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CN110832067A - 新的基于微生物生物质的饲料产品 - Google Patents

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CN110832067A
CN110832067A CN201880044642.8A CN201880044642A CN110832067A CN 110832067 A CN110832067 A CN 110832067A CN 201880044642 A CN201880044642 A CN 201880044642A CN 110832067 A CN110832067 A CN 110832067A
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lactobacillus
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bifidobacterium
bacteria
bacillus
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W·科尔曼
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Oakbio Inc
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Abstract

水产饲料、动物饲料和其他食品，以及营养和药物化合物、化学物质和生物材料是可以通过微生物发酵以商业规模生产的重要商品。本发明提供了一种通过在水性培养基中培养针对这个目的特意选择的微生物细胞的聚生体从简单气体进料(如二氧化碳、氢和氧)生产这些有价值的多碳化合物的方法。除了利用廉价进料如废工业气体用于这种培养外，本文所述的平台还提供了从工业排放中除去二氧化碳和其他废气的优点，否则这些废气将造成全球气候变化。此外，微生物聚生体的培养可以为饲料混合物提供从单一培养物可能无法获得的高营养成分。

Description

新的基于微生物生物质的饲料产品
相关申请的交叉参考
本申请要求2017年7月3日提交的美国专利申请No.15/641,114的权益，将其按引用并入本文中。
背景
技术领域
本发明总体地涉及微生物发酵和工业生物技术的领域，包括用于通过气体发酵从含有碳和能量的气流生产包括高蛋白质食品、食品添加剂和其他产品的营养产品的生物方法、过程和微生物，所述气流可以是各种工业过程的副产品、副产物或产物。
背景技术
气体原料代表了可用于生长在人类和动物营养产品中使用的化学自养微生物的巨大的碳和能量资源。化学自养细菌能够从作为主要或附加能量源的无机源(如CO2、CO、CH4，以及在某些情况下，氢(H2)或甲烷(CH4))来捕获和代谢碳。通过经由代谢碳固定将无机碳转化为有机碳，这些微生物可以作为自然环境中的主要生产者。这些化学自养物种中的许多在生物反应器中可以在气体进料上进行培养用于生物质的商业化生产，所述生物质可以加工成营养产品，如动物饲料、伴侣动物饲料或甚至人类的食物以及化学品。
微生物聚生体(consortium)定义为两种或更多种共生的微生物。微生物共培养。对于作为本发明的部分描述的聚生体，化学自养微生物用于其中碳和能量的主要来源都以气体提供的系统中，使得主要生产者通过互惠的相互作用支持限定的细菌物种的聚生体。当收获时，本发明中各种限定的物种的聚生体可以用作营养产品。为了制造更理想的营养产品，期望的是使多个不同的物种一起生长，每个物种提供不同的营养特性。多种微生物的使用允许最终产品的营养组成的受控改变和定制。也可能包括一种或多种产生关键组分(如虾青素、类胡萝卜素，其是用于水产养殖的重要成分)的遗传修饰的菌株。
因此，非常需要能够增加最终生物质产品中所需脂肪酸和氨基酸的量的细菌制剂。
发明内容
本发明的一个优点是可以将干燥的生物质掺入水产饲料或其他营养产品中，以代替通常收获并用于喂养养殖的鱼和海鲜(如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼和虾)的鱼粉。这将对减轻世界渔业的压力产生重大影响(Pitcher&Cheung，2013)，世界渔业无法跟上鱼粉的预计需求。
本发明的另一个优点是可以调节聚生体的组成以微调生物质产品的营养组成。这种进行调整的能力是有利的，因为例如，最近的研究表明，根据动物自身的总氨基酸组成来调整给予实验小鼠的饲料的氨基酸组成不仅减少了所需的饲料量，而且改善动物的健康。同样，通过选择添加的各种成分的量以实现所需氨基酸特征来改变水产养殖及其他动物饲料和饲料添加剂。通过调整聚生体，可以得到许多特定用途的营养产品，包括供人类使用。甚至可以形成特定的聚生体，以帮助治疗疾病、饮食性缺陷或匹配与所提出的食用生物体的生长阶段。
