit dem UHBD-Programm beurteilt (siehe z. B. Antosiewicz et al., 1994; Briggs und Antosiewicz, 1999; Madura et al., 1995). Die elektrostatischen freien Ionisationsenergien jedes ionisierbaren Rests werden durch Lösen der Poisson-Boltzmann-Gleichung für jeden Rest berechnet. Diese individuellen freien Ionisationsenergien werden modifiziert, um gekoppeltes Titrationsverhalten zu berücksichtigen, woraus sich ein Satz selbstkonsistenter vorhergesagter Ionisationszustände ergibt. Diese vorhergesagten freien Ionisationsenergien werden dann neu berechnet, so dass Ionisationsverschiebungen infolge der Bindung eines dNTP berücksichtigt werden. Unerwartete Ionisationszustände werden weiteren rechnerischen und experimentellen Untersuchungen unterzogen, woraus sich ein Satz partieller Ladungen für jeden Rest in dem Protein ergibt, d. h. jeder ionisierbare Rest in dem Protein kann je nach dem Typ des angefügten Tags oder der Aminosäuresubstitution einen anderen Ladungszustand aufweisen.
  • Als weitere Hilfestellung bei der Aminosäurenstellenselektion wird eine Karte der elektrostatischen Potentiale anhand der Eigenschaften der molekularen Oberfläche des Taq-Polymerase/DNA-Komplexes generiert, gescreent durch Lösungsmittel und bei Bedarf durch gelöste Ionen (d. h. Ionenstärke) vornehmlich mit dem UHBD-Programm. Die Karte gibt eine Orientierungshilfe über Bindungsorte für die dNTPs und die elektrostatische Umgebung an vorgeschlagenen Mutations-/Markierungsstellen.
  • Die generierten Molekülmodelle sind so gestaltet, dass sie unter Berücksichtigung neuer Versuchsdaten ständig verfeinert werden, so dass die Konstruktion verbesserter Molekülmodelle, verbesserte molekulare Dynamikkalkulationen und verbesserte Kraftfeldparamter möglich sind, so dass die Modelle das Systemverhalten zur Verfeinerung der Tag-Chemie und/oder Tag-Positionierung, Vorhersage neuer Polymerasemutanten, Baseneinbauraten und Polymerasefidelität besser vorhersagen.
  • Molekulare Docking-Simulationen werden verwendet, um die angedockte Orientierung der natürlichen und fluoreszierend markierten dNTPs innerhalb der Polymerasebindungstasche vorherzusagen. Die besten Andockkonfigurationen werden in Anwesenheit einer expliziten Lösungsmittelumgebung energieminimiert. In Verbindung mit zum Markieren selektierten Aminosäurestellen in der Polymerase werden die Docking-Studien zur Analyse verwendet, wie die Tags interagieren, und um die FRET-Effizienz für jede selektierte Aminosäurestelle vorherzusagen.
  • Mit Ausnahme der elektrostatischen Kalkulationen werden alle Docking-, Quantenmechanik-, Molekülmechanik- und Moleküldynamikkalkulationen jetzt und weiterhin mit dem HyperChem (v6.0) Computerprogramm durchgeführt. Die HyperChem-Software läuft auf PCs unter einem Windows-Betriebssystem. Eine Reihe von Computerprogrammen zur Datenanalyse oder zur FRET-Vorhersage (wie nachfolgend beschrieben) werden jetzt und weiterhin mit dem Linux-Betriebssystem und dem UHBD-Programm, das unter Linux läuft, auf einen PC geschrieben.
  • Analyse von Polymerasestrukturen
  • Für DNA-Polymerase I (DNA Pol I) von E. coli, T. aquaticus, B. stearothermophilus, T7 Bakteriophage und humane Pol β gelöste Kokristallstrukturen demonstrieren, dass (replikative) Polymerasen gemeinsame mechanistische und strukturelle Merkmale haben. Die Strukturen, die Taq-DNA-Polymerase in einer 'offenen' (nicht produktiven) Konformation und in einer 'geschlossenen' (produktiven) Konformation einfangen, sind zur Identifizierung von Regionen der Polymerase, die im Laufe des Baseneinbaus Veränderungen erfahren, von besonderer Bedeutung. Die Zugabe des Nucleotids zum Polymerase/Primer/Template-Komplex ist für den Übergang von seiner offenen in seine geschlossene Konformation verantwortlich. Ein Vergleich dieser Strukturen liefert Informationen über die Konformationsveränderungen, die innerhalb der Polymerase im Laufe des Nucleotideinbaus auftreten. Im Speziellen wird in der geschlossenen Konformation die Spitze der „fingers"-Domäne nach innen um 46° gedreht, wodurch das dNTP am 3'-Ende des Primerstrangs in der aktiven Stelle der Polymerase positioniert wird. Die Geometrie dieses terminalen Basenpaares wird mit der seiner Bindungstasche genau abgeglichen. Die Bindung der korrekten, komplementären Base erleichtert die Bildung der geschlossenen Konformation, während eine inkorrekte dNTP-Bindung diese Konformationsveränderung nicht hervorruft. Eine Reaktionschemie tritt auf, wenn das Enzym in der geschlossenen Kon formation ist.
  • In 2 sind die offenen und geschlossenen Ternärkomplexformen des großen Fragments von Taq DNA Pol I (Klentaq 1) in einer Überlagerung ihrer Cα-Spuren dargestellt. Der Ternärkomplex enthält das Enzym, das ddCTP und die Primer/Template-Duplex-DNA. Die offene Struktur ist in magentarot und die geschlossene Struktur in gelb dargestellt. Das ungeordnete Aussehen im oberen linken Abschnitt des Proteins zeigt die Bewegung der „fingers"-Domäne in offenen und geschlossenen Konformationen.
  • Mit einem Programm zur Bestimmung der Veränderung der Position von Aminosäuren in der offenen und der geschlossenen Konformation der Polymerase relativ zum gamma-Phosphat eines gebundenen ddGTP von zwei verschiedenen Kristallstrukturen der Taq-Polymerase mit dem Primer und gebundenem ddGTP wurden Listen der 20 Aminosäurestellen, die die größte Positionsveränderung im Hinblick auf Mutation und Markierung erfahren, identifiziert. Für jede Aminosäure wurden die Distanzen zwischen ihren alpha- und beta-Kohlenstoffatomen und der gamma-Phosphatgruppe des gebundenen ddGTP berechnet. Listen, die von den beiden unterschiedlichen Sätzen von Kristallographiedaten für die Taq-Polymerase abgeleitet wurden, sind in den Tabellen I, II, III und IV enthalten. TABELLE I Die 20 Aminosäurestellen, die die größte Positionsveränderung im Hinblick auf 2ktq Daten zwischen der offenen Form der Polymerase und der geschlossenen Form der Polymerase relativ zum alpha-Kohlenstoff des Rests erfahren
    Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (Å) Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (Å)
    517 Alanin 9,10 491 Glutaminsäure 2,90
    516 Alanin 6,86 486 Serin 2,78
    515 Serin 6,53 490 Leucin 2,62
    513 Serin 6,40 586 Valin 2,61
    518 Valin 5,12 492 Arginin 2,60
    514 Threonin 3,94 462 Glutaminsäure 2,59
    488 Asparagin 3,73 483 Asparagin 2,47
    487 Arginin 3,50 685 Prolin 2,46
    489 Glutamin 3,13 587 Arginin 2,44
    495 Phenylalanin 3,05 521 Alanin 2,38
    TABELLE II Die 20 Aminosäurestellen, die die größte Positionveränderung im Hinblick auf 2ktq Daten zwischen der offenen Form der Polymerase und der geschlossenen Form der Polymerase relativ zum beta-Kohlenstoff des Rests erfahren
    Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (A) Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (Å)
    517 Alanin 10,98 491 Glutaminsäure 3,41
    516 Alanin 9,05 587 Arginin 3,39
    515 Serin 8,02 521 Alanin 3,33
    513 Serin 7,46 498 Leucin 3,21
    518 Valin 5,47 489 Glutamin 3,08
    685 Prolin 5,16 514 Threonin 2,97
    487 Arginin 4,24 581 Leucin 2,93
    495 Phenylalanin 3,94 483 Asparagin 2,92
    488 Asparagin-säure 3,88 497 Glutaminsäure 2,91
    520 Glutaminsäure 3,66 462 Glutaminsäure 2,83
    TABELLE III Die 20 Aminosäurestellen, die die größte Positionsveränderung im Hinblick auf 3ktq Daten zwischen der offenen Form der Polymerase und der geschlossenen Form der Polymerase relativ zum alpha-Kohlenstoff des Rests erfahren
    Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (Å) Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (Å)
    517 Alanin 8,95 515 Serin 6,36
    656 Prolin 8,75 653 Alanin 6,16
    657 Leucin 8,59 661 Alanin 5,94
    655 Asparagin-säure 8,05 652 Glutaminsäure 5,44
    660 Arginin 7,35 647 Phenylalanin 5,25
    658 Methionin 7,06 649 Valin 5,22
    659 Arginin 6,69 518 Valin 5,15
    654 Valin 6,60 644 Serin 5,08
    513 Serin 6,59 643 Alanin 5,01
    516 Alanin 6,57 650 Prolin 4,72
    TABELLE IV Die 20 Aminosäurestellen, die die größte Positionsveränderung im Hinblick auf 3ktq Daten zwischen der offenen Form der Polymerase und der geschlossenen Form der Polymerase relativ zum beta-Kohlenstoff des Rests erfahren
    Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (Å) Standort des Rests Identität des Rests Veränderung bei der Distanz (Å)
    517 Alanin 10,85 654 Valin 6,25
    656 Prolin 9,05 653 Alanin 6,14
    657 Leucin 8,75 661 Alanin 6,04
    516 Alanin 8,68 643 Alanin 5,74
    655 Asparagin-säure 8,24 649 Valin 5,55
    515 Serin 7,92 647 Phenylalanin 5,45
    660 Arginin 7,89 518 Valin 5,42
    513 Serin 7,60 652 Glutaminsäure 5,13
    659 Arginin 6,98 644 Serin 4,89
    658 Methionin 6,77 487 Arginin 4,77
  • Die oben aufgeführten Aminosäuren repräsentieren bevorzugte Aminosäurestellen für den Cysteinaustausch und die anschließende Tag-Anfügung, da diese Stellen die Stellen in der Taq-Polymerase repräsentieren, die bedeutende Positionsveränderungen im Laufe des Baseneinbaus erfahren.
