CN111108120A - 抗人类血管内皮生长因子受体的抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种抗体或其抗原结合片段，其与人类第二型血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR‑2)结合。本发明亦关于一种于一需要个体中抑制VEGFR‑2调控的讯息传递的方法、一种治疗患有由VEGFR‑2的活性及/或讯息传递所导致或与其相关联疾病及/或失调的个体的方法、一种治疗患有肿瘤的个体的方法、一种于一需要个体中抑制内皮细胞的细胞增生的方法及一种侦测一样品中的人类第二型血管内皮生长因子受体的方法。

Description

抗人类血管内皮生长因子受体的抗体及其应用

技术领域

本发明是关于一种抗体或其抗原结合片段及其应用，所述抗体或其抗原结合片段针对人类血管内皮生长因子受体(VEGFR)具特异性。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的讯息传递路径的功能即是促进血管新生，血管新生是指由原有血管形成新的微血管。血管新生的调控异常和许多疾病的致病机转有关，同时也是多种癌症的一个特征。参与此讯息传递最主要的即是血管内皮生长因子家族的蛋白质及其受体，此路径的活化会引发复杂的讯息传递网络，促进血管内皮细胞的生长、移动和存活。此讯息传递路径被认为与肿瘤血管新生有密切关连，因此抑制血管内皮生长因子讯息路径为肿瘤血管新生的重要调控点。

血管内皮生长因子包括一群序列高度保守的同源(homologous)双体醣蛋白(dimeric glycoprotein)，以双硫键连结二条分子量各为24kDa的单链分子后才具有生物活性。目前已知的血管内皮生长因子家族成员有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D与胎盘生长因子(placenta growth factor，PlGF)，其中VEGF-A最早被发现且研究最为透彻，其在血管新生中扮演关键性的角色。

当血管内皮生长因子与血管内皮生长因子受体(VEGF receptor，VEGFR)结合时，血管内皮生长因子受体会形成双体，并互相磷酸化。血管内皮生长因子受体的细胞外结构域共有七个似免疫球蛋白结构域(Ig-like domains)，大致来说，第一至第三结构域负责受体与配体的结合，而第四至第七结构域则负责受体间双体化，并导致磷酸化及下游的讯息传递。

血管内皮生长因子受体属于酪胺酸激酶(tyrosine kinase，TK)家族的成员的一，在细胞讯息传递过程中扮演极重要的角色，可以将细胞外诱导细胞生长、繁殖、以及抗凋亡的讯号传递到细胞内。血管内皮生长因子受体分为三类，分别为VEGFR-1(或称flt-1)、VEGFR-2(或称KDR/flk-1)与VEGFR-3(或称flt-4)。VEGF-A会和VEGFR-1及VEGFR-2结合，两种受体均表达于血管内皮细胞，而血管内皮生长因子的讯号最主要是经由第二型血管内皮生长因子受体传达。第一型血管内皮生长因子受体与配体的结合能力较第二型血管内皮生长因子受体强了十倍以上，但却只有相对较弱的激酶活性。第三型血管内皮生长因子受体则主要表达于淋巴内皮细胞上。

目前已知肿瘤的血管新生除了由原有的周边血管内皮细胞增生形成外，也可藉由VEGFR-2的调控吸引血管内皮母细胞移动至肿瘤内或其周边，再分化为血管内皮细胞。由于和血管内皮生长因子有关的血管新生只发生于伤口修复和妇女生理周期时，阻断血管内皮生长因子讯息路径对于正常生理作用的影响有限，因此抑制血管内皮生长因子讯息路径便成为抑制肿瘤血管新生的重要调控点，进而导致肿瘤细胞死亡。血管内皮生长因子已知在多种实体肿瘤中有过度表达的情形，如大肠直肠癌、乳癌、前列腺癌、肺癌等。

因此，仍需发展新的方法，以阻断血管内皮生长因子的信息传递路径。

发明内容

本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其与人类第二型血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)或一人类第二型血管内皮生长因子受体片段结合。本发明的抗体可用于抑制VEGFR-2所调控的讯息传递，及治疗由VEGFR-2的活性或讯息传递所导致或与其相关联疾病或失调。本发明的抗体亦可用于抑制内皮细胞的细胞增生。

本发明提供一种于一需要个体中抑制VEGFR-2调控的讯息传递的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种治疗患有由VEGFR-2的活性或讯息传递所导致或与其相关联疾病或失调的个体的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种治疗患有肿瘤的个体的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种于一需要个体中抑制内皮细胞的细胞增生的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种侦测一样品中的人类第二型血管内皮生长因子受体的方法，包含将所述样品与请前述的抗体或其抗原结合片段接触。

本发明将于下述段落中详述，本发明的其他特征、目的及优点可见于实施方式及申请专利范围中。

图式简单说明

图1展示本发明抗体对小鼠VEGFR-2、人类VEGFR-1或VEGFR-3的结合亲和力分析的ELISA结果。

图2展示本发明抗体的结合域定位(结构域1至结构域3及结构域4至结构域7)的ELISA结果。

图3展示本发明抗体的结合域定位的ELISA结果。

图4展示本发明抗体的抗原决定基定位的ELISA结果。

图5展示本发明抗体的HUVEC增生抑制分析。

图6藉由流式细胞测量术展示本发明抗体的抗体内在化至HUVEC中的结果。

图7展示藉由DeltaVision显微镜成像系统观测的抗体内在化结果。

图8展示根据本发明的抗体-药物接合物(ADC)的尺寸排阻层析分析结果。

图9展示根据本发明的抗体-药物接合物的电泳分析结果。

图10藉由流式细胞测量术展示根据本发明的ADC抗体内在化至HUVEC中的结果。

图11展示本发明的ADC的HUVEC增生抑制分析。

图12展示根据本发明的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)藉由流式细胞测量术的定量分析。

图13展示根据本发明的嵌合抗原受体T细胞的细胞毒性分析。

图14展示用放射性同位素标记根据本发明的抗体的效率。

图15展示藉由放射线标记根据本发明的抗体在HT-29异种移植小鼠的NanoSPECT/CT中的肿瘤侦测的结果。

图16展示人源化、小鼠及人类抗体的VL片段的比对。M：322A6；Hd：Hu322B1HdH。

图17展示人源化、小鼠及人类抗体的VH片段的比对。M：322A6；Hu：人类模板IGHV1-46*01F；HuB1：Hu322B1HdH。

具体实施方式

本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其与人类第二型血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)或一人类第二型血管内皮生长因子受体片段结合。

详言的，本发明的抗体或其抗原结合片段与人类第二型血管内皮生长因子受体或其片段中的一抗原决定基特异性结合，其中所述人类第二型血管内皮生长因子受体具有如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，且所述抗原决定基包含：

SEQ ID NO：1中第606位点的白胺酸、第607位点的天冬胺酸、第647位点的精胺酸、第648位点的离胺酸及第649位点的苏胺酸；或

SEQ ID NO：1中第711位点的丝胺酸、第716位点的离胺酸、第717位点的天门冬胺酸及第725及726位点的精胺酸。

本发明的抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)，或可仅包含一个抗原结合部分(例如Fab、F(ab')2或scFv片段)，并可加以修饰以影响其功能。

本发明的抗体或其抗原结合片段与VEGFR-2或其片段中的一抗原决定基特异性结合。VEGFR-2，或称KDR或flk-1，是为一种血管内皮生长因子的受体，且藉由与配体(ligand)结合时，其形成双体并互相磷酸化而活化。VEGFR-2的细胞外区域共有七个似免疫球蛋白结构域(Ig-like domains)，大致来说，第一至第三结构域负责受体与配体的结合，而第四至第七结构域则负责受体间双体化，并导致磷酸化及下游的讯息传递。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段结合至VEGFR-2的细胞外区域的第六至第七结构域。

本发明包含一种抗VEGFR-2抗体及抗原结合片段，其以高度亲和力结合至单体或双体化的VEGFR-2分子。

于本发明一优选实施例中，VEGRF-2具有如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；VEGFR-2的细胞外区域的第六结构域具有如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；VEGFR-2的细胞外区域的第七结构域具有如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。

本发明所属技术领域中具通常知识者已知许多技术可用于确定一个抗体是否与一个多肽或蛋白内的“一个或多个胺基酸特异性结合”。示范性技术包括，例如Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,N.Y.)中所述的惯用交联-阻断分析、丙胺酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol248:443-463)，以及肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的抗原决定基切除、抗原决定基提取和化学修饰的方法(Tomer,2000,Protein Science 9：487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体特异性结合的胺基酸的另一方法是用质谱检测的氢/氘交换。总的说来，氢/氘交换法涉及用氘标记所关注的蛋白，随后使抗体与氘标记的蛋白结合。然后，将所述蛋白/抗体复合物转移至水中，除了受抗体保护的残基(其维持氘标记状态)，让所有残基均发生氢-氘交换。在抗体解离后，进行标靶蛋白的蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示与抗体相互作用的特定胺基酸对应的那些氘标记的残基。参阅例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry267(2):252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。