然而，已知具有营养和/或药用和/或益生益处的细菌，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等，不能在气体基质(如CO2、H2、CO和CH4)上生长。
但是，已知来自贪铜菌属(Cupriavidus)、红细菌属(Rhodobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基球菌(Methylococcus)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)和副球菌属(Paracoccus)的某些化学自养微生物的菌株可在气态基质(如CO2、H2、CO和CH4)上生长。
光能自养微生物是细菌、蓝细菌和藻类，它们可以利用光能固定CO2中的碳。然而，某些光能自养细菌种也表现出化学自养代谢，因为它们能够利用氢作为能量源来驱动CO2的固定而不需要光。它们的实例是红细菌属、红螺菌属和红假单胞菌属。许多其他这样的物种在文献中是已知的。已经证明，与在一些厌氧气体发酵中使用的典型产乙酸菌相比，钩虫贪铜菌(C.necator)在CO2/H2上的生长更快，且更高效。
在化学自养条件下生长的细菌表达的蛋白质、酶、转运蛋白、脂肪、油类、维生素、辅因子和其他生物化学物质的量与传统发酵中产生的那些不同(在某些情况下，不同的类型)。这样的实例是细胞色素、醌类(例如，辅酶Q)、RuBisCO(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶)、多糖、蛋白质以及总体上不同水平和比率的氨基酸，以及不同种类、水平和比率的脂肪酸。因此，化学自养生长的细菌与异养生长的相同细菌具有不同的营养特征。这些生长差异可能对于为生物质产品提供另外的维生素、矿物质、辅因子等是有利的。
化学自养生长的细菌还具有不同的分泌活性，这影响发酵混合物的内容物。化学自养细菌(和光能自养生长的光能自养细菌)将化学物质释放到生长培养基中，如乙醇酸盐、多糖、蛋白质(包括一种或多种必需氨基酸)、氨基酸、脂肪、油类、烃、核酸、有机酸、聚羟基链烷酸、凝集素类(phasins)、类胡萝卜素(如β-胡萝卜素和叶黄素)、维生素、基因转移剂(GTA)、多糖、糖类、淀粉和其他生物分子，其然后可被非自养细菌和其他异养微生物用作生长基质和生长调节剂。这些非自养物种包括细菌、蓝细菌、藻类、酵母和真菌。某些微生物，如藻类、蓝细菌和一些可能能够自养生长且也能够异养生长并因此也可能以这种方式生长的细菌。
在一个替代的实施方案中，聚生体中的一个或多个菌株可以自然地或经遗传修饰以产生有价值的分子，如特定的脂肪酸，如多不饱和脂肪酸(例如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)、维生素、醇、糖、酮、酯、酸、二酸、着色剂、香料、调味剂、类胡萝卜素、卟啉、激素、多糖、抗生素或蛋白质产物(例如酶、治疗性蛋白质、抗生素、激素、维生素、前体、抗体或疫苗)。本发明提供了一种使用廉价的气体进料来生产此类分子的方法，即使宿主生物体不能仅靠气体生长。
在本申请中，我们描述了其中通过在气态基质上培养化学自养微生物、光能自养和非化学自养微生物来产生具有提供营养、医学和/或膳食益处的特征并且包含这些微生物的聚生体的食品或饲料产品的发明。该聚生体形成其中化学自养微生物形成食物链的基础的生态系统，非自养微生物能够在该基础上生长。本文描述的基于气体的发酵过程的目标在于与相同化学自养微生物单独生长时产生的生物质相比产生具有增强的营养价值的生物质产物。本发明的再一个经济益处是促进所需的或有益的微生物的生长，所述微生物否则不能利用作为主要碳源的廉价的CO2或其他C1进料，和/或用于能量的氢(或其他无机或C1化合物)。
