CN111087389B

CN111087389B - 一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物

Info

Publication number: CN111087389B
Application number: CN201911224491.7A
Authority: CN
Inventors: 张世华; 李洪滨; 杨慧; 刘千子; 蔡栋梁
Original assignee: Jiamusi University
Current assignee: Jiamusi University
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2039-12-03
Also published as: CN111087389A

Abstract

本发明涉及一种式I化合物及其药学上接受的盐、制备方法及其用途，其中，R₁和R₂独立地选自H、C_1‑5烷基、‑(CH₂)_n‑NR₃R₄，R₃和R₄独立地选自H或C_1‑5烷基，n为1、2、3、4或5。所述化合物对于胶质母细胞瘤有较好的治疗效果，用药后在正常组织细胞中的浓度含量显著降低，副作用潜在风险小，具有很大的临床应用前景。

Description

一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物

技术领域

本发明涉及药学领域，具体涉及一种治疗胶质母细胞瘤的药物、制备方法，及其用于抗肿瘤、尤其是用于治疗胶质母细胞瘤的用途。

背景技术

胶质母细胞瘤(GBM；世界卫生组织第IV级胶质瘤)是成人中最常见的原发性脑肿瘤。即使采用本领域中当前最先进的手术前和手术中神经成像技术的积极手术切除术(aggressive surgical resection)以及手术后放射治疗和化学治疗进来的进展，GBM的预后仍然不良。在当前最佳手术治疗后治疗方案下的中位存活率(median survivalrate)仅为15个月。因此，当务之急是鉴定新的候选治疗剂。定义新治疗方法的一个挑战是GBM的异质性。瘤内异质性源自遗传性和非遗传性表观遗传因素。此外，新兴的概念提出了抑制肿瘤细胞表型产生自由小亚组的干细胞氧细胞 (stem-like cell)启动的连续进行异常和恶性分化过程。这些干细胞样细胞通过其以下能力来定义：(i)自我更新(self-renewal)；(ii)在多种异种移植范例中的肿瘤启动和增殖；和(iii)多潜能性(multipotency)，即其分化为星形细胞(astrocyte)、少突细胞(oligodendrocyte)和神经元的能力。另外假设这些细胞耐受当前大多数放射治疗及化学治疗，并且认为针对干细胞样细胞的治疗可以改善目前常规治疗的可怕记录。基于该考虑，已开始使通常应用于干细胞研究领域的体外技术适用于分离、扩增以及更好地表征具有干细胞特征的肿瘤细胞。细胞在贴附条件下作为单层培养物增殖，与“球状体(sphereoid)”培养物相比，其可提供显著的优点。

近年来，研究和寻找肿瘤的靶向标志物、开发新型靶向药物成为治疗肿瘤的一类有效途径，专利CN201610177363.1中发现了巢蛋白在脑胶质母细胞瘤肿瘤细胞体外增殖和体内生长中发挥着重要作用，提供了一种治疗脑胶质母细胞瘤的靶向药物-Nes0694，对于脑胶质母细胞瘤有很好的抑制效果，提供了一种治疗胶质母细胞瘤的新型靶向药和化疗方法。

然而，靶向药作为一种对肿瘤较为有效的治疗手段，用药后其往往也会伴随很多的副作用，影响患者术后的恢复、增加病患的痛苦。进一步的动物试验的研究显示，在给药后，血中Nes0694进入体内后随血液循环到达全身组织，经被动扩散方式很快进入各组织细胞内，不仅进入肿瘤细胞中，在正常组织中的浓度也相对较高，1小时后血中药物浓度较为迅速地下降。由于抗肿瘤药物相对较多地分布到全身各处组织的缘故，肿瘤细胞内的药物含量受到影响，更重要的是，对身体其它正常组织造成的损害和副作用也随之加大。因此，对这一类药物进行分子结构设计和改良，找到一种在血液中可以维持比Nes0694药物有更持久、更高的药物浓度，这样的结果不仅对药物发挥抗肿瘤作用非常有利，对于正常组织的损害也会降低。

