CN105603005A - 脂肪酸和衍生物的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从包含H2、CO2和O2的气体生产至少一种脂肪酸和/或其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供在含水培养基中的遗传修饰的氢氧化细菌；和(b)使所述含水培养基接触以20-70：10-45：5-35的重量比包含H2、CO2和O2的气体；其中，所述脂肪酸包含至少5个碳原子，并且其中，所述氢氧化细菌相对于野生型细菌是遗传修饰的，以提高酶E1的表达并提高酶E2的表达，所述酶E1能够催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化，所述酶E2能够催化酰基ACP至脂肪酸的转化。
Description
发明领域
本发明涉及通过生物技术方式的脂肪酸生产。具体地，本发明涉及从可再生资源的具有多于5个碳原子的脂肪酸的生物技术生产。
背景技术
脂肪酸和/或甘油三酯在多种工业中具有各种用途。在食品工业中，例如，脂肪酸和/或脂肪三酯可以用于动物饲料以及用于补充营养。脂肪酸和/或甘油三酯也可以用于化妆品和药学领域中。这些应用可需要游离脂肪酸或甘油三酯。这些脂肪酸和/或甘油三酯的天然资源相当有限。
例如，各种多不饱和脂肪酸(PUFA)和含PUFA的甘油三酯主要得自于微生物，例如被孢霉(Mortierella)和裂殖壶菌(Schizochytrium)，或产油植物，例如大豆或油菜，藻类，例如隐甲藻(Crypthecodiniumor)、褐指藻(Phaeodactylum)等，其中它们通常以其甘油三酯的形式获得。游离PUFA通常通过水解从甘油三酯制备。然而，长链多不饱和脂肪酸不能从天然油料作物植物有效地分离。
传统上，工业规模生产的脂肪酸和/或甘油三酯起始于石油化学品衍生的材料。这通常起始于对环境有害的汽油或石油的裂化。此外，由于这些起始材料的价格将与石油的价格关联，且预期石油价格在未来提高，脂肪酸和/或甘油三酯的价格也会相对于石油价格的提高而提高。
因此，期望找到不同于以纯石油为基础的更为可持续的新材料，作为用于脂肪酸和/或甘油三酯生产的起始材料，其对环境产生的破坏也更少。
过去已经描述了朝向脂肪酸生产的一系列生物技术途径。然而，由于产率低、纯度不足以及需要多步纯化程序，它们都不适合用于从可再生能源商业大规模地生产脂肪酸。具体地，供给至生物技术上有用的生物体的碳底物实际上只有小部分被转化成所需的产品，而大部分被初级代谢反应消耗。
与生物技术途径相关的另一个问题是获得产品的混合物并且因此组成难以控制的事实。更具体地，虽然可生产一系列的脂肪酸，但单一加合物的生产会是理想的。由于混合物包含在化学结构方面高度相关的化合物，以有效且直接的方式纯化或至少富集单一组分通常超出技术可行性的范围。
因此，本领域需要从可再生能源生产脂肪酸的更有效的方式。
发明内容
根据本发明的任何方面的方法尝试解决上述问题。具体地，根据本发明的任何方面的方法可以能够使用至少一种遗传修饰的氢氧化细菌(hydrogen
oxidising bacteria)，以通过首先将碳源转化成酰基CoA，并且随后将酰基CoA转化成丙二酰CoA，并且随后最后将丙二酰CoA转化成至少一种具有多于5个碳原子的脂肪酸的方式，将碳源转化成至少一种脂肪酸和/或其衍生物。根据本发明的任何方面的方法允许在不存在富含能量的有机化合物的情况下，生产脂肪酸及其衍生物。此外，根据本发明的任何方面的方法提供朝向脂肪酸及其衍生物的生产的有效生物技术途径。在根据本发明的任何方面的方法中，所得的脂肪酸及其衍生物中的更多的碳原子源自于二氧化碳分子，即与本领域中已知的其他方法相比，使用根据本发明的任何方面的方法，源自二氧化碳而不是源自任何其他有机分子(例如醇类或碳水化合物)的碳原子的比例更高。
根据本发明的一个方面，提供了从包含H2、CO2和/或O2的气体生产至少一种脂肪酸和/或其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 提供在含水培养基中的遗传修饰的氢氧化细菌；和
(b) 使所述含水培养基接触以20-70：10-45：5-35的重量比包含H2、CO2和/或O2的气体；
其中，所述脂肪酸包含至少5个碳原子，并且
其中，所述氢氧化细菌相对于野生型细菌是遗传修饰的，以提高酶E1的表达并提高酶E2的表达，所述酶E1能够催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化，所述酶E2能够催化酰基ACP至脂肪酸的转化。
根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌是指可经过工程化以产生各种脂肪酸及其衍生物的重组氢氧化细菌，所述脂肪酸衍生物包括但不限于短链醇类，例如乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇，脂肪醇、脂肪酯、烃类和蜡酯等。
在一个实施例中，本公开提供了修饰氢氧化细菌，从而使其生产并且任选地释放从可再生碳源生成的脂肪酸和/或其衍生物的方法。此类氢氧化细菌是遗传工程化的，例如，通过引入编码一种或多种蛋白的外源DNA序列，所述蛋白能够代谢可再生碳源，以生产并且在一些实例中分泌脂肪酸衍生物。随后，所述经修饰的氢氧化细菌能够用于发酵过程，以使用可再生碳源(生物质)作为起始材料生产有用的脂肪酸和/或其衍生物。在一些实例中，因为易于对其途径进行工程化以控制生长、生产以及减少或消除降低生物合成途径效率的副反应，所以使用现有的在遗传上易控制的氢氧化细菌。此外，此类修饰的氢氧化细菌可用于消耗可再生碳源以产生燃料，所述燃料能够直接作为生物燃料使用，而无需用于贮存或运输的专门方法。在其他实例中，对天然产生烃类的微生物进行工程化，以通过表达提高脂肪酸生产的外源核酸序列而过量产生烃类。
根据本发明的任何方面的方法可用于生产具有限定的碳链长度、分支和饱和水平的脂肪酸和/或其衍生物。在具体实例中，同质产品的生产降低了与发酵和分离相关的整体成本。具体地，所述脂肪酸包含至少5个碳原子。例如，所述脂肪酸可以是饱和或不饱和的。所述脂肪酸可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子。在一些实例中，所述脂肪酸包含多于20个碳原子。更具体地，所述脂肪酸和/或其衍生物可包含长度为至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34个碳的碳链。在一些实例中，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的制成的脂肪酸和/或衍生物产品的包含长度为至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34个碳的碳链。在另外其他的实例中，至少60%、70%、80%、85%、90%或95%的脂肪酸和/或衍生物产品包含1、2、3、4或5个不饱和点。具体地，根据本发明的任何方面的方法可导致脂肪酸的组合的生产。更具体地，结果可包含生产至少2、3、4、5或6种脂肪酸的组合。
根据本发明的任何方面，用于步骤(b)中的碳源可以是任何可再生的碳源。具体地，所述碳源可包含H2、CO2和/或O2。更具体地，所述碳源包含氧气，允许在有氧的条件下生产脂肪酸。
氢气在引入步骤(b)中的H2、CO2和O2气体中的分压可以是0.1-100巴、0.2-10巴，特别是0.5-4巴。二氧化碳在引入步骤(b)中的含H2、CO2和O2气体中的分压可以是0.03-100巴，特别是0.05-1巴，更特别是0.05-0.3巴。氧在引入步骤(b)中的H2、CO2和O2气体中的分压可以是0.001-100巴，特别是0.04-1巴，更特别是0.04-0.5巴。具体地，步骤(b)中的H2和/或CO2的来源可以是合成气。所述合成气可以与氧组合使用，成为引入步骤(b)中的H2、CO2和O2气体的来源。更具体地，根据本发明的任何方面，引入步骤(b)中的H2、CO2和O2气体可包含合成气。