于本发明一优选实施例中，所述抗原决定基包含SEQ ID NO：1中第606位点的白胺酸、第607位点的天冬胺酸、第647位点的精胺酸、第648位点的离胺酸及第649位点的苏胺酸。

于本发明另一优选实施例中，所述抗原决定基包含SEQ ID NO：1中第711位点的丝胺酸、第716位点的离胺酸、第717位点的天门冬胺酸及第725及726位点的精胺酸。

本发明另包含一种抗VEGFR-2抗体，其特异性结合至相同抗原决定基。类似地，本发明亦包含一种抗VEGFR-2抗体，其与此处所述的任何特定范例抗体竞争结合VEGFR-2。

使用本领域内周知的惯用方法，可以轻易地确定一种抗体是否与本发明的对照抗EGFR抗体一样，与同样的抗原决定基结合，或在结合过程中竞争。例如，为了确定一种试验抗体是否与本发明的对照抗VEGFR-2抗体一样与同样的抗原决定基结合，可让所述对照抗体与一个VEGFR-2蛋白(例如所述VEGFR-2胞外结构域的一个可溶性部分或细胞表面表达的VEGFR-2)结合。然后，评估试验抗体与所述VEGFR-2分子结合的能力。如果所述试验抗体在与对照抗VEGFR-2抗体饱和结合的后能够与VEGFR-2结合，就可得出结论，所述试验抗体和对照抗VEGFR-2抗体分别与不同的抗原决定基结合。在另一方面，如果所述试验抗体在与对照抗VEGFR-2抗体饱和结合的后不能与VEGFR-2分子结合，则所述试验抗体的抗原决定基就可能与本发明的对照抗VEGFR-2抗体所结合的抗原决定基相同。然后可进行其他常规的实验(例如肽突变和结合分析)，以确定所观察到试验抗体无法结合的原因，实际上是由于与对照抗体所结合的抗原决定基相同，或是空间位阻(或另一现象)而导致。这类实验可采用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞计数法或本领域内可供利用的任何其他定量或定性的抗体结合分析法来完成。按照本发明的某些实施例，如果例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的抗体对另一抗体结合的抑制作用达至少50％，但优选的是75％、90％或甚至99％(如竞争结合分析所测量)，则两种抗体就是与同一个(或重迭的)抗原决定基结合。或者，如果抗原中减弱或消除一个抗体结合的几乎所有胺基酸突变都能减弱或消除另一个抗体的结合，则可认为两个抗体与相同的抗原决定基结合。若能减弱或消除一个抗体的结合的胺基酸突变，仅有一部分能减弱或消除另一个抗体的结合，则可认为两个抗体具有“重迭的抗原决定基”。

为了确定一抗体是否与对照抗VEGFR-2抗体在结合过程中竞争，可在两个方面上实施上述结合方法：第一个方面，在饱和条件下让对照抗体与一个VEGFR-2蛋白(例如所述VEGFR-2胞外结构域的可溶部分或细胞表面表达的VEGFR-2)结合，随后评估所述试验抗体与VEGFR-2分子的结合情况。第二个方面，在饱和条件下让试验抗体与VEGFR-2分子结合，然后评估对照抗体与所述VEGFR-2分子的结合。如果在这两个方向只有第一个(饱和)抗体能够与VEGFR-2分子结合，那就可以得出结论，所述试验抗体与对照抗体在与VEGFR-2结合过程中竞争。如同本领域习知技艺人士所能理解的，与对照抗体在结合过程中竞争的抗体，其抗原决定基未必与对照抗体所结合的抗原决定基相同，但可能与一重迭或邻近的抗原决定基结合，而在空间上阻断所述对照抗体的结合。

本文所用的术语“抗体”意为包含至少一个互补决定区(complementaritydetermining region，简称CDR)的任何抗原结合分子或分子复合体，所述互补决定区特异性地与一个特定的抗原(如VEGFR-2)结合或与其相互作用。术语“抗体”包括由四条多肽链，即两条重(H)链和两条轻(L)链，以双硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子，及其多聚体(例如IgM)。每条重链均包含一个重链可变区(heavy chain variable region，本文简称HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包含三个域，CH1、CH2和CH3。每条轻链均包含一个轻链可变区(本文简称LCVR或VL)和一个轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个域(CL1)。VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDRs)的高变异区域，以及散布于其中的被称为框架区(frame work regions，FR)的保守区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从胺基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的另一些实施例中，抗VEGFR抗体(或其抗原结合部分)的FRs可能与人类种系序列相同，或可能经过天然或人工的修饰。一个胺基酸共有序列可根据两个或两个以上CDR的并排分析而予以定义。

本文所用的术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。本文所用的抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等术语，包括与一个抗原特异性结合而形成复合体的任何天然产生的、以酶促方式获得的、合成的或基因改造的多肽或醣蛋白。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区或恒定区的DNA的操纵和表达的重组基因改造技术，例如从完整的抗体分子产生。这样的DNA是已知及/或容易从例如商业来源、DNA数据库(包括例如噬菌体-抗体数据库)获得，或可为合成而得。所述DNA可被定序，且可以化学方法或分子生物学技术加以操纵，例如将一个或多个可变区及/或恒定区排列成一种合适的构型，或引入密码子、产生半胱胺酸残基、修饰、添加或删除胺基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟所述抗体高变区(例如：一个孤立的互补决定区CDR，如一CDR3胜肽)或一个受限制的FR3-CDR3-FR4胜肽的胺基酸残基组成的最小识别单位。其他工程分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三聚抗体、四聚抗体、微型抗体、奈米抗体(例如单价奈米抗体、二价奈米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)，以及鲨鱼可变IgNAR域，也包括在本文所用的“抗原结合片段”这一表述中。

一个抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变区。可变区可以是任何尺寸或具有任何胺基酸组成，且通常包含至少一个CDR，其邻近或位于一或多个框架序列的框架内。在含有与VL区相关联的VH区的抗原结合片段中，所述VH区和VL区的相对位置可处于任何适宜的排列。例如，所述可变区可为二聚化且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，一个抗体的抗原结合片段可含有一个单一的VH区或VL区。

在某些实施例中，一个抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定区共价连接的至少一个可变区。在本发明的抗体的抗原结合片段内可发现的可变区和恒定区的非限制性示范性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变区和恒定区的任何构型中，包括上述任何示范性构型，所述可变区和恒定区可直接地相互连接或可藉由一个完全的或部分的铰链区或连接区连接。一个铰链区可含有至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多的)胺基酸，其在一个单一肽分子中相邻的可变区及/或恒定区的间形成一种具弹性或半弹性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含上述可变区和恒定区的任何构型的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)，所述可变区和恒定区以非共价键相互连接及/或与一或多个单一的VH区或VL区(例如通过双硫键)连接。

如同完整的抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。一个抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变区，其中每个可变区能够特异性地与另一个抗原或同一抗原的不同抗原决定基结合。对于任何多特异性抗体形式，包括本文所揭露的示范性双特异性抗体形式，均可用本领域内可利用的惯用技术，使其可可用于涉及本发明的抗体的抗原结合片段的用途。

优选地，根据本发明的所述抗体或其抗原结合片段为一哺乳类抗体。

本文所用的术语“哺乳类抗体”意在包括含有衍生自哺乳类种系(germline)免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的哺乳类抗体可包括非由哺乳类种系免疫球蛋白序列编码的胺基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变，或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如可在CDR中，尤其是在CDR3中包括上述胺基酸残基。

本文所用的术语“重组哺乳类抗体”意在包括所有以重组方法制备、表达、产生或分离的哺乳类抗体，例如用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(将在下文进一步描述)，从重组的、组合的人抗体库分离的抗体(将在下文进一步描述)，从人类免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或者以任何其他涉及将哺乳类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列上的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组哺乳类抗体含有衍生自哺乳类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施例中，这类重组哺乳类抗体经受体外诱变(或当使用人类Ig序列转基因动物时，经受体内体细胞诱变)，从而使得所述重组抗体的VH区和VL区的胺基酸序列成为这样的序列：它们虽然衍生自人类种系VH序列和VL序列并与人类种系VH序列和VL序列序列有亲缘关系，但也许并不天然地存在于所有的哺乳类种系体内抗体的中。