本发明的目的就是为了解决以上技术问题，为了克服现Nes0694药物所产生的毒性副作用，提供一种在维持原有靶向药抗肿瘤活性的基础上，选择性地输送抗肿瘤药物到达体内的靶组织，降低正常组织中的药物含量，提高疗效和降低对正常组织毒副作用的抗肿瘤、尤其是抗胶质母细胞瘤的新型药物。

发明内容

本发明的目的之一，在于基于现有技术，提供一种新型的抗肿瘤化合物，尤其是对于胶质母细胞瘤的治疗效果好，对体内正常组织损伤小，副作用潜在风险小，临床应用前景大。为了达到这个目的，本发明提供一种包含化合物，其结构如式I所示：

及其药学上接受的盐；

其中，R₁和R₂独立地选自H、C_1-5烷基、或-(CH₂)_n-NR₃R₄，R₃和 R₄独立地选自H或C_1-5烷基，n为1、2、3、4或5。

进一步地，所述的C_1-5烷基选自甲基、乙基、丙基或异丙基。

作为优选，式I化合物具体选自如下化合物：

进一步地，所述的药学上接受的盐为式I化合物与无机酸或有机酸形成的盐，优选为式Ⅰ化合物与盐酸、硫酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、磷酸、氢溴酸、马来酸、富马酸或苹果酸形成的盐。

本发明的另一目的在于提供一种所述式I化合物的制备方法，权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其包括如下步骤：

步骤(1)：合成2,6-二(溴三苯基膦甲基)吡啶(II)：将2,6-二溴甲基吡啶溶于有机溶剂中，加热至50～80℃，加入三苯基膦，保持此温度搅拌反应6～15小时，冷却至室温，加入石油醚，固体抽滤干燥得到 2,6-二(溴三苯基膦甲基)吡啶(II)，反应式如下：

步骤(2)：式I化合物的合成：将式II化合物加入至醚类或腈类溶剂中，冷却至-75℃至-30℃，慢慢滴加1.1～2.0当量的正丁基锂，滴加完全后，在此温度下继续搅拌半个小时，然后加入式III化合物溶于醚类或腈类溶剂的溶液，继续反应1～3小时，升至室温，淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，经快速柱色谱分离得到式I化合物，反应式如下：

作为优选，所述步骤(1)中的有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、DMF或DMSO；所述2,6-二(溴三苯基膦甲基)吡啶(II)与三苯基膦的摩尔比为1:2～3。

进一步地，所述步骤(2)中，式II化合物与式III化合物的摩尔比例为1:1.05～1.2；优选为1:1.05～1.1。进一步地，作为优选，所述醚类溶剂选自THF、二氧六环。

本发明的又一目的在于提供一种组合物，其包括所述式I化合物及其药学上接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。

至于药物组合物的具体剂型，则可根据现有技术视实际需要进行选择，如片剂、散剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、注射剂等药学上的剂型；其中，口服用药片和胶囊含有传统的赋形剂如：填充物、润滑剂、分散剂、稀释剂以及粘合剂。

本发明的再一目的在于提供所述的式I化合物及其药学上接受的盐或上述的组合物用于制备抗肿瘤药物的用途，所述肿瘤优选为胶质母细胞瘤，肝癌，肺癌，宫颈癌，血癌，胃癌，尤其优选为胶质母细胞瘤。

附图说明

图1a-图1e：本发明化合物和药物Nes0694在ICR小鼠体内的分布图。

具体实施方式

尽管在本申请中示出和描述了本发明优选的实施方案，但是对本领域技术人员而言明显的是，该实施方案仅以实例的方式提供。本领域技术人员将想起大量的变更、变换和置换，这些均在本发明范围内。应理解的是，在实践本发明中，可以使用本申请所述的本发明实施方案的各种备选方案。意在所附权利要求限定了本发明范围并且由此覆盖了在这些权利要求范围内的方法和结构及它们的等同形式。