例如，合成气可以从煤气化的副产物提供。因此，氢氧化细菌将作为废产品的物质转化成有价值的原材料。
可选地，可以通过广泛可得的低成本农业原料的气化提供合成气，用于根据本发明的任何方面的方法。由多种能够转化成合成气的原材料的实例，几乎所有形式的植物都可以用于此目的。原材料的实例为多年生草例如芒草，玉米残渣，加工废物例如锯末。通常，主要经过热解、部分氧化和/或蒸汽重整，可以在干燥生物质的气化设备中获得合成气，且主要产品为例如H2、CO2和O2。通常对部分的产品气体进行加工以优化产品产率并且避免焦油的形成。可以使用石灰和/或白云石进行对合成气中不期望的焦油和CO的裂化。这些方法详细描述于Reed,
TB, 1981中。也可使用不同来源的混合物，用于合成气的生成。
具体地，步骤(b)中的合成气中含有的碳包含氢氧化细菌在方法步骤(b)中可得的所有碳源的至少50重量%或至少70重量%、90重量%的碳，其中煤物质的重量百分比涉及碳原子。除了来自合成气的CO2之外的其他碳源可以是氢氧化细菌可得的，例如以含水培养基中碳水化合物的形式。
更多的CO2源，例如烟道气、石油炼厂气、酵母发酵或梭菌发酵的产物，来自含纤维素材料的气化或煤气化的废气等，可作为CO2源用于引入步骤(b)的H2、CO2和O2气体中。
具体地，引入步骤(b)的气体以分别为20-70：10-45：5-35的重量比包含H2、CO2和/或O2。H2和O2的比例可根据来源而改变。例如，H2与O2的重量比可以是2:1、4:1、5:1等。
术语“氢氧化细菌”可以与术语“氢氧混合气细菌(knallgas bacterium)”互换使用，并且是指能够氧化氢，使用氧作为终末电子受体，并且能够在有氧条件下固定二氧化碳的任何细菌。具体地，氢氧混合气细菌可以选自甲烷杆菌(Methanobacterium)、醋杆菌(Acetobacterium)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)、脱硫单胞菌(Desulfomonas)、副球菌(Paracoccus)、无色杆菌(Achromobacter)、产碱菌(Alcaligenes)、假单胞菌(Pseudomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)和贪铜菌(Cupriavidus)。更具体地，氢氧混合气细菌可以是贪铜菌菌株，甚至更具体地是钩虫贪铜菌H16 (Cupriavidus
necator H16)。示例性的氢氧混合气细菌可包括但不限于：敏捷食酸菌(Acidovorax
facilis)，食酸菌属种(Acidovorax sp.)，真养产碱菌(Alcaligenes eutropha)、产碱菌属种(Alcaligenes sp.)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium
japonicum)、慢生根瘤菌属种(Bradyrhizobium sp.)、钩虫贪铜菌DSM 531(Cupriavidus necator DSM 531)、螺杆菌属种(Heliobacter sp.)、氢杆菌属种(Hydrogenobacter
sp.)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)、真养氢单胞菌(Hydrogenomonas eutropha)、泛养氢单胞菌(Hydrogenomonas pantotropha)、氢单胞菌属种(Hydrogenomonas sp.,)、易捷氢单胞菌(Hydrogenomonas facilis)、氢噬胞菌属种(Hydrogenophaga sp.)、海洋氢弧菌(Hydrogenovibrio
marinus)(菌株MH-110)、氢弧菌属种(Hydrogenovibrio
sp.)、氢氧微生物(Oxyhydrogen microorganism)、氢嗜热假单胞菌(Pseudomonas hydrogenothermophila)、噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)、假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)、真养劳尔氏菌(Ralstonia
eutropha)、劳尔氏菌属种(Ralstonia sp.)、大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)、根瘤菌属种(Rhizobium sp.)、不透明红球菌(Rhodococcus
opacus)、红球菌属种(Rhodococcus sp.)、嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophila)、生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonas blastica)、荚膜红假单孢菌(Rhodopseudomonas capsulata)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、类球红细菌(Rhodopseudomonas sheroides)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、绿色红假单胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、红假单胞菌属种(Rhodoseudomonas sp.)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、红螺菌属种(Rhodospirillum sp.)、桃红荚硫菌(Thiocapsa
roseopersicina)、荚硫菌属种(Thiocapsus
sp.)、争论贪噬菌(Variovorax paradoxus)、贪噬菌属种(Variovorax sp.)、黄色杆菌属种(Xanthobacter
sp.)、海洋嗜热解氢杆菌(Hydrogenothermus marinus)、真养劳尔氏菌(Ralstonia eutropha)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus
necator)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、争论产碱菌(Alcaligenes paradoxus)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、敏捷假单胞菌(Pseudomonas facilis)、黄假单胞菌(Pseudomonas flava)、帕氏假单胞菌(Pseudomonas
palleronii)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonas
saccharophila)和红球菌属种(Rhodococcus
sp.)(灰暗诺卡氏菌(Nocardia opaca))、类黄假单胞菌(Pseudomonas pseudoflava)。在一个实例中，氢氧混合气细菌可以是经过遗传修饰而成为氢氧混合气细菌的细菌，而相应的野生型菌株则不是氢氧混合气细菌。在这种情况下，所述细菌可以是顺从这种修饰的任何生物体，例如大肠杆菌(E.
