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CN110167951A - 使用mitra尖端提取检测dna突变的方法 - Google Patents

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CN110167951A
CN110167951A CN201780083031.XA CN201780083031A CN110167951A CN 110167951 A CN110167951 A CN 110167951A CN 201780083031 A CN201780083031 A CN 201780083031A CN 110167951 A CN110167951 A CN 110167951A
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H·桑德斯
N·J·克拉克
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Diagnostics Investment Ltd
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Abstract

本公开文本提供了用于确定表现出癌症症状或有患遗传性癌症诸如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌的风险的患者是否将受益于用一种或多种治疗剂进行的治疗的快速且非侵入性方法。这些方法基于在使用体积计量吸收微量取样装置(例如MITRA尖端)收集的小体积干生物流体样品中检测遗传性癌症相关突变。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。

Description

使用MITRA尖端提取检测DNA突变的方法
技术领域
本公开文本提供了用于确定表现出癌症症状或有患遗传性癌症诸如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌的风险的患者是否将受益于用一种或多种治疗剂进行的治疗的方法。这些方法基于在使用体积计量吸收微量取样装置收集的小体积干生物流体样品中检测遗传性癌症相关突变。可以使用下一代测序(NGS)检测对应于与遗传性癌症相关的一个或多个基因的靶核酸序列的改变。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。
背景技术
下文提供对本公开文本的背景的说明只为了帮助读者理解本公开文本，并且并不承认描述或构成本公开文本的现有技术。
遗传性癌症占所有癌症的5％-10％，并且由于高度渗透的种系突变而升高。最常见的遗传性癌症是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和皮肤癌。遗传基因突变或致病变体增加了患者产生癌症的风险。因此，确定癌症是否由遗传性致病变体引起可以用于评估患者发展癌症的风险，并且可以帮助揭示癌症筛查、预防和治疗的选择。
下一代测序(NGS)广泛用于癌症诊断，因为其能够以高通量方式在单个测定中检测多种基因改变。然而，与从生物样品(例如血液)收集和制备核酸相关的程序通常是麻烦的，通常需要专门的设备或技术技能。此外，重症患者，诸如癌症患者，不能提供大量血液用于复发性测试。
因此，需要快速且非侵入性方法来确定患者是否有患遗传性癌症诸如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌的风险。
发明内容
一方面，本公开文本提供了一种用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的方法，所述方法包括(a)从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取基因组DNA；(b)产生包含对应于多个遗传性癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库，所述多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL，其中衔接子序列与多个扩增子的末端连接；以及(c)使用高通量大规模平行测序检测多个扩增子中的至少一个中的至少一种突变。在一些实施方案中，干生物流体样品是干血浆、干血清或干全血。在一些实施方案中，干生物流体样品包含抗凝血剂(例如EDTA、肝素)。在某些实施方案中，干生物流体样品是从患有或怀疑患有遗传性癌症的患者获得。遗传性癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌。
另外或可替代地，在一些实施方案中，微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。在某些实施方案中，微量取样装置是尖端。干生物流体样品的洗脱可以通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来进行。在某些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和TritonX-100。在另一个实施方案中，裂解缓冲液包含800mM盐酸胍；30mM Tris·Cl，pH 8.0；30mMEDTA，pH 8.0；5％Tween 20；以及0.5％Triton X-100。在其他实施方案中，裂解缓冲液包含2.5％-10％十二烷基硫酸钠。
另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液在90℃下接触长达15分钟来进行的。另外或可替代地，在某些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达1小时来进行的。在其他实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达16-18小时来进行的。在一些实施方案中，微量取样装置的样品体积不超过10-20μL。
在方法的一些实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱不超过400ng基因组DNA。在方法的其他实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱约100ng至约400ng基因组DNA。
在某些实施方案中，高通量大规模平行测序是使用焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、边合成边测序、边连接边测序或SMRTTM测序来进行的。在方法的一些实施方案中，衔接子序列是P5衔接子、P7衔接子、P1衔接子、A衔接子或Ion XpressTM条形码衔接子。
另外或可替代地，在一些实施方案中，多个扩增子还包含唯一性索引序列。在某些实施方案中，使用诱饵组富集多个扩增子，所述诱饵组包含与多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列。在一些实施方案中，诱饵组的核酸序列是RNA诱饵、DNA诱饵或其组合。
另一方面，本公开文本提供了一种用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的方法，所述方法包括从用裂解缓冲液和蛋白酶K从微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中分离基因组DNA，其中多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在某些实施方案中，使用高通量大规模平行测序检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。
一方面，本公开文本提供了一种用于选择表现出癌症症状的患者或有患遗传性癌症风险的患者以用抗癌治疗剂治疗的方法，所述方法包括(a)在使基因组DNA从血细胞中释放的条件下洗脱干血液样品，其中用体积计量吸收微量取样装置从患者收集干血液样品；(b)从洗脱的干血液样品中分离基因组DNA；(c)产生包含对应于多个遗传性癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库，所述基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL，其中衔接子序列与多个扩增子的末端连接；(d)使用高通量大规模平行测序检测多个扩增子中的至少一个中的至少一种突变；以及(e)如果在对应于以下中的一或多个的多个扩增子中的至少一个中检测到突变，则选择所述患者来用抗癌治疗剂治疗：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在一些实施方案中，体积计量吸收微量取样装置是尖端。在某些实施方案中，患者患有选自乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌或结肠癌的遗传性癌症或有患所述遗传性癌症的风险。