已知许多微生物物种具有营养益处，或产生有益物质，或具有益生菌性质(其可以是可通过这种方法产生的产物的重要组成部分)。它们的实例是：盘状节螺蓝细菌(Arthirospira platensis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroidesamyphilus)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、栖瘤胃拟杆菌(Bacteroidesruminocola)、猪拟杆菌(Bacteroides suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium latis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus latis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、类谷糠乳杆菌(Lactobacillus parafarraginis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗特氏乳杆菌(Lactobacillus reuterii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、芽孢乳杆菌(Lactobacillus sporogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、迦得拟微绿球藻(Nannochloropsis gaditana)、湖沼微绿球藻(Nannochloropsis limnetica)、海洋微绿球藻(Nannochloropsis oceanica)、眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)、Nannochloropsis salina、产玉米黄素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)、Paracoccus carotinifaciens、马氏副球菌(Paracoccus marcusii)、副球菌属(Paracoccus sp.)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、酵母片球菌(Pediococcuscerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、薛氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、双醋酸乳链球菌(Streptococcus diacetylactis)、粪链球菌(Streptococcus faecium)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilies)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)。
附图说明
图1是根据各种实施方案在CO2、H2和O2上生长的聚生体的明视野显微照片，其显示了多个微生物物种。
图2是根据各种实施方案，根据本发明的示例性实施方案的生物反应器的示意图。
具体实施方式
根据本发明，通过培养微生物聚生体从工业过程的废气产生如蛋白质生物质和/或其他生物产物的产品、材料、中间体等。这样的气体可以包括CO2、CO、CH4和H2，从而减少环境污染而且同时节省能源和化学原料。工业流出物中可能存在的其他痕量气体，例如H2S或SO2，可以为自养初级生产细菌提供附加的营养，而此类气体的移除还提供了从气流中补救这些有毒GHG的额外益处。
根据本发明的示例性方法，将所需的气体混合物的成分引入包含一种或多种培养的利用废气成分以产生所需化合物的微生物菌株的生物反应器中。所需产物(生物质、营养物质、蛋白质等)利用针对所产生的化合物的合适回收方法，在单独的一个或多个容器中从水相回收。回收方法的实例包括萃取、蒸馏或其组合，或其他有效的回收方法。细菌从水相中去除，并进行循环使用以避免毒性和保持高细胞浓度，从而使反应速率最大化。如果需要，通过离心、膜超滤或其他技术完成细胞分离。
本发明的主要目的是提供用于从二氧化碳、氢和氧生产产物、中间体、材料等(如生物质、饲料成分、蛋白质、维生素、益生菌、天然抗生素、有机酸等)的方法和/或微生物聚生体。
本发明的另一个目的是提供用于从工业过程的废气流产生如生物质、饲料成分、蛋白质、维生素、益生菌、天然抗生素和有机酸这样的物品的方法、微生物和装置，所述工业过程如酿造、生物乙醇生产、水泥制造、炼油以及产生废CO2和/或H2的类似过程。
本发明的又一个目的是提供一种方法、微生物和装置，其涉及在有氧条件下的连续气态基质发酵以完成某些工业过程的废气流向有用产物的转化，所述有用产物如生物质、饲料成分、蛋白质、维生素、益生菌、天然抗生素和有机酸。
根据下面结合附图的详细描述，本发明的其他目的和进一步的应用范围将变得显而易见，附图中相同的部件由相同的附图标记来表示。
详述