coli)。
如本文使用的短语“提高的酶活性”应理解为提高的细胞内活性。基本上，酶促活性的提高可以通过提高编码所述酶的一个或多个基因序列的拷贝数量，使用强启动子或采用编码具有提高活性的相应酶的基因或等位基因，并且任选地通过组合这些措施而实现。根据本发明的任何方面使用的遗传修饰的细胞或生物体是例如通过转化、转导、接合或这些方法的组合产生的，其中使用包含期望的基因，这个基因的等位基因或其一部分的载体和使得所述基因可以表达的载体。具体地，通过将基因或等位基因整合到细胞的染色体中，或染色体外的复制载体实现异源表达。
遗传修饰的细胞可以在遗传上不同于野生型细胞。根据本发明的任何方面的遗传修饰的细胞与野生型细胞之间的遗传差异可以是在所述遗传修饰的细胞中存在野生型细胞中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等。在一个实例中，根据本发明的任何方面的遗传修饰的细胞可包含酶，所述酶使细胞能够生产至少一种脂肪酸和/或其酰基辅酶A；并将脂肪酸和/或其酰基辅酶A转化成脂肪酸酯。相对于本发明的遗传修饰的细胞，野生型细胞可没有或具有不可检测到的酶活性，所述酶使所述遗传修饰的细胞能够产生至少一种脂肪酸和/或其衍生物。
如本文连同细胞使用的短语“野生型”可指代具有如在野外天然所见形式的基因组构成的细胞。此术语可应用于完整细胞和单独的基因二者。因此，术语“野生型”不包括这样的细胞或这样的基因，其中已使用重组方法至少部分地人工改变所述基因序列。
技术人员可以能够使用本领域中已知的任何方法对细胞进行遗传修饰。根据本发明的任何方面，所述遗传修饰的细胞可以经过遗传修饰，从而在指定的时间段，在2小时内，具体地在8小时或24小时内，形成比野生型细胞多至少两倍，特别是至少10倍，至少100倍，至少1000倍，或至少10000倍的脂肪酸和/或其衍生物。可以通过例如在相同的条件(相同的细胞密度、相同的营养培养基、相同的培养条件)下，将根据本发明的任何方面的细胞和野生型细胞各自分离地在适合的营养培养基中培养指定的时间段，并且随后测定所述营养培养基中目标产物(脂肪酸、其酰基辅酶A和各自的脂肪酸酯)的量，来测定产品形成的增加。
根据本发明的任何方面，所述氢氧化细菌可以相对于野生型细菌是遗传修饰的，以提高酰基-ACP或酰基-CoA的生产，减少脂肪酸衍生物和中间物的分解代谢，或减少在生物合成途径中特定点的反馈抑制。在一个实例中，也可以转移细胞资源以有助于脂肪酸的过量生产，例如，可以削弱乳酸、琥珀酸和/或乙酸途径，并且可以过表达乙酰-CoA羧化酶(ACC)。具体地，可以在根据本发明的任何方面的氢氧化细菌中提高酶E1的表达，所述酶E1可以能够催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化。在一个实例中，根据本发明的任何方面的氢氧化细菌还可以包含酶E2表达的提高，所述酶E2可以能够催化酰基ACP至脂肪酸的转化。根据本发明的任何方面的氢氧化细菌可包含E1和E2表达的增加。
根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以在期望的环境中培养，例如具有有限的甘油(培养基中小于1% w/v)的环境。这样，这些氢氧化细菌将具有提高的乙酰-CoA生产水平。在乙酰-CoA生产水平提高的基础上，还可以通过使用包含在从头合成的质粒中的编码accABCD
(乙酰CoA羧化酶，例如登录号AAC73296，EC 6.4.1.2)的DNA对上文所述的氢氧化细菌进行遗传修饰，从而提高丙二酰-CoA的生产。可以通过在从头合成的质粒中进一步包括编码脂肪酶(例如，登录号CAA89087、CAA98876)的DNA而实现脂肪酸的过量生产。
在一些实例中，过表达乙酰-CoA羧化酶(ACC)以使其细胞内浓度例如相对于天然表达水平提高至少2倍，例如至少5倍，或至少10倍。
在一个实例中，可使用plsB (例如登录号AAC77011)
D311E突变以除去对酰基-CoA池的限制。
在遗传修饰的氢氧化细菌中还可以包含sfa基因(Fab
A的抑制基因，例如具有登录号AAN79592)的过表达，从而提高单不饱和脂肪酸的生产(Rock等人，1996)。
具体地，E1可以选自能够催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化的酶的组。因此，E1可以选自E1a
accA (EC 6.4.1.2)、E1b
accB (EC 6.4.1.2)、E1c
accC (EC 6.3.4.14)、E1d
accD (EC 6.4.1.2)及其组合。更具体地，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经遗传修饰而提高E1a、E1b、E1c、E1d、E1aE1b、E1aE1c、E1aE1d、E1bE1c、E1bE1d、E1cE1d、E1aE1bE1c 、E1aE1bE1d、E1bE1cE1d或E1aE1bE1cE1d的表达。
具体地，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而过表达至少一种酶E2，所述酶E2能够催化酰基ACP至脂肪酸(可能为游离脂肪酸)的转化。更具体地，E2可以是硫酯酶。甚至更具体地，E2可以选自酰基-ACP硫酯酶E2a、酰基-CoA硫酯酶E2b、酰基-硫酯酶E2c等。具体地，E2a (EC 3.1.2.14或EC
3.1.2.22)可以是能够催化酰基-ACP硫酯的水解的任何酶；E2b
(EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC
3.1.2.20或EC 3.1.2.22)可以是能够催化酰基-CoA硫酯的水解的任何酶；E2c (EC
3.1.2.2、EC 3.1.2.4、EC
3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC
3.1.2.22)可以是能够催化酰基-硫酯和醇至羧酸酯的转化的任何酶。可以选择E2以提供同质的产品。
更具体地，E2可以是E2a。例如，可以通过削弱使用C18:1-ACP的硫酯酶C18
(例如登录号AAC73596和POADA1)，以及表达使用C10-ACP的硫酯酶C10 (例如登录号Q39513)，生产C10脂肪酸及其衍生物。因此，产生具有10个碳的链长度的脂肪酸和/或其衍生物的相对均质的群体。在另一个实例中，可以通过削弱产生非-C14脂肪酸的内源硫酯酶，以及表达使用C14-ACP的硫酯酶(具有登录号Q39473)，生产C14脂肪酸及其衍生物。在又另一个实例中，可以通过表达使用C12-ACP的硫酯酶(例如登录号QQ41635)以及削弱产生非-C12脂肪酸的硫酯酶，生产C12脂肪酸及其衍生物。下表1中提供了可用于生产特定脂肪酸的E2的实例。可以使用本领域中已知的方法证实乙酰基CoA、丙二酰CoA和脂肪酸的过量生产，例如通过使用放射性前体，在细胞裂解后HPLC和GC-MS。
| 登录号 | 来源生物 | 基因 | 优先产生的产物 |
| AAC73596 | 大肠杆菌 | 不含前导序列的tesA | C18:1 |