哺乳类抗体，例如人类抗体，具有两种与铰链异质性有关的形式。在第一种形式中，一个免疫球蛋白分子包含一个约150-160kDa的稳定的四链构建物，其中两个二聚体由链间重链双硫键连接在一起。在第二种形式中，所述二聚体不是由链间双硫键连接在一起，而是形成由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。分离这些形式极为困难，甚至在亲和纯化的后也是如此。

本文披露的抗VEGFR-2抗体与衍生所述抗体的相应种系序列相比，在重链和轻链可变区的框架区及/或CDR区可包含一个或多个胺基酸的取代、插入及/或缺失。通过将本文披露的胺基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可获得的种系序列相比，可以轻易地证实这类突变。本发明包括衍生自本文所披露的任何胺基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一或多个框架区及/或CDR区内的一或多个胺基酸突变为衍生所述抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一个哺乳类种系序列的相应残基，或突变为相应的种系序列残基的保守胺基酸取代(这类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本发明所属技术领域中具通常知识者从本文披露的重链和轻链可变区序列开始，能够轻易地产生许多包含一个或多个单个种系突变或其组合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施例中，上述VH及/或VL区内的所有框架及/或CDR残基均回复突变为在衍生所述抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施例中，只有某些残基才回复突变为原始种系序列，例如，只有FR1的最先8个胺基酸或FR4的最后8个胺基酸中发现突变残基，或只有CDR1、CDR2或CDR3中发现突变残基。在其他某些实施例中，一或多个框架及/或CDR残基回复突变为一个不同种系序列(即一个不同于最初衍生所述抗体的种系序列的种系序列)的相应残基。此外，本发明的抗体可在框架区及/或CDR区内含有两个或多个突变的任何组合，例如，其中某些残基分别突变为一特定种系序列的相应残基，而某些其他不同于原始种系序列的残基则保持不变或突变为一个不同种系序列的相应残基。一旦获得含有一或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的后，可轻易地测试其一或多种所需的特性，例如改善的结合特异性、提高的结合亲和力、改善或增强的拮抗性或促进的生物学特性(视情况而定)、下降的免疫原性等。以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段均包括在本发明范围内。

本发明还包括含有本文所披露的任何VH、VL及/或CDR胺基酸序列的变异体的抗VEGFR-2抗体，所述变异体含有一个或多个保守的胺基酸取代。例如，本发明包括含有VH、VL及/或CDR胺基酸序列的抗VEGFR-2抗体，所述胺基酸序列相对于本文所披露的任何VH、VL及/或CDR胺基酸序列，含有例如10个或以下、8个或以下、6个或以下、4个或以下等保守的胺基酸取代。

术语“实质的相同性”或“实质上相同”，当指一个核酸或其碎片时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，以下述任何已知的序列同一性算法如FASTA、BLAST或Gap测量，至少有95％的核苷酸序列同一性，优选的是至少有96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基相同性。在某些情况下，一个与参照核酸分子实质上相同的核酸分子，可编码具有与所述参照核酸分子编码的多肽相同或实质上类似的胺基酸序列的多肽。

当应用于多肽时，术语“实质的相似性”或“实质上相似”意为两个肽序列用诸如GAP或BESTFIT等程序的默认间隙权重排列达到最佳比对时，两者至少有95％的序列同一性，更佳的是至少有98％或99％的序列同一性。优选的是，不相同的残基位置的差别是为保守性的胺基酸取代。“保守性的胺基酸取代”是指，一个胺基酸残基被另一个具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)侧链(取代基团)的胺基酸残基所取代。一般而言，保守性的胺基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的胺基酸序列相互的间的差别仅在于某些保守性取代的情况中，可将序列同一性百分比或相似性程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校正。进行这种调整的方法是本领域习知技艺人士众所周知的。含有化学性质相似侧链的胺基酸类别的实例包括：(1)脂肪族侧链：甘胺酸、丙胺酸、缬胺酸、白胺酸和异白胺酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝胺酸和苏胺酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺酸和麸酰胺酸；(4)芳香族侧链：苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；(5)碱性侧链：离胺酸、精胺酸和组胺酸；以及(6)酸性侧链：天冬酰胺酸和麸酰胺酸，以及(7)含硫侧链：半胱胺酸和甲硫胺酸。优选的保守性胺基酸取代基是：缬胺酸-白胺酸-异白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、离胺酸-精胺酸、丙胺酸-缬胺酸、麸酰胺酸-天冬酰胺酸，以及天冬酰胺酸-麸酰胺酸。或者，保守性取代是Gonnet et al.(1992)Science 256:1443-1445中所披露的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihood matrix)中任何具有非负值的变化。

多肽的序列相似性，也称为序列同一性，通常是用序列分析软件来测量的。蛋白质分析软件是用指定给各种取代(包括保守性胺基酸取代)、缺失和其他修饰的相似性程度对相似的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit程序，可在系统内定参数情况下使用这些程序，以确定紧密相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)的间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质与其突变后形成的蛋白质的间的序列同源性或序列同一性。也可以用GCG Version 6.1程序FASTA(例如FASTA2和FASTA3)中系统内定参数或推荐参数来比较多肽序列，而提供被查询序列和被搜索序列的间的最佳重迭区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明的序列与含有大量源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是BLAST计算机程序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用系统内定参数。参阅例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，每篇论文均以引用方式纳入本文。

于本发明一优选实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)及轻链可变区的互补决定区，其中所述重链可变区的互补决定区包含CDRH1、CDRH2及CDRH3区，且所述轻链可变区的互补决定区包含CDRL1、CDRL2及CDRL3区，且

所述CDRH1区包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRH2区包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRH3区包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRL1区包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRL2区包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

及所述CDRL3区包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列。

于本发明另一优选实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的互补决定区(CDRs)及轻链可变区的互补决定区，其中所述重链可变区的互补决定区包含CDRH1、CDRH2及CDRH3区，且所述轻链可变区的互补决定区包含CDRL1、CDRL2及CDRL3区，且

所述CDRH1区包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRH2区包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRH3区包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRL1区包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

所述CDRL2区包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列；

及所述CDRL3区包含如SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列。

于本发明一优选实施例中，一抗体322A6或其抗原结合片段包含一重链可变区，包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列。优选地，所述重链可变区域是由如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列所编码。322A6或其抗原结合片段包含一轻链可变区，包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列。优选地，所述轻链可变区域是由如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列所编码。

于本发明另一优选实施例中，一抗体12A6或其抗原结合片段包含一重链可变区，包含如SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列。优选地，所述重链可变区域是由如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列所编码/12A6或其抗原结合片段一轻链可变区，包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的实质相似序列。优选地，所述轻链可变区域是由如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列所编码。

于另一方面，本发明的抗体优选为人源化抗体(humanized antibody)。“人源化抗体”唯一重组蛋白，其中，来自一物种(例如：小鼠)的一抗体的CDRs，由小鼠抗体的重链及轻链可变区域转移至人类的重链及轻链可变区域，包含人类框架序列。所述抗体分子的恒定区则衍生自一人类抗体的恒定区。

为改良根据本发明的人源化抗体的结合亲和力，人类框架区中的一些胺基酸残基经CDR的物种(例如小鼠)中的相对应胺基酸残基替换。优选地，人源化抗体Hu322B1HdH或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列的重链可变区。优选地，重链可变区由SEQID NO：24的核酸序列编码。Hu322B1HdH或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的大体上类似序列或其大体上类似序列的轻链可变区。优选地，轻链可变区由SEQ ID NO：26的核酸序列编码。

优选地，本发明的抗体是一单株抗体。

本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。多特异性抗体可以针对同一标靶多肽的不同抗原决定基具有特异性，或可含有针对一个以上标靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。本发明的抗VEGFR-2抗体可与另一个功能分子，例如另一胜肽或蛋白，连接或共表达。例如，一个抗体或其片段可与一个或多个其他分子实体，如另一个抗体或抗体片段实现功能性(例如以化学偶联、基因融合、非共价键连接或其他方式)连接，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一臂对人类VEGFR-2或其片段具有特异性，而免疫球蛋白的另一臂则对第二种治疗靶标具有特异性或与一治疗基团偶联。