  • Zur weiteren Verfeinerung der Aminosäurestellenselektion wird eine Visualisierung der Polymerase in ihren offenen und geschlossenen Konformationsextremen für diese identifizierten Aminosäurestellen verwendet, so dass die endgültigen selektierten Aminosäurestellen das Signal maximieren und Hintergrundrauschen minimieren, wenn sie modifiziert wurden, um fluoreszierende Tags zur Analyse mit der FRET-Methodik zu tragen. Aminosäureveränderungen, die die Sekundärstruktur oder Aktivität des Proteins voraussichtlich nicht wesentlich beeinflussen, bilden einen verfeinerten Satz von Aminosäurestellen in der Taq-Polymerase zur Mutagenese und Fluoreszenzmodifikation, so dass das Tag vor einer Interaktion mit freien dNTPs abgeschirmt wird. Die folgenden drei Felder illustrieren das Protokoll, das in der vorliegenden Erfindung zum Verfeinern der Aminosäurestellenselektion von der obigen Liste von Aminosäuren verwendet wird, die die größte Positionsveränderung relativ zu einem gebundenen ddGTP erfahren, während die Polymerase von der offenen in die geschlossene Form übergeht.
  • In den 3A-C ist eine Überlagerung zwischen 3ktq (geschlossen 'schwarz') und 1tau (offen 'hellblau'), dem großen Fragment von Taq-DNA-Polymerase I dargestellt. In 3A ist die gebundene DNA von 3ktq in Rot dargestellt, während das an 3ktq gebundene ddCTP in Grün dargestellt ist. Drei Reste wurden visuell identifiziert, die sich am meisten bewegen, wenn die Polymerase von offen (1tau) in geschlossen (3ktq) übergeht, nämlich Asp655, Pro656 und Leu657. Auf der Basis weiterer Analysen der Strukturen scheint Pro656 die Aufgabe zu haben, die O-Helix abzudecken. Die Seitenkette von Leu657 ist in der geschlossenen (3ktq) Form einem anderen Teil des Proteins sehr nahe. Man geht davon aus, dass das Hinzufügen einer größeren Seitenkette/Tag die Fähigkeit der Polymerase zum Erreichen einer völlig geschlossenen, aktiven Konformation vermindert. Umgekehrt ist Asp655 sowohl in der geschlossenen als auch in der offenen Konformation der Polymerase völlig lösungsmittelexponiert. 3B zeigt eine Nahansicht der aktiven Stelle von der Überlagerung der 3ktq (geschlossenen) und 1tau (offenen) Konformationen der Taq-Polymerase. Die großen Verlagerungen zwischen der offenen und der geschlossenen Konformation sind offensichtlich. 3C zeigt eine Nahansicht einer Moleküloberflächenrepräsentation von 3ktq (ohne DNA und ddCTP). Die Moleküloberfläche ist in zwei Bereichen gefärbt, blau für Asp655 und grün für Leu657. In dieser Darstellung ist es offensichtlich, dass Leu657 in unmittelbarer Nähe zu einem anderen Teil des Proteins ist, da der grüne Teil der Moleküloberfläche in der „Dau men"-Domäne mit einem Teil der „Finger"-Domäne „verbunden" ist. In dieser Ansicht ist diese Region der Polymerase mit Blick in den Handfläche dargestellt, wobei die Finger rechts sind und der Daumen links ist.
  • MUTAGENESE UND SEQUENZIERUNG VON POLYMERASEVARIANTEN
  • Das Taq-DNA-Polymerase kodierende Gen wurde erhalten und wird in pTTQ 18 im E. coli-Stamm DH1 exprimiert (siehe z. B. Engelke et al., 1990). Die Erfinder haben Aminosäurekandidaten für die Mutagenese identifiziert, einschließlich der Aminosäuren in den Tabellen I-IV, der verfeinerten Listen oder Mischungen oder Kombinationen davon. Die Erfinder haben unter Anwendung standardmäßiger Molekularverfahren, die in der Technik allgemein bekannt sind, ein Cysteincodon individuell an jeder der Targetaminosäurestellen eingeführt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989 und Allen et al., 1998). DNA wird von isolierten Kolonien gereinigt, die die mutierte Polymerase exprimieren, mit Farbstoff-Terminator-Fluoreszenzchemie sequenziert, auf einem automatisierten Sequenzer ABI PRISM 377 nachgewiesen und mit SequencherTM von GeneCodes, Inc. analysiert.
  • EXPRESSION UND REINIGUNG VON ENZYMVARIANTEN
  • Die Erfinder haben demonstriert, dass die Taq-Polymerase γ-markierte dNTPs einfügen kann, um erweiterte DNA-Sequenzen zu synthetisieren. Der nächste Schritt beinhaltet die Konstruktion von Mutanten, die ein Tag tragen können, das so gestaltet ist, dass es mit den Tags an den dNTPs interagiert, und die Optimierung der Polymerase zur Einzelmolekülsequenzierung. Die Mutanten werden mit standardmäßiger ortsspezifischer Mutagenese wie oben und im Versuchskapitel beschrieben konstruiert. Die Konstrukte werden dann in E. coli eingefügt und darin exprimiert. Mutierte Taq-Polymerase wird dann, nachdem genügend E. coli kultiviert wurde, für eine anschließende Polymeraseisolierung und -reinigung gewonnen.
  • Zwar kann E. coli auf optische Dichten von mehr als 100 durch rechnergesteuerte, feedbackgestützte Lieferung nicht fermentativer Substrate kultiviert werden, doch sind die resultierenden drei kg E. coli-Zellpaste während der Polymeraseoptimierung überhöht. Wenn optimierte Polymerasekonstrukte präpariert werden, wird diese Großproduktion natürlich verwendet. Während der Entwicklung von optimier ten Polymerasen werden die Mutanten von E. coli-Zellmassen gewonnen, die in gut mit Sauerstoff angereicherten 10-l-Batch-Kulturen unter Verwendung eines reichhaltigen Mediums, das von Amgen erhältlich ist, kultiviert werden. Für ein schnelles Polymerasemutantenscreening werden die Mutanten präpariert, indem E. coli in mit Prallflächen versehenen 2-l-Schüttelgläsern kultiviert wird. Zellpaste wird dann mit einer präparativen 6-l-Zentrifuge geerntet, durch eine French-Presse lysiert und durch Zentrifugation von Zelltrümmern befreit. Zum Reduzieren von Interferenz von E. coli Nucleinsäuresequenzen wird es bevorzugt, außerdem andere Nucleinsäuren zu entfernen. Die Entfernung erfolgt entweder unter Verwendung von Nucleasen (und einer anschließenden Hitzedenaturierung der Nuclease) oder vorzugsweise unter Verwendung einer Variation des in Murphy et al., Nature Biotechnology 17, 822, 1999, beschriebenen Nucleinsäurepräzipitationsprotokolls auf Verdichtungsmittelbasis.
  • Da die Wärmebeständigkeit von Taq-Polymerase wesentlich höher ist als bei typischen E. coli-Proteinen, wird eine Reinigung von Taq-Polymerase oder ihren Mutanten von kontaminierenden Taq-Polymeraseproteinen durch eine einfache 60-minütige Wärmebehandlung der rohen Polymerase bei 75°C erreicht, wodurch die E. coli-Proteinkontamination etwa um das 100fache reduziert wird. Diese Reduzierung der E. coli-Proteinkontamination in Kombination mit dem hohen anfänglichen Expressionsniveau produziert nahezu reine. Taq-Polymerase oder Mutanten davon in einem praktischen Anfangsschritt; vorausgesetzt natürlich, dass die mutierte Polymerase die Wärmebeständigkeit der nativen Polymerase beibehält.
  • Zum routinemäßigen Sequenzieren und PCR-Screenen ist gewöhnlich eine weitere begrenzte Reinigung erforderlich. Ein einziger Anionenaustauschschritt, typischerweise auf Q-Sepharose bei pH 8,0, reicht gewöhnlich aus, um ein Produkt zu produzieren, das für diese Tests rein genug ist. Vorzugsweise wird außerdem ein zweiter Reinigungsschritt durchgeführt, um zu gewährleisten, dass die Kontamination die Ergebnisse der anschließenden Untersuchung nicht trübt. Der zweite Reinigungsschritt schließt SDS-PAGE und CD-überwachte Schmelzversuche ein.
  • SELEKTION EINER STELLE IN dNTP FÜR DIE AUFNAHME EINES FLUORESZIERENDEN TAGS
  • Molekulare Docking-Simulationen wurden mit dem AutoDock-Computerprogramm (Morris et al., 1998; Soares et al., 1999) durchgeführt, um die angedockte Orientierung der natürlichen und fluoreszierend markierten dNTPs vorherzusagen. Konformationsflexibilität wird während der Docking-Simulationen erlaubt, wobei von einem effizienten Lamarckschen genetischen Algorithmus Gebrauch gemacht wird, der in dem AutoDock-Programm implementiert ist. Eine Teilmenge von Proteinseitenketten darf sich ebenfalls bewegen, um das dNTP aufzunehmen, während es andockt. Die besten Andockkonfigurationen werden dann in Anwesenheit einer Lösungsmittelumgebung energieminimiert. Es stehen Versuchsdaten zur Verfügung, die Aminosäuren in der aktiven Stelle der Polymerase identifizieren, die in der Katalyse involviert und mit den Template/Primer-DNA-Strängen oder dem einzufügenden dNTP in Kontakt sind. Die computergestützte chemische Modellierung, wie Docking-Studien, kann dazu verwendet werden, Stellen im dNTP zu identifizieren und zu unterstützen, die markiert werden können, und die FRET-Effizienz der dNTPs vorherzusagen, die eine spezifische Markierung an einer spezifischen Stelle tragen.
  • Im Allgemeinen werden dNTPs entweder durch Reagieren eines dNTP mit einem gewünschten Tag oder durch Reagieren eines Vorläufers wie der Pyrophosphatgruppe oder der Base mit einem gewünschten Tag und dann Vervollständigen der Synthese des dNTP markiert.
  • Chemische Modifikation von Nucleotiden für DNA-Polymerasereaktionen
  • Die Erfinder haben Synthesen für die Modifizierung von Fluorophor- und Fluoreszenz-Energietransferverbindungen entwickelt, so dass sie ausgeprägte optische Eigenschaften für den Differenzsignalnachweis, für Nucleotid/Nucleosid-Synthone für den Einbau von Modifikationen an Basen-, Zucker- oder Phosphatrückgratpositionen und für die Produktion komplementärer Sätze von vier Desoxynucleotidtriphosphaten (dNTPs) haben, die Substituenten auf Nucleobasen, Zucker- oder Phosphatrückgrat enthalten.