在任何上述实施方案中，抗癌治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(edatrexate)(10-乙基-10-脱氮-氨基喋呤)、塞替派(thiotepa)、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、长春瑞滨(vinorelbine)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)、氟维司群(fulvestrant)、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、替莫唑胺(temozolmide)、托泊替康(topotecan)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、艾日布林(eribulin)、突变霉素(mutamycin)、卡培他滨(capecitabine)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、布舍瑞林(buserlin)、戈舍瑞林(goserelin)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、利塞膦酸盐(risedronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、地诺单抗(denosumab)、唑来膦酸盐(zoledronate)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、拉帕替尼(tykerb)、蒽环霉素(anthracycline)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿地白介素(aldesleukin)、考比替尼(cobimetinib)、达拉非尼(dabrafenib)、达卡巴嗪(dacarbazine)、拉他莫金(talimogene laherparepvec)、咪喹莫特(imiquimod)、重组干扰素α-2b、伊匹单抗(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、曲美替尼(trametinib)、纳武单抗(nivolumab)、聚乙二醇干扰素α-2b、索尼德吉(sonidegib)、维莫德吉(vismodegib)、维罗非尼(vemurafenib)、西妥昔单抗(cetuximab)、伊立替康盐酸盐、甲酰四氢叶酸钙(leucovorin calcium)、三氟尿苷和替比嘧啶盐酸盐(trifluridine and tipiracilhydrochloride)、奥沙利铂(oxaliplatin)、帕尼单抗(panitumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、瑞格非尼(regorafenib)和阿柏西普(ziv-aflibercept)。
本文还公开了用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的试剂盒，所述试剂盒包含皮肤穿刺工具、体积计量吸收微量取样装置、裂解缓冲液和蛋白酶K，其中多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。裂解缓冲液可以包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。
在一些实施方案中，本发明技术的试剂盒还包含与多个遗传性癌症相关基因中的一个或多个的一个或多个区域或外显子杂交的一个或多个引物对。另外或可替代地，在一些实施方案中，本发明技术的试剂盒还包含与多个遗传性癌症相关基因中的一个或多个的一个或多个区域或外显子杂交的一个或多个诱饵序列。
在本发明技术的试剂盒的任何上述实施方案中，体积计量吸收微量取样装置是尖端。
附图说明
图1显示了使用如实施例1中所述的三种不同提取方法获得的每个尖端的DNA产量。
图2(a)显示了从自尖端洗脱的干血液样品中获得的每个靶区域在34-基因癌症易感组(MyVantageTM综合遗传性癌症组(MyVantageTMHereditary ComprehensiveCancer Panel))上的最低读取片段覆盖量。图2(b)显示了每个靶区域在34-基因癌症易感组(MyVantageTM综合遗传性癌症组)上的最低读取片段覆盖量，其中干血液样品使用单或双尖端提取获得。“Ops”是指常规操作样品。
图3显示了当使用不同的DNA提取方法时从尖端获得的DNA产量的比较。‘ON’意指将样品与特定裂解缓冲液一起孵育过夜。
图4(a)显示了从自单尖端洗脱的干血液样品中获得的每个靶区域(在109-358ng范围内的DNA产量)在34-基因癌症易感组(MyVantageTM综合遗传性癌症组)上的最低读取片段覆盖量。使用平台进行DNA提取。图4(b)显示了每个靶区域在34-基因癌症易感组(MyVantageTM综合遗传性癌症组)上的最低读取片段覆盖量，其中干血液样品使用单或双尖端提取获得。对4个样品进行双尖端提取，并且得到在340-543ng范围内的DNA产量。对1个样品(AS)进行单尖端提取，并且DNA产量为214ng。
图5显示了当使用从尖端洗脱的干血液样品时，通过长范围PCR进行的分别对应于CHEK2和PMS2靶区域的10kb和18kb区域的有效扩增。
图6显示了从自尖端洗脱的干血液样品中获得的各种CHEK2和PMS2外显子的最低读取片段覆盖量。
图7显示了使用DNA获得的每个靶区域的最低读取片段覆盖量，所述DNA是从以下获得：(a)通过手指针刺用收集的血液，(b)芯吸有EDTA全血的尖端，以及(c)从常规血液抽取获得的EDTA全血。
具体实施方式
本公开文本提供了用于确定表现出癌症症状或有患遗传性癌症诸如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌的风险的患者是否将受益于用一种或多种治疗剂进行的治疗的方法。这些方法基于在使用体积计量吸收微量取样装置收集的小体积干生物流体样品中检测遗传性癌症相关突变。此外，当在含有作为已知PCR抑制剂的抗凝血剂诸如EDTA的干生物流体样品上使用时，本文公开的方法保持其分析灵敏度。参见Huggett等人,BMC Res Notes.1:70(2008)。还提供了用于实践所述方法的试剂盒。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明技术所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
除非上下文另外说明或另外显而易见，否则如本文所用，关于数字的术语“约”通常视为包括属于所述数字任一方向(大于或小于)的1％–10％范围内的数字。
术语“衔接子”是指化学合成的短核酸序列，其可以用于连接核酸序列的末端以促进与另一个分子的附接。衔接子可以是单链或双链的。衔接子可以并有用于PCR扩增或测序的短(典型地少于50个碱基对)序列。
如本文所用，向受试者“施用”治疗剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，所述途径包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)或局部。施用包括自施用和由另一个人施用。
如本文所用，基因或基因产物(例如标记基因或基因产物)的“改变”是指基因或基因产物内存在突变，例如与正常或野生型基因相比，影响基因或基因产物的数量或活性的突变。与正常或健康组织或细胞(例如对照)中基因或基因产物的数量、结构和/或活性相比，遗传改变可导致癌组织或癌细胞中其数量、结构和/或活性变化。例如，与正常的健康组织或细胞相比，在癌组织或癌细胞中，与癌症相关的改变可具有改变的核苷酸序列(例如突变)、氨基酸序列、染色体易位、染色体内转化、拷贝数、表达水平、蛋白质水平、蛋白质活性。示例性突变包括但不限于点突变(例如沉默、错义或无义)、缺失、插入、倒位、连接突变、重复、易位、染色体间和染色体内重排。突变可以存在于基因的编码区或非编码区中。在某些实施方案中，所述改变与表型例如癌症表型(例如癌症风险、癌症进展、癌症治疗或对癌症治疗的抗性中的一种或多种)相关。
如本文所用，关于核酸序列的术语“扩增(amplify或amplification)”是指增加样品中核酸序列群的表现的方法。将扩增反应中在体外产生的特定靶核酸序列的拷贝称为“扩增子”或“扩增产物”。扩增可为指数性或线性的。靶核酸可为DNA(诸如例如基因组DNA和cDNA)或RNA。尽管下文所述的示例性方法涉及使用聚合酶链反应(PCR)扩增，但本领域技术人员熟知多种其他方法，诸如等温法、滚环法等。本领域技术人员应理解，这些其他方法可代替PCR方法使用或与PCR方法一起使用。参见例如Saiki,“Amplification of GenomicDNA”,PCR Protocols,Innis等人编,Academic Press,San Diego,CA 1990,第13-20页；Wharam等人,Nucleic Acids Res.29(11):E54-E54(2001)。
如本文所用，“诱饵”是一种杂交捕获试剂，其检索靶核酸序列以用于测序。诱饵可以是核酸分子，例如DNA或RNA分子，其可以与靶核酸杂交(例如互补)，从而使得可捕获靶核酸。在一个实施方案中，诱饵是RNA分子(例如天然存在或修饰的RNA分子)；DNA分子(例如天然存在或经修饰的DNA分子)或其组合。在其他实施方案中，诱饵包括结合实体，例如亲和标签，所述结合实体使得可例如通过与结合实体结合来捕获且分离由诱饵和与所述诱饵杂交的核酸形成的杂交体。在一个实施方案中，诱饵适用于溶液相杂交。
如本文所用，“诱饵组”是指一种或多种诱饵分子。
术语“癌症”或“肿瘤”可互换使用，并且指存在具有致癌细胞典型特征的细胞，所述特征诸如不受控的增殖、永生、转移潜力、快速生长和增殖速率以及某些特征性形态特征。癌细胞通常是肿瘤形式，但此类细胞可以单独存在于动物体内，或可以是非致瘤性癌细胞。如本文所用，术语“癌症”包括癌前以及恶性癌症。