| Q41635 | 加州月桂(Umbellularia californica) | fatB | C12:0 |
| Q39513; | 萼距花(Cuphea hookeriana) | fatB2 | C8:0 – C10:0 |
| AAC49269 | 萼距花 | fatB3 | C14:0 – C16:0 |
| Q39473 | 樟树(Cinnamonum camphorum) | fatB | C14:0 |
| CAA85388 | 拟南芥(Arabidopsis thaliana) | fatB [M141T]* | C16:1 |
| NP189147; NP193041 | 拟南芥 | fatA | C18:1 |
| CAC39106 | 大豆慢生根瘤菌(Bradyrhiizobium japonicum) | fatA | C18:1 |
| AAC72883 | 萼距花 | fatA | C18:1 |
表1：用于从酰基-ACP生产脂肪酸的硫酯酶的实例。
根据本发明的任何方面，所述氢氧化细菌可以经遗传修饰而表达选自E2a、E2b和E2c的E2，连同E1a、E1b、E1c、E1d、E1aE1b、E1aE1c、E1aE1d、E1bE1c、E1bE1d、E1cE1d、E1aE1bE1c 、E1aE1bE1d、E1bE1cE1d或E1aE1bE1cE1d。更具体地，所述氢氧化细菌可以经遗传修饰而表达E1aE1bE1cE1dE2a。
在一个实例中，E1a与AAC73296或EG11647的多肽具有至少50%的序列同一性；E1b与EG10275的多肽具有至少50%的序列同一性；E1c与EG10276的多肽具有至少50%的序列同一性；和/或E1d与EG10217的多肽具有至少50%的序列同一性，及其组合。根据本发明的任何方面使用的E1a、E1b、E1c和E1d可包含与accA
(AAC73296或EG11647)、accB
(EG10275)、accC (EG10276)、accD (EG10217)及其组合的任一序列的多肽具有至少60、65、70、75、80、85、90、95、98或100%的序列同一性。具体地，所述氢氧化细菌可以经过遗传修饰而至少包含用于催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化的任意多肽的功能性片段。
在一个实例中，E2与选自以下的多肽具有至少50%的序列同一性：AAC79596、ACC49269、CAA58388、NP189147、NP193041、、AAC72883、AAC72881.1、ABB71579.1、CAC19934.1、AAC49180.1
(由SEQ ID NO: 10编码)、AAC49783.1、AAC49179.1、CAB60830.1、ABB71581.1、AAC49269.1、CAC19933.1、CAA54060.1、AAC72882.1、Q39513.1、AAC49784.1、ABO38558.1、ABO38555.1、ABO38556.1、ABO38554.1、ADB79568.1、ADB79569.1、ACQ57188.1、ACQ57189.1、ABK96561.1、ACQ63293.1、ACQ57190.1、Q9SQI3.1、ABU96744.1、ABC47311.1、XP_002324962.1、AAD01982.1、AAB51525.1、ACV40757.1、XP_002309244.1、CBI28125.3、ABD91726.1、XP_002284850.1、XP_002309243.1、XP_002515564.1、ACR56792.1、ACR56793.1、XP_002892461.1、ABI18986.1、NP_172327.1、CAA85387.1、CAA85388.1、ADA79524.1、ACR56795.1、ACR56794.1、CAN81819.1、ACF17654.1、AAB71729.1、ABH11710.1、ACQ57187.1、AAX51637.1、AAB88824.1、AAQ08202.1、AAB71731.1、AAX51636.1、CAC80370.1、CAC80371.1、AAG43858.1、ABD83939.1、AAD42220.2、AAG43860.1、AAG43861.1、AAG43857.1、AAL15645.1、AAB71730.1、NP_001068400.1、EAY86877.1、NP_001056776.1、XP_002436457.1、NP_001149963.1、ACN27901.1、EAY99617.1、ABL85052.1、XP_002437226.1、NP_001151366.1、ACF88154.1、NP_001147887.1、XP_002453522.1、BAJ99650.1、EAZ37535.1、EAZ01545.1、AAN17328.1、EAY86884.1、EEE57469.1、Q41635.1、AAM09524.1、Q39473.1、NP_001057985.1、AAC49001.1、XP_001752161.1、XP_001770108.1、XP_001784994.1、XP_002318751.1、NP_001047567.1、XP_002322277.1、XP_002299627.1、XP_002511148.1、CBI15695.3、XP_002299629.1、XP_002280321.1、CAN60643.1、XP_002459731.1、XP_002975500.1、XP_002962077.1、XP_001773771.1、NP_001151014.1、XP_002317894.1、XP_002971008.1、XP_001774723.1、XP_002280147.1、XP_002526311.1、XP_002517525.1、XP_001764527.1、ABI20759.1、BAD73184.1、XP_002987091.1、XP_002985480.1、CBI26947.3、ABI20760.1、XP_002303055.1、XP_002885681.1、ADH03021.1、XP_002532744.1、EAY74210.1、EEC84846.1、EEE54649.1、AAG35064.1、AAC49002.1、CAD32683.1、ACF78226.1、BAJ96402.1、XP_002462626.1、NP_001130099.1、XP_002462625.1、ABX82799.3、Q42712.1、NP_193041.1、AAB51524.1、NP_189147.1、ABR18461.1、XP_002863277.1、AAC72883.1、AAA33019.1、CBI40881.3、XP_002262721.1、AAB51523.1、NP_001063601.1、ADB79567.1、AAL77443.1、AAL77445.1、AAQ08223.1、AAL79361.1、CAA52070.1、AAA33020.1、CAA52069.1、XP_001785304.1、CAC39106.1、XP_002992591.1、XP_002968049.1、XP_001770737.1、XP_001752563.1、AAG43859.1、XP_002978911.1、XP_002977790.1、ACB29661.1、XP_002314829.1、XP_002991471.1、EAZ45287.1、XP_002986974.1、EEC73687.1、XP_002312421.1、ACJ84621.1、NP_001150707.1、AAD28187.1、XP_001759159.1、XP_001757193.1、XP_002322077.1、ABE01139.1、XP_002447294.1、AAX54515.1、AAD33870.1。