  • Synthese von γ-Phosphat-modifizierten dNTPs
  • Die Erfinder haben gefunden, dass die native Taq-Polymerase Phosphat-modifizierte dNTPs oder ddNTPs polymerisieren kann. Wieder wird das Markieren der dNTPs oder ddNTPs an den beta- und/oder gamma-Phosphatgruppen bevorzugt, da die replizierte DNA keine unnatürlichen Basen enthält, die Polymeraseaktivität nicht wesentlich nachteilig beeinflusst wird und lange DNA-Stränge produziert werden. Die Erfinder haben γ-ANS-Phosphat-dNTPs synthetisiert, wobei ANS am Phosphat über eine Phosphamidbindung angefügt ist. Obschon diese markierten dNTPs ohne weiteres durch die native Taq-Polymerase und durch HIV reverse Transkriptase eingefügt werden, ist ANS nur eines aus einer großen Auswahl von Tags, die entweder über die β- und/oder γ-Phosphatgruppen angefügt werden können.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet markierte dNTPs oder ddNTPs in Kombination mit Polymerase für den Signalnachweis. Die dNTPs werden an Phosphatpositionen (alpha, beta und/oder gamma) und/oder an anderen Nucleotidpositionen durch eine kovalente Bindung oder Affinitätsassoziation modifiziert. Die Tags sind so gestaltet, dass sie von der Base entfernt werden, bevor das nächste Monomer zur Sequenz hinzugefügt wird. Ein Verfahren zum Entfernen des Tags besteht darin, das Tag auf den gamma- und/oder beta-Phosphaten zu platzieren. Das Tag wird entfernt, während sich das Pyrophosphat von der wachsenden DNA-Sequenz dissoziiert. Ein anderes Verfahren besteht darin, das Tag an einer Position des Monomers durch eine spaltbare Bindung anzufügen. Das Tag wird dann nach dem Einbau und vor dem Einbau des nächsten Monomers entfernt, wobei die spaltbare Bindung unter Verwendung von Licht, einem Reagens zur Spaltung chemischer Bindungen in dem Polymerisationsmedium und/oder Hitze gespalten wird.
  • Eine verallgemeinerte Syntheseroutine zum Synthetisieren anderer γ-markierter dNTPs ist wie folgt:
    Figure 00730001
    wobei FR ein fluoreszierendes Tag ist, L eine Linkergruppe ist, X entweder H oder ein Gegenion abhängig vom pH-Wert des Reaktionsmediums ist, Z eine Gruppe ist, die mit der Hydroxylgruppe des Pyrophosphats reagieren kann, und Z' die Gruppe nach der Reaktion mit dem dNMP ist. Vorzugsweise ist Z Cl, Br, I, OH, SH, NH2, NHR, CO2H, CO2R, SiOH, SiOR, GeOH, GeOR oder eine ähnliche reaktive Funktionsgruppe oder Austrittsgruppe, wobei R ein Alkyl, Aryl, Aralkyl, Alkaryl, halogenierte Analoga davon oder Heteroatomanaloga davon ist, und Z' O, NH, NR, CO2, SiO, GeO ist, wobei R ein Alkyl, Aryl, Aralkyl, halogenierte Analoga davon oder Heteroatomanaloga davon ist.
  • Die Synthese schließt das Reagieren eines Z-terminierten fluoreszierenden Tags, FR-L-Z, mit einer Pyrophosphatgruppe, P2O6X3H, in DCC und Dichlormethan ein, um ein fluoreszierend markiertes Pyrophosphat zu erhalten. Nach der Herstellung des fluoreszierend markierten Pyrophosphats wird es mit einem Morpholin-terminierten dNMP in saurem THF zur Reaktion gebracht, um ein dNTP mit einem fluoreszierenden Tag an seinem γ-Phosphat zu produzieren. Da die letzte Reaktion ein fluoreszierendes Tag beinhaltet und größer als die Ausgangsmaterialien ist, ist die Trennung von nicht modifiziertem Ausgangsmaterial und markiertem Pyrophosphat unkompliziert.
  • Eine verallgemeinerte Synthese einer FR-L-Gruppe ist nachfolgend dargestellt:
    Figure 00740001
  • Fluorescein (FR) wird zuerst mit Isobutyrylanhydrid in Pyridin in Anwesenheit von Diisopropylamin reagiert, um ein Fluorescein zu produzieren, bei dem beide Ringhydroxylgruppen für die anschließende Linkeranfügung geschützt sind. Das hydroxygeschützte Fluorescein wird dann mit N-Hydroxylsuccinimid in DCC und Dichlormethan reagiert, gefolgt von der Zugabe von 1-Hydroxy-6-amino-hexan, um eine hydroxyterminierte FR-L-Gruppe zu produzieren. Diese Gruppe kann dann entweder mit Pyrophosphat reagiert werden, um die dNTPs an ihrer γ-Phosphatgruppe zu markieren oder um Aminosäuren zu markieren (siehe z. B. Ward et al., 1987; Engelhardt et al., 1993; Little et al., 2000; Hobbs, 1991).
  • Durch die Verwendung verschiedener fluoreszierender Tags an jedem dNTP können Tags so gestaltet werden, dass jedes Tag ein unterscheidbares Emissionsspektrum emittiert. Die Emissionsspektren können unterschieden werden durch die Produktion von Tags mit nicht überlappenden Emissionsfrequenzen – mehrfarbig – oder jedes Tag kann ein nicht überlappendes Spektralmerkmal wie eine einzigartige Emissionsbande, eine einzigartige Absorptionsbande und/oder ein einzigartiges Intensitätsmerkmal haben. Ein System, das ein unterscheidbares Tag an jedem dNTP verwendet, verbessert die Konfidenzwerte in Verbindung mit dem „Base Calling"-Algorithmus.
  • Das oben für Fluorescein dargestellte Syntheseschema ist auch an andere Farbstoffe anpassbar, wie Tetrachlorfluorescein (JOE) oder N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA). Typischerweise finden die Reaktionen mit gamma-Phosphat-Markierung in basischen wässrigen Lösungen und einem Carbodiimid wie DEC statt. Andere Fluorophormoleküle und dNTPs können ebenso modifiziert werden.
  • Synthese von an der Base markiertem dNTP
  • Obwohl das Markieren der dNTPs am beta- und/oder gamma-Phosphat bevorzugt wird, können die dNTPs auch an der Base und/oder den Zuckeranteilen markiert werden, während gleichzeitig ihre Polymerasereaktionsaktivität beibehalten wird. Die Modifikationsstellen werden vorzugsweise so gewählt, dass sie die Watson-Crick-Basenpaarung nicht stören. Ein verallgemeinertes Schema für die Basenmodifikation ist wie folgt:
    Figure 00750001
  • Polymeraseaktivitätsassays unter Verwendung eines fluoreszierend markierten Enzyms
  • Die Aktivitäten von Polymerasevarianten werden im Laufe der gesamten Polymeraseentwicklung überwacht. Die Polymeraseaktivität wird geprüft, nachdem ein Aminosäure-Kandidat zu Cystein mutiert wurde und nach dem Fluoreszenzmarkie ren des Cysteins. Der zum Überwachen der Fähigkeit der nativen Taq-Polymerase für den Einbau fluoreszierend markierter dNTPs angewendete Assay wird auch zum Screenen von Polymerasevarianten angewendet. Da die mutierten Taq-Polymerasen veränderte Aminosäuresequenzen haben, liefern die Assays Mutantencharakterisierungsdaten wie Wärmebeständigkeit, Fidelität, Polymerisationsgeschwindigkeit, Affinität zu modifizierten kontra natürlichen Basen.
  • Assays im Hinblick auf die Aktivität der mutierten Taq-Polymerase finden unter Bedingungen statt, die denen ähnlich sind, die zum Untersuchen des Einbaus von fluoreszierend markierten dNTPs in DNA-Polymere durch die native Taq-Polymerase verwendet werden. Zum Untersuchen der Aktivität mutierter Taq-Polymerase wird die gereinigte mutierte Taq-Polymerase in Polymerasereaktionspuffer mit einem 5'-32P-endmarkierten Primer/Einzelstrang-Template-Duplex und (einem) geeigneten markierten dNTP(s) inkubiert. Die Fähigkeit der Polymerase für den Einbau eines fluoreszierend markierten dNTP wird durch Prüfen der relativen Menge an Fluoreszenz in Verbindung mit dem erweiterten Primer auf einem ABI377 DNA-Sequenzer (für fluoreszierend markierte Basen), einem Phosphorimagersystem Fuji BAS1000 oder anderen geeigneten oder ähnlichen Detektoren oder Nachweissystemen überwacht. Dieser Assay wird dazu verwendet zu bestätigen, dass die mutierte Polymerase markiertes dNTP einfügt, und zu bestätigen, dass fluoreszierende Signaturen im Laufe des Baseneinbaus erhalten werden. Diese Assays verwenden einen endmarkierten Primer, das fluoreszierend markierte dNTP und die geeignete Base jenseits des fluoreszierenden Tags. Die Produkte werden dann nach Größe getrennt und im Hinblick auf eine Erweiterung analysiert. Die Reaktionen finden nach Bedarf entweder unter konstanten Temperaturreaktionsbedingungen oder thermozyklisch statt.
  • Primer-Extension-Assays
  • Die Fähigkeit von Taq-DNA-Polymerase, eine γ-Phosphat-dNTP-Variante einzufügen, wird unter Bedingungen geprüft, die denen ähnlich sind, die zum Untersuchen des Einzelbaseneinbaus durch eine fluoreszierend markierte DNA-Polymerase entwickelt wurden (siehe z. B. Furey et al., 1998). Diese Experimente demonstrieren, dass Polymerasen, die ein fluoreszierendes Tag tragen, nicht a priori eine reduzierte Polymerisationsaktivität haben. Die Erfinder haben demonstriert, dass die native Taq-Polymerase γ-markiertes dNTP einzeln oder kollektiv einfügt, um lange DNA-Ketten zu produzieren.
  • Zum Untersuchen der Polymeraseaktivität wird die Polymerase in Polymerasereaktionspuffer wie Taq-DNA-Polymerasepuffer von Promega Corporation aus Madison, Wisconsin mit einem 5'-32P oder einem fluoreszierend endmarkierten Primer-(TOP)/Einzelstrang-Template-(BOT-'X')-Duplex und (einem) angemessenen dNTP(s) wie in Tabelle V dargestellt inkubiert. Die Reaktionen finden je nach Wunsch oder Bedarf entweder bei konstanter Temperatur oder thermozyklisch statt. Die Reaktionsprodukte werden dann nach Größe getrennt und mit einem Phosphorimager- oder Fluoreszenznachweissystem quantifiziert. Die relative Effizienz des Einbaus wird für jedes markierte dNTP durch einen Vergleich mit seinem natürlichen Gegenstück bestimmt. TABELLE V
    Figure 00770001
  • In Tabelle V steht 'TOP' für den Primerstrang eines Assay-DNA-Duplex. Varianten des Template-Strangs werden durch 'BOT' repräsentiert. Das relevante Merkmal des DNA-Template steht hinter dem Bindestrich. BOT-T, BOT-C, BOT-G, BOT-A werden zum Beispiel zum Überwachen der Polymeraseeinbaueffizienz und Fidelität für Nucleotide oder Nucleotidvarianten von jeweils dA, dG, dC und dT verwendet.