微生物菌株。钩虫贪铜菌的优势在于可以在H2、CO2、O2的混合物上非常迅速地生长并达到高密度，并且可以长时间连续培养而没有污染。巴塞尔贪铜菌(C.basilensis)，和在替代H2添加或使用CH4的情况中，荚膜甲基球菌(Methyloccocus capsulatus)正是如此。用于聚生体的细菌菌株选择为天然存在的(即，非-GMO)、通常认为是安全的(GRAS)生物体，或者因为它们的明显有益品质和明显缺乏负面特征而选择，使得它们广泛适用于饲料和食品加工，尽管如果需要，也可以包括针对特定目的(例如，通过工程化途径的代谢产物产生)而设计的GMO生物体。本文所述的本发明的所有菌株从培养物保藏作为纯的、无外来污染的模式培养物获得。
气体供应。CO2、H2和O2可以由从工业排放器收集的烟气(称为“烟道气”)或从气体供应商处获得的纯压缩气体货物(称为“实验室气体”)、由通过工业过程产生的工艺气体、由气化炉或热解输出气、合成气、由水泥生产、由燃烧过程或由产生一种或多种所需气体的任何工业、天然或其他过程来提供。为了生产饲料、食品、保健营养品、生物制品等，优选的是没有毒性元素污染物(例如，汞)的废CO2工业来源。这种来源的实例包括来自啤酒厂和生物乙醇工厂的CO2。氢可以作为热解气、合成气的气体组合物的部分，作为如丙烯生产这样的活动的工业副产品，作为来自炼油厂的混合气流的组分或在通过蒸汽甲烷重整(SMR)方法产生的气体中，从压缩气体或从水的电解来提供。氧可以从大气中获得，作为电解的产物，或作为工业副产物气体(例如水泥烟气)的组分获得。
本发明的实施方案包括用于将工业场所的烟气收集并压缩到可运输的加压气瓶中，使得大量烟气可以被带回实验室以用于分析和微生物发酵的方法。在实验室中，用H2将CO2和O2(来自实验室气体或烟气)进一步稀释约5倍以为细菌提供对于生长优化的进料混合物。对于商业规模的操作，发酵设备可以位于气体生产场所附近，或者气体可以通过车辆或管道运输到生物质生产场所。
为了注入到发酵罐中，供气通过0.2um过滤器过滤以去除颗粒和微生物。对于小规模实验，将压缩H2、CO2和O2各自调节至20psi。气体被输送到流量分配器，其设定气体的相对比例，并通过可变面积流量计来控制进入发酵罐中的混合物和流速。气体流量调节至0.2-1.2VVM之间以在发酵的各个阶段提供足够的营养物。将搅拌速率调节在150-300rpm之间以提供充分的混合。
营养物监测。可以测量和监测输入和输出气体的组成以确定气体摄取速率、质量平衡和将气体溶解到溶液和生物质中的质量转移效率。还可以监测和补充关键营养素(如NH4、PO4&SO4)以防止可能限制细菌生长的营养素限制。
微生物接种物。用于发酵罐运行的接种物可以用多种方式来制备；每个微生物菌株可以单独生长，或者两个或更多个微生物菌株可以在单次发酵中组合在一起。异养物种总是从异养培养基上的纯培养物生长，所述培养基适合于繁殖正在生长的特定物种(或物种的组)。化学自养物种可以在气体上生长，或在某些情况下，可以在异养培养基上生长。光能自养物种可以使用光或异养培养基生长。一些光能自养物种也是化学自养的，且因此可以在气态基质上生长。接种生物反应器涉及将包含一个或多个物种的培养物无菌添加到生物反应器中。
在一些实施方案中，在发酵程序或运行开始时，用于聚生体的所有培养物在短时间内添加到生物反应器中。
在一些实施方案中，化学自养微生物在发酵开始时添加到生物反应器中，并且含有其他物种的接种培养物在之后的时间点添加。
在一些实施方案中，可以改变添加的时机、培养物添加的量和密度以及制备接种物的方法，以影响最终产物的品质、组成和/或价值。
在一些实施方案中，聚生体中使用的一个或多个菌株的另外的接种可以在之后的时间添加。
在本发明的实施方案中，培养物通过在配备有气体配件的培养基小瓶中在H2/CO2/O2上将钩虫贪铜菌和其他化学自养种生长至～1的OD620来制备。非化学自养物种在液体酵母-蛋白胨培养基(YT培养基)中生长，其是公知的和可商业购得的培养基。将生物反应器接种至OD～0.1。约5％的接种物是理想的。pH用2N NH4OH控制。发酵运行长达几天，导致1-100或更高的OD620。分析回收的生物质的蛋白质和脂质含量以及每种产物的组成。除了模式菌株，有时候使用本发明的一些实施方案钩虫贪铜菌和/或荚膜红细菌(R.capsulatus)的专有菌株，或其他微生物专有菌株。本发明的实施方案包括适应于烟气并且因此对各种有毒气体组分耐受的化学自养物种的几个菌株，如果将复杂的工业烟气用作原料，这些有毒气体组分可以包括在混合物中。在一些情况中，在之后的时间点进行一个或多个聚生体菌株的另外的接种。
在用于实施的各种实施方案中通常使用的微生物种包括表1中所示的那些：图1中的显微照片来自所有这些(除了B-3226)的发酵。
Figure BDA0002353665280000091
Figure BDA0002353665280000101
表1.