具体地，E2可以选自：AAC72881.1、ABB71579.1、CAC19934.1、AAC49180.1、AAC49783.1、AAC49179.1、CAB60830.1、ABB71581.1、AAC49269.1、CAC19933.1、CAA54060.1、AAC72882.1、Q39513.1、AAC49784.1、AAC72883.1、Q41635.1和AAC49001.1及其组合。根据本发明的任何方面使用的E2可以包含与上文提供的任一序列及其组合的多肽的至少60、65、70、75、80、85、90、95、98或100%的序列同一性。具体地，所述氢氧化细菌可以经过遗传修饰而至少包含用于催化酰基ACP到至少一种脂肪酸的转化的任意多肽的功能性片段。
在一些实例中，脂肪酸可经过进一步的步骤以产生选自丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、烃类、蜡酯等的至少一种脂肪酸衍生物。
在一个实例中，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而过表达至少一种蜡酯合酶(EC 2.3.1.75) (E21)。所述遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而表达E1aE1bE1cE1dE2E21。在另一个实例中，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而过表达至少一种醇乙酰转移酶(2.3.1.84) (E22)。在另外其他的实例中，所述遗传修饰的氢氧化细菌可以经遗传修饰而表达E1aE1bE1cE1dE2E21E22、E1aE1bE1cE1dE2E22等。
在另外其他的实例中，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而过表达至少一种酰基-CoA还原酶(EC 1.2.1.50) (E23)和至少一种醇脱氢酶(EC 1.1.1.1) (E24)。具体地，所述遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而表达E1aE1bE1cE1dE2E23E24、E1aE1bE1cE1dE2E23、E1aE1bE1cE1dE2E24等。
在进一步的实例中，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而过表达至少一种形成脂肪醇的酰基-CoA还原酶(1.1.1.*) (E25)。具体地，所述遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而表达E1aE1bE1cE1dE2E25等。
在一个实例中，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而相对于野生型细菌提高酶E26 (脂肪酸甲基转移酶(EC 2.1.1.15))的表达。具体地，所述遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而表达E1aE1bE1cE1dE2E26等。
根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌也可以经修饰而使一种或多种内源基因在功能上缺失或削弱，从而有助于脂肪酸及其衍生物的生产。例如ackA (EC
2.7.2.1)、ackB (EC 2.7.2.1)、adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10)、fabF (EC 2.3.1.179)、fabR (登录号NP_418398)、fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-)、GST (EC 6.3.2.3)、gpsA (EC
1.1.1.94)、ldhA (EC 1.1.1.28)、pflB (EC EC 2.3.1.54)、plsB (EC 2.3.1.15)、poxB (EC 1.2.2.2)、pta (EC 2.3.1.8)、谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其组合。
根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌也可以经修饰而使一种或多种内源基因过表达。例如，pdh、panK、aceEF (编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的EIp脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分；登录号：NP_414656、NP_414657，EC: 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)、accABCD /fabH /fabD/fabG/acpP/fabF
(登录号：Q0KCA7、G0EWI2、F8GYI0、G0EWI3、F8GWN5、G0ERC9、CAD85557、CAD85558、NP_842277、NP_841683、NP_415613、EC 6.4.1.2 C、EC: 2.3.1.180、
2.3.1.39、1.1.1.100、1.6.5.3、 2.3.1.179)，编码脂肪酰基-CoA还原酶的基因(登录号：AAC45217，EC 1.2.1.-)、UdhA或类似的基因(编码吡啶核苷酸转氢酶，登录号：CAA46822，EC: 1.6.1.1)和编码脂肪酰基-CoA还原酶的基因(登录号：AAC45217, EC
1.2.1.-)。