于本发明一优选实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是与一治疗剂接合。

如本文所使用，“治疗剂”表示细胞生长抑制或细胞毒性剂或具有相对应放射性同位素的同位素螯合剂。细胞生长抑制或细胞毒性剂的实例包括(但不限于)抗代谢物(例如，氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲胺喋呤、甲酰四氢叶酸、羟基尿素、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他丁(pentostatin)、氟达拉宾磷酸盐(fludarabinephosphate)、克拉屈滨(cladribine)(2-CDA)、天冬酰胺酶、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitibine)、硫唑嘌呤、胞嘧啶甲胺喋呤、三甲氧苄二胺嘧啶(trimethoprim)、嘧啶甲胺(pyrimethamine)或培美曲塞(pemetrexed))；烷化剂(例如，美法伦(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、异环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲菌素、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、丝裂霉素C、环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀(uramustine)、二溴甘露醇、四硝酸酯、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺、米托唑胺(mitozolomide)或替莫唑胺(temozolomide))；类烷化剂(例如，顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、赛特铂(satraplatin)或特瑞铂(triplatin))；DNA小沟槽烷化剂(例如，倍癌霉素(duocarmycin)，诸如CC-1065及其任何类似物或衍生物；吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazapene)或其任何类似物或衍生物)；蒽环类药物(anthracycline)(例如，道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、埃达霉素(idarubicin)或伐柔比星(valrubicin))；抗生素(例如，放线菌素d(dactinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、安曲霉素(anthramycin)、链佐霉素(streptozotocin)、短杆菌素D(gramicidin D)、丝裂霉素(mitomycin)(例如，丝裂霉素C)；卡其霉素(calicheamicin)；抗有丝分裂剂(包括例如，类美登素(maytansinoid)(诸如DM1、DM3及DM4)、奥瑞他汀(auristatin)(包括例如，单甲基奥瑞他汀E(MMAE)及单甲基奥瑞他汀F(MMAF))、海兔毒素(dolastatin)、念珠藻环肽(cryptophycin)、长春花属生物碱(例如，长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine))、紫杉烷(例如，太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇或新颖紫杉烷)、特吡莱辛(tubulysin)及秋水仙碱)；拓朴异构酶抑制剂(例如，伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、喜树碱(camptothecin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)或米托蒽醌(mitoxantrone))；HDAC抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin)、西达本胺(chidamide)、帕比司他(panobinostat)或贝林诺他(belinostat))；蛋白酶体抑制剂(例如，肽基硼酸)；以及放射性同位素，诸如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或Bi213、P32及Lu的放射性同位素，包括Lu177。同位素螯合剂的实例包括(但不限于)乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺-N,N,N',N",N"-五乙酸酯(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N"'-四乙酸酯(DOTA)、1,4,7,10-肆(2-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(THP)、三伸乙基四胺-N,N,N',N",N"',N"'-六乙酸酯(TTHA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N"'-四(亚甲基膦酸酯)(DOTP)及巯基乙酰基三甘胺酸(MAG3)。

在本发明的一个优选实施例中，抗体或其抗原结合片段可使用任何数目的表达系统产生，包括原核及真核表达系统。在一些实施例中，表达系统为哺乳动物细胞表达(诸如融合瘤)或CHO细胞表达系统。诸多此类系统是广泛购自商业供货商。在抗体包含VH及VL区的实施例中，VH及VL区可例如在双顺反子表达单元中或在不同启动子的控制下，使用单一载体表达。在其他实施例中，VH及VL区可使用单独载体表达。如本文所述的VH或VL区可视情况包含N端处的甲硫胺酸。

编码相关抗体的重链及轻链的基因可选殖于细胞，例如，编码单株抗体的基因可选殖于融合瘤且用于产生重组单株抗体。编码单株抗体的重链及轻链的基因库亦可由融合瘤或浆细胞制得。重链及轻链基因产物的随机组合生成具有不同抗原特异性的大抗体池(参见例如，Kuby,Immunology(第3版1997))。

用于制造单链抗体或重组抗体的技术(US 4,946,778、US 4,816,567)可适用于制造本发明的抗体及多肽。并且，转基因小鼠或其他生物体，例如其他哺乳类，可用于表达人源化抗体或人类抗体(参见例如US 5,545,807、US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661,016、Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)、Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)、Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845-51(1996)、Neuberger,NatureBiotechnology 14:826(1996)及Lonberg&Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

于本发明一优选实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是表达于一细胞的表面。优选地，所述细胞为T细胞。

本发明提供了一些含有本发明的抗VEGFR-2抗体或其抗原结合片段的医药组合物。本发明的医药组合物是与适宜的载体、赋形剂以及改善转移、递送、耐受性等的其他试剂一起配制的。在这本所有药剂化学师都知道的处方集里可以找到大量的适宜配方：Remington's Pharmaceutical Sciences(雷氏药学大全)，Mack Publishing Company,Easton,PA。这些配方包括，例如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂质、含有(阳离子或阴离子)脂质的泡囊(如LIPOFECTIN TM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有碳蜡的半固体状混合物。还可参阅Powell et al.,Compendium of excipients forparenteral formulations(非肠道用配方的赋形剂概论)，PDA(1998)J Pharm SciTechnol 52:238-311。

给患者施用的抗体剂量可根据即将受药的患者的年龄和体形大小、标靶疾病、病症、给药途径等因素而改变。优选的剂量通常是按照体重或身体表面积计算的。当本发明的抗体用于治疗成人患者的与VEGFR-2活性相关的某种病症和疾病时，将本发明的抗体经由静脉输入也许较有效，通常是单剂量按体重计约0.01至约20mg/kg给药，优选为约0.02至约7mg/kg、约0.03至约5mg/kg，或约0.05至约3mg/kg。取决于病症的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调整。抗VEGFR-2抗体给药的有效剂量和计划可根据经验确定；例如，可通过定期评估来监视患者病情的进展并相应地调整剂量。而且，可以使用本领域众所周知的方法进行剂量的跨物种类推(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。

已知有多种药物递送系统可用来施用本发明的医药组合物，例如封装在能够表达变异病毒、受体介导的胞吞作用的脂质体、微颗粒、微胶囊、重组细胞中(参见如Wu etal.，1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。所述组合物可经由任何方便的途径给药，例如，输注或快速注射，经上皮或黏膜(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，并可与其他生物活性剂一起给药。给药方式可为全身性或局部性。

本发明的医药组合物可用标准的针头和针筒经皮下或静脉注射。此外，对于皮下给药，一种笔型给药装置可方便地用于本发明的医药组合物的给药。这种笔型给药装置可以是重复使用型或用后即弃型。可重复使用的笔型给药装置一般采用一种可更换的含医药组合物的药筒。一旦药筒内所有医药组合物均已输出、药筒变空，则可方便地丢弃空药筒，并用一个含医药组合物的新药筒取代，所述笔型给药装置即可重复使用。在用后即丢弃的笔型给药装置中，则无可更换的药筒。相反地，所述用后即丢弃的笔型给药装置具有一个预先灌满医药组合物的贮液器。一旦所述贮液器内医药组合物用完，整个装置即被丢弃。

在某些情况下，所述医药组合物可用一种控制释放系统给药。在一个实施例中，可使用一种泵(参阅Langer，出处同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一个实施例中，可采用聚合物材料；参阅Medical Applications of ControlledRelease,Langer and Wise(eds.),1974，CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一个实施例中，可将一种控制释放系统置于所述组合物靶目标附近，从而只需要全身性剂量的一部分(参阅例如，Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release，出处同上，vol.2,pp.115-138)。其他控制释放系统在Langer,1990，Science 249:1527-1533的综述中也被论及。

注射用制剂可包括静脉注射、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些注射用制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水介质中，或通常用于注射的油性介质中，以此方式制备所述注射用制剂。作为注射用的水介质有例如生理盐水、含葡萄糖和其他助剂的等渗压溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇类(如乙醇)、多元醇类(如丙二醇、聚乙二醇)，非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯80、HCO-50(50莫耳的氢化蓖麻油的聚氧乙烯加合物)等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制备的注射液最好是装入一种适当的安瓶中。

优选地，上述口服或注射用医药组合物可制备成单位剂量的剂型，以容纳一定剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓶)、栓剂等。单位剂量的上述抗体含量一般为每剂约5mg至约500mg；尤其是注射剂型，优选的是上述抗体含量为约5mg至约100mg，其他剂型中抗体含量为约10mg至约250mg。

本发明的抗体可用于一需要个体中抑制VEGFR-2调控的讯息传递，或治疗由VEGFR-2的活性或讯息传递所导致或与其相关联疾病或失调。本发明的抗体亦可用于抑制内皮细胞的细胞增生。

本发明提供一种于一需要个体中抑制VEGFR-2调控的讯息传递的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种治疗患有由VEGFR-2的活性或讯息传递所导致或与其相关联疾病或失调的个体的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种治疗患有肿瘤的个体的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种于一需要个体中抑制内皮细胞的细胞增生的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含前述的抗体或其抗原结合片段。