如本文关于多核苷酸(即核苷酸诸如寡核苷酸或靶核酸的序列)所用的术语“互补体”、“互补”或“互补性”是指Watson/Crick碱基配对原则。如本文所用的核酸序列的互补体是指如下寡核苷酸，该寡核苷酸在与核酸序列比对以使一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对时呈“反向平行缔合”。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。本文所述的核酸中可以包括天然存在的核酸中通常未发现的某些碱基。这些碱基包括例如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)以及肽核酸(PNA)。互补性无需完美；稳定双链体可以含有错配碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可在考虑多个变量后凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度以及错配碱基对的发生率。互补序列还可以为与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，并且还可以为cDNA。
如本文所用，术语“基本上互补”意指两个序列在严格杂交条件下杂交。本领域技术人员应了解，基本上互补的序列无需沿其整个长度杂交。特别地，基本上互补的序列可以包含不与靶序列杂交的连续碱基序列，所述连续碱基序列位于在严格杂交条件下与靶序列杂交的连续碱基序列的3'或5'。
如本文所用，“对照”是用于比较目的的实验中使用的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。如本文所用的“对照核酸样品”或“参考核酸样品”是指来自对照或参考样品的核酸分子。在某些实施方案中，参考或对照核酸样品是野生型或非突变的DNA或RNA序列。在某些实施方案中，参考核酸样品经过纯化或分离(例如将其从其天然状态中去除)。在其他实施方案中，参考核酸样品来自非肿瘤样品，例如血液对照、正常相邻肿瘤(NAT)或来自同一或不同受试者的任何其他非癌样品。
如本文所用，术语“检测”是指确定样品中目标核酸中突变或改变的存在。检测不要求方法提供100％灵敏度。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如使得可预防遗传性癌症或减少遗传性癌症或减少一种或多种与遗传性癌症相关的症状的量。在治疗或预防应用的背景下，向受试者施用的治疗剂的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，诸如一般健康状况、年龄、性别、体重以及药物耐受性。所述量还取决于疾病的程度、严重程度和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。如本文所用，治疗药物或治疗剂的“治疗有效量”是指使遗传性癌症诸如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌的生理作用至少得到改善的水平。治疗有效量可以分一次或多次施用给予。
如本文所用，术语“提取”或“分离”是指将核酸与样品中存在的其他细胞物质分离所采取的任何操作。术语提取或分离包括机械或化学裂解，添加清洁剂或蛋白酶或者沉淀和去除其他细胞物质。
本文使用的“基因”是指包含产生RNA所必需的调节和编码序列的DNA序列，其可以具有非编码功能(例如核糖体或转运RNA)或可以包括多肽或多肽前体。RNA或多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，只要保留所需的活性或功能即可。尽管核酸序列可以以DNA形式显示，但是本领域普通技术人员认为相应的RNA序列将具有类似序列，其中胸腺嘧啶被尿嘧啶替代，即“T”被“U”替代。
如本文所用的术语“杂交”是指如下过程，其中两个基本上互补的核酸链(在至少14至25个核苷酸的片段上至少约65％互补，至少约75％或至少约90％互补)在适当严格的条件下彼此退火，以通过在互补碱基对之间形成氢键来形成双链体或异源双链体。典型地且优选地用探针长度的核酸分子来进行杂交，所述核酸分子优选长度为15-100个核苷酸，更优选长度为18-50个核苷酸。核酸杂交技术为本领域所熟知。参见例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受以下因素影响，诸如：核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性以及所形成杂交物的热熔点(Tm)。本领域技术人员了解如何估计并调节杂交条件的严格度，以使得具有至少期望互补性水平的序列可稳定杂交，而具有较低互补性的序列不会杂交。对于杂交条件和参数的例子，参见例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborPress,Plainview,N.Y.；Ausubel,F.M.等人1994,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J。在一些实施方案中，在严格杂交条件下发生特异性杂交。对靶核酸具有特异性的寡核苷酸或多核苷酸(例如探针或引物)将与靶核酸在适合的条件下“杂交”。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可为个别生物体、脊椎动物、哺乳动物或人类。在一个优选实施方案中，个体、患者或受试者是人类。
如本文所用，术语“文库”是指核酸序列的集合，例如衍生自全基因组、亚基因组片段、cDNA、cDNA片段、RNA、RNA片段或其组合的核酸集合。在一个实施方案中，文库核酸序列的一部分或全部包含衔接子序列。衔接子序列可以位于一端或两端。衔接子序列可以用于例如测序方法(例如NGS方法)，用于扩增，用于逆转录或用于克隆到载体中。
文库可以包含核酸序列的集合，例如靶核酸序列(例如肿瘤核酸序列)、参考核酸序列或其组合。在一些实施方案中，文库的核酸序列可以来源于单个受试者。在其他实施方案中，文库可以包含来自超过一个受试者(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多个受试者)的核酸序列。在一些实施方案中，可以组合来自不同受试者的两个或更多个文库以形成具有来自超过一个受试者的核酸序列的文库。在一个实施方案中，受试者是患有遗传性癌症或有患遗传性癌症风险的人类。
“文库核酸序列”是指核酸分子，例如DNA、RNA或其组合，其是文库的成员。典型地，文库核酸序列是DNA分子，例如基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中，文库核酸序列是断裂的，例如剪切或酶促制备的基因组DNA。在某些实施方案中，文库核酸序列包含来自受试者的序列和并非来源于受试者的序列，例如衔接子序列、引物序列或使得可鉴别例如“条形码”序列的其他序列。
如本文使用的“下一代测序或NGS”是指测定单独的核酸分子(例如在单分子测序中)的核苷酸序列或以高通量平行方式(例如同时对超过103、104、105个或更多个分子进行测序)测定单独核酸分子的克隆扩增代表物(proxy)的核苷酸序列的任何测序方法。在一个实施方案中，可以通过在由测序实验产生的数据中计数核酸物质同源序列的相对出现次数来估计文库中所述核酸物质的相对丰度。下一代测序方法是本领域中已知的，并且描述于例如Metzker,M.Nature Biotechnology Reviews 11:31-46(2010)中。
如本文所用，“寡核苷酸”是指在主要以指定间隔包含相同单体单元的主链上具有核酸碱基序列的分子。以如下方式将碱基安排在主链上，使得其可以与具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸酯单元的主链。可区分2'位不具有羟基的寡脱氧核糖核苷酸与2'位具有羟基的寡核糖核苷酸。寡核苷酸还可以包括如下衍生物，其中羟基中的氢由有机基团例如烯丙基替代。用作引物或探针的寡核苷酸通常长度为至少约10-15个核苷酸，或长度为最多约70、100、110、150或200个核苷酸，并且更优选地长度为至少约15至25个核苷酸。用作特异性扩增或特异性检测特定靶核酸的引物或探针的寡核苷酸通常能够与靶核酸特异性地杂交。
如本文所用，术语“引物”是指如下寡核苷酸，其在置于诱导合成与靶核酸链互补的引物延伸产物的条件下，即在不同的核苷酸三磷酸和在适当缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中的聚合酶存在下以及在合适的温度下时，能用作核酸序列合成的起始点。引物中的一个或多个核苷酸可例如通过添加甲基、生物素或地高辛配基(digoxigenin)部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸来修饰。引物序列无需反映模板的准确序列。例如，可使非互补核苷酸片段附接于引物的5'端，其中引物序列的其余部分与所述链基本上互补。如本文所用的术语引物包括可合成的引物的所有形式，所述形式包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、经标记的引物等。如本文所用的术语“正向引物”意指退火到双链DNA(dsDNA)的反义链的引物。“反向引物”退火到dsDNA的正义链。