除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的含义。将本申请提及的所有专利和出版物通过引用的方式并入本文。

实施例1：化合物I-a的制备

步骤(1)：合成2,6-二(溴三苯基膦甲基)吡啶(II)

将(5.0mmol)2,6-二溴甲基吡啶溶于乙腈中，加热至70℃，加入 (5.25mmol)三苯基膦，保持此温度搅拌反应8小时，冷却至室温，加入石油醚，抽滤获得固体产物，真空干燥得到2,6-二(溴三苯基膦甲基) 吡啶(II)3.78g，96％。

步骤(2)：化合物I-a的合成：

将步骤(1)制备得到的式II化合物(0.47g，0.6mmol)加入至 THF中，冷却至-75℃，慢慢滴加1.15当量的正丁基锂，滴加完全后，在此温度下继续搅拌半个小时，然后加入式III-a化合物(0.31g，1.23 mmol)溶于THF溶剂的溶液，继续反应2小时，升至室温，加入pH约为7的缓冲溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，经快速硅胶柱色谱(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝6:1的混合溶液)分离得到式 I-a化合物，减压浓缩，得到0.33g式I-a化合物，收率:91％。

¹H-NMR(d⁶-DMSO，400MHz):δ7.92～7.52(m，2H)，7.42～ 7.12(m，1H)，4.32(t，2H)，4.16(d，2H)，3.74(d，2H)， 3.62(s，2H)，2.78(s，6H)，2.56(s，6H)，2.35(m，4H)，2.21～2.25(m，12H)，1.78(t，12H)。

ESI MS m/z 602.0[M+Na]⁺。

实施例2：化合物I-b的制备

将步骤(1)制备得到的式II化合物(0.47g，0.6mmol)加入至 THF中，冷却至-75℃，慢慢滴加1.15当量的正丁基锂，滴加完全后，在此温度下继续搅拌半个小时，然后加入式III-b化合物(0.26g，1.26 mmol)溶于二氧六环溶剂的溶液，继续反应3小时，升至室温，加入 pH约为7的缓冲溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，经快速硅胶柱色谱(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝5:1的混合溶液)分离得到式I-b化合物，减压浓缩，得到0.27g式I-b化合物，收率:87％。

¹H-NMR(d⁶-DMSO，400MHz):δ8.01～7.67(m，2H)，7.47～ 7.16(m，1H)，4.17(t，2H)，4.09(d，2H)，3.71(d，2H)， 3.59(s，2H)，3.15(m，2H)，2.74(s，6H)，2.51(s，6H)，2.35 (m，4H)，2.11～2.18(m，4H)，1.52(t，6H)；

ESI MS m/z 518.0[M+Na]⁺。

实施例3：化合物I-c的制备

将步骤(1)制备得到的式II化合物(0.47g，0.6mmol)加入至 THF中，冷却至-75℃，慢慢滴加1.15当量的正丁基锂，滴加完全后，在此温度下继续搅拌半个小时，然后加入式III-c化合物(0.22g，1.23 mmol)溶于THF溶剂的溶液，继续反应2小时，升至室温，加入pH约为7的缓冲溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，经快速硅胶柱色谱(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝8:1的混合溶液)分离得到式 I-c化合物，减压浓缩，得到0.26g式I-c化合物，收率:93％。

¹H-NMR(d⁶-DMSO，400MHz):δ7.83～7.54(m，2H)，7.42～ 7.21(m，1H)，4.51(s，2H)，3.97(d，2H)，3.61(d，2H)， 2.69(s，6H)，2.42(s，6H)，1.87(s，12H)；