生物反应器发酵。用于化学自养合成的生物反应器用于本发明的实施。许多生物反应器的类型和设计是合适的。用于培养本申请中讨论的产品的生物反应器的关键部分是存在至少部分填充液体培养基的容器，微生物被分散于其中。液体包含微生物生长需要的化学物质，以下讨论其实例。存在至少一个用于将气态基质引入生物反应器中的液体中的接口。所述容器可以具有顶部空间，在气体穿过容器中的流体后在所述顶部空间中收集。排出口允许气体排出容器。按照需要存在用于传感器、液体或化学物质添加和移除产物、液体或样品用于测试的其他接口，如预期在发酵、细胞培养和微生物培养领域中公知的常见生物反应器上存在的。最低设计的生物反应器显示于图2中。在各种实施方案中，本发明已经在定制的基于250ml、1L和4L玻璃烧瓶的生物反应器中以及在商业制造的具有4-气体操作选项的New Brunswick Scientific Bio Flo 4500中实施。可以结合本发明使用的其他生物反应器设计可以在2011年8月6日提交的并且名称为“Chemoautotrophic BioreactorSystems and Methods of Use(化学自养生物反应器系统及使用方法)”的美国专利申请系列No.13/204,649中找到，将其按引用并入本文中。用于本发明实施方案的生物反应器可以包括一个或多个容器和/或塔或管道布置，并且可以包括，例如，连续搅拌罐反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、泡罩塔、气升式发酵罐、静态混合器、流化床、上流或下流、连续、分批或环状反应器，或适用于维持合适的气体-液体接触的任何其他容器或装置。在一些实施方案中，生物反应器可以包含第一生长容器和第二化学自养合成容器，而在其他实施方案中，在整个生长和合成阶段中使用单个容器。
在一些实施方案中，气体再循环系统可以用于提高转化效率，特别是在连续过程中，以降低总的气体需求。连续收集细胞物质对于商业生产过程是有利的，并且可以通过连续除去细胞培养液和连续补充培养基来进行，以维持培养物体积和细胞密度。在15至70℃之间的恒定或变化的温度下进行发酵，但优选温度为30℃。
监测细胞生长和物种多样性。为了监测细胞生长的进展并验证培养物的物种多样性，可以周期性地移取样品用于分析，或生物反应器系统可以包含分析设备。在一些实施方案中实施该技术时，表征包括细胞形态的显微分析，其实例显示于图1中(来自运行的完成)，其显示物种多样性得到了维持。利用配备了Amscope CCD相机的Olympus BX研究显微镜使用亮视野显微镜观察培养物的湿涂片。显微照片使用用于成像和数据储存的Amscope软件生成。还可以使用本领域公知的方法，如16S rRNA基因、23S rRNA基因或其他遗传标志物和表型指标的分析，来监测和定量物种多样性(Jovel等，2016)。使用ICN TiterTek 96-孔平板阅读器通过在620nm下的光密度(OD)测量来表征生长性能。重复测量每个发酵样品的等份试样(200ul)以绘制生长曲线。
碳捕获。可以通过进行顶部空间气体分析，以及使用烟气作为用于细菌生物质产生的唯一碳源的生长实验，来验证新的烟气来源的碳捕获。还可以通过将培养物离心、洗涤沉淀物、在冷冻干燥机中干燥细胞并将冷冻干燥的细胞称重来测定每个培养的干重。
气体混合。对于氢发酵，通常用纯氢以约8:1至1:1的比率(H2:CO2，v/v)稀释CO2进料或原始烟气，从而导致约50％-1％或更低的最终CO2浓度。O2浓度理想地为3-12％。对于甲烷发酵，通常甲烷浓度为80％至5％，CO2为40％-1％，和氧为50％至5％。在任一种系统中，CO可以高达10％，并且可以存在各种其他气体，包括硫氧化物、氮氧化物、硫化氢、分子氮或气体来源中存在的其他气体。
培养基。可以使用许多不同的矿物质培养基配方，并且改变培养基是可以影响最终产品的特征的方式之一。在各种实施方案中，通常，使用不含无机碳或复合营养素的矿物盐培养基(改进自Repaske&Mayer，1976)：Na2HPO4.2H2O 4.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，NH4C11.8g/L,MgSO4.7H2O 0.11g/L，NaHCO3 0.2g/L，FeSO4.7H2O 12mg/L，CaC12.2H2O 10mg/L，ZnSO4.7H2O 100μg/L，MnC12.4H2O 30μg/L，H3BO3 300μg/L，CoC12.6H2O 200μg/L，CuC12.2H2O10μg/L，NiC12.6H2O 20μg/L，Na2MoO4.2H2O 30μg/L。
浓缩和收获。可以通过许多方法，如过滤、重力分离或其他方法来收获生物质产物，其中许多在工业上实施。可以通过喷雾干燥、冷冻干燥、热干燥、脱水或许多其他方法来进行干燥，其中许多目前在工业上实施。
如果在进一步加工前细胞必须制成无生活力的，简单热处理是有用的。由于冷冻干燥更耗能的事实，其更适合于加工需要温和处理的非常高价值的产品。干燥的材料可以容易地与其他成分混合以形成可以替代水产饲料产品的营养鱼饲料，所述水产饲料产品通常为了蛋白质、脂肪酸和其他营养素而依赖于鱼粉。来自30L批次的培养聚生体的干燥材料的氨基酸组成(表2)与鱼粉的非常相当(IAFMM Report，1970)。