  • Vorläufige Assays werden vor einer ausgiebigen Reinigung des markierten dNTP durchgeführt, um zu gewährleisten, dass die Polymerase nicht durch eine Chemikalie inhibiert wird, die mit dem markierten dNTP co-gereinigt wird, und zwar unter Verwendung des 'BOT-Sau'-Template. Das 'BOT-Sau'-Template wurde entworfen, um den Einbau von natürlichem dGTP vor markiertem dATP zu überwachen (d. h. eine positive Kontrolle für Polymeraseaktivität). Eine umfangreichere Reinigung findet dann für viel versprechende markierte Nucleotide statt. Ebenso werden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Polymerase die Erweiterung nach dem Einbau der markierten dNTPs, einzeln oder kollektiv, unter Verwendung des gleichen endmarkierten 'TOP'-Primers, des angemessenen 'BOT'-Primers, des fluoreszierend markierten dNTP und der angemessenen Base 3" des markierten Nucleotids fortsetzt. Die Produkte werden dann nach Größe getrennt und analysiert, um die relative Erweiterungseffizienz zu bestimmen.
  • Assay-Fidelität des γ-Phosphat-markierten Nucleotideinbaus
  • Der Taq-DNA-Polymerase fehlt 3'-5' Exonucleaseaktivität (Proofreading-Aktivität). Würde die bei der Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung verwendete Polymerase 3'-5' Exonucleaseaktivität besitzen, dann wäre die Polymerase in der Lage, eine weitere Base hinzuzufügen, um eine solche zu ersetzen, die durch die Proofreading-Aktivität entfernt würde. Diese neu hinzugefügte Base würde ein fluoreszierendes Signatursignal produzieren, das den Einbau einer zusätzlichen Base in das Template bestätigt, was in einer falsch identifizierten DNA-Sequenz resultieren würde, eine Situation, die die Einzelmolekülsequenzierungssysteme der vorliegenden Erfindung problematisch machen würde.
  • Übersteigt die Fehlerrate für den Einbau modifizierter dNTPs einen Grenzwert von etwa 1 Fehler in 100, dann lässt man die Sequenzierungsreaktionen vorzugsweise parallel laufen, wobei die optimale Zahl, die zum Produzieren von Sequenzinformationen mit einem hohen Konfidenzgrad für jeden „Base Call" erforderlich ist, anhand der Fehlerrate bestimmt wird. Höhere Fehlerraten erfordern mehr Parallelläufe, während geringere Fehlerraten weniger Parallelläufe erfordern. Bei einer ausreichend geringen Fehlerrate von im Allgemeinen weniger als 1 Fehler in 1000, vorzugsweise 1 Fehler in 5000 und insbesondere 1 Fehler in 10.000 eingebauten Basen, sind in der Tat keine Parallelläufe erforderlich. Insertionen oder Deletionen sind möglicherweise gravierendere Fehlerarten und rechtfertigen eine minimale Redundanz von 3 Wie derholungen je Probe. Würden 2 Reaktionen ablaufen, könnte man nicht sicher sein, welche korrekt ist. Folglich sind 3 Reaktionen für die von diesem System produzierte hohe Datenqualität notwendig.
  • Die BOT-Varianten-Template werden dazu verwendet, die Genauigkeit zu charakterisieren, mit der jedes γ-markierte dNTP durch eine konstruierte Polymerase eingebaut wird, wie in Tabelle V dargelegt ist. Oligonucleotide dienen als DNA-Template, wobei sich jedes lediglich hinsichtlich der Identität der ersten eingebauten Base unterscheidet. Experimente unter Verwendung dieser Templates werden zum Untersuchen der relativen Einbaueffizienz jeder Base und der Fähigkeit der Polymerase zur Unterscheidung zwischen den markierten dNTPs durchgeführt. Zuerst werden Experimente mit Polymerasevarianten unter Verwendung von Einzelstrang-DNA-Templaten mit relativ einfacher Sequenz durchgeführt. Eine große Anordnung von sequenzcharakterisierten Templates ist aus Dr. Hardins Labor an der University of Houston erhältlich, die eine Ressource von mehr als 300 gereinigten Templates beinhaltet. Eine Serie von Templates enthält z. B. polyA- oder polyT-Sequenzen variabler Länge. Zusätzliche Templates mit definierter Sequenz werden nach Bedarf konstruiert, was die Entwicklung der „Base-Calling"-Algorithmen erleichtert.
  • Assays im Hinblick auf die Fluoreszenzintensität
  • Ein direkter Nachweis der Polymeraseaktion am markierten dNTP wird durch Lösungsfluoreszenzmessungen unter Verwendung des SPEX 212 Instruments oder eines ähnlichen Instruments erhalten. Dieses Instrument wurde für die erfolgreiche Erfassung von Fluoreszenzsignalen von ANS-γ-Phosphat-markierten dNTPs verwendet, die durch Taq-Polymerase auf nanomolaren Konzentrationsniveaus eingebaut wurden. Das SPEX 212 Instrument beinhaltet eine 450 Watt Xenonlichtbogenquelle, Doppelemissions- und Doppelanregungsmonochromatoren, einen gekühlten PMT (kürzlich aufgerüstet auf eine simultane T-Format-Anisotropie-Datenerfassung) und Hi-Tech Stopped-Flow-Zubehör. Dieses Instrument kann eine Zunahme der Fluoreszenzintensität und/oder eine Veränderung bei Absorptionsspektren nach der Freisetzung des markierten Pyrophosphats von ANS-γ-Phosphat-markierten dNTPs erfassen, wie für durch Taq und RNA-Polymerase und Venom-Phosphodiesterase freigesetztes ANS-Pyrophosphat verifiziert wurde.
  • Es wurden und werden weiterhin Experimente durchgeführt, in denen γ-Phosphat-markiertes dATP oder TTP (Kontrolle: nicht modifiziertes dATP und TTP) in einem geeigneten Puffer (z. B. Puffer von Promega Corporation) in Anwesenheit von Polymerase (Kontrolle: kein Enzym) und DNA-Primer/Template [poly(dA).poly(dT)] (Kontrolle: keine Primer/Template-DNA) inkubiert wurden. Wenn die Polymerase ein markiertes dNTP einbaut, werden Veränderungen der Fluoreszenzintensität und/oder Frequenz, Absorption und/oder Emissionsspektren und DNA-Polymerkonzentration erfasst. Veränderungen bei diesen messbaren Eigenschaften in Abhängigkeit von der Zeit und/oder der Temperatur im Hinblick auf Versuchs- versus Kontrollküvetten ermöglichen eine eindeutige Bestimmung, ob eine Polymerase das γ-Phosphat-markierte dNTP einbaut. Anregung und Fluoreszenzemission können für jedes markierte dNTP auf der Basis von Veränderungen bei diesen messbaren Eigenschaften optimiert werden.
  • Entwicklung eines Einzelmolekülnachweissystems
  • Der Nachweis von Fluoreszenz von einzelnen Molekülen findet vorzugsweise unter Anwendung von Mikroskopie statt. Konfokale Scanning-Mikroskopie kann in diesem Einsatzgebiet angewendet werden, allerdings wird eine Nicht-Scanning-Methode bevorzugt. Zu Mikroskopen, die für die Erfassung von Fluoreszenzsignalen infolge von Polymeraseaktivität nützlich sind, gehört jeder beliebige Mikroskoptyp, wobei Ölimmersionsmikroskope bevorzugt werden. Die Mikroskope werden vorzugsweise in einer Umgebung mit kontrollierter Vibration und kontrollierten Temperaturschwankungen platziert und mit einer hochempfindlichen Digitalkamera ausgestattet. Zwar können viele verschiedene Kameras für die Aufnahme der Fluoreszenzsignale verwendet werden, doch werden verstärkte CCD-Kameras wie iPentaMax von Princeton Instruments bevorzugt.
  • Das Nachweisverfahren schließt das Belichten der Proben bei Wellenlängen ein, die ausreichen, um Tag-Fluoreszenz hervorzurufen, vorzugsweise in einem internen Reflexionsformat. Sind die fluoreszierenden Tags ein Donor-Akzeptor-Paar, dann muss die Anregungsfrequenz ausreichen, um den Donor anzuregen. Zwar kann jede beliebige Art von Lichtquelle verwendet werden, doch wird ein Laser als Lichtquelle bevorzugt. Es ist oft von Vorteil, dieselbe Probe mit mehreren Fluoreszenzemissionswellenlängen abzubilden, entweder in schneller Folge oder simultan. Bei der simultanen mehrfarbigen Abbildung wird ein Bildsplitter bevorzugt, damit dieselbe CCD alle Farbbilder simultan erfassen kann. Alternativ können mehrere Kameras verwendet werden, die jeweils die Probe durch Emissionsoptikfilter unterschiedlicher Wellenlängenspezifität betrachten.
  • Der Tag-Nachweis hängt in der Praxis natürlich von vielen Variablen ab, wie dem spezifischen verwendeten Tag sowie elektrischen, fluoreszierenden, chemischen, physikalischen, elektrochemischen, Massenisotop- oder anderen Eigenschaften. Die Einzelmolekül-Fluoreszenzabbildung ist unter Verwendung eines invertierten Epifluoreszenzmikroskops Nikon Diaphot TMD von Forschungsqualität möglich, das mit Laserbeleuchtung und einer empfindlicheren Kamera aufgerüstet ist. Ferner ist die Einzelmolekültechnologie eine gut entwickelte und handelsübliche Technologie, siehe z. B. Peck et al., 1989; Ambrose et al., 1994; Goodwin et al., 1997; Brouwer et al., 1999; Castro und Williams, 1997; Davis et al., 1991; Davis et al., 1992; Goodwin et al., 1997; Keller et al., 1996; Michaelis et al., 2000; Orrit und Bernard, 1990; Orrit et al., 1994; Sauer et al., 1999; Unger et al., 1999; Zhuang et al., 2000.
  • Das Epifluoreszenzmikroskop kann für die Anregung einer abklingenden Welle mit einem Argonionenlaser bei 488 nm nachgerüstet werden. Die Erfinder haben diese Beleuchtungsgeometrie zuvor in Assays für Nucleinsäurehybridisierungsstudien verwendet. Der existierende Aufbau wurde außerdem durch den Austausch der aktuellen CCD-Kamera durch eine verstärkte CCD-Kamera I-PentaMAX Generation IV (12-Bit; 512 × 512 Pixel) von Princeton Instruments verbessert, die in einer Vielzahl ähnlicher Einzelmolekülanwendungen erfolgreich eingesetzt wurde. Diese Kamera erreicht eine Quanteneffizienz von mehr als 45% im gesamten Emissionswellenlängenbereich der zu verwendenden Farbstoffe, und deutlich jenseits dieses Bereichs. Die vertikale Ausrichtung ihres existierenden Mikroskops tendiert dazu, Vibrationsprobleme zu minimieren, und das Instrument ist derzeit auf einem Antivibrationstisch montiert.
  • Ein bevorzugtes hochempfindliches Abbildungssystem basiert auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop Olympus IX70-S8F. Das System beinhaltet hintergrundarme Komponenten und ermöglicht die Erfassung von Einzelmolekül-Fluoreszenzbildern mit einer Geschwindigkeit von mehr als 80 Frames pro Sekunde, mit einer Quanteneffizienz zwischen 60 und 70% im Bereich der Emissionswellen längen der fluoreszierend aktiven Tags.