ESI MS m/z 460.0[M+Na]⁺。

实施例4：本发明化合物的体外实验

1、实验材料

1.1药品与试剂：新生小牛血清(杭州四季青公司)、MEM培养液(Gibco 公司)、RPMI1640培养液(Gibco公司)、胰酶(Gibco公司)、MTT(郑州博兴生物科技有限公司)；实施例1-3化合物I-a、I-b、I-c，Nes0694(白色粉末，纯度＞98％，按照CN201610177363.1的方法制备得到)；替莫唑胺(江苏天士力帝益药业有限公司)。

1.2供试细胞：

将人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞 (MCF-7)、人官颈癌细胞(Hela)在含有10％(体积百分数)新生小牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的MEM或RPMI1640培养液中生长，在37℃的温度下，5％(体积分数)CO₂的培养箱中培养，2 天更换一次培养液，培养瓶铺满时用2.5g/L胰酶消化传代，细胞培养至对数期。

1.3仪器：CO₂培养箱(MCO-15AC，SANYO)、自动酶标仪(Mk3，美国Thermro生产)、倒置显微镜(XDS-200D，上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.4统计方法：采用SPSS-12.0进行统计学处理，计量资料均用x±s表示。

2、方法与结果

2.1配制药物原液：定量称取0.01mmol化合物I-a、I-b、I-c，Nes0694 (根据专利CN201610177363.1中的方法制备获得)、替莫唑胺，加入 0.5mL DMSO溶解后用0.5mL培养液稀释，配制成1×10⁴μmol/L的药物原液，备用。

2.2 MTT法测定本发明化合物I-a、I-b、I-c，以及Nes0694对人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)的抑制作用：取培养至对数生长期的上述细胞，细胞计数5×10⁴个/mL(K562细胞为2.5×10⁵个/mL)，接种于96孔板中，每孔液体100μL，细胞贴壁后(除K562细胞)倾去原液；然后加入含有0.3％体积分数的胎牛血清的培养液，饥饿培养；24h后更换培养液，并加入上述制备的药物原液，分别配制成0.16μmol/L、0.32μmol/L、0.63 μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L七个不同浓度作为测定组，同时设置正常细胞作为对照组(每组设置6个复孔)，继续培养24h；然后每孔加入20μL MTT，4h后倾去所有液体，加入150 μL DMSO，使固体溶解，在37℃温度下静置0.5h；用自动酶标仪在 570nm的波长下检测，630nm波长下参考；计算化合物I-a、I-b、I-c和 Nes0694对上述细胞半数抑制浓度(IC₅₀)。抑制率＝(1-测定组OD值/ 正常对照组OD值)×100％。并结合抑制率采用Probit分析计算每个化合物针对肿瘤细胞的IC₅₀，统计分析采用SPSS 11.0软件进行。

结果如表1所示。

表1：：本发明化合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)

注：与阳性对照组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，本发明化合物I-a～I-c对U87MG细胞、Hela细胞、MCF-7 细胞均具有细胞毒性，对于A549细胞毒性较弱，尤其是对于人胶质母细胞瘤细胞(U87MG)细胞毒性很强，与Nes0694和替莫唑胺相比具有优势，基本维持了这类靶向药较强的抑制活性。

实施例5：本发明化合物抑制荷瘤大鼠的实验

取Fisher344大鼠(体重200-220g)，雌雄各半，在饲养两天后，在大鼠右侧背部后肢侧注射100ul U87MG肿瘤细胞悬液(总量约1×10⁷个)；接种肿瘤细胞U87MG后次日随机分成6组，分为化合物I-a组(5mg/kg)、 I-b组(5mg/kg)、I-c组(5mg/kg)、Nes0694组(5mg/kg)、替莫唑胺(5mg/kg)和模型组(等量生理盐水)，每组10只。每日尾静脉注射一次，连续给药2周。