在以下提及的展示中，细胞悬浮液通过无菌出口从发酵罐取出。随后可以在标准或工艺离心机中以大约4,000×g或更高通过离心除去上清液以形成细胞沉淀物。随后在低盐缓冲液中洗涤细胞，并随后再次沉淀。随后使用商业MTS冷冻干燥机将最终的细胞糊冷冻干燥成粉末。
表2.聚生体的氨基酸组成的实例。在各种实施方案中，在具有4-气体输入和控制选项的New Brunswick Scientific BioFlo 4500生物反应器中以30L的规模培养由化学自养菌、光能自养菌和益生异养菌组成的生长的聚生体样品。由NP分析实验室(St.Louis.MO)进行了氨基酸组成分析。
氨基酸 g/100干生物质
天冬氨酸 4.49
苏氨酸 2.40
丝氨酸 1.79
谷氨酸 7.31
脯氨酸 1.67
甘氨酸 2.15
丙氨酸 3.24
缬氨酸 3.34
甲硫氨酸 1.16
异亮氨酸 2.60
亮氨酸 3.24
酪氨酸 1.71
苯丙氨酸 1.99
组氨酸 0.930
赖氨酸 3.48
精氨酸 2.45
半胱氨酸 0.312
色氨酸 0.519
专利引用
Figure BDA0002353665280000141
图1显示了在CO2、H2和O2上生长的聚生体的亮视野显微照片，2017年5月15日拍摄。这张照片显示了使用CO2作为主要碳源和H2作为主要能源生长的化学自养和异养微生物的混合物。通过箭头来表示短而细的棒100、中等长度的粗棒110(钩虫贪铜菌的特征)、长棒120(巨大芽孢杆菌的特征)和球菌130。
图2显示了作为适用于在气体上培养聚生体的生物反应器的一个实例的生物反应器200的示意图。生物反应器200可以包括用于与单独的生长容器结合使用的合成容器，或可以包括适用于生长和合成两个阶段的容器。在图2中，生物反应器200包括容器205，其在操作中容纳一定量的液体培养基210，该液体培养基210在培养中含有化学自养微生物和其他微生物。生物反应器200还包括通过其可以将气态基质220引入容器205中而用于引入液体培养基210中的基质口215、通过其可以将新鲜培养基230引入容器205中而用于引入液体培养基210中的培养基进口225和通过其可以移除培养基210，例如，以收获生物质和/或化学产品的培养基出口235。生物反应器200还可以包括顶部空间240和从顶部空间240排出气体的气体释放阀245。在一些实施方案中，培养基出口235和培养基进口225通过收获生物质170并重新调节培养基210用于再循环的系统连接。在一些实施方案中，气体释放阀245连接到将气态基质重新循环回基质口215并且可以进行增加或减少以优化气体组成的系统。

Claims (33)

1.一种食品和/或饲料添加剂产品，其包含：
化学自养和光能自养细菌以及异养微生物的聚生体，所述聚生体包括
来自贪铜菌属(Cupriavidus)、红球菌属(Rhodococcus)或甲基球菌属(Methylococcus)的化学自养细菌，
来自红细菌属(Rhodobacter)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)或节螺蓝细菌属(Arthrospira)的光能自养细菌，和
来自芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、副球菌属(Paracoccus)、片球菌属(Pediococcus)、Acidilactici、小球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)或链球菌属(Streptococcus)的异养微生物。
2.一种方法，其包括：
在系统内提供化学自养和光能自养细菌以及异养微生物的聚生体，所述系统包括填充有包含所述聚生体的水性培养基的发酵容器，所述发酵容器具有输入口，气态基质通过其引入所述水性培养基中，所述发酵容器进一步具有排出口，气体通过其排出所述发酵容器，其中所述水性培养基包含无机阴离子和无机阳离子，和其中所述水性培养基含有每种浓度不超过0.05％的添加的糖、酵母提取物、蛋白胨和/或有机碳化合物，所述聚生体包括
来自贪铜菌属(Cupriavidus)、红球菌属(Rhodococcus)或甲基球菌属(Methylococcus)的化学自养细菌，
来自红细菌属(Rhodobacter)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)或节螺蓝细菌属(Arthrospira)的光能自养细菌，和
来自芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、副球菌属(Paracoccus)、Acidilactici、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)或链球菌属(Streptococcus)的异养微生物；
将第一气态基质引入所述输入口中，所述第一气态基质包括主要是单碳原子分子形式的碳；