  • Beim Abbilden der Fluoreszenz mehrerer Einzelmoleküle wird bevorzugt, das Vorhandensein mehrerer Fluoreszenzemitter innerhalb eines Datenerfassungskanals wie einem einzelnen Pixel oder einem Pixel-Bin des Sichtfeldes der CCD oder eines anderen digitalen Abbildungssystems zu minimieren. Eine begrenzte Zahl von Datenerfassungskanälen wie Pixel ist in jeder beliebigen gegebenen digitalen Abbildungsapparatur verfügbar. Zufällig beabstandete, dicht positionierte Fluoreszenzemitter produzieren gewöhnlich eine erhöhte Fraktion von Pixeln oder Pixel-Gins, die mehrfach belegt und in der Datenanalyse problematisch sind. Mit zunehmender Dichte von Emittern im Sichtfeld nimmt die Zahl problematischer Datenkanäle zu. Zwar kann eine Mehrfachbelegung von unterscheidbaren Datenerfassungsregionen innerhalb des Sichtfeldes durch Reduzieren der Konzentration von Emittern in dem Sichtfeld reduziert werden, doch nimmt durch diese Verringerung der Konzentration von Emittern die Fraktion von Datenerfassungskanälen oder Pixeln zu, die überhaupt keinen Emitter sehen, so dass es zu einer ineffizienten Datenerfassung kommt.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Erhöhen und/oder Maximieren der Datenerfassungseffizienz schließt das Kontrollieren des Abstands zwischen Emittern (markierte Polymerasemoleküle) ein. Dieser Abstand wird auf verschiedene Art und Weise erreicht. Zunächst einmal können die Polymerasen auf einem Substrat immobilisiert werden, so dass sich nur eine einzige Polymerase innerhalb jeder Datenerfassungskanal- oder Pixelregion innerhalb des Sichtfeldes des Abbildungssystems befindet. Die Immobilisierung wird durch Verankern eines Auffangmittels oder einer Verknüpfungsgruppe erreicht, das/die chemisch an das Substrat angefügt wird. Auffang- oder Verknüpfungsmittel können auf nützliche Distanzen beabstandet werden, indem inhärent große Auffangmittel gewählt werden, indem sie mit Molekülen konjugiert oder an diese gebunden werden, die ihr sterisches Volumen oder ihr elektrostatisches Repulsionsvolumen erhöhen, oder durch Immobilisierung unter Bedingungen, die so gewählt werden, dass die Repulsion zwischen Polymerisationsmolekülanordnungen (z. B. geringe Innenstärke, um elektrostatische Repulsion zu maximieren) maximiert wird.
  • Alternativ kann die Polymerase mit assoziierten Proteinen assoziiert werden, die das sterische Volumen der Polymerase oder das elektrostatische Repulsionsvo lumen des Polymerisationssystems erhöhen, so dass sich die jeweiligen Polymerisationsmolekülanordnungen nicht näher als eine Distanz annähern können, die größer als die Datenkanalauflösungsgröße des Abbildungssystems ist.
  • Polymeraseaktivitätsassays unter Verwendung eines Einzelmolekülnachweissystems
  • Diese Assays werden im Wesentlichen wie die hierin beschriebenen Polymeraseaktivitätsassays durchgeführt. Wie oben erwähnt, beinhaltet der Hauptunterschied zwischen der Prüfung der Polymeraseaktivität für Screeningzwecke die Immobilisation irgendeines Teils der Polymerisationsanordnung, wie zum Beispiel der Polymerase, der Target-DNA oder eines Primer-assoziierten Proteins, an einem festen Träger, um die Betrachtung individueller Replikationsereignisse zu ermöglichen. Es steht eine Vielfalt von Immobilisationsoptionen zur Verfügung, wie unter anderem die kovalente und/oder nicht kovalente Anfügung von einer der Molekülanordnungen an einer Oberfläche wie einer organischen Oberfläche, einer anorganischen Oberfläche, in oder auf Nanoröhrchen oder anderen ähnlichen Nanostrukturen und/oder in oder auf poröse Matrizen. Zweck dieser Immobilisationstechniken ist es, spezifische Bereiche für die Erfassung der nachweisbaren Eigenschaft wie Fluoreszenz, NMR oder dergleichen bereitzustellen, wo der Abstand ausreicht, um Datenerfassungskanäle mit mehreren Emittern zu verringern oder zu minimieren. Folglich besteht ein bevorzugtes Datenerfassungsverfahren für die Einzelmolekülsequenzierung darin zu gewährleisten, dass die fluoreszierend markierten Polymerasen innerhalb des Sichtfeldes der Abbildungsapparatur so voneinander beabstandet sind, dass jeder Datenerfassungskanal die Aktivität von nur einer einzigen Polymerase sieht.
  • Analyse von Fluoreszenzsignalen vom Einzelmolekül-Sequenzierungssystem
  • Die vom Detektor generierten Rohdaten repräsentieren zwischen einem und vier zeitabhängigen Fluoreszenzdatenströmen, die Wellenlängen und Intensitäten umfassen: ein Datenstrom für jede beobachtete fluoreszierend markierte Base. Die Zuordnung von Basenidentitäten und Zuverlässigkeiten wird mit dem PHRED-Computerprogramm berechnet. Bei Bedarf schreiben die Erfinder Computerprogramme zur Interpretation der Datenströme mit partiellen oder überlappenden Daten. In solchen Fällen werden mehrere Versuche durchgeführt, so dass Konfidenzgrenzen jeder Basenidentität gemäß der Variation in den Zuverlässigkeitsindizes und den Schwierigkeiten in Verbindung mit dem Assemblieren von Sequenzstrecken von Fragmenten zugeordnet werden. Die Zuverlässigkeitsindizes repräsentieren die Güte der Anpassung zwischen den beobachteten Wellenlängen und Intensitäten von Fluoreszenz im Vergleich zu Idealwerten. Das Ergebnis der Signalanalysen ist eine lineare DNA-Sequenz mit assoziierten Sicherheitswahrscheinlichkeiten. Darüber hinaus werden die Daten bei Bedarf in einer Datenbank zur dynamischen Abfrage für Identifikations- und Vergleichszwecke gespeichert. Ein Suchbegriff (Sequenz) mit 6-10, 11-16, 17-20, 21-30 Basen kann anhand Referenzsequenzen verglichen werden, um perfekt abgeglichene Sequenzen oder solche mit einem gemeinsamen benutzerdefinierten Identitätsniveau schnell zu identifizieren. Es werden mehrere Versuche durchgeführt, so dass Konfidenzgrenzen jeder Basenidentität gemäß der Variation in den Zuverlässigkeitsindizes und den Schwierigkeiten in Verbindung mit dem Assemblieren von Sequenzstrecken von Fragmenten zugeordnet werden können. Die Zuverlässigkeitsindizes repräsentieren die Güte der Anpassung zwischen den beobachteten Wellenlängen und Intensitäten von Fluoreszenz im Vergleich zu Idealwerten. Das Ergebnis der Signalanalysen ist eine lineare DNA-Sequenz mit assoziierten Sicherheitswahrscheinlichkeiten.
  • INFORMATIK: ANALYSE VON FLUORESZENZSIGNALEN VON DEM EINZELMOLEKÜL-NACHWEISSYSTEM
  • Mit der Datenerfassung können Daten anhand partieller Informationen zur Gewinnung von Sequenzinformationen von mehreren Polymerasemolekülen zusammengestellt werden, um die Gesamtsequenz des Template oder des Targetmoleküls zu bestimmen. Eine wichtige Motivation für das Zusammenbringen von Ergebnissen, die mit mehreren Einzelmolekülen erhalten werden, ist die Tatsache, dass es nicht möglich ist, Daten von einem Einzelmolekül über einen unbeschränkten Zeitraum zu gewinnen. Bei einer typischen Farbstoff-Photobleichungseffizienz von 2·10–5 durchlauft ein typisches Farbstoffmolekül voraussichtlich 50.000 Anregungs-/Emissionszyklen vor der permanenten Photobleichung. Die Datenerfassung von einem bestimmten Molekül kann auch durch Intersystem Crossing in einen optisch inaktiven (in den Zeitplänen von Interesse) Triplettzustand unterbrochen werden. Selbst mit Vorsichtsmaßnahmen gegen Photobleichung sind folglich von einem be liebigen gegebenen Molekül erhaltene Daten zwangsläufig für Template-Sequenzen beträchtlicher Länge lückenhaft, und diese Subsequenzen werden gemeinsam verarbeitet, um die Gesamtsequenz eines Target-DNA-Moleküls abzuleiten.
  • Darüber hinaus ist es in bestimmten Fällen von Nutzen, Reaktionen mit Referenzkontrollen ähnlich wie bei Mikroarray-Assays durchzuführen. Ein Signalvergleich zwischen der Referenzsequenz und der Testprobe wird zum Identifizieren von Unterschieden und Ähnlichkeiten in Sequenzen oder Sequenzzusammensetzungen verwendet. Solche Reaktionen können zum schnellen Screenen von DNA-Polymeren verwendet werden, um den Homologiegrad zwischen den Polymeren zu bestimmen, um Polymorphismen in DNA-Polymeren zu bestimmen oder um Pathogene zu identifizieren.
  • BEISPIELE
  • Klonierung und Mutagenese von Taq-Polymerase
  • Klonierung
  • Der Bakteriophage-Lambda-Wirtsstamm Charon 35, der die volle Länge des Thermus aquaticus-Gens beinhaltet, das DNA-Polymerase I (Taq Pol I) kodiert, wurde von der Amerikanischen Typus-Kultursammlung (ATCC; Manassas, VA) bezogen. Taq Pol I wurde direkt von dem Lysat des infizierten E. coli-Wirts unter Verwendung der folgenden DNA-Oligonucleotidprimer amplifiziert:
    Taq Pol I vorwärts
    5'-gc gaattc atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc-3'
    Taq Pol I rückwärts
    5'-gc gaattc accctccttgg cggagcgc cagtcctccc-3'
  • Das unterstrichene Segment von jedem synthetischen DNA-Oligonucleotid repräsentiert konstruierte EcoRI-Restriktionsstellen, die dem Taq Pol I Gen unmittelbar vorangehen und folgen. Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung des oben beschriebenen Rückwärtsprimers und des folgenden Vorwärtsprimers brachte ein zusätzliches Konstrukt mit einer N-terminalen Deletion des Gens hervor:
    Taq Pol I_A293_trunk
    5'-aatccatgggccctggaggaggc cccctggcccccgc-3'
  • Das unterstrichene Segment entspricht einer konstruierten NcoI-Restriktionsstelle, wobei das erste Codon ein Alanin kodiert (ATG-Start, der einen Expressionsvektor repräsentiert, der der Ribosomenbindungsstelle folgt). Im Idealfall werden die Volllängen- und verkürzten Konstrukte des Taq Pol I Gens mit einer einzelnen EcoRI-Stelle (volle Länge) und in einen NcoI/EcoRI-verdauten pRSET-b Expressionsvektor ligiert. Der E. coli-Stamm JM109 wird als Wirt für alle In-vivo-Manipulationen der konstruierten Vektoren verwendet.