引物长度典型地为10、15、18或30个核苷酸，或长度为最多约100、110、125或200个核苷酸。在一些实施方案中，引物长度优选在约15至约60个核苷酸之间，并且长度最优选在约25至约40个核苷酸之间。在一些实施方案中，引物长度为15至35个核苷酸。对于最佳的杂交或聚合酶链反应扩增，没有标准长度。用于特定引物应用的最佳长度可以以H.Erlich,PCR Technology,Principles and Application for DNAAmplification,(1989)中所述的方式容易地确定。
如本文所用，术语“引物对”是指可以一起用于扩增目标核酸的给定区域的正向和反向引物对(即左侧和右侧引物对)。
如本文所用的“探针”是指与靶核酸通过杂交相互作用的核酸。探针可以与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补水平通常基于探针的功能取决于多种因素。可以以本领域中熟知的多种方式中的任一种标记或不标记或者修饰探针。探针可以与靶核酸特异性地杂交。探针可以是DNA、RNA或RNA/DNA杂交体。探针可以是寡核苷酸、人工染色体、断裂的人工染色体、基因组核酸、断裂的基因组核酸、RNA、重组核酸、断裂的重组核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸、环杂环的寡聚体或核酸的缀合物。探针可以包含经修饰的核碱基、经修饰的糖部分和经修饰的核苷酸间连接。探针长度典型地为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100个核苷酸或更长。
如本文所用，术语“样品”是指从患者获得的临床样品。在优选实施方案中，从生物来源获得样品(即“生物样品”)，诸如从受试者收集的组织或体液。样品来源包括但不限于粘液、痰(处理或未处理)、支气管肺泡灌洗液(BAL)、支气管洗涤液(BW)、血液、体液、脑脊髓液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如活组织检查材料)。优选的样品来源包括血浆、血清或全血。
如本文关于本发明技术的方法所用的术语“灵敏度”是方法在异质序列群中检测预选序列变体的能力的量度。如果给定如下样品，其中预选序列变体以样品中序列的至少F％存在，方法可以以C％的预选置信度、S％的次数检测到预选序列，则方法对F％的变体具有S％的灵敏度。举例而言，如果给定如下样品，其中预选变体序列以样品中序列的至少5％存在，方法可以以99％的预选置信度、10次有9次检测到预选序列(F＝5％；C＝99％；S＝90％)，则方法对5％的变体具有90％的灵敏度。示例性灵敏度包括至少50、60、70、80、90、95、98和99％。
如本文关于寡核苷酸引物所用的术语“特异性”意指在比对所述寡核苷酸与待扩增的核酸时，引物的核苷酸序列与所述核酸的一部分具有至少12个碱基的序列同一性。对核酸具有特异性的寡核苷酸引物是在严格的杂交或洗涤条件下，能够与目标标靶杂交并且基本上不与非目标核酸杂交的引物。更高水平的序列同一性是优选的，并且包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少85％-95％，并且更优选至少98％的序列同一性。可以使用采用本领域熟知算法的市售电脑程序以默认设置来测定序列同一性。如本文所用，具有“高序列同一性”的序列至少在约50％的所比对核苷酸位置处，优选至少在约60％的所比对核苷酸位置处，且更优选至少在约75％的所比对核苷酸位置处具有相同的核苷酸。
如本文所用，“特异性”是方法区分真实存在的预选序列变体与测序假象或其他密切相关序列的能力的量度。特异性是避免假阳性检测的能力。假阳性检测可能由以下引起：在样品制备期间引入目标序列中的错误、测序误差或密切相关序列如假基因或基因家族成员的疏忽测序。如果在应用于N总个序列的样品集时，其中X真实序列是真实变体并且X非真实是非真实变体，方法选择了非真实变体中的至少X％为非变体，则方法具有X％的特异性。例如，如果在应用于1,000个序列的样品集时，其中500个序列是真实变体并且500个是非真实变体，方法选择了500个非真实变体序列中的90％为非变体，则方法具有90％的特异性。示例性特异性包括至少50、60、70、80、90、95、98和99％。
如本文所用的术语“严格杂交条件”是指至少与以下一样严格的杂交条件：在42℃下在50％甲酰胺、5x SSC、50mM NaH2PO4(pH 6.8)、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA和5x Denhart氏溶液中杂交过夜；在45℃下用2x SSC、0.1％SDS洗涤；并且在45℃下用0.2x SSC、0.1％SDS洗涤。在另一个实施例中，严格杂交条件不应允许在20个连续核苷酸的片段上有超过两个碱基不同的两个核酸杂交。
如本文所用术语“靶核酸”或“靶序列”是指待分析样品中待检测和/或定量的目标核酸序列。靶核酸可由以下构成：染色体区段、具有或不具有基因间序列的完整基因、具有或不具有基因间序列的基因的区段或部分或针对其设计探针或引物的核酸序列。靶核酸可以包括一个或多个野生型序列、突变、缺失、插入或重复、串联重复元件、目标基因、目标基因区域或所述区域的任何上游或下游区域。靶核酸可以代表特定基因的替代序列或等位基因。靶核酸可源自基因组DNA、cDNA或RNA。
如本文所用，术语“治疗”是指获得有益或期望的临床结果的操作，所述临床结果包括但不限于减轻或改善疾病或病症的一种或多种病征或症状(例如部分或完全消退)，降低疾病的程度，稳定(即不恶化，实现稳定的疾病)疾病状态，改善或缓解疾病状态，降低进展速度或减少进展时间以及缓解(部分或全部)。
本发明技术的方法中采用的微量取样装置
常规的干血斑技术伴有许多缺点，所述缺点包括不精确的样品体积和对恒定样品粘度的依赖(即样品将均匀地散布在样品卡上的预期)。当向卡片施用等体积的样品时，恒定粘度产生保持恒定的血斑直径。然而，由于血液中的血细胞比容(HCT)或细胞压积(PCV)水平不同，所以血液样品之间的粘度显著变化。具有高血细胞比容水平的样品在血斑纸上形成较小直径的斑点，导致在取样斑点的固定直径内具有不同血液浓度。据信斑点直径中的PCV水平显示出约45％的变化。当将内标物喷洒在血斑上时，这可能会引起定量时45％的误差。本文公开的方法中采用的微量取样装置具有几个优点，包括收集更精确的血液体积，没有血细胞比容偏差，以及容易地用标准液体处理器进行自动化操作以进行实验室加工的能力。
另外，相对于所公开的微量取样装置，常规血斑技术需要相对多体积的血液。干血斑通常每个斑点需要50-75μl，而微量取样装置可以由大约20μl产生结果。本领域中认为，对于检测病毒载量，与其他样品类型诸如血浆相比，干血斑通常具有性能可变性问题(Pannus等人,Medicine,95:48(e5475)(2016))，并且对于某些类型的评估(例如光密度)，与其他样品类型诸如血清相比，干血斑的体积可能需要显著较高(Brandao等人,J.Clin.Virol.,57:98-102(2013))。实际上，发现使用干血斑和血浆斑点筛查两者来检测在接受抗逆转录病毒疗法的HIV患者中的病毒载量和治疗无效，两个结果都产生高的假阳性率(Sawadogo等人,J.Clin.Microbiol.,52(11):3878-83(2014))。
可用于本发明技术的方法的微量取样装置包含具有远端和近端的吸收尖端。吸收尖端远端的宽度比近端的宽度窄。近端附接于固持器，而远端配置成接触待吸收的流体，诸如血液。微量取样装置使得生物流体样品诸如血液可容易地干燥、运输，然后进行分析。在某些实施方案中，生物流体是来自手指针刺的血液。
芯吸作用将血液吸入吸收尖端。吸收尖端与固持器之间的任选障壁阻止血液通过或芯吸到固持器。吸收尖端由即使在可获得过量流体时也芯吸起基本上相同体积的流体(体积计量吸收微量取样或VAMSTM)的材料构成。吸收尖端的体积影响所吸收流体的体积。可以改变吸收尖端的尺寸和形状以调节所吸收血液的体积和吸收速率。可以接受约7-15μL、约20μL并且甚至高达约30μL的血液体积。取样时间可以是约2秒、约3秒、约5秒或最多约10秒。
在一些实施方案中，用于吸收尖端的材料是亲水性的(例如聚酯)。可替代地，所述材料最初可以是疏水性的，随后进行处理以使其具有亲水性。可以通过各种已知方法使疏水性基质具有亲水性，所述方法诸如基质的等离子体处理或表面活性剂处理(例如Tween-40或Tween-80)。在一些实施方案中，使用等离子体处理使疏水性材料诸如聚烯烃(例如聚乙烯)具有亲水性。可替代地，可以使用将亲水性聚合物接枝到表面上和用极性或亲水性分子诸如糖将表面上的活性基团化学官能化来实现吸收尖端的亲水性表面。还可以使用共价修饰来将极性或亲水性官能团添加到吸收尖端的表面上。用于吸收尖端的其他合适材料包括烧结玻璃、烧结钢、烧结陶瓷以及塑料的烧结聚合物和烧结聚乙烯。
在一些实施方案中，微量取样装置包括由亲水性聚合物材料制成的吸收尖端，所述吸收尖端的尺寸足以在约2-5秒内吸收最多约20μL的血液，长度小于约5mm(0.2英寸)，横截面积小于约20mm2，并且密度小于约4g/cc。在一些实施方案中，吸收尖端由聚乙烯构成并且被配置成吸收约1-20微升血液，优选在1-7秒内，并且更优选在约1-5秒内。吸收尖端可以含有干血、干抗凝血剂或内标物中的一种或多种。
在某些实施方案中，吸收尖端的体积为约35mm3，在约3秒内吸收约13-14微升血液，在约2.5秒内吸收9-10微升血液，并且孔隙体积为约38％。在某些实施方案中，吸收尖端的体积为约24微升，密度为约0.6g/cc，在约2.5秒内吸收约10微升血液，并且孔隙体积为约40％。在一些实施方案中，体积计量吸收微量取样装置是如US 2013/0116597中所述的尖端，所述案通过全文引用的方式并入本文中。