将第二气态基质引入所述水性培养基中，所述第二气态基质主要包括氢气(H2)或甲烷气(CH4)或其混合物，其中所述第一或第二基质中的任一种另外包括氧气(O2)；和
从所述系统收集所述细菌的细胞。
3.通过权利要求2的方法制得的产品。
4.权利要求2的方法或权利要求3的产品，其中所述无机阴离子包括磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、碳酸盐和/或铵。
5.权利要求2、3或4的方法或产品，其中所述无机阳离子包括铁、镍、钙、镁、锰和/或钴。
6.权利要求1-4或5的方法或产品，其中
所述化学自养细菌包括钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、巴塞尔贪铜菌(Cupriavidus basilensis)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)和混浊红球菌(Rhodococcus opacus)中的一种或多种，
所述光能自养细菌包括荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、深红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)和盘状节螺蓝细菌(Arthirospira platensis)中的一种或多种；和
所述异养微生物包括盘状节螺蓝细菌(Arthirospira platensis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroides amyphilus)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、栖瘤胃拟杆菌(Bacteroides ruminocola)、猪拟杆菌(Bacteroides suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium latis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、原始小球藻(Chlorella protothecoides)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacilluscellobiosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbruekii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、乳酸乳杆菌(Lactobacilluslatis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、类谷糠乳杆菌(Lactobacillusparafarraginis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗特氏乳杆菌(Lactobacillus reuterii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、芽孢乳杆菌(Lactobacillus sporogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、迦得拟微绿球藻(Nannochloropsis gaditana)、湖沼微绿球藻(Nannochloropsis limnetica)、海洋微绿球藻(Nannochloropsis oceanica)、眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)、Nannochloropsis salina、产玉米黄素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)、Paracoccus carotinifaciens、马氏副球菌(Paracoccus marcusii)、副球菌属(Paracoccus sp.)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、酵母片球菌(Pediococcuscerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、薛氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、双醋酸乳链球菌(Streptococcus diacetylactis)、粪链球菌(Streptococcus faecium)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilies)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)中的一种或多种。
7.权利要求1-5或6的方法或产品，其中所述化学自养细菌包括钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。