如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”是指向罹患不良病状、病症或疾病的有临床症状的个体投与药剂或调配物，以便实现症状的严重程度及/或频率降低、消除症状及/或其潜在病因及/或有助于损伤好转或修复。术语“预防(preventing/prevention)”是指向易罹患特定不良病状、病症或疾病的无临床症状的个体投与药剂或组合物，且因此是关于预防症状出现及/或其潜在病因。如熟习此项技术者所理解，预防(prevention/preventing)不必达成病状的绝对(完全)阻断或避免。确切而言，预防可达成待预防的疾病或病状的基本上(例如，超过约50％)减轻或避免。除非本文中另外明确地或藉由暗示指明，否则若在未提及可能的预防的情况下使用术语“治疗(treatment/treating)”，则意欲亦涵盖预防。

“癌症”、“肿瘤”、“转型”及类似术语包括癌变前、赘生性、转型及癌细胞，且可指实体肿瘤，或非实体癌症(参见例如，Edge等人AJCC Cancer Staging Manual(第7版2009)；Cibas and Ducatman Cytology:Diagnostic principles and clinical correlates(第3版2009))。癌症包括良性赘瘤及恶性赘瘤(异常生长)两者。“转型”是指自发的或诱发的表达型变化，例如，细胞的不朽化、形态变化、异常细胞生长、减少的接触抑制及固着及/或恶性病(参见Freshney,Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(第3版1994))。尽管转型可由转型病毒的感染及新基因组DNA的并入或外源DNA的摄入引起，但其亦可以自发方式或在暴露于诱癌物的后产生。

除其他用途外，本发明的抗体可用于治疗、预防和/或改善与VEGFR-2的表达或活性相关或由VEGFR-2的表达或活性媒介的任何疾病或失调，或通过阻断VEGFR-2和VEGFR-2配体的间的相互作用可治疗的任何疾病或失调，或可用于抑制VEGFR-2活性及/或信号，及/或促进受体内在化，及/或减少细胞表面受体的数目。例如，本发明的抗体和抗原结合片段可用于治疗表达高水平VEGFR-2的肿瘤。本发明的抗体和抗原结合片段可用于治疗在下列器官中产生的例如原发性及/或转移性肿瘤：脑和脑脊膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤及附属物、结缔组织、脾脏、免疫系统、造血细胞和骨髓、肝脏、泌尿道，以及某些特殊的感觉器官如眼睛。在某些实施例中，本发明的抗体和抗原结合片段被用于治疗一种或多种下列癌症：肾细胞癌、胰腺癌、乳癌、头颈部癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、大肠直肠癌、胃癌(如MET扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(例如VEGFR-2依赖性非小细胞肺癌)、滑膜肉瘤、甲状腺癌或黑色素瘤。

本发明提供一种侦测一样品中的人类血管内皮生长因子受体的方法，包含将所述样品与前述的抗体或其抗原结合片段接触。

本发明的抗VEGFR-2抗体也可用于检测及/或测量样品中VEGFR-2或表达VEGFR-2的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗VEGFR-2抗体或其片段可用于诊断特征为VEGFR-2异常表达(例如过度表达、表达不足、缺乏表达等)的症状或疾病。示范性VEGFR-2诊断分析法可包括例如用一种本发明的抗VEGFR-2抗体与获自患者的样品接触，其中所述抗VEGFR-2抗体以一种可检测的标记或报导基因分子标记。或者，在诊断应用中也可以将一种未标记的抗VEGFR-2抗体与本身具有可检测标记的第二种抗体结合使用。所述可检测标记或报导基因分子可以是一种放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；一种荧光或化学发光基团，如异硫氰酸荧光素，或罗丹明；或一种酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或荧光素酶。可用于检测或测量样品中VEGFR-2的特别的示范性测定法包括酵素结合免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)，以及荧光激活细胞分选(FACS)。

可依照本发明用于VEGFR-2诊断分析的样品，包括获自病人的在正常或病理条件下含有可检测量VEGFR-2蛋白或其片段的任何组织或体液样品。一般而言，先从一位健康病人(例如未患与VEGFR-2异常水平或活性相关的疾病或症状的病人)获得特定的样品并测量其VEGFR-2表达水平，以建立VEGFR-2水平的基线或标准。然后，可将这VEGFR-2基线水平与从疑为患有VEGFR-2相关性疾病或状况的人员所获得的样品测得的VEGFR-2表达水平进行比较。

提供以下实例以帮助熟习此项技术者实践本发明。

实例

scFv/Fab抗体库的构筑

使用含有SEQ ID NO：1的序列的融合蛋白质VEGFR2-Fc-His作为抗原使小鼠免疫，每两周6次。在免疫接种后，牺牲小鼠以获得脾脏。提取出脾脏的全部RNA且藉由引物在RT-PCR程序中反转录以构筑含有V_H、V_L、V_H-CH1、V_L-CL的抗体片段。抗体片段在聚合酶链反应中组装成scFv片段以构筑scFv库。首先，藉由来自V_L-CL片段的V_L-CL库将Fab库构筑至质体中。随后，将V_H-CH1片段构筑至含有V_L-CL片段的质体中，产生最终Fab库。

制备用于生物淘选的scFv/Fab噬菌体

将所获得的库接种至含有100μg/ml安比西林(ampicillin)及2％葡萄糖(2YTAG)的2×YT培养基中，且在37℃振荡下培育，直至OD 600nm达到0.5。用辅助噬菌体感染培养物且随后在37℃水浴中无振荡培养30min。收集细胞且将其悬浮于含有100μg/ml安比西林及25μg/ml卡那霉素(kanamycin)(2YTAK)的2×YT培养基中，且再在30℃振荡下培育隔夜。收集培养物的上清液且将其与1/5体积的PEG/NaCl(20％聚乙二醇8000，2.5M NaCl)混合，且在4℃下保持1小时或大于1小时。离心的后，收集离心块且将其悬浮于40mL PBS中且再次离心以收集上清液。

使用ELISA方法选择

将ELISA培养盘(Nunc)每孔涂布1μg/100μL的抗原，且在pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中在4℃下保持隔夜。孔用PBS洗涤3次且用每孔300μL的PBS-5％脱脂牛奶(MPBS)在37℃下阻断1.5小时。用PBS洗涤3次的后，添加100μL于5％MPBS中的噬菌体，所述MPBS具有含有his标记的融合蛋白质，且在37℃下培育90分。用PBS-0.05％Tween 20(PBST)洗涤10次及用PBS洗涤10次的后，噬菌体藉由添加100μL的100mM三乙胺(TEA)溶离且在37℃下反应30分。100μL的经溶离噬菌体用pH 7.4、50μL的1M Tris中和。将10ml在指数生长阶段的TG1添加至150μL的经溶离噬菌体中。培养物在37℃下无振荡培育30分进行感染。将经感染TG1细菌离心且收集且随后悬浮于2×YT中，并涂铺于2×YT-AG培养盘上。细菌在30℃下培育隔夜。

使用戴诺珠粒(Dynabeads)方法选择

在预清洁噬菌体步骤中，戴诺珠粒用1ml PBS预洗涤3次，且悬浮于PBS中。随后，将0.3mL噬菌体与0.5ml的5％MPBS及含有his标记的融合蛋白质混合，且在旋转器上培育30分，且随后移出戴诺珠粒。

使戴诺珠粒与生物素标记的VEGFR2-His反应90分。戴诺珠粒用1ml PBS洗涤3次且悬浮于5％MPBS中并培育90分，且随后用1ml PBS洗涤3次。将预清洁噬菌体添加至具有戴诺珠粒的VEGFR2-His中，且在旋转器上再培育30分。戴诺珠粒随后用1ml的0.05％PBST、0.2％MPBS及PBS洗涤。所结合的噬菌体用1ml的100mM TEA溶离。为快速中和，将pH 7.4、0.5ml的1M Tris添加至经溶离噬菌体中。随后，采用6ml的TG1的指数生长培养物且添加经TEA溶离的噬菌体。培养物在37℃下(水浴)无振荡培育30分。合并经感染TG1细菌且离心以收集离心块。将块状的细菌悬浮于1ml的2×YT中且涂铺于大的2×YT-AG培养盘上。细菌在30℃下培育隔夜。

制备下一轮噬菌体

将5至6ml的2×YT、15％甘油添加至细菌培养盘中且菌落藉由玻璃涂抹棒变松散。随后，将10μl刮下的细菌添加至10ml的2×YT-AG中且细菌在37℃振荡下生长，直至在600nm下的OD达到0.5。藉由添加辅助噬菌体用M13KO7辅助噬菌体以1:20的比率感染10ml培养物，且经感染培养物在37℃水浴中无振荡培育30分。培养物经离心以收集离心块，且离心块藉由50mL的2×YT-AK悬浮，且随后在30℃下培养隔夜。此外，使40ml的隔夜培养物在10,000rpm下离心20min以收集上清液，且将1/5体积(8ml)PEG/NaCl添加至上清液中。将孔混合且在4℃下保持1小时或大于1小时。混合物在10,000rpm下离心20分且收集离心块并将其悬浮于2ml PBS中。悬浮液在12000rpm下离心10分以移除大部分剩余的细菌残渣。