吸收尖端可以成形为具有类似截头圆锥的具有窄且圆的远端的外部。在一些实施方案中，固持器具有圆柱形柱，所述圆柱形柱配合到吸收尖端中心内的凹部中并且沿着吸收尖端和固持器的纵向轴线延伸。吸收尖端的锥形形状有助于快速且均匀地芯吸样品。
可以将固持器适配为与移液管一起使用。在一些实施方案中，管状圆锥形固持器是优选的，其中吸收尖端位于固持器的窄端。固持器的较宽相对端可以是封闭的或开放且中空的，并且可以被任选地配置成附接于移液管尖端。固持器可以具有向外延伸的凸缘，所述凸缘被设置成邻接固持器、干燥架或测试设备中的配合结构，以帮助将吸收尖端定位在此类固持器、干燥架和测试设备中的期望位置处。
在某些实施方案中，固持器可以包括移液管尖端或配置成与移液管尖端嵌套的逐渐变细的管状结构。吸收尖端可以由聚乙烯构成，并且吸收尖端和固持器都在无菌条件下制造，或最后进行灭菌。吸收尖端可以含有干抗凝血剂。在一些实施方案中，固持器具有沿固持器的长度延伸的多个肋。肋可以具有选择来使吸收尖端不与凹部的壁接触的高度和长度，其中固持器和吸收尖端被放置在凹部中以进行吸收尖端中干血液的运输或提取。
在吸收小体积样品之后，然后干燥吸收尖端。在一些实施方案中，将小体积血液样品在环境温度或室温下干燥至少10分钟，至少20分钟，至少30分钟，至少40分钟，至少50分钟，至少1小时，至少2小时，至少3小时，至少4小时，至少5小时，至少6小时，至少8小时，至少12小时，至少16小时，至少20小时，至少24小时，至少48小时，至少72小时或至少96小时。在某些实施方案中，将小体积血液样品干燥约2-3小时。
可以在合适的支架或固持器上进行干燥，或优选地，可以将吸收尖端和固持器转移到特殊的干燥容器中，所述干燥容器被配置成便于干燥，同时使吸收尖端与干燥容器的壁或其他潜在的污染表面之间的接触达最少。干燥容器可以具有干燥剂以便于干燥。干燥容器还可以提供保护盖，可以密封所述保护盖以进行运输而防止污染。在一些实施方案中，盖具有表面，可以在所述表面上写入印刷标记以鉴别干血液样品的来源并且提供其他相关信息。在一些实施方案中，容器的尺寸和容器内固持器的相对位置将符合SBS微孔板规格。可以将微量取样装置和干燥容器与干燥剂一起放置在塑料袋中以辅助干燥，并且可以以这种方式运输，或在去除干燥剂之后运输。
在一些实施方案中，固持器的较宽相对端是中空的，并且容器具有包括安装突起部分的第一部分，所述安装突起部分的尺寸被设计成配合到固持器的中空端中并且可释放地接合所述中空端。另外或可替代地，容器具有第二部分，所述第二部分可释放地紧固于第一部分，并且具有被配置成包封固持器的一部分以进行固持器运输的凹部。容器可以包含多个开口，从而使得空气可进入微量取样装置的吸收尖端。此外，第一部分可以具有如下侧面，其中具有足够尺寸的进入端口，并且所述进入端口被定位成使得当固持器在安装突起上时可以穿过所述端口施加标记并且施加到固持器上。
在测试位置处接收之后，可以手动或通过自动化构件在预定体积的合适缓冲液(如本文所述)中洗脱吸收尖端，以从干血液中提取目标核酸或蛋白质。物理搅拌技术诸如流体和/或吸收尖端的超声处理或涡旋可以加速从干血液到液体样品基质中的提取过程。可以使用物理分离技术诸如离心、蒸发/重构、浓缩、沉淀、液/液萃取和固相萃取进一步简化样品基质以进行进一步分析。
每个容器可以包封多个固持器，其中每个固持器在其远端包含吸收尖端并且具有中空的近端。容器同样具有多个细长的安装突起，安装突起各自的尺寸被设计成配合到多个固持器的中空端中并且可释放地接合所述中空端。容器的第二部分具有凹部，所述凹部被配置成将多个固持器中的每一个分别包封在容器内的单独外壳中。在某些实施方案中，多个固持器中的每一个具有沿固持器长度延伸的多个肋，其中肋被配置成使吸收尖端不接触容器的壁。根据需要，可以将干燥剂放置在容器内以帮助干燥吸收尖端中的血液或维持干燥。每个固持器可以具有将固持器与容器以及与至少一个其他固持器相关联的可见标记，诸如序列号，其中数字的各部分指示相关的固持器/吸收尖端和所运输固持器的容器。
核酸提取
一方面，本公开文本提供了一种从用体积计量吸收微量取样装置(例如尖端)收集的干生物流体样品中提取基因组DNA的方法。在一些实施方案中，通过使体积计量吸收微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来洗脱干生物流体样品。裂解缓冲液可以包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。蛋白酶K是一种广谱丝氨酸蛋白酶，其在很宽的pH范围(4-12)内是稳定的，其中最适pH为pH 8.0。蛋白酶K切割的主要位点是与具有封闭的α氨基的脂族和芳族氨基酸的羧基相邻的肽键。将反应温度从37℃升高到50℃-60℃可以使蛋白酶K活性增加数倍。可以通过添加0.5％-1％十二烷基硫酸钠(SDS)、3M氯化胍、1M硫氰酸胍或4M尿素来提高蛋白酶K活性。
可替代地，用于核酸提取的其他方案可以用于本发明技术的方法中。其他市售核酸纯化试剂盒的例子包括Molzym GmbH&Co KG(Bremen,DE)、Qiagen(Hilden,DE)、Macherey-Nagel(Düren,DE)、Roche(Basel,CH)或Sigma(Deisenhofen,DE)。还可以使用基于使用聚苯乙烯珠粒等的其他核酸纯化系统作为载体材料。
在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA包含使存在于干生物流体样品中的细胞中的核蛋白复合物变性。在某些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA包含去除蛋白质污染物、灭活核酸酶活性和/或去除干生物流体样品中存在的生物和/或化学污染物。
在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA可以使用自动DNA提取平台进行。在一些实施方案中，自动DNA提取平台具有高通量容量，诸如每个循环高达100次提取。在某些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA可以使用市售自动化工作站诸如或自动化来进行。在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA在EZ1TM自动化系统上进行。在一些实施方案中，从用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品中提取基因组DNA使用市售试剂盒进行。
多重连接依赖性探针扩增(MLPA)
多重连接依赖性探针扩增(MLPA)是多重聚合酶链反应的变化形式，其允许仅用单个引物对扩增多个标靶。MLPA反应可以分为四个主要步骤：1)DNA变性和MLPA半探针的杂交；2)连接反应；3)PCR扩增；4)通过电泳分离扩增产物。在第一个步骤中，使DNA变性并且与MLPA探针的混合物一起孵育过夜。每个MLPA探针由两个寡核苷酸(或半探针)组成，所述寡核苷酸(或半探针)识别DNA上的相邻靶位点。一个半探针寡核苷酸包含由正向引物识别的序列，而另一个半探针包含由反向引物识别的序列。仅当两个半探针寡核苷酸与其各自的标靶杂交时，半探针才连接到完整的探针中。使用半探针的优点是仅扩增连接的寡核苷酸，而不是未结合的半探针寡核苷酸。因为在随后的PCR反应期间仅连接的探针被指数扩增，所以探针连接产物的数量是样品中靶序列数量的量度。
每个完整的探针具有唯一性长度，因此可以通过(毛细管)电泳分离且鉴定其所得扩增子。该特征避免了多重PCR的分辨率限制。因为用于探针扩增的正向引物被可检测标记，所以每个扩增子产生可以用毛细管测序仪检测的荧光峰。将关于给定样品获得的峰图案与关于各种参考样品获得的峰图案进行比较，可以确定每个扩增子的相对数量。该比率是靶序列在样品DNA中存在比率的量度。
NGS平台
在产生加衔接子标签的扩增子文库之后，使用高通量大规模平行测序(即下一代测序)对扩增子进行测序。在一些实施方案中，高通量大规模平行测序采用使用可逆染料终止子的边合成边测序。在其他实施方案中，利用通过连接测序进行测序。在其他实施方案中，测序是单分子测序。下一代测序技术的例子包括但不限于焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序等。
Ion TorrentTM(Life Technologies,Carlsbad,CA)扩增子测序系统采用基于流动的方法，其检测在DNA复制中并入未经修饰的核苷酸期间由氢离子释放引起的pH变化。为了与该系统一起使用，最初通过产生侧接测序衔接子的DNA片段来产生测序文库。在一些实施方案中，可以通过乳液PCR在颗粒上克隆扩增这些片段。然后将具有扩增模板的颗粒放置在硅半导体测序芯片中。在复制期间，向芯片一个接一个地添加大量核苷酸，并且如果核苷酸与特定微孔中的DNA分子互补，则将所述核苷酸并入。在核苷酸由聚合酶并入DNA分子中时自然释放质子，从而引起可检测的局部pH改变。然后该孔中溶液的pH改变，并且用离子传感器检测。如果模板序列中存在均聚物重复序列，则将在单个循环中并入多个核苷酸。这产生相应数量的释放氢和比例较高的电子信号。
454TM GS FLX TM测序系统(Roche,Germany)在大规模平行焦磷酸测序系统中采用基于光的检测方法。焦磷酸测序使用DNA聚合，一次添加一种核苷酸物质，并且通过因释放附接的焦磷酸盐而发射的光检测且定量添加到给定位置的核苷酸数量。为了与454TM系统一起使用，将衔接子连接的DNA片段固定在油包水乳液中的小DNA捕获珠粒上，并且通过PCR(乳液PCR)扩增。将每个结合DNA的珠粒放置在picotiter板上的孔中，并且将测序试剂递送到板的孔中。在测序运行期间，在picotiter板装置上以固定次序依次添加四种DNA核苷酸。在核苷酸流动期间，对与每个珠粒结合的DNA的数百万拷贝进行平行测序。当将与模板链互补的核苷酸添加到孔中时，将核苷酸并入现有DNA链上，从而产生由仪器中的CCD相机记录的光信号。