  • Mutagenese
  • Nach der Erzeugung eines geeigneten Konstrukts werden individuelle Cysteinmutationen an bevorzugten Aminosäurepositionen eingeführt, einschließlich der Positionen 513-518, 643, 647, 649 und 653-661 der nativen Taq-Polymerase. Die folgenden Aminosäurereste entsprechen den Aminosäuren zwischen Aminosäure 643 und 661, wobei xxx intervenierende Aminosäurereste in der nativen Polymerase repräsentiert:
    643-Ala xxx xxx xxx Phe xxx Val xxx xxx Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala-661
  • Überlappende Primer werden zum Einführen von Punktmutationen in das native Gen durch PCR-gestützte Mutagenese verwendet (unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase).
  • Komplementäre Vorwärts- und Rückwärtsprimer enthalten jeweils ein Codon, das die gewünschten mutierten Aminosäurereste kodiert. PCR unter Verwendung dieser Primer resultiert in einem „nicked", nicht methylierten, doppelsträngigen Plasmid, das die gewünschte Mutation enthält. Zum Entfernen der Template-DNA wird das gesamte PCR-Produkt mit DpnI-Restriktionsenzym (schneidet an methylierten Guanosinen in der Sequenz GATC) behandelt. Nach dem Verdau des Template-Plasmids wird das mutierte Plasmid transformiert und die Ligation findet in vivo statt.
  • Die folgenden synthetischen DNA-Oligonucleotid-Primer werden zur Mutagenese wie nachfolgend beschrieben verwendet, wobei die kleingeschriebenen Buch staben so modifiziert wurden, dass die gewünschte Cystein-Substitution an der angegebenen Position hervorgebracht wird. Mutanten werden dann per automatisierte Sequenzierung gescreent.
  • Austausch Alanin 643 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Ala643Cys_fwd 5'-C CAC ACG GAG ACC tgC AGC TGG ATG TTC GGC G-3' Taq Pol I_Ala643Cys-rev 5'-C GCC GAA CAT CCA CGA Gca GGT CTC CGT GTG G-3'
  • Austausch Phenylalanin 647 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Phe647Cys_fwd 5'-CC GCC AGC TGG ATG TgC GGC GTC CCC CGG GAG GCC-3' Taq Pol I_Phe647Cys-rev 5'-GGC CTC CCG GGG GAC GCC GcA CAT CCA CGT GGC GG-3'
  • Austausch Valin 649 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Val649Cys_fwd 5'-GCC AGC TGG ATG TTC GGC tgC CCC CGG GAG GCC GTG G-3' Taq Pol I_Val649Cys_rev 5'-C CAC GGC CTC CCG GGG Gca GCC GAA CAT CCA GCT GGC-3'
  • Austausch Glutaminsäure 652 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Glu652Cys_fwd 5'-GGC GTC CCC CGG tgc GCC GTG GAC CCC CTG ATG CGC-3' Taq Pol I_Glu652Cys_rev 5'-GCG CAT CAG GGG GTC CAC GGC gca CCG GGG GAC GCC-3'
  • Austausch Alanin 653 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Ala653Cys_fwd 5'-GGC GTC CCC CGG GAG tgC GTG GAC CCC CTG ATG CGC-3' Taq Pol I_Ala653Cys_rev 5'-GCG CAT CAG GGG GTC CAC Gca CTC CCG GGG GAC GCC-3'
  • Austausch Valin 654 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Val654Cys_fwd 5'-GTC CCC CGG GAG GCC tgt GAC CCC CTG ATG CGC-3' Taq Pol I_Val654Cys_rev 5'-GCG CAT CAG GGG GTC aca GGC CTC CCG GGG GAC-3'
  • Austausch Asparaginsäure 655 gegen Cystein
    • Taq Pol I_D655C_fwd 5'-CCC CGG GAG GCC GTG tgC CCC CTG ATG CGC CGG-3' Taq Pol I_D655C_rev 5'-CCG GCG CAT CAG GGG Gca CAC GGC CTC CCG GGG-3'
  • Austausch Prolin 656 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Pro656Cys_fwd 5'-CGG GAG GCC GTG GAC tgC CTG ATG CGC CGG GCG-3' Taq Pol I_Pro656Cys_rev 5'-CGC CCG GCG CAT CAG Gca GTC CAC GGC CTC CCG-3'
  • Austausch Leucin 657 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Leu657Cys_fwd 5'-GCC GTG GAC CCC tgc ATG CGC CGG GCG GCC-3' Taq Pol I_Leu657Cys_rev 5'-GGC CGC CCG GCG CAT gca GGG GTC CAC GGC-3'
  • Austausch Methionin 658 gegen Cystein
    • Tag Pol I_Met658Cys-fwd 5'-GCC GTG GAC CCC CTG tgt CGC CGG GCG GCC-3' Taq Pol I_Met658Cys_rev 5'-GGC CGC CCG GCG aca CAG GGG GTC CAC GGC-3'
  • Austausch Arginin 659 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Arg659Cys_fwd 5'-GCC GTG GAC CCC CTG ATG tGC CGG GCG GCC AAG ACC-3' Taq Pol I_Arg659Cys_rev 5'-GGT CTT GGC CGC CCG GCa CAT CAG GGG GTC CAC GGC-3'
  • Austausch Arginin 660 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Arg660Cys_fwd 5'-GAC CCC CTG ATG CGC tGc GCG GCC AAG ACC ATC-3' Taq Pol I_Arg660Cys_rev 5'-GAT GGT CTT GGC CGC gCa GCG CAT CAG GGG GTC-3'
  • Austausch Alanin 661 gegen Cystein
    • Taq Pol I_Ala661 Cys_fwd 5'-CCC CTG ATG CGC CGG tgc GCC AAG ACC ATC AAC-3' Taq Pol I_Ala661 Cys_rev 5'-GTT GAT GGT CTT GGC gca CCG GCG CAT CAG GGG-3'
  • Die resultierenden mutierten Taq-Polymerasen werden dann mit einem gewünschten atomaren oder molekularen Tag zum Markieren des Cysteins in der mutierten Struktur durch die SH-Gruppe des Cysteinrests zur Reaktion gebracht und im Hinblick auf den Einbau von nativem und/oder markiertem dNTP und die Einbaueffizienz gescreent. Die mutierten Polymerasen werden außerdem im Hinblick auf Fluoreszenzaktivität im Laufe des Baseneinbaus gescreent. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung außerdem mutierte Taq-Polymerase mit einem hinzugefügten Cysteinrest an einer oder mehreren der Stellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 513-518, 643, 647, 649 und 653-661. Nach dem Cysteinaustausch und der Verifikation der Polymeraseaktivität unter Verwendung der modifizierten dNTPs werden die mutierten Taq-Polymerasen mit einem Tag durch die SH-Gruppe des eingefügten Cysteinrests zur Reaktion gebracht.
  • Synthese modifizierter dNTPs
  • Synthese von (γ-AmNS)dATP
  • Nucleotidanaloga, die das an die γ-Phosphatbindung angefügte Fluorophor 1-Aminonaphtalen-5-sulfonat enthalten, wurden synthetisiert (J. Biol. Chem. 254, 12069-12073, 1979). dATP Analogon-(γ-AmNS)dATP wurde mit Verfahren synthetisiert, die von der Beschreibung von Yarbrough und Mitarbeitern für (γ-AmNS)ATP leicht abgeändert waren, mit einigen Modifikationen.
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von gamma-ANS-markiertem dATP, die in 4 graphisch dargestellt ist.
  • 1-Aminonaphthalen-5-sulfonsäure (447 mg, 2 mmol, 40 eq., von Lancaster) wurde zu 10 ml H2O gegeben und der pH-Wert wurde mit 1 N NaOH auf 5,8 eingestellt. Das unlösliche Material wurde mit einem Spritzenfilter entfernt, so dass eine Lösung erhalten wurde, die für diesen pH-Wert im Wesentlichen gesättigt war (~0,18 bis 0,2 M). 4 ml von 12,5 mM 5'Triphosphat-2'-desoxyadenosindinatriumsalz (0,05 mmol, 1 eq.) und 2 ml von 1 M 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimidhydrochlorid (DEC, 2 mmol, 40 eq., von Lancaster) wurden bei 22°C in ein Reaktionsgefäß gegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 10 ml der 1-Aminonaphthalen-5-sulfonatlösung eingeleitet und 2,5 h lang fortfahren gelassen. Der pH-Wert wurde durch die regelmäßige Zugabe von 0,1 N HCl zwischen 5,65 und 5,75 gehalten. Nach 2,5 h wurde die Reaktion auf 50 ml verdünnt und auf eine Lösung von 0,05 M Triethylammoniumbicarbonatpuffer (TEAB, pH ~7,5) eingestellt. Das Reaktionsprodukt wurde auf einer 50 ml DEAE-SEPHADEX Ionenaustauscher-(A-25-120)-Säule bei niedriger Temperatur chromatographiert, die mit 1,0 M wässrigem TEAB (100 ml) (~pH 7,5), 1,0 M wässrigem Natriumbicarbonat (100 ml) und 0,05 M wässrigem TEAB (100 ml) (~pH 7,5) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradient von wässrigem TEAB (~pH 7,5) von 0,05 bis 0,9 M eluiert. Es wurden etwa 10-ml-Fraktionen aufgefangen. Absorbanz- und Fluoreszenzprofile (UV 366 nm) der Fraktionen wurden nach einer geeigneten Verdünnung erhalten. Die fluoreszierende Fraktion eluierte bei ~0,7 M Puffer nach dem Peak des nicht in Reaktion getretenen dATP und wies eine leuchtend blaue Fluoreszenz auf. Die produkthaltigen Fraktionen wurden gepoolt, mit einem Lyophilisator getrocknet und zweimal mit H2O/Ethanol (70/30) co-verdampft. Der Rest wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 31P NMR (1H entkoppelt, 600 MHz, D2O, Me3PO4 externe Referenz, 293 K, pH 6,1) δ (ppm) –12,60, –14,10, –25,79. Die Referenzverbindung dATP brachte die folgenden Resonanzpeaks hervor: 31P NMR (dATP, Na+) in D2O 293 K, δ (ppm) –11,53 (γ), –13,92 (α), –24,93 (β).
  • Mit Diodenarray-UV-Nachweis-HPLC wurde die Fraktion mit dem gewünschten Produkt leicht durch die ausgeprägte Absorption der ANS-Gruppe bei 366 nm identifiziert. Ferner wurden 31P NMR-Spektren für das γ-Phosphat-markierte dATP und das reguläre dATP in einer wässrigen Lösung aufgezeichnet. Für jede Verbindung wurden drei charakteristische Resonanzen beobachtet, wodurch der Triphosphatanteil in dem γ-markierten dATP bestätigt wurde. Die kombinierten Analysen – 1H-NMR, HPLC und UV-Spektren – liefern unterstützende Informationen für die Bildung der korrekten Verbindung.