藉由ELISA筛检VEGFR2阳性噬菌体

将来自培养盘的单独菌落接种至200μl的2×YT-AG 96孔盘中，且在37℃下在振荡下生长隔夜，且随后将50μl转移至每孔含有200μl的2×YT-AG的第二96孔盘中，在37℃下振荡2小时。随后，将50μl的具有10⁹pfu M13KO7辅助噬菌体的2×YT-AG添加至第二培养盘的各孔中。混合物在37℃下静置30min且随后在37℃下振荡1小时。在4000rpm下离心30分的后，抽出上清液，且将离心块悬浮于300μl的2×YT-AK中，在30℃下在振荡下生长隔夜。培养物在4000rpm下离心30分且取出100μl的培养物上清液用于噬菌体ELISA。

将ELISA培养盘每孔涂布1μg/mL的蛋白质抗原，且随后用PBS淋洗3次，且用每孔300μl的2％MPBS在37℃下阻断2小时。用PBS再淋洗3次的后，添加100μl如上文详细说明的噬菌体培养物上清液且在37℃下培育90分。舍弃噬菌体溶液，且孔用PBST洗涤6次及用PBS洗涤6次，随后添加HRP-抗M13抗体于5％MPBS中的适当稀释液。混合物在37℃下培育60min，且用PBST洗涤6次及用PBS洗涤6次。孔用基质溶液(TMB)显色，且反应藉由添加50μl的1M硫酸中止。颜色变成黄色，且分析OD 650nm及OD 450nm。

筛检的后，鉴定出总共379个纯系及66种CDRH3。

全长抗体的表达

将编码抗VEGFR2抗体的V_H及V_L链的基因插入至表达载体中。藉由所构筑的载体转染Free-style 293细胞。遵循以下程序，在30ml体积中转染悬浮液FreeStyle^TM 293细胞。在转染的前大约24小时，以2×10⁶个细胞/毫升转移15ml的FreeStyle^TM 293细胞。将烧瓶置放于37℃、8％CO₂培育箱中。随后将37.5μg的质体DNA稀释至1.5ml的无菌150mM NaCl中，使总体积达1.5ml。在另一管中，将37.5μL的PEI(2.0mg/ml)稀释于1.5ml的无菌150mM NaCl中。使DNA及PEI溶液在室温下静置5分钟，藉由将管倒转轻轻混合，且在室温下静置约10-20分钟。立即添加DNA-PEI混合物至F293细胞中且在37℃、8％CO2培育箱中在以135-150rpm旋转的定轨振荡器平台上培育经转染细胞4小时。随后添加相同体积新鲜培养基至总体积达30ml，且培养5-7天。收集细胞进行蛋白质纯化及定量。

鉴定出总共78个菌落，包括322A6及12A6。

结合亲和力分析

将ELSA培养盘涂布每孔100μL/的人类VEGFR-2、小鼠VEGFR2、人类VEGFR1或人类VEGFR3，在4℃下隔夜，且随后用PBS淋洗3次，且在37℃下用300μL/孔的5％MPBS阻断2小时。孔用PBS淋洗3次，且添加100μL的抗VEGFR2抗体2倍连续稀释液并在37℃下培育90min。舍弃测试溶液且用PBS洗涤3次。添加HRP-抗人类IgG抗体于5％MPBS中的适当稀释液(1:10000)且在37℃下培育60min，且孔用PBS洗涤3次。孔用100μL的基质溶液TMB显色，且反应藉由添加50μL的1M硫酸终止。颜色变成黄色，且分析OD 650nm及OD 450nm。

数种抗体的结合亲和力的结果展示于图1及表1中。其展示12A6及322A6抗体对人类VEGFR-2具有结合亲和力。322A6抗体对小鼠VEGFR-2具有结合亲和力，但对人类VEGFR-1及VEGFR-3不具有亲和力。因此，322A6对VEGFR-2具有特异性。

表1：

322A6及12A6的CDR的序列展示于表2中。322A6包含有包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列的重链可变区，且重链可变区由SEQ ID NO：16的核酸序列编码。322A6包含有包含SEQID NO：19的胺基酸序列的轻链可变区，且轻链可变区由SEQ ID NO：18的核酸序列编码。12A6包含有包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重链可变区，且重链可变区由SEQ ID NO：20的核酸序列编码。12A6包含有包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列的轻链可变区，且轻链可变区由SEQ ID NO：22的核酸序列编码。

表2：

结构域定位分析

构筑人类VEGFR-2的片段。片段以如上所述的结合亲和力分析。结构域定位的结果展示于图2及图3及表3及表4中。

表3：

结合结构域	322A6(45)	12A6
			R2 D1-2	-	-
R2 D1-3	-	-
			R2 D1-4	-	-
R2 D1-5	-	-
			R2 D1-6	-	+++++
R2 D1-7	+++++	+++++
			R2 D6-7	+++++	+++++
R2 D6	-	+++
			R2 D7	++++	++++

表4：

样品	结合结构域
		322A6	7
12A6	6-7

抗原决定基定位

在人类VEGFR-2的结构域6(SEQ ID NO：2)及结构域7(SEQ ID NO：3)中，构筑若干点突变体。突变体以如上所述的结合亲和力分析。突变位点的位置展示于图4中。12A6的抗原决定基包含位置606处的白胺酸残基、位置607处的天冬胺酸残基、位置647处的精胺酸残基、位置648处的离胺酸残基及位置649处的苏胺酸残基。322A6的抗原决定基包含位置711处的丝胺酸残基、位置716处的离胺酸残基、位置717处的天门冬胺酸残基及位置725及位置726处的精胺酸残基。

抗VEGF R2 Ab-HUVEC增生抑制分析

材料：HUVEC(Cascade Biologics，目录号C-003-5C)，培养基200(CascadeBiologics，目录号M-200-500)，融合瘤培养基(10％FBS-DMEM)，FBS(Hyclone，#SH30071.03)，DMEM(GIBCO，#11995)，人类CHO VEGF、hVEGF(PROSPEC，目录号CYT-260)，抗VEGFR2抗体、WST-1(Roche，目录号11644807001)。

将100μL于10％FBS-DMEM中的抗体样品接种至96孔盘的各孔中，且每个样品双重复。收集细胞且将其以8×10⁴个细胞/毫升悬浮于培养基200中，且在37℃、5％CO₂下培育30分钟。以培养基200(Medium 200)稀释hVEGF至50ng/ml，且将50μL的标准hVEGF添加至培养盘中，在37℃、5％CO₂下培育96小时。随后，将20μL的WST-1添加至各孔中且在37℃、5％CO₂下培育4小时。使用ELISA读取器量测吸亮度(OD 450-655nm)。

增生分析的结果展示于图5中。如图5中所示，当抗体浓度愈高时，VEGFR-2信号抑制的效果愈强，且HUVEC的数目(OD 450-655nm)愈少。在抗体当中，12A6具有最强效果，其中IC50＝3.9μg/ml。

抗VEGFR-2抗体至HUVEC中的内在化

藉由流式细胞测量术分析抗体至HUVEC中的内在化。

流式细胞测量术(CytoFLEX)

细胞株：HUVEC

第1抗体：322A6

第2抗体：山羊抗人类κ轻链，Bethyl，目录A80-115F

培养基200(M200)，Thermo，目录C-003-25P-A，低血清生长补充剂(LSGS)。目录S00310

FBS(Gibco，目录10082-147)，FACS缓冲剂(1×PBS，1％FBS，0.02％NaN3)

15mL法尔康(Falcon)管(Corning，目录CS352096)

T150：组织培养瓶(TPP，90150)

计数HUVEC的细胞数目，且将其与322A6混合并在冰上培育1小时。细胞藉由离心收集，且藉由10mL冰冷的FACS缓冲剂洗涤3次。将2×10⁵个细胞/反应/孔(24孔盘)接种于RPMI培养基w/2％FBS中，且随后在37℃或4℃下培育指定时间段。在各时间点，藉由10mL冰冷的FACS缓冲剂洗涤细胞，且将第2抗体(α-hIgG-FITC，藉由冰冷的FACS缓冲剂1:200稀释)添加于冰上持续1小时。藉由10mL冰冷的FACS缓冲剂洗涤3次的后，将细胞接种(藉由FACS缓冲剂，2×10⁵个细胞/反应/管)且在37℃或4℃下培育指定时间段。在各时间点，将细胞悬浮且藉由流式细胞测量术及CytExpert软件分析。