基于可逆染料终止子的测序技术：首先将DNA分子附接到载玻片上的引物上并且扩增，以便形成局部克隆集落。添加四种类型的可逆终止子碱基(RT碱基)，并且洗去未并入的核苷酸。与焦磷酸测序不同，一次只能使DNA延伸一种核苷酸。用相机拍摄荧光标记的核苷酸的图像，然后以化学方法从DNA中去除染料和末端3'阻断子，从而使得可进行下一个循环。
Helicos Biosciences Corp's(Cambridge,MA)单分子测序使用DNA片段和添加的聚A尾衔接子，其与流动池表面附接。在每个循环中，添加DNA聚合酶和单种荧光标记的核苷酸，从而引起表面固定的引物-模板双链体的模板依赖性延伸。由Helioscope测序仪进行读取片段的处理。在获得平铺整个阵列的图像之后，化学切割和荧光标记的释放使得可进行后续的延伸和成像循环。
边合成边测序(SBS)，如“旧式”染料终止电泳测序，依赖于通过DNA聚合酶并入核苷酸来测定碱基序列。将具有固定衔接子的DNA文库变性为单链并移植到流动池中，接着桥接扩增以在玻璃芯片上形成高密度斑点阵列。可逆终止子法使用可逆形式的染料终止子，其一次添加一种核苷酸，通过重复去除阻断基团来检测每个位置的荧光以使得可聚合另一种核苷酸。核苷酸并入的信号可以随所有使用的荧光标记的核苷酸、磷酸盐驱动的光反应和氢离子传感而变化。SBS平台的例子包括Illumina GA、HiSeq 2500、HiSeq 1500、HiSeq2000或HiSeq 1000。个人测序系统(Illumina,Inc.)也采用了使用可逆终止子化学的边合成边测序。
与边合成边测序方法相反，边连接边测序方法使用DNA连接酶来测定靶序列。该测序方法依赖于通过模板DNA链上的局部互补性相邻的寡核苷酸的酶促连接。该技术采用根据测序位置标记的具有固定长度的所有可能寡核苷酸的分区。对寡核苷酸进行退火且连接，并且用DNA连接酶优先连接以匹配序列在该位置产生二核苷酸编码的色空间信号(通过释放荧光标记的探针，所述探针对应于沿着寡核苷酸的已知位置处的已知核苷酸)。LifeTechnologies的SOLiDTM测序仪主要使用该方法。测序之前，通过乳液PCR来扩增DNA。将各自仅含有相同DNA分子的拷贝的所得珠粒沉积在固体平面基板上。
SMRTTM测序基于边合成边测序方法。在零模波导(ZMW)小孔样容器中合成DNA，其中捕获工具位于孔的底部。使用未经修饰的聚合酶(与ZMW底部附接)和在溶液中自由流动的荧光标记的核苷酸进行测序。以仅在孔底部出现的荧光被检测到的方式构建孔。荧光标记在核苷酸并入DNA链中时与所述核苷酸分离，留下未经修饰的DNA链。
也可以使用AnyDot芯片(Genovoxx,Germany)进行DNA的高通量测序，所述芯片允许监测生物过程(例如miRNA表达或等位基因变异性(SNP检测))。例如，AnyDot芯片允许核苷酸荧光信号检测的10X-50X增强。其他高通量测序系统包括以下文献中披露的那些：Venter,J.等人,Science 2001年2月16日；Adams,M.等人,Science 2000年3月24日；和M.J,Levene等人,Science299:682-686,2003年1月；以及美国申请公开号2003/0044781和2006/0078937。
本发明技术的遗传学癌症检测测定
本文提供了用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的方法，所述方法包括从用裂解缓冲液和蛋白酶K从微量取样装置(例如尖端)的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中分离基因组DNA，其中多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在某些实施方案中，使用高通量大规模平行测序检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变。在一些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。
一方面，本发明技术提供了一种用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的方法，所述方法包括(a)从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取基因组DNA；(b)产生包含对应于多个遗传性癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库，所述多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL，其中衔接子序列与多个扩增子的末端连接；以及(c)使用高通量大规模平行测序检测多个扩增子中的至少一个中的至少一种突变。在一些实施方案中，干生物流体样品是干血浆、干血清或干全血。在某些实施方案中，干生物流体样品是从患有或怀疑患有遗传性癌症的患者获得。遗传性癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌。
另外或可替代地，在一些实施方案中，微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。在某些实施方案中，微量取样装置是尖端。干生物流体样品的洗脱可以通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来进行。在某些实施方案中，裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和TritonX-100。在另一个实施方案中，裂解缓冲液包含800mM盐酸胍；30mM Tris·Cl，pH 8.0；30mMEDTA，pH 8.0；5％Tween 20；以及0.5％Triton X-100。
另外或可替代地，在一些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液在90℃下接触长达15分钟来进行的。另外或可替代地，在某些实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达1小时来进行的。在其他实施方案中，干生物流体样品的洗脱是通过使微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达16-18小时来进行的。在一些实施方案中，微量取样装置的样品体积不超过10-20μL。
在方法的一些实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱不超过400ng基因组DNA。在方法的其他实施方案中，从微量取样装置的吸收尖端洗脱约100ng至约400ng基因组DNA。
另外或可替代地，在一些实施方案中，多个扩增子还包含唯一性索引序列。在某些实施方案中，使用诱饵组富集多个扩增子，所述诱饵组包含与多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列。在一些实施方案中，诱饵组的核酸序列是RNA诱饵、DNA诱饵或其组合。
在一个实施方案中，本发明技术中的特征性方法以多重多基因测定形式使用，所述形式例如并入来自大量基因中的大量不同遗传改变的多个信号的测定。
在方法的一些实施方案中，检测到的至少一种突变是APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL的突变。
在一些实施方案中，单个引物或引物对中的一个或两个引物包含与引物的标靶特异性序列部分的5'末端连接的特定衔接子序列(也称为测序衔接子)。该测序衔接子是具有已知序列的短寡核苷酸，其可以为邻接的未知靶核酸的扩增和测序两者提供引发位点。因此，衔接子使得可将片段与流动池结合以进行下一代测序。本发明技术中使用的引物中可以包括任何衔接子序列。在某些实施方案中，使用含有寡核苷酸测序衔接子的引物扩增对应于APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL的突变的特定区域的扩增子以产生加衔接子标签的扩增子。
在其他实施方案中，所用的引物不含衔接子序列，随后(即扩增后)所产生的扩增子与扩增子一端或两端的寡核苷酸测序衔接子连接。在一些实施方案中，所有正向扩增子(即从与靶核酸的反义链杂交的正向引物延伸的扩增子)含有相同的衔接子序列。在一些实施方案中，当进行双链测序时，所有正向扩增子含有相同的衔接子序列，并且所有反向扩增子(即从与靶区段的有义链杂交的反向引物延伸的扩增子)含有与正向扩增子的衔接子序列不同的衔接子序列。在一些实施方案中，衔接子序列还包含索引序列(也称为索引标签、“条形码”或多重标识符(MID))。
在一些实施方案中，衔接子序列是建议用于Illumina测序仪(MiSeq和HiSeq)的P5和/或P7衔接子序列。参见例如Williams-Carrier等人,Plant J.,63(1):167-77(2010)。在一些实施方案中，衔接子序列是建议用于Life Technologies测序仪的P1、A或Ion XpressTM条形码衔接子序列。其他衔接子序列是本领域已知的。一些制造商建议将特定的衔接子序列用于其所提供的特定测序技术和机器。
另外或可替代地，在上述方法的一些实施方案中，对对应于来自超过一个样品的APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL的特定区域的扩增子进行测序。在一些实施方案中，对所有样品同时平行测序。