  • Das gleiche Syntheseverfahren wurde zum Herstellen von γ-ANS-Phosphat-modifiziertem dGTP, dTTP und dCTP angewendet.
  • Einbau von γ-Phosphat-markiertem dNTP durch Taq-Polymerase
  • Die folgenden Beispiele verdeutlichen, dass handelsübliche Taq-DNA-Polymerase die ANS-γ-Phosphat-dNTPs effizient einfügt, die Synthesen und die Charakterisierung wie oben beschrieben.
  • Das erste Beispiel illustriert den Einbau von ANS-γ-Phosphat-dATP, um erweiterte DNA-Produkte von Primer-Templaten zu produzieren. Die Reaktionen fanden in Extensionspuffer statt und die resultierenden radioaktiv markierten Produkte wurden auf einem 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgel nach Größe getrennt. Daten wurden mit einem Phosphorimagersystem erfasst. Mit Bezug auf 5 enthält Bahn 1 5'-radioaktiv markierte 'TOP'-Sonde in Extensionspuffer. Bahn 2 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM dGTP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-Sau'). Bahn 3 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM dATP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-Sau'). Bahn 4 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM ANS-γ-dATP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-Sau'). Bahn 5 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM dGTP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-T'). Bahn 6 enthält Überlauf von Bahn 5. Bahn 7 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM dATP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-T'). Bahn 8 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM ANS-γ-dATP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-T'). Bahn 9 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM dGTP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-3T'). Bahn 10 enthält Taq-DNA-Polymerase, 50 μM dATP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-3T'). Bahn 11 enthält Taq-DNA-Polymerase, ANS-γ-dATP, inkubiert mit einem DNA-Duplex (radioaktiv markierter TOP mit überschüssigem 'BOT-3T'). Bahn 12 enthält 5'-radioaktiv markierte 'TOP'-Sonde in Extensionspuffer. Bahn 13 enthält 5'-radioaktiv markierte 'TOP'-Sonde und Taq-DNA-Polymerase in Extensionspuffer. Oligonucleotidsequenzen sind in Tabelle V dargestellt.
  • Ein quantitativer Vergleich der Bahnen 1 und 4 zeigt den Nachweis einer sehr geringen unspezifischen Einzelbasenerweiterung beim Aufnehmen von ANS-γ-dATP in die Reaktion, allerdings sollte die erste eingebaute Base dGTP sein (die nicht zur Reaktion gegeben wurde). Eine quantitative Analyse der Bahnen 1 und 8 zeigt, dass beim Aufnehmen von ANS-γ-dATP in die Reaktion etwa 71% des TOP-Primers durch eine Template-gerichtete Einzelbase erweitert wurden, und die erste eingebaute Base dATP sein sollte. Somit fügt Taq-DNA-Polymerase γ-markierte Nucleotide ein. Ebenso wichtig für die Fähigkeit der Polymerase für den Einbau eines γ-markierten Nucleotids ist, das DNA-Polymer nach dem Einbau der modifizierten dATP erweitern zu können. Ein Vergleich zwischen Bahn 1 und Bahn 11 zeigte, dass ein DNA-Strang erweitert wurde, nachdem ein γ-markiertes Nucleotid eingefügt wurde. Der Einbau eines modifizierten Nucleotids war daher für die Polymeraseaktivität nicht von Nachteil. Es ist außerdem zu beachten, dass die Erweiterung des Primerstrangs durch den Einbau eines ANS-γ-Nucleotids von den Watson-Crick-Basenpaarungsregeln abhängig war. In der Tat wurde die Fidelität des Nucleotideinbaus wenigstens 15fach durch das Hinzufügen dieses Tags zum γ-Phosphat erhöht.
  • Das folgende Beispiel veranschaulicht die Synthese von erweiterten DNA-Polymeren unter Verwendung aller vier ANS-γ-Phosphat-markierten dNTPs. Die in diesen Reaktionen erzeugten Produkte wurden auf einem 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt, das Gel wurde getrocknet und nach dem Aussetzen der Fuji BAS1000 Abbildungsplatte über Nacht abgebildet. In 6 ist ein Bild von (A) dem tatsächlichen Gel, (B) dem beleuchteten Phosphorbild und (C) einem verstärkten Phosphorbild dargestellt. Es folgen Bahnenbeschreibungen für A, B und C: Bahn 1 ist die Kontrolle, die gereinigten 10-Basen-Primer enthält, der auf 11 und 12 Basen durch eine Template-vermittelte Zugabe von alpha-32P dCTP erweitert wurde. Bahn 2 beinhaltet den gleichen Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA bei 96°C 3 Minuten lang (zum Denaturieren des Templates) inkubiert wurde; die Reaktion wurde auf 37°C gebracht (um Primer-Template anzulagern), Taq-DNA-Polymerase und alle vier natürlichen dNTPs (jeweils 100 μM) wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Bahn 3 beinhaltet den gleichen markierten Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde, die Reaktion war [lacuna] DNA-Polymerase und alle vier gamma-modifizierten dNTPs (jeweils 100 μM) wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Bahn 4 beinhaltet die Kontrolle, gereinigten 10-Basen-Primer, der auf 11 und 12 Basen durch die Zugabe von alpha-32P-dCT erweitert wurde, lief parallel mit den Reaktion der Bahnen 5-8 zyklisch ab [sic]. Bahn 5 beinhaltet den gleichen 32P-markierten Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier natürlichen dNTPs (jeweils 100 μM) zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab. Bahn 6 beinhaltet den gleichen 32P-markierten Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA bei 96°C 3 Minuten lang inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier gamma-modifizierten dNTPs (jeweils 100 μM) zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab. Bahn 7 beinhaltet nicht gereinigten, 32P-markierten 10-Basen-Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier natürlichen dNTPs (jeweils 100 μM) zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab. Bahn 8 beinhaltet nicht gereinigten, 32P-markierten 10-Basen-Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier gamma-modifizierten dNTPs zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab. In den Reaktionen mit markierten dNTPs ist eine wesentliche Verringerung der Pyrophosphorolyse im Vergleich zu Reaktionen mit natürlichen Nucleotiden offensichtlich.
  • Das nächste Beispiel illustriert die Synthese von langen DNA-Polymeren unter Verwendung aller vier ANS-γ-Phosphat-markierten dNTPs. Jede Primer-Erweiterungsreaktion wurde in zwei Fraktionen aufgeteilt, wobei eine Fraktion durch ein 20%iges denaturierendes Gel (wie oben beschrieben) elektrophoretisiert wurde, während die andere durch ein 6%iges denaturierendes Gel elektrophoretisiert wurde, um die Produktlängen besser zu beurteilen. Das Gel wurde getrocknet und mit einer Fuji BAS1000 Abbildungsplatte (über Nacht) abgebildet. In 7 ist ein Bild von (A) dem tatsächlichen Gel, (B) einem belichteten Phosphorbild des tatsächlichen Gels und (C) einem verstärkten Phosphorbild des tatsächlichen Gels dargestellt. Es folgen Bahnenbeschreibungen für A, B und C: Bahn 1 beinhaltet 123 Marker, wobei Größenstandards auf der linken Seite der jeweiligen Felder angegeben sind. Bahn 2 enthält die Kontrolle, gereinigten 10-Basen-Primer, der auf 11 und 12 Basen durch eine Template-vermittelte Zugabe von alpha-32P dCTP erweitert wurde. Bahn 3 enthält den gleichen 32P-markierten Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C (zum Denaturieren des Template) inkubiert wurde; die Reaktion wurde auf 37°C gebracht (um Primer-Template anzulagern), Taq-DNA-Polymerase und alle vier natürlichen dNTPs (jeweils 100 μM) wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Bahn 4 enthält den gleichen 32P-markierten Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde auf 37°C gebracht, Taq-DNA-Polymerase und alle vier gamma-modifizierten dNTPs (jeweils 100 μM) wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Bahn 5 bein haltet die Kontrolle, gereinigten 10-Basen-Primer, der auf 11 und 12 Basen durch die Zugabe von alpha-32P-dCT erweitert wurde, lief parallel mit den Reaktionen der Bahnen 5-8 zyklisch ab [sic]. Bahn 6 enthält den gleichen 32P-markierten Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier natürlichen dNTPs (jeweils 100 μM) zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab. Bahn 7 enthält den gleichen 32P-markierten Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier gamma-modifizierten dNTPs (jeweils 100 μM) zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab. Bahn 8 enthält nicht gereinigten, 32P-markierten 10-Basen-Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier natürlichen dNTPs (jeweils 100 μM) zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab. Bahn 9 enthält nicht gereinigten, 32P-markierten 10-Basen-Primer, der mit doppelsträngiger Plasmid-DNA 3 Minuten lang bei 96°C inkubiert wurde; die Reaktion wurde 10 Minuten lang auf 37°C gebracht, während dieser Zeit wurden Taq-DNA-Polymerase und alle vier gamma-modifizierten dNTPs zugegeben. Die Reaktion lief 25 Mal bei 96°C 10 Sekunden lang, bei 37°C 1 Minute lang und bei 70°C 5 Minuten lang zyklisch ab.
  • Die Mehrzahl der Erweiterungsprodukte in dieser Reaktion sind im Hinblick auf sowohl natürliche als auch γ-modifizierte dNTPs mehrere hundert Basen lang, und ein wesentlicher prozentualer Anteil dieser Produkte ist zu groß, um in das Gel einzutreten. Folglich wird demonstriert, dass die gamma-Phosphat-markierten dNTPs von Taq-Polymerase verwendet werden, um lange DNA-Polymere zu erzeugen, die nicht markierte oder native DNA-Polymerketten sind.
  • Unterschiedliche Polymerasen reagieren unterschiedlich auf gamma-modifizierte Nucleotide
  • Die angegebenen Enzyme (Taq-DNA-Polymerase, Sequenase, HIV-1 reverse Transkriptase, T7 DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, Pfu DNA-Polymerase) wurden in dem vom Hersteller vorgeschlagenen Reaktionspuffer inkubiert, 50 μM des angegebenen Nucleotids bei 37°C 30 bis 60 Minuten lang, und die Reaktionsprodukte wurden durch Größentrennung durch ein 20%iges denaturierendes Gel analysiert.
  • Taq-DNA-Polymerase verwendet die gamma-modifizierten Nucleotide effizient, um erweiterte DNA-Polymere genauer zu synthetisieren (siehe 4-6).
  • Das Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I verwendet die gamma-modifizierten Nucleotide effizient, ist jedoch ohne die bei anderen Enzymen beobachteten extremen Fidelitätsverbesserungen, wie in 8 dargestellt.
  • Pfu DNA-Polymerase verwendet gamma-modifizierte Nucleotide nicht effizient und ist daher kein bevorzugtes Enyzm für das Einzelmolekül-Sequenzierungssystem wie in 9 dargestellt.