结果展示于表5及图6中。在抗体内在化发生的前(0min)，藉由流式细胞测量术侦测由抗体结合的HUVEC细胞。在抗体内在化发生的后，抗体自细胞表面易位至细胞内部的核内体，且流式细胞测量术的信号消失。因此，若抗体具有较强的抗体内在化倾向，则与靶细胞的相对结合较少。如表5及图6中可见，322A6具有较强的抗体内在化倾向。

表5：

亦藉由DeltaVision显微镜成像系统在显微镜下观察抗体内在化，且展示于图7中。以Rab5a作为阳性对照，且以DAPI标记细胞核。藉由同时标记322A6及核内体，其展示322A6成功地内在化至细胞中。

抗VEGFR2抗体与罗米地辛的接合

322A6(C45)抗体根据以下流程与罗米地辛(亦称为伊斯达斯(Istodax)，抗癌剂)接合：

接合条件列于表6中。

表6：

藉由尺寸排阻层析(SEC)分析所获得的抗体-药物接合物(ADC)(11-0151-00-01)：

管柱：Superdex 200 Increase 10/300 GL(GE)

样品：IgG及IgG-ADC，0.3mg/mL

样品体积：100μL

流速：0.5mL/min

缓冲剂：1×PBS

系统：

层析结果展示于图8及表7中。亦对ADC进行电泳且展示于图9中。

表7：

如图8中所示，所获得的抗体-药物接合物具有95.4％的单体及95％的纯度。

亦如上所述分析ADC的内在化。结果展示于图10中，且322A6的ADC中的内在化倾向与仅322A6抗体(c45)中的倾向类似。

亦如上所述分析ADC对HUVEC增生的抑制。结果展示于图11中。单独的322A6抗体(c45)在抑制HUVEC增生方面的效果适中。其意谓322A6抗体在VEGFR-2讯息传递方面的阻断效果不是非常强。然而，当经处理的322A6与罗米地辛接合时(c45-ADC)，HUVEC的相对细胞存活率显著下降。不受理论限制，咸信HUVEC的相对细胞存活率的下降由322A6抗体的ADC的细胞毒性导致，而非HUVEC增生的抑制。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法

自健康供体分离外周血液单核细胞(PBMC)且用具有10％FBS(hyclone)及100U/mL重组介白素-2(Roche)的RPMI中的

人类T活化剂CD3/CD28(Gibco)刺激48小时。使用人类Pan T细胞分离套组(Miltenyi Biotec)，根据制造商的说明书收集经活化的T细胞。慢病毒载体含有抗VEGFR-2抗体的单链可变片段，及4-1BB及CD3-z的信号传导域。藉由用转移基因组质体及慢病毒封装辅助质体pMD2.G及pCMVΔR8.91瞬时转染HEK293T细胞而产生病毒上清液，且将其用以在涂有RetroNectin的培养盘(TaKaRa Bio Inc.)上转导人类T细胞。藉由流式细胞测量术分析转导效率。

结果展示于图12中。定量分析分别展示5.1％、10.4％及7.79％的在T细胞上表达的1121、12A6及322A6 CAR。

抗原受体T细胞的细胞毒性分析

藉由使用细胞毒性侦测套组(Roche,Indianapolis,IN,USA)，根据制造商说明书量测细胞毒性活性。将抗VEGFR-2CAR T细胞与VEGFR2阳性细胞株以指定E:T比率在37℃下一起培育16小时。使用下式计算特异性细胞溶解百分比：(测试-效应剂对照-低对照/高对照-低对照)*100。高对照在靶细胞于1％Triton X 100中培育的后计算；效应剂对照为单独的T细胞的自发LDH释放值；低对照为单独的靶细胞的自发LDH释放值。效应细胞：藉由抗VEGFR-2CAR转导的原生T细胞(第1次转导5天后)。靶细胞：FS293(过度表达的VEGFR-2)。效应细胞及靶细胞共培养16小时。

亦使用CD19的scFv片段制造CAR-T作为对照(CD19)。亦将单独的T细胞视为对照(T)。1121抗体为特异性结合于VEGFR-2的结构域2及结构域3的已知抗VEGFR-2抗体，所述等结构域远离VEGFR-2中的细胞膜。1121的CAR-T在分析中用于比较。结果展示于图13中。12A6及322A6的CAR-T均具有比1121的CAR-T强的细胞毒性。不受理论限制，咸信12A6及322A6抗体特异性结合于VEGFR-2的结构域6及/或结构域7，所述等结构域靠近VEGFR-2中的细胞膜。

产生放射性、碘结合抗体

将1ml的25mM Tris-HCl(pH 7.5)及0.4M NaCl缓冲溶液添加至IODO-gen管中，且随后舍弃。将100μl的缓冲溶液添加至管中，且随后添加1μl的I-123或I-131，在室温下在轻微振荡下反应6分钟。添加抗VEGFR-2抗体，在室温下在轻微振荡下反应6至9分钟。藉由将反应物转移至新的微量离心管中来终止反应。藉由85％甲醇显色溶液及ITLC/SG纸用Radio-TLC分析标记方法的效率。

标记方法¹³¹I-抗VEGFR-2-纯系45(322A6)的效率展示于图14中。超过96.8％的抗体经标记。

放射性碘结合抗体在血清中的稳定性

将经标记抗体与来源于人类或大鼠的血清以1:19的体积比混合且在37℃下反应。在第0.25、0.5、1、4、8、24、48及72小时，将800μl的10％TCA添加至10μl样品中且混合。含于样品中的蛋白质藉由冰浴15分钟沈淀。藉由0.45μm PVDF膜过滤上清液且计数液体的比率活性，展现经解离的I-131。稳定性＝(过滤前的活性-过滤后的活性)/过滤前的活性。

结果展示于表8中，显示¹³¹I-抗VEGFR-2-纯系-45在72小时内在血清中不降解。

表8：

藉由放射性碘结合抗体侦测肿瘤

采用SPECT/CT，藉由根据本发明的放射线结合抗体侦测肿瘤。于HT-29异种移植小鼠静脉内注射4至8μCi/μg的放射性。向各小鼠投予1至2mg/kg的B.W.¹³¹I或¹²³I标记的抗VEGFR2抗体。在第1、4、24及48小时，藉由SPECT/CT扫描小鼠。

结果展示于图15中。结果显示，放射线结合抗体322A6能够特异性结合于HT-29异种移植肿瘤且放射性信号积聚于肿瘤中。最强信号在第18小时出现于肿瘤中。抗体在第18小时后降解，且几乎所有抗体在第48小时后降解。

组合疗法

以6至8周龄的雄性B6(C57BL/6JNarl)小鼠作为动物模型。小鼠在12小时光亮/黑暗循环下喂食且任意采食PMI饲料(RMH3000-5P76)及水。将小鼠分组为：

第1组：IgG(Mu)(非功能IgG抗体)，15mpk/i.v.，两次/周，n＝6

第2组：αCTLA-4(Mu)，5mpk/i.v.+IgG(Mu)，10mpk/i.v.，两次/周，n＝6

第3组：αCTLA-4(Mu)，5mpk/i.v.+322A6，10mpk/i.v.，两次/周，n＝6第4组：IgG(Mu)，5mpk/i.v.+322A6，10mpk/i.v.，两次/周，n＝6

量测肿瘤尺寸且列于表9中。抗CTLA4抗体及抗VEGFR-2抗体(322A6)的组合具有协同效应。

表9：

亦量测体重且列于表10中，且其显示所有组的体重大体上相同。

表10：

抗体的人源化

人类V区框架的选择：自IMGT数据库(http://www.imgt.org/)及常用VH3/Vk1(4D5)鉴别与322A6框架区具有最高程度的同源性的人类V区框架序列人类生殖系V_L及V_H序列的序列选择。最后，分别针对VH框架及VL框架选择VH3及Vk1的框架序列。标记为Hu的人源化框架来自IMGT数据库且Hd系列来自4D5框架。

全长CDR移植Ab构筑：322A6(HH)由具有6个完整鼠类CDR序列的完整人类框架(VLκ亚群I及V_H亚群III)组成。322A6(HH)及半人源化(MH或HM)抗体构筑体藉由PCR及限制酶切割组装，用于定向次选殖至经修饰的抗体表达载体pTCAE8.3中。质体含有编码人类κ轻链及人类IgG1 C区的DNA片段。全长抗体在Free-style293细胞中表达。