脂肪酸合酶(FAS)是催化酰基链的起始和延伸的一组肽(Marrakchi等人，2002)。酰基载体蛋白(ACP)以及FAS途径中的酶控制产生的脂肪酸的长度、饱和度和分支。能够包括在FAS中的酶包括但不限于AccABCD、FabD、FabH、FabG、FabA、FabZ、FabI、FabK、FabL、FabM、FabB、FabF等。取决于期望的特定脂肪酸，可以过表达或削弱所述基因，以提供对脂肪酸的生产适合的条件。根据本发明的任何方面的脂肪酸生产的前体是乙酰-CoA和丙二酰-CoA。经工程化而过量产生这些组分的氢氧化细菌可以用作后续遗传工程化步骤的起点，以提供脂肪酸衍生物，例如脂肪酸酯、烃类、脂肪醇等。可组合或单独地对宿主氢氧化细菌菌株进行多种不同的修饰，以获得提高的酰基CoA/丙二酰CoA/脂肪酸和脂肪酸衍生物的生产。例如，为了提高乙酰CoA生产，可以构建具有均在组成型或相反可控制的启动子的控制下的pdh、panK、aceEF (编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的EIp脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)，fabH/fabD/fabG/acpP/fabF，在一些实施例中，和编码脂肪酰基-CoA还原酶和醛脱羰基酶的其他DNA的质粒。这些基因的示例性的Genbank登录号为：pdh
(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK (也称作coaA、AAC76952)、(E3和E4)aceEF (AAC73227、AAC73226)、(E12)fabH
(AAC74175)、(E10)fabD (AAC74176)、(E11)fabG (AAC74177)、(E5)acpP (AAC74178)和fabF (AAC74179)。
可以通过使用包含对应基因的无效突变或缺失突变的条件复制型或非复制型质粒的转化，或通过取代启动子或增强子序列，在根据本发明的任何方面的工程化的氢氧化细菌中敲除其他酶，例如fadE、gpsA、IdhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB，或可以降低其表达水平。这些基因的示例性的Genbank登录号为：fadE (AAC73325)、gspA (AAC76632)、IdhA (AAC74462)、pflb (AAC73989)、adhE (AAC74323)、pta (AAC75357)、poxB (AAC73958)、ackA (AAC75356)和ackB (BAB81430)。
甚至更具体地，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可经修饰而过表达选自以下的至少一种酶：E3 aceE
(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)、E4 aceF (EC 1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)、E5 acpP (AAC74178)、E6 fadD (EC 2.3.1.86)、E7 cerl (EC 4.1.99.5)、E8 fabA (EC4.2.1.60)、E9 fabB (EC 2.3.1.41)、E10 fabD (EC 2.3.1.39)、E11 fabG (EC 1.1.1.100)、E12 fabH (EC 2.3.1.180)、E13 fabI (EC 1.3.1.9)、E14 fabZ (EC 4.2.1.-)、E15脂肪酶(EC
3.1.1.3)、E16丙二酰-CoA脱羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)、E17 panD
(EC 4.1.1.11)、E18 panK (EC
2.7.1.33)、E19 pdh (EC
1.2.4.1)、E20 udhA (EC
1.6.1.1)及其组合。在一个实例中，根据本发明的任何方面的遗传修饰的氢氧化细菌可以经修饰而过表达如上文所述的E1a、E1b、E1c和/或E1d及其组合，连同选自E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19和E20的至少一种酶。在一个实例中，所述氢氧化细菌可经过遗传修饰而表达E1aE1bE1cE1d和选自E3至E20的至少一种酶，或E3至E20的所有酶。具体地，根据本发明的任何方面的氢氧化细菌可连同至少E6一起过表达E1aE1bE1cE1d。
除非另有指出，本文使用的所有技术和科学术语具有如技术人员通常所理解相同的含义。技术人员可使用本领域中已知的任何方法。这些方法的一些实例提供在本说明书中。所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不用于限定。
本说明书全文中使用的登录号来自于由美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(美国国家生物技术信息中心)。所述登录号如2014年6月30日的数据库中所提供。类似地，本说明书全文中提供的EC编号来自于由东京大学部分赞助，由Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics维护的KEGG Ligand数据库。所述EC编号如2014年6月30日的数据库中所提供。
具体实施方式
实施例
如本领域技术人员可理解的，可对上文描述的优选实施方式进行设计、构建或操作中的改变或改进而不脱离权利要求书的范围。期望例如这些变化包涵在权利要求书的范围中。
实施例
1
用于使用真养劳尔氏菌制备脂肪酸的质粒的构建
为了构建从真养劳尔氏菌生产脂肪酸的质粒，合成由以下组件组成的3个合成表达盒：
真养劳尔氏菌groEL基因的核糖体结合位点(SEQ
ID NO: 1)，编码来自萼距花的硫酯酶的基因ChFATB2 (SEQ
ID NO: 2)，其已经在质体靶向序列的5'-截短，大肠杆菌rrnB基因的终止子(SEQ ID NO: 5)，其中在真养劳尔氏菌的翻译中，用于ChFATB2的编码区是密码子优化的(RBS RegroEL-ChFATB2-T；SEQ
ID NO: 6)。
真养劳尔氏菌groEL基因的核糖体结合位点(SEQ ID NO: 1)，编码来自椰子(Cocos nucifera)的硫酯酶的基因CnFATB3 (SEQ
ID NO:3)，大肠杆菌rrnB基因的终止子(SEQ
ID NO: 5)，其中在真养劳尔氏菌的翻译中，用于CnFATB3的编码区是密码子优化的(RBS RegroEL-CnFATB3-T；SEQ
ID NO: 7)。
真养劳尔氏菌groEL基因的核糖体结合位点(SEQ ID NO: 1)，编码来自加州月桂(Umbellularia californica)的硫酯酶的基因UcFATB1 (SEQ ID NO: 4)，大肠杆菌rrnB基因的终止子(SEQ ID NO: 5)，其中在真养劳尔氏菌的翻译中，用于UcFATB1的编码区是密码子优化的(RBS RegroEL-UCTE-T；SEQ
ID NO: 8)。
随后，经KpnI / HindIII，将表达盒RBS
RegroEL-ChFATB2-T、RBS
RegroEL-CnFATB3-T和RBS
RegroEL-UcFATB1-T克隆到广宿主范围表达载体pBBR1MCS-2 (SEQ
ID NO: 9)中，从而使基因表达在大肠杆菌lacZ启动子的控制之下。所得的表达质粒命名为PbBr-ChFATB2、PbBr-CnFATB3和PbBr-UcFATB1，分别具有SEQ ID NO: 10、11和12的序列。