在上述方法的一些实施方案中，使用本文所述的方法对对应于来自至少1、5、10、20、30或多达35、40、45、48或50个不同样品的APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL的特定区域的扩增子进行扩增且测序。
另外或可替代地，在方法的一些实施方案中，来源于单个样品的扩增子还可以包含指示产生扩增子的来源的相同索引序列，其指示产生扩增子的来源，每个样品的索引序列不同于来自所有其他样品的索引序列。因此，使用索引序列使得每次测序运行可汇集多个样品，随后基于索引序列确定样品来源。在一些实施方案中，使用Access ArrayTM系统(Fluidigm Corp.,San Francisco,CA)或Apollo 324System(Wafergen Biosystems,Fremont,CA)通过在一个装置中同时扩增来自样品的核酸来产生条形码标记(索引标记)的扩增子文库。
在一些实施方案中，使用含有索引序列的引物(例如正向引物和/或反向引物)产生索引标记的扩增子。可以在文库制备期间作为“条形码标记”工具包括这些索引标记的引物，以将特定扩增子鉴别为源自特定样品来源。当采用衔接子连接和/或索引标记的引物时，衔接子序列和/或索引序列在扩增期间被并入扩增子(与标靶特异性引物序列一起)中。因此，所得扩增子具有测序能力，并且不需要传统的文库制备方案。此外，索引标签的存在使得可区分来自多个样品来源的序列。
在一些实施方案中，可以用非衔接子连接和/或非索引标记引物扩增扩增子，随后可以使测序衔接子和/或索引序列与所得扩增子中的每一个的一端或两端连接。在一些实施方案中，扩增子文库使用多重PCR方法产生。
将来自超过一个样品来源的索引标记扩增子单独定量，然后在高通量测序之前汇集。因此，使用索引序列使得每次测序运行可汇集多个样品(即来自超过一个样品来源的样品)，随后基于索引序列确定样品来源。“多重化”是将多个加衔接子标签和索引标记的文库汇集到单个测序运行中。当使用索引标记的引物组时，该能力可以被用于比较研究。在一些实施方案中，在测序之前汇集来自多达48个单独来源的扩增子文库。
在产生加衔接子标签并且任选地索引标记的扩增子文库之后，使用高通量大规模平行测序(即下一代测序)对扩增子进行测序。用于进行高通量，大规模平行测序的方法是本领域已知的。在方法的一些实施方案中，高通量大规模平行测序是使用454TM GS FLX TM焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、边合成边测序、边连接边测序或SMRTTM测序来进行的。在一些实施方案中，可以使用读取片段深度方法来执行高通量大规模平行测序。
遗传性癌症的治疗
本文公开了用于确定患者是否将受益于用一种或多种抗癌治疗剂进行的治疗的方法。
乳腺癌和卵巢癌疗法的例子是本领域熟知的，并且包括手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合。免疫治疗剂包括抗体、放射免疫缀合物和免疫细胞因子。
化学治疗剂的类别可以包括烷化剂、铂剂、紫杉烷、长春花碱剂、抗雌激素药、芳香酶抑制剂、卵巢抑制剂、VEGF/VEGFR抑制剂、EGF/EGFR抑制剂、PARP抑制剂、细胞抑制生物碱、细胞毒性抗生素、抗代谢物、内分泌/激素剂、双膦酸盐治疗剂和靶向生物治疗剂(例如US 6306832、WO 2012007137、WO 2005000889、WO 2010096603等中所述的治疗性肽)。
特定化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-脱氮-氨基喋呤)、塞替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、托泊替康、长春新碱、长春碱、艾日布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸盐、曲妥珠单抗、拉帕替尼、蒽环霉素(例如柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin))、贝伐单抗或其组合。
组合化学治疗疗法可以包括AT：(多柔比星)和(多西他赛)；AC：(环磷酰胺)； CMF：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶；CEF： (表柔比星(Epirubicin))和氟尿嘧啶；EC：FAC：5-氟尿嘧啶、和GET：(吉西他滨)、和TC：TC：(卡铂)；TAC：或TCH： (曲妥珠单抗)和用于转移性乳腺癌或卵巢癌的其他组合化学疗法包括：Taxol和(卡培他滨)；Taxotere和Taxotere和 和 和 (蛋白质结合的紫杉醇)和 和 (伊立替康)和(Temozolomide)；和或(伊沙匹隆)和在一些实施方案中，化学治疗剂包括环磷酰胺和5-氟尿嘧啶或包括甲氨蝶呤、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶。
用于治疗皮肤癌的抗癌药的非限制性例子包括阿地白介素、考比替尼、达拉非尼、达卡巴嗪、氟尿嘧啶、拉他莫金、咪喹莫特、重组干扰素α-2b、伊匹单抗、派姆单抗、曲美替尼、纳武单抗、聚乙二醇干扰素α-2b、索尼德吉、维莫德吉和维罗非尼。
用于治疗结肠癌的抗癌药的非限制性例子包括贝伐单抗、卡培他滨、西妥昔单抗、伊立替康盐酸盐、甲酰四氢叶酸钙、三氟尿苷和替比嘧啶盐酸盐、奥沙利铂、帕尼单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼和阿柏西普。
一方面，本公开文本提供了一种用于选择表现出癌症症状的患者或有患遗传性癌症风险的患者以用抗癌治疗剂治疗的方法，所述方法包括(a)在使基因组DNA从血细胞中释放的条件下洗脱干血液样品，其中用体积计量吸收微量取样装置从患者收集干血液样品；(b)从洗脱的干血液样品中分离基因组DNA；(c)产生包含对应于多个遗传性癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库，所述基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL，其中衔接子序列与多个扩增子的末端连接；(d)使用高通量大规模平行测序检测多个扩增子中的至少一个中的至少一种突变；以及(e)如果在对应于以下中的一或多个的多个扩增子中的至少一个中检测到突变，则选择所述患者来用抗癌治疗剂治疗：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在某些实施方案中，体积计量吸收微量取样装置是尖端。在一些实施方案中，患者患有选自乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌或结肠癌的遗传性癌症或有患所述遗传性癌症的风险。
有患遗传性癌症风险的患者包括以下受试者：其(a)有两名或更多近亲被诊断患有癌症；(b)具有多种原发性肿瘤；(c)患有双侧或罕见癌症；(d)多代人中具有家族性癌症发病率；(e)具有与特定癌症综合征一致的肿瘤群；(f)具有某些种族背景(例如德系犹太血统)；或在年轻时出现癌症。
癌症症状包括但不限于持续咳嗽或带血的唾液，排便习惯改变，血便，贫血，乳房肿块或乳房分泌物，睾丸肿块，排尿频率改变，血尿，声音嘶哑，持续性肿块或腺体肿胀，出血或边缘不规则的痣，消化不良或吞咽困难，不寻常的阴道出血或分泌物，意外的体重减轻，夜间盗汗，发烧，肛门或生殖器区持续瘙痒，疮不愈合，头痛，背痛，骨盆痛以及腹胀。
在任何上述实施方案中，抗癌治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-脱氮-氨基喋呤)、塞替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、托泊替康、长春新碱、长春碱、艾日布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸盐、曲妥珠单抗、拉帕替尼、蒽环霉素、贝伐单抗、阿地白介素、考比替尼、达拉非尼、达卡巴嗪、拉他莫金、咪喹莫特、重组干扰素α-2b、伊匹单抗、派姆单抗、曲美替尼、纳武单抗、聚乙二醇干扰素α-2b、索尼德吉、维莫德吉、维罗非尼、西妥昔单抗、伊立替康盐酸盐、甲酰四氢叶酸钙、三氟尿苷和替比嘧啶盐酸盐、奥沙利铂、帕尼单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼和阿柏西普。
试剂盒
本公开文本提供了用于在干生物流体样品中检测本文所述的多个遗传性癌症相关基因中的一种或多种突变的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含皮肤穿刺工具、体积计量吸收微量取样装置、裂解缓冲液和蛋白酶K，其中多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。裂解缓冲液可以包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。可替代地，裂解缓冲液包含2.5％-10％十二烷基硫酸钠。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于使干生物流体样品中存在的细胞中的核蛋白复合物变性的一种或多种组分。另外或可替代地，在一些实施方案中，试剂盒还包含用于去除蛋白质污染物、灭活核酸酶活性和/或去除干生物流体样品中存在的生物和/或化学污染物的一种或多种组分。