回复突变：选择纯系322A6(HuB1-Hd)自CDR移植框架进行1-3轮回复突变，用于结合活性恢复。简言的，吾等藉由

邻近度、上部核心区、界面面积进行计算机模型化来分析CDR移植框架，且亦应用成功案例中最常用的先前经验。吾等已选择3轮，可能有5至11个胺基酸发生回复突变。此等位点视为CDR结合及结构的重要位点。在选殖及抗体表达的后，藉由ELISA及BIAcore测定结合活性。具有7个胺基酸回复突变(7+0)的重链(HuB1)及轻链(Hd)的组合纯系为VEGFR2结合的适合候选。

人源化抗体Hu322B1HdH是由包含如SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列的重链可变区，及包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列的轻链可变区所构筑而成。所述重链可变区是由如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列所编码，且所述轻链可变区是由如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列所编码。V_L片段的比对结果是如图16所示，V_H片段的比对结果是如图17所示。

本发明是配合前述特定实施例以说明，其替换、调整及变化为本领域中具通常知识者可以理解。这些替换、调整及变化仍属于本发明的范围。

序列表

<110> 财团法人生物技术开发中心

<120> 抗人类血管内皮生长因子受体的抗体及其应用

<130> 无

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 764

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

195 200 205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr

210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

290 295 300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

355 360 365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr

370 375 380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

450 455 460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser His Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

580 585 590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

610 615 620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

625 630 635 640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe

740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu

755 760

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln Pro Thr Glu Gln Glu Ser

1 5 10 15

Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser Thr Phe Glu Asn Leu Thr

20 25 30

Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro Ile His Val Gly Glu Leu

35 40 45

Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr Leu Trp Lys Leu Asn Ala

50 55 60

Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile Met Glu Leu Lys

65 70 75 80

Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys Leu Ala Gln Asp

85 90 95

Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val Arg Gln Leu Thr

100 105 110

<210> 3

<211> 87

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Pro Thr Ile Thr Gly Asn Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu

1 5 10 15

Ser Ile Glu Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile

20 25 30

Met Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val

35 40 45

Leu Lys Asp Gly Asn Arg Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu

50 55 60

Asp Glu Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala

65 70 75 80

Lys Val Glu Ala Phe Phe Ile

85

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Met Ile Asp Phe Ser Asp Ser Glu Thr Lys Leu Asn Gln Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Asp Val Arg Gly Asn Phe Asp Val

1 5

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ser Met Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Gly Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Lys Ala Ser Asn Leu His Thr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 16

<211> 351

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(351)

<400> 16

gag gtg cag ctg cag cag tct ggg cct cag ctg gtt agg cct ggg gct 48

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

tca gcg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac gca ttc acc acc tac 96

Ser Ala Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

tgg atg cac tgg gtg aaa cag agg cct gga caa ggt ctt gag tgg att 144

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

ggc atg att gat ttt tcc gat agt gaa act aag tta aat cag agg ttc 192

Gly Met Ile Asp Phe Ser Asp Ser Glu Thr Lys Leu Asn Gln Arg Phe

50 55 60

aag ggc aag gcc aca ttg act gtt gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 240

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

atg caa ctc agc agc ccg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca aga gat gtc aga ggg aac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg 336

Ala Arg Asp Val Arg Gly Asn Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

gtc acc gtc tcc tca 351

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Phe Ser Asp Ser Glu Thr Lys Leu Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg Asp Val Arg Gly Asn Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

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115

<210> 18

<211> 336

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<400> 18

gat att gtg ttg aca cag tct cct gct tcc tta gct gta tct ctg ggg 48

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

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Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

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85 90 95

Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 20

<211> 351

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(351)

<400> 20

cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

tca gtg aag gta tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act gac tac 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

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Ser Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

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Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Lys Phe

50 55 60

aag ggc aag gcc aca ttg act gtt gac aag tcc tcc agc aca gcc ttc 240

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

atg cat ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288

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85 90 95

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Ala Lys Gly Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

gtc acc gtc tcc tca 351

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115

<210> 21

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 324

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(324)

<400> 22

gat att cag atg att cag tct cca tcc agt ctg tct gca tcc ctt gga 48

Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

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Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tct gga aca ggt ttc aca tta acc atc agc agc ctg cag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 23

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 23

Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

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50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 24

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(351)

<400> 24

caa gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa cca ggc gcc 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

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Gly Met Ile Asp Phe Ser Asp Ser Glu Thr Lys Leu Asn Gln Arg Phe

50 55 60

aag ggc aag gcc acc ctg acc gtg gac aag agc acc agc acc gcc tac 240

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65 70 75 80

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gct aga gat gtg cgg ggc aac ttc gac gtg tgg ggc cag gga aca ctc 336

Ala Arg Asp Val Arg Gly Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

gtg acc gtg tct agc 351

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Phe Ser Asp Ser Glu Thr Lys Leu Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Val Arg Gly Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<400> 26

gac atc cag atg acc cag agc ccc agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

gac aga gtg acc atc acc tgt cgg gcc agc aag agc gtg tcc acc agc 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

ggc tac agc tac atg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

aag ctg ctg atc tac ctg gcc agc aac ctg gaa agc ggc gtg ccc agc 192

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

aga ttt tcc ggc agc ggc tct ggc acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

gag ctg ccc tgg acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgg 336

Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构筑体

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Claims (22)

1.一种与人类第二型血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factorreceptor 2，VEGFR-2)或其片段中的一抗原决定基特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述人类第二型血管内皮生长因子受体具有如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，且所述抗原决定基包含：

SEQ ID NO：1中第606位点的白胺酸、第607位点的天冬胺酸、第647位点的精胺酸、第648位点的离胺酸及第649位点的苏胺酸；或

SEQ ID NO：1中第711位点的丝胺酸、第716位点的离胺酸、第717位点的天门冬胺酸及第725及726位点的精胺酸。

2.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其为一哺乳类抗体。

3.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区的互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)及轻链可变区的互补决定区，其中所述重链可变区的互补决定区包含CDRH1、CDRH2及CDRH3区，且所述轻链可变区的互补决定区包含CDRL1、CDRL2及CDRL3区，所述CDRH1区包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRH2区包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRH3区包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRL1区包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRL2区包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列或其实质相似序列；及所述CDRL3区包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或其实质相似序列。

4.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区的互补决定区(CDRs)及轻链可变区的互补决定区，其中所述重链可变区的互补决定区包含CDRH1、CDRH2及CDRH3区，且所述轻链可变区的互补决定区包含CDRL1、CDRL2及CDRL3区，所述CDRH1区包含如SEQID NO：10所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRH2区包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRH3区包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRL1区包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列或其实质相似序列；所述CDRL2区包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列或其实质相似序列；及所述CDRL3区包含如SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或其实质相似序列。

5.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含一重链可变区，包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列或其实质相似序列；及一轻链可变区，包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列或其实质相似序列。

6.如权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区域是由如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列所编码；所述轻链可变区域是由如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列所编码。

7.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含一重链可变区，包含如SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列或其实质相似序列；及一轻链可变区，包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列或其实质相似序列。

8.如权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区域是由如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列所编码；所述轻链可变区域是由如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列所编码。

9.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含一重链可变区，包含如SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列或其实质相似序列；及一轻链可变区，包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或其实质相似序列。

10.如权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区域是由如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列所编码；所述轻链可变区域是由如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列所编码。

11.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其是与一治疗剂接合。

12.如权利要求11的抗体或其抗原结合片段，其中所述治疗剂是选自由抗代谢物、烷化剂、类烷化剂、DNA小沟槽烷化剂、蒽环类药物(anthracyclines)、抗生素、卡其霉素(calicheamicins)、抗有丝分裂剂、拓朴酶抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂及放射线同位素所组成的群组。

13.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其是表达于一细胞的表面。

14.如权利要求13的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞为一T细胞。

15.一种于一需要个体中抑制VEGFR-2调控的讯息传递的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含权利要求1的抗体或其抗原结合片段。

16.一种治疗患有由VEGFR-2的活性或讯息传递所导致或与其相关联疾病或失调的个体的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含权利要求1的抗体或其抗原结合片段。

17.一种治疗患有肿瘤的个体的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含权利要求1的抗体或其抗原结合片段。

18.如权利要求17的方法，所述肿瘤为实体肿瘤。

19.如权利要求18的方法，所述肿瘤是选自由肾细胞癌、胰腺癌、乳癌、头颈部癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、大肠直肠癌、胃癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌或黑色素瘤。

20.一种于一需要个体中抑制内皮细胞的细胞增生的方法，包含给予所述个体一医药组合物，所述医药组合物包含权利要求1的抗体或其抗原结合片段。

21.一种侦测一样品中的人类第二型血管内皮生长因子受体的方法，包含将所述样品与权利要求1的抗体或其抗原结合片段接触。

22.如权利要求21的方法，是用以侦测VEGFR-2的第六至第七结构域。

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