实施例
2
引入用于在真养劳尔氏菌中生产脂肪酸的质粒
将来自上文的质粒转染到感受态的大肠杆菌S17-1细胞中，在该菌株中来自真养劳尔氏菌的质粒在其他菌株之间的接合转移是可能的。出于这种目的，进行使用各自质粒的Spotmating接合(如FRIEDRICH等人，1981)，其中大肠杆菌S17-1株是供体，且真养劳尔氏菌H16 (重新分类为真养产碱菌，DSMZ
428)和真养劳尔氏菌PHB-4 (重新分类为真养产碱菌，DSMZ
541)是受体。在所有情况下都获得了接合子，其携带各自的质粒，并且相应的菌株命名如下：
真养劳尔氏菌H16 PbBr-ChFATB2，真养劳尔氏菌H16 PbBr-CnFATB3，真养劳尔氏菌H16
PbBr-UcFATB1，真养劳尔氏菌PHB-4-PbBr ChFATB2，真养劳尔氏菌PHB-4-PbBr CnFATB3，和真养劳尔氏菌PHB-4-PbBr
UcFATB1。
实施例
3
脂肪酸的定量
发酵样品中辛酸、3-羟基癸酸、癸酸、月桂酸、3-羟基肉豆蔻酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸的定量，通过基于对所有分析物的内部校准的HPLC-ESI / MS进行，并且使用内标：辛酸、3-羟基癸酸、癸酸、月桂酸、3-羟基肉豆蔻酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、硬脂酸的D3月桂酸(甲基-D3，99%)，和棕榈酸、油酸、硬脂酸的D3 (D3-甲基，98%)。
使用以下设备：
● HPLC系统：Surveyor
(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)，由Surveyor MS泵，Surveyor
Autosampler Plus和Surveyor
Surveyor PDA组成
● 质谱仪：TSQ Vantage HESI
II - 源 (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
Massachusetts, USA)
HPLC柱：XBridge BEH C8，100 x 2.1 mm，粒径：2.5微米，孔径130 Å (Waters, Milford Massachusetts, USA)。
通过将1200 µl丙酮和300 µl的样品混合约10秒，且随后在约13,000 rpm离心5分钟制备样品。取出澄清上清，并在使用丙酮适当稀释后进行分析。对于各900µl的稀释样品，移入100 µl的ISTD溶液。
使用上述HPLC柱进行HPLC分离。注射体积为2µl，柱温度为25℃，流速为0.3 mL/min。移动相由洗脱液A (水 + 10 mM乙酸铵，用氨中和，调整至pH = 9)和洗脱液B (乙腈/移动相A 95/5)。使用以下梯度：
。
在负电离中进行ESI-MS，使用来自ESI源的以下参数：
● 喷雾电压：3000 V
● 蒸发器温度：380℃
● 鞘气体压力：40
● 辅助气体压力：15
● 毛细管温度：380℃。
通过使用以下参数的“单离子监控(SIM)”进行单个化合物的检测和量化：
。
在培养以下菌株后，可检测到脂肪酸的形成：
● 真养劳尔氏菌H16 pBBR-ChFATB2
● 真养劳尔氏菌H16 pBBR-CnFATB3
● 真养劳尔氏菌H16 pBBR-UcFATB1
● 真养劳尔氏菌PHB-4
pBBR-ChFATB2
● 真养劳尔氏菌PHB-4
pBBR-CnFATB3
● 真养劳尔氏菌PHB-4
pBBR-UcFATB1。
实施例
4
经氢氧混合气的使用，使用遗传修饰的细胞用于脂肪酸生产
用于脂肪酸形成的遗传修饰的细胞：
● 真养劳尔氏菌H16 pBBR-ChFATB2
● 真养劳尔氏菌H16 pBBR-CnFATB3
● 真养劳尔氏菌H16 pBBR-UcFATB1
● 真养劳尔氏菌PHB-4
pBBR-ChFATB2
● 真养劳尔氏菌PHB-4
pBBR-CnFATB3
● 真养劳尔氏菌PHB-4
pBBR-UcFATB1。
根据Vollbrecht等人，1978，所有菌株均培养在具有挡板的2 x 250 ml摇瓶的25ml培养基中。
培养基包含(NH4)2HPO4 2.0 g/l；KH2PO4 2.1g/l；MgSO4 × 7 H2O
0.2 g/l；FeCl3 × 6 H2O 6 mg/l；CaCl2
× 2 H2O 10 mg；痕量元素溶液(Pfennig and Lippert, 1966) 0.1 ml。所述痕量元素溶液包含Titriplex III 10 g/l，FeSO4
x 7 H2O 4 g/l，ZnSO4
x 7 H2O 0.2 g/l，MnCl2
x 4 H2O 60 mg/l，H3BO3
0.6 g/l，CoCl2 x 6 H2O 0.4
g/l，CuCl2 x 2 H2O 20
mg/l，NiCl2 x 6 H2O 40
mg/l，Na2Mo4 x 2 H2O
60 mg/l。预培养物的培养基补充果糖5 g/l，卡那霉素300 μg/ml，并且从冷冻培养物接种(1% (v/v))。培养在30℃和150 rpm进行24小时。
在化能自养条件下，在来自Satorius的2L不锈钢反应器Biostat B中进行产物形成，并且使用1L培养基，其包含：(NH4)2HPO4 2.0 g/l；KH2PO4 2.1 g/l；MgSO4 × 7 H2O
3 g/l；FeCl3 × 6 H2O 6 mg/l；CaCl2
× 2 H2O 10 mg；生物素1 mg/l，硫胺素-HCl 1 mg/l，Ca-泛酸盐 1 mg/l，烟酸20 mg/l，痕量元素溶液0.1 ml和聚丙二醇(用水以1:5稀释的PPG 1000，在30℃下调整)。
培养条件为30℃，500-1500 rpm。培养时间为76-150小时。使用1M NaOH调整pH 7。使用包含H2 90体积%，CO2 6体积%，O2 4体积%的气体混合物进行放气，并且超压为0-2巴且通气量为1.9 vvm。
通过在50 ml Falcon管中离心(在20℃和4500 rpm下10分钟)收获接种反应器所需体积的预培养物(0.1 % (v/v))。在重复3次的清洗步骤中，将沉淀溶解在10 ml磷酸盐缓冲盐水中，并将悬液再次离心(在20℃和4500 rpm下10分钟)。最后，将沉淀溶解在10 ml培养基((NH4)2HPO4 2.0 g/l；KH2PO4 2.1 g/l；MgSO4 × 7 H2O
3 g/l；FeCl3 × 6 H2O 6 mg/l；CaCl2
× 2 H2O 10 mg；生物素 1 mg/l，硫胺素-HCl 1 mg/l，Ca-泛酸盐 1 mg/l，烟酸 20 mg/l，痕量元素溶液 0.1 ml和聚丙二醇(以1:5用水稀释的PPG 1000，在30℃下调整))中。
在培养后，如所述测定脂肪酸的浓度。
参考文献
Reed, TB, 1981, Biomass: principles and technology, Noves Data
Corporation, Park Ridge, NJ.