  • HIV-1 reverse Transkriptase verwendet die gamma-markierten Nucleotide effizient, mit signifikanten Fidelitätsverbesserungen wie in 10 dargestellt.
  • Polymerisationsaktivität ist in den von nativer T7 DNA-Polymerase erzeugten Reaktionsprodukten schwer nachzuweisen (aufgrund der Exonucleaseaktivität des Enzyms). Ihr gentechnisch modifiziertes Derivat Sequenase zeigt jedoch, dass die gamma-modifizierten Nucleotide effizient eingebaut werden und die Einbaufidelität im Vergleich zu nicht modifizierten Nucleotiden verbessert wird. 11 zeigt die Versuchsergebnisse für native T7 DNA-Polymerase und Sequenase.
  • Folglich ermöglicht eine verbesserte Fidelität infolge der Verwendung der gamma-modifizierten dNTPs der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf die Taq-Polymerase oder die HIV1 reverse Transkriptase eine Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung. Allerdings nutzen nicht alle Polymerasen gleichermaßen die gamma-modifizierten Nucleotide der vorliegenden Erfindung; im Speziellen fügen Klenow, Sequenase, HIV-1 reverse Transkriptase und Taq-Polymerasen die modifizierten Nucleotide der vorliegenden Erfindung ein, wohingegen die Pfu DNA-Polymerase die modifizierten Nucleotide der vorliegenden Erfindung nicht einzufügen scheint.
  • Verbesserte PCR-Erzeugung langer DNA-Sequenzen
  • Die Fidelität der Nucleinsäuresynthese ist ein begrenzender Faktor bei der Erzielung einer Amplifikation langer Targetmoleküle mittels PCR. Der Fehleinbau von Nucleotiden bei der Synthese von Primererweiterungsprodukten begrenzt die Targetlänge, die effizient amplifiziert werden kann. Der Effekt auf die Primererweiterung einer mit dem Template fehlgepaarten 3'-terminalen Base ist in Huang et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20: 4567-4573 beschrieben. Das Vorliegen falsch eingebauter Nucleotide kann in einer vorzeitig beendeten Strangsynthese resultieren, wodurch die Zahl der Template-Stränge für zukünftige Amplifikationsrunden reduziert und folglich die Amplifikationseffizienz für lange Targets reduziert wird. Selbst ein geringes Nucleotidfehleinbauniveau kann für Sequenzen von mehr als 10 kb kritisch werden. Die Daten in 4 zeigen, dass die Fidelität der DNA-Synthese unter Verwendung von gamma-markierten dNTPs für die native Taq-Polymerase verbessert wird, was längere DNA-Erweiterungen ermöglicht, ohne dass die Zugabe von Polymerasen mit 3'-5' Exonuclease- oder „Proofreading"-Aktivität nötig ist, die in dem von Cheng et al., U.S. Pat. Nr. 5,512,462 entwickelten Langstrecken-PCR-Verfahren erforderlich ist. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes PCR-System für die Erzeugung von PCR-amplifizierten DNA-Produkten mit erhöhter Erweiterungslänge bereit, das das Inkontaktbringen einer nativen Taq-Polymerase mit erfindungsgemäßen gamma-markierten dNTPs unter PCR-Reaktionsbedingungen beinhaltet. Die PCR-Produkte mit erweiterter Länge ergeben sich aus einer verbesserten Genauigkeit des Baseneinbaus, die von der Verwendung der gamma-modifizierten dNTPs der vorliegenden Erfindung herrührt.
  • Signalintensität und Reaktionskinetik geben Informationen zur Basenidentität
  • Die Signalintensitäten für jedes Nucleotid in dem erweiterten DNA-Strang werden zum Bestimmen, Bestätigen oder Unterstützen von Basenidentitätsdaten verwendet. In 12 entspricht die durchgezogene Linie Reaktionsprodukten, die produziert werden, wenn die vier natürlichen Nucleotide (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in der Synthesereaktion aufgenommen werden. Die gestrichelte bzw. unterbrochene Linie entspricht Reaktionsprodukten, die produziert werden, wenn proprietäre basenmodifizierte Nucleotide in der Reaktion aufgenommen werden. Wie deutlich zu sehen ist, beeinflussen Sequenzkontext und Basenmodifikation(en) die Reak tionsproduktintensität und/oder -kinetik, und diese Identifizierungsmuster werden in proprietäre „Base Calling"-Software eingebaut, um einen hohen Konfidenzwert für die Basenidentität an jeder sequenzierten Position zu erzeugen.
  • Die vorliegende Erfindung wurde zwar vollständig und komplett beschrieben, doch ist es zu verstehen, dass im Rahmen der angefügten Ansprüche die Erfindung in anderer Weise als speziell beschrieben umgesetzt werden kann. Die Erfindung wurde zwar mit Bezug auf ihre bevorzugten Ausgestaltungen offenbart, aber es wird für die Fachperson anhand der vorliegenden Beschreibung verständlich sein, dass Änderungen und Modifikationen möglich sind, ohne vom Umfang der oben beschriebenen und im Anschluss beanspruchten Erfindung abzuweichen.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
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Claims (15)

  1. Zusammensetzung, die ein Polymerisationsmittel, einschließlich eines molekularen Tags, der kovalent zu einer Stelle am Polymerisationsmittel gebunden ist, ein Monomer, einschließlich eines molekularen Tags, der kovalent zu einer beta-, gamma- oder terminalen Phosphatgruppe des Monomers gebunden ist, einen Primer und ein Template umfasst, wo mindestens einer der Tags ein Fluoreszenzvermögen aufweist, das vor, während und/oder nach jeder einer Sequenz von Monomereinfügungen aufgrund einer Wechselwirkung zwischen dem Tag des Polymerisationsmittels und dem Tag des Monomers eine Veränderung zeigt, wo die Sequenz von Monomereinfügungen einem Komplement einer entsprechenden Sequenz von Monomeren im Template entspricht.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Tag des Polymerisationsmittels einen Donorfluoreszenz-Tag umfasst, worin jede Monomerart einen unterschiedlichen Akzeptorfluoreszenz-Tag, der kovalent zu der beta-, gamma- oder terminalen Phosphatgruppe des Monomers gebunden ist, einschließt und worin das Fluoreszenzvermögen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen dem Polymerase-Tag und dem Tag an einem Einfügungsmonomer während jeder der Sequenz von Monomereinfügungen darstellt.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Polymerisationsmittel eine Polymerase oder Reverse Transkriptase darstellt.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die Polymerase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Taq-DNA-Polymerase I, T7-DNA-Polymerase, Sequenase und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli besteht.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die Reverse Transkriptase HIV-1-Reverse-Transkriptase umfasst.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin jedes der Monomere ein Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) umfasst und der Monomer-Tag kovalent zur beta- oder gamma-Phosphatgruppe von jedem dNTP gebunden ist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Tags Fluoreszenz-Tags umfassen und das Fluoreszenzvermögen eine Intensität und/oder Frequenz von emittiertem Fluoreszenzlicht umfasst.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Fluoreszenzvermögen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) darstellt, wo entweder der Monomer-Tag oder der Polymerase-Tag einen Donor umfasst und der andere Tag einen Akzeptor umfasst und wo FRET auftritt, wenn sich die zwei Tags in nächster Nähe befinden.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Polymerase Taq-DNA-Polymerase I mit einem Tag umfasst, der mit einer Aminosäure an einer bestimmten Aminosäureposition der Taq-DNA-Polymerase I verbunden ist, wo die Aminosäureposition aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 513-518, 643, 647, 649 und 653-661 der SEQ.-ID-Nr. 11 besteht, wo der Tag ein Fluoreszenzmolekül umfasst.
  10. Sequenzierungsgerät zum Detektieren von Einfügungsvorgängen auf einer Einzelmolekülebene, das Folgendes umfasst: eine erste Kammer, die mindestens einen Replikationskomplex einschließt, der eine Polymerase mit einem Donorfluoreszenz-Tag, der kovalent zu einer Stelle der Polymerase gebunden ist, einen Primer und ein Template, darin enthalten, umfasst; eine zweite Kammer, die Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP)-Arten für die Polymerase einschließt, von denen einige oder alle molekulare Tags aufweisen, die kovalent zu einer beta-, gamma oder terminalen Phosphatgruppe davon gebunden sind, und einen Kanal, der die Kammern verbindet, wo die dNTP-Tags Akzeptorfluorophore umfassen und wo Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen dem Polymerase-Tag und dem Tag eines Einfügungs-dNTP während jeder einer Sequenz von dNTP-Einfügungen auftritt und wo die Sequenz von Monomereinfügungen einem Komplement einer entsprechenden Sequenz von Monomeren im Template entspricht; einen Detektor, der zur Detektion von Fluoreszenzlicht, das durch jedes FRET-Auftreten an jedem Replikationskomplex erzeugt wird, eingestellt ist, um FRET-Vorgänge für jeden Replikationskomplex in einem Sichtbereich der CCD-Kamera zu erzeugen und die FRET-Vorgänge in eine Sequenz von eingefügten dNTP für jeden Replikationskomplex umzuwandeln.
  11. Gerät nach Anspruch 10, worin die zweite Kammer vier Kammern umfasst, eine für jede dNTP-Art, und jede dNTP-Art einen unterschiedlichen Akzeptorfluorophor-Tag einschließt.
  12. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren auf einer Einzelmolekülebene, das Folgendes umfasst: Inkontaktbringen eines Nukleinsäure-Templates, das eine unbekannte Sequenz von Nukleotiden oder Nukleotidanaloga umfasst, mit der sequenzierenden Zusammensetzung, die eine Polymerase mit einem Fluoreszenzdonor, der kovalent zu einer Stelle der Polymerase gebunden ist, einen Primer und Monomere für die Polymerase umfasst, wobei jedes Monomer einen einzigartigen Fluoreszenzakzeptor hat, der kovalent zu einem beta-, gamma- oder terminalen Phosphat davon gebunden ist, wo die Polymerase, der Primer und das Template einen Replikationskomplex bilden. Anregen des Fluoreszenzdonors mit einem Licht von einer Anregungslichtquelle; Detektieren von emittiertem Fluoreszenzlicht vom Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen dem Fluoreszenzdonor der Polymerase und einem Fluoreszenzakzeptor des Einfügungsmonomers während jeder einer Sequenz von Monomereinfügungen; und Umwandeln der Sequenz von Monomereinfügungen, um eine entsprechende Sequenz von Monomeren im Template abzulesen.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Polymerase, das Template oder der Primer des Replikationskomplexes an einem Träger immobilisiert ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Polymerase, das Template oder der Primer des Replikationskomplexes in einer Region, einem Bereich, einer Vertiefung, einer Furche oder einem Kanal an einem Träger immobilisiert ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, das weiter eine Vielfalt von Polymerasen mit einem Fluoreszenzdonor, der kovalent zu einer Stelle der Polymerase gebunden ist, Primer und Templates umfasst, um eine Vielfalt von Replikationskomplexen zu bilden.
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