8.权利要求1-6或7的方法或产品，其中所述化学自养细菌包括荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)。
9.权利要求1-7或8的方法或产品，其中所述异养微生物包括动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)。
10.权利要求1-8或9的方法或产品，其中所述化学自养细菌包括混浊红球菌(Rhodococcus opacus)。
11.权利要求1-9或10的方法或产品，其中所述异养微生物包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和/或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
12.权利要求1-10或11的方法或产品，其中所述异养微生物包括巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
13.权利要求1-11或12的方法或产品，其中所述异养微生物包括酵母或真菌。
14.权利要求1-12或13的方法或产品，其中提供化学自养、光能自养和异养微生物的所述聚生体包括将所述化学自养细菌加入所述发酵容器中并且随后将光能自养和异养微生物加入所述发酵容器中。
15.权利要求1-13或14的方法或产品，其中提供化学自养、光能自养和异养微生物的所述聚生体包括同时将所述化学自养、光能自养和异养微生物加入所述发酵容器中。
16.权利要求1-14或15的方法或产品，其中所述第一气态基质中的单碳原子分子的浓度和所述第二气态基质中的氢气浓度都比环境大气中发现的浓度高。
17.权利要求1-14或15的方法或产品，其中所述单碳原子分子包括CO2，并且所述第一气态基质包括一定浓度的CO2和一定浓度的CH4，其中所述第二基质包括一定浓度的氢气，和其中全部三种浓度都高于环境大气中发现的浓度。
18.权利要求1-14或15的方法或产品，其中所述单碳分子包括CO、CO2和CH4，并且所述第一气态基质包括一定浓度的CO2、一定浓度的CH4和一定浓度的CO，其中所述第二基质包括一定浓度的氢气，和其中全部四种浓度都高于环境大气中发现的浓度。
19.权利要求1-14或15的方法或产品，其中所述单碳原子分子包括CO和CH4，和所述第一气态基质包括一定浓度的CO和一定浓度的CH4，其中所述第二基质包括一定浓度的氢气，且其中全部三种浓度都高于环境大气中发现的浓度。
20.权利要求1-14或15的方法或产品，其中所述单碳原子分子包括CH4、CO和CO2。
21.权利要求1-14或15的方法或产品，其中所述单碳原子分子包括CO和CH4，且所述第一气态基质包括一定浓度的CO和一定浓度的CH4，其中所述第二基质包括一定浓度的氢气，和其中全部三种浓度都高于环境大气中发现的浓度。
22.权利要求1-14或15的方法或产品，其中所述单碳原子分子包括CO和CH4，且所述第一气态基质包括一定浓度的CO和一定浓度的CH4，和其中两种浓度都高于环境大气中发现的浓度。
23.权利要求1-21或22的方法或产品，其中所述细菌中的一种已经被遗传修饰。
24.权利要求1-22或23的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生类胡萝卜素。
25.权利要求1-23或24的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生叶黄素。
26.权利要求1-24或25的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生维生素。
27.权利要求1-25或26的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生蛋白质。
28.权利要求1-26或27的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生虾青素。
29.权利要求1-27或28的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生多不饱和脂肪酸。
30.权利要求1-28或29的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生二十碳五烯酸。
31.权利要求1-29或30的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生二十二碳六烯酸。
32.权利要求1-30或31的方法或产品，其中所述聚生体的细菌中的一种产生包括必需氨基酸的蛋白质。
33.权利要求13的方法或产品，其中酵母或真菌包括曲霉属(Aspergillus)、酵母属(Saccharomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)或红酵母属(Rhodotorula)的种。
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