采用测量肿瘤直径的评价方法进行动态观察被试物抗肿瘤的效应。实验结果如表2所示。

肿瘤直径的测量次数为每周2-3次，每次测量同时还需要称量大鼠体重。

肿瘤体积的计算公式为：V＝1/2a×b×c，其中a、b、c分别表示肿瘤的长、宽、高。按照下列公式计算抑瘤率：

抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100％。

表2：本发明化合物抑瘤实验测定结果

试验结果表明：本发明的化合物组与生理盐水对照组相比，在低剂量 (5mg/kg)的用药下，就显示肿瘤体积明显减小，肿瘤抑制率达到50％以上，明显优于同等剂量的Nes0694组和替莫唑胺组。

实施例6：本发明化合物与对比化合物Nes0694在小鼠体内的分布

为了评估本发明化合物与对比化合物小鼠体内的分布特性，进行本试验。

实验方法：将ICR小鼠随机分成16组，其中8组动物(5～6只) 经其尾静脉注射Nes0694，给药剂量为5mg/kg体重。另外8组动物(每组5～6只)经由尾静脉注入本发明化合物I-a，给与剂量是按其所含 Nes0694的量计为5mg/kg体重。还有8组动物(每组1～2只)经由尾静脉注入生理盐水为空白对照组，其血浆和组织样品用于制作标准曲线。ICR小鼠在注药后的0.25、0.5、1、2、4、8、24和48小时，取其血液立即离心，留置血浆并冻存于-70℃下，便于样品集中检测。随后处死动物并取其肝脏、心脏、肺、肾脏称重，用无菌生理盐水洗去组织上的血迹后剪成小块，再用匀浆器将组织匀浆并固相萃取后。样品用标签标记后冻存于-70℃直到检测。

采用HPLC检测动物血浆和组织样品中的Nes0694和I-a含量，结果显示在图1。

按5mg/kg体重的剂量注入Nes0694和I-a到小鼠体内后，从不同时间段(48小时内)分别取得的动物血浆样品，经HPLC检测其中的Nes0694 浓度，结果显示在图1a。从图中可知，药物Nes0694进入血液0.25小时 (15分钟)后，平均血药浓度约为12.67±0.13μg/mL，随后在2小时内血中药物浓度迅速下降。I-a进入体内0.25小时后，血药浓度约为9.78±0.11μg/mL，下降缓慢，在0.5h各个时间点上，I-a实验组动物血中药物浓度都是超过Nes0694实验组。这些数据说明，药物Nes0694进入体内后随血液循环到达全身组织，很快进入各组织细胞内，使血中药物浓度迅速下降。而本发明化合物I-a进入体内后，在血液中的浓度下降较慢，以维持比药物Nes0694有更持久、更高的药物浓度，这样的结果对药物发挥抗肿瘤作用非常有利。图1b、1c、1d和1e分别显示了动物给与Nes0694 或I-a后，药物在动物的肝脏、肺、肾脏和心脏组织中的分布情况。从图1b中可知，由于肝脏是这类药物代谢的主要器官，静脉注入Nes0694后，肝中Nes0694的浓度较肺、肾脏和心脏组织中高。与Nes0694不同，在各个时间点(0.25、0.5、1、2、4、8、24和48小时)上，I-a实验组动物肝中的药物浓度都较Nes0694实验组的低。在动物的肺和肾组织中也发现了类似的药物分布态势(图1c和图1d)。另外，Nes0694用药组，心脏中的药物浓度在0.5小时左右达高峰(4.57±0.12μg/g组织)，随后逐渐下降(图1e)。与Nes0694用药组相比，从I-a动物组的心脏组织中，检测的药物浓度较低，用药0.5小时的峰值浓度比Nes0694实验组的平均低近 30％倍。上述实验结果显示，药物Nes0694在体内更容易扩散，导致相对平均的全身组织更广泛分布，对正常组织可预期产生的伤害会更大，药物副作用更加明显。相反，本发明化合物I-a，相对大地降低了药物在正常组织内的分布，从而降低了药物的毒性副作用。特别是有效地降低了药物在心脏组织中的分布，改善了这类药物对心肌细胞造成的不可逆性损害。