Marrakchi等人，Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002
Rock等人，J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996
FRIEDRICH等人，1981, Naturally Occurring genetic
transfer of hydrogen-oxidizing ability in between strains of Alcaligenes
eutrophus J Bacteriol 147: 198-205
Vollbrecht等人，1978
Pfennig和Lippert, 1966。
Claims (11)
1.从包含H2、CO2和O2的气体生产至少一种脂肪酸和/或其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 提供在含水培养基中的遗传修饰的氢氧化细菌；和
(b) 使所述含水培养基接触以20-70：10-45：5-35的重量比包含H2、CO2和O2的气体；
其中，所述脂肪酸包含至少5个碳原子，并且
其中，所述氢氧化细菌相对于野生型细菌是遗传修饰的，以提高酶E1的表达并提高酶E2的表达，所述酶E1能够催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化，所述酶E2能够催化酰基ACP至脂肪酸的转化。
2.权利要求1的方法，其中E1选自E1a accA (EC 6.4.1.2)、E1b accB (EC 6.4.1.2)、E1c accC (EC 6.3.4.14)、E1d accD (EC 6.4.1.2)及其组合，和/或E2是至少一种硫酯酶(EC 3.1.2.14和EC 3.1.2.22)。
3.权利要求1或2的方法，其中所述氢氧化细菌相对于野生型细菌是遗传修饰的，以提高酶E1a、E1b、E1c和E1d的表达。
4.权利要求2或3的方法，其中：
(a) E1a与登录号AAC73296或EG11647及其组合的多肽具有至少50%的序列同一性；
(b) E1b与登录号EG10275及其组合的多肽具有至少50%的序列同一性；
(c) E1c与登录号EG10276及其组合的多肽具有至少50%的序列同一性；和
(d) E1b与登录号EG10217及其组合的多肽具有至少50%的序列同一性；
或者涉及用于催化乙酰CoA经丙二酰CoA至酰基ACP的转化的任意多肽的功能性片段。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中E2是酰基-ACP硫酯酶。
6.权利要求5的方法，其中E2与具有选自以下的登录号的多肽具有至少50%的序列同一性：AAC72881.1、ABB71579.1、CAC19934.1、AAC49180.1、AAC49783.1、AAC49179.1、CAB60830.1、ABB71581.1、AAC49269.1、CAC19933.1、CAA54060.1、AAC72882.1、Q39513.1、AAC49784.1、AAC72883.1、Q41635.1和AAC49001.1，及其组合。
7.前述任一项权利要求的方法，其中所述氢氧化细菌相对于野生型细菌是进一步遗传修饰的，以提高选自以下的至少一种酶的表达：E3 aceE (EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)、E4 aceF (EC
1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)、E5 acpP
(AAC74178)、E6 fadD
(EC 2.3.1.86)、E7 cerl
(EC 4.1.99.5)、E8 fabA
(EC4.2.1.60)、E9 fabB
(EC 2.3.1.41)、E10 fabD
(EC 2.3.1.39)、E11 fabG
(EC 1.1.1.100)、E12 fabH
(EC 2.3.1.180)、E13 fabI
(EC 1.3.1.9)、E14 fabZ
(EC 4.2.1.-)、E15脂肪酶(EC 3.1.1.3)、E16丙二酰-CoA脱羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)、E17 panD (EC
4.1.1.11)、E18 panK
(EC 2.7.1.33)、E19 pdh
(EC 1.2.4.1)、E20 udhA
(EC 1.6.1.1)及其组合。
8.前述任一项权利要求的方法，其中所述氢氧化细菌选自：无色杆菌(Achromobacter)、嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus)、食酸菌(Acidovorax)、产碱杆菌(Alcaligenes)、项圈藻(Anabena)、产液菌(Aquifex)、节杆菌(Arthrobacter)、固氮螺菌(Azospirillum)、芽孢杆菌(Bacillus)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、贪铜菌(Cupriavidus)、德克斯氏菌(Derxia)、螺杆菌(Helicobacter)、草螺菌(Herbaspirillum)、氢杆菌(Hydrogenobacter)、Hydrogenobaculum、氢噬胞菌(Hydrogenophaga)、嗜氢菌(Hydrogenophilus)、嗜热解氢杆菌(Hydrogenothermus)、氢弧菌(Hydrogenovibrio)、艾德昂菌01 (Ideonella sp. 01)、Kyrpidia、生金球菌(Metallosphaera)、甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)、分枝杆菌(Myobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、寡养菌(Oligotropha)、副球菌(Paracoccus)、Pelomonas、极胞菌(Polaromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、根瘤菌(Rhizobium)、红球菌(Rhodococcus)、红假单孢菌(Rhodopseudomonas)、红螺菌(Rhodospirillum)、链霉菌(Streptomyces)、荚硫菌(Thiocapsa)、密螺旋体(Treponema)、贪噬菌(Variovorax)、黄色杆菌(Xanthobacter)和沃特氏菌(Wautersia)。
9.前述任一权利要求的方法，其中所述氢氧化细菌是进一步遗传修饰的，以相对于野生型细菌提高酶蜡酯合酶E21 (EC 2.3.1.75)的表达。
10.前述任一权利要求的方法，其中所述氢氧化细菌是进一步遗传修饰的，以相对于野生型细菌提高脂肪酸甲基转移酶E26 (EC 2.1.1.15)的表达。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述细菌包含编码ACP、Sfa或其组合的外源核酸序列。
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