在一些实施方案中，试剂盒还包含与多个遗传性癌症相关基因中的一个或多个的一个或多个区域或外显子杂交的一个或多个引物对。另外或可替代地，在一些实施方案中，试剂盒还包含与多个遗传性癌症相关基因中的一个或多个的一个或多个区域或外显子杂交的一个或多个诱饵序列。
特别地，在一些实施方案中，本发明技术的试剂盒包含一个或多个引物对或诱饵序列，所述引物对或诱饵序列与选自以下的基因中的一个或多个选择性地杂交，并且可用于扩增或捕获选自以下的基因中的一个或多个：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。
在一些实施方案中，本发明技术的试剂盒包含单个引物对或诱饵序列，所述引物对或诱饵序列与选自以下的单个基因的区域或外显子杂交：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在其他实施方案中，本发明技术的试剂盒包含多个引物对或诱饵序列，所述引物对或诱饵序列与选自以下的单个基因的一个或多个区域或外显子杂交：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在某些实施方案中，本发明技术的试剂盒包含多个引物对或诱饵序列，所述引物对或诱饵序列包含与以下中的每一个的单个基因的区域或外显子特异性杂交的单个引物对或诱饵序列：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在某些实施方案中，本发明技术的试剂盒包含多个引物对或诱饵序列，所述引物对或诱饵序列包含与以下中的每一个的一个或多个区域或外显子杂交的超过一个引物对或超过一个诱饵序列：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。
因此，本文预期本发明技术的试剂盒包含引物对或诱饵序列，所述引物对或诱饵序列识别并且与选自以下的一个或多个基因的一个或多个区域或外显子特异性杂交：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。
在本发明技术的试剂盒的任何上述实施方案中，体积计量吸收微量取样装置是尖端。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含多个体积计量吸收微量取样装置，每个体积计量吸收微量取样装置在近端具有中空固持器并且在远端具有吸收尖端。吸收尖端包含亲水性聚合物材料，所述材料被配置成在约10秒或更短时间内吸收30微升或更少的血液。试剂盒还包括具有多个隔室的容器。每个隔室被配置成可释放地接合体积计量吸收微量取样装置。容器被配置成防止微量取样装置的吸收尖端与内部放置微量取样装置的隔室邻接。
另外或可替代地，在某些实施方案中，试剂盒可以包括多个进入端口，其中每个端口与单独的隔室相关联。每个端口的位置使得可印刷到端口所关联的隔室内存在的体积计量吸收微量取样装置的固持器上。在某些实施方案中，体积计量吸收微量取样装置的固持器具有沿固持器长度延伸的多个肋，其中肋被配置成使吸收尖端不接触容器的壁。容器优选具有两个被配置成形成管形隔室的部分。容器可以具有第一部分，所述第一部分具有多个细长的安装突起，所述安装突起各自沿着不同隔室的一部分延伸。体积计量吸收微量取样装置的固持器的中空端配合到安装突起上，以将固持器可释放地紧固在安装突起上。
在一些实施方案中，试剂盒包含如下液体培养基，其含有浓度为250nM或更低的至少一种标靶特异性核酸探针。使用所述试剂盒，以所需量提供探针以根据本发明技术进行可靠的多重检测反应。
在一些实施方案中，试剂盒还包含缓冲液、具有聚合酶活性的酶、具有聚合酶活性且缺乏5'→3'核酸外切酶活性或5'→3'和3'→5’两种核酸外切酶活性的酶、酶辅因子(诸如镁或锰)、盐、链延伸核苷酸(诸如脱氧核苷三磷酸(dNTP))、经修饰的dNTP、核酸酶抗性dNTP或经标记的dNTP，以上是进行测定或反应诸如在干生物流体样品中扩增和/或检测本文所述的多个遗传性癌症相关基因中的一个或多个突变所必需的。
在一个实施方案中，本发明技术的试剂盒还包含阳性对照核酸序列和阴性对照核酸序列，以在实验运行期间确保测定的完整性。试剂盒还可以包含使用说明、用于自动化分析的软件、容器、包装诸如意图用于商业销售的包装等。
试剂盒还可以包含以下中的一种或多种：洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂以及检测构件。通常针对意图使用试剂盒的特定扩增/检测技术对缓冲液和/或试剂进行优化。试剂盒中还可以包括使用这些缓冲液和试剂进行程序中的不同步骤的方案。
本发明技术的试剂盒可以包括用于从干生物流体样品制备核酸的组分，所述核酸用于随后扩增和/或检测对应于本文公开的多个遗传性癌症相关基因的靶核酸序列的改变。可以使用此类样品制备组分从干生物流体样品诸如干血清、干血浆或干全血中产生核酸提取物。在上述方法中使用的测试样品将基于如下因素而变化，诸如测定形式、检测方法的性质以及用作待测试的测试样品的特定细胞或提取物。从样品中提取核酸的方法是本领域熟知的，并且可以容易地修改以获得与所用系统相容的样品。用于从测试样品中提取核酸的自动化样品制备系统可购得，例如Roche Molecular Systems’COBAS AmpliPrepSystem、Qiagen's BioRobot 9600、Qiagen's BioRobot EZ1、和AppliedBiosystems'PRISMTM6700样品制备系统。
实施例
实施例1：从使用 尖端收集的干血液样品中提取基因组DNA
该实施例证明，本发明技术的方法可用于从使用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品(例如干血液)中提取高产量的基因组DNA。
所述研究共招募了四名人类受试者。从4名供血者中的每一名收集三尖端的血液，以同时测试三种提取方法。通过手指针刺在每个尖端上收集装置上收集固定体积的10μL血液。干燥血液样品之后，然后将尖端收集装置的吸收尖端放置在180μL缓冲液G2(含有800mM盐酸胍；30mM Tris·Cl，pH 8.0；30mM EDTA，pH 8.0；5％Tween20；0.5％Triton X-100的裂解缓冲液)中，并且涡旋15秒。三种提取方法中的每一种的剩余样品处理步骤如下所总结：
然后使用dsDNA HS测定试剂盒定量提取的基因组DNA，所述试剂盒使用仅在dsDNA存在下发荧光的dsDNA嵌入染料。因此，使用dsDNAHS测定试剂盒定量dsDNA不受可能影响其他定量方法的RNA、蛋白质、盐或其他污染物的影响。表1和图1证明了从每个尖端获得的DNA产量根据提取方法而改变。确定提取方法3(将尖端与缓冲液G2在90℃下孵育15分钟，并且与蛋白酶K一起在56℃下孵育过夜)产生最高数量的DNA。
另外，图3证明从尖端回收的DNA产量将根据提取程序期间使用的裂解缓冲液、裂解期、提取平台和尖端的数量而显著变化。例如，与Roche MagNAPure平台(<30ng)相比，在Qiagen平台中从与Qiagen ATL缓冲液(包含2.5％-10％十二烷基硫酸钠)一起孵育1小时的单尖端回收的DNA产量较高(110-456ng)。相比之下，用某些裂解缓冲液(诸如Roche裂解缓冲液、Roche外部裂解缓冲液和ReliaprepTM(Promega))获得的DNA产量较低(<10ng)。参见图3。
这些结果证明，本发明技术的方法可用于从使用体积计量吸收微量取样装置收集的干生物流体样品(例如干血液)中提取高产量的基因组DNA。
实施例2：使用从 尖端中提取的干血液样品检测遗传性癌症相关突变
如实施例1中所述，使用提取方法3(将尖端与缓冲液G2在90℃下孵育15分钟，并且与蛋白酶K一起在56℃下孵育过夜)从通过尖端从每名供体收集的干血液样品中提取基因组DNA。汇集从每个供体的2个尖端中提取的DNA。然后在MyVantageTM综合遗传性癌症组上测试汇集的DNA，所述MyVantageTM综合遗传性癌症组评估了对应于包含以下的34个遗传性癌症相关基因中多个的731个扩增子：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。在Illumina测序仪上进行下一代测序。用于评估覆盖区域成功测序的质量度量标准包括给定区域中每个覆盖位置最少有20个读取片段。
结果。图2(a)显示在三个样品中，731个评估区域中的100％都通过了QC标准。一个样品中731个评估区域中有730个通过了QC标准。还比较了进行单尖端与双尖端提取的样品的测序性能。图2(b)和图4(b)显示，无论是采用单尖端提取或双尖端提取，731个评估区域中的100％都通过了QC标准。
图5证明当使用从尖端洗脱的干血液样品时，通过长范围PCR有效扩增了分别对应于CHEK2和PMS2靶区域的10kb和18kb扩增子。图6证明从自尖端洗脱的干血液样品中提取的基因组DNA显示出对数个CHEK2和PMS2外显子的充分覆盖。
此外，图7证明，使用从芯吸有EDTA全血的尖端获得的DNA的每个靶区域的最低读取片段覆盖量与用从通过手指针刺用尖端收集的血液获得的DNA观察到的最低读取片段覆盖量相当。因此，这些结果证明，本发明技术的方法能在含有已知PCR抑制剂诸如EDTA的干生物流体样品中有效检测遗传性癌症相关突变。
这些结果证明，本发明技术的方法能够在用体积计量吸收微量取样装置(例如尖端)收集的小体积干生物流体样品中检测本文所述的多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变。
实施例3：通过 平台使用从 尖端中提取的干血液样 品检测遗传性癌症相关突变
使用平台(其允许一次自动化96个样品)从通过尖端收集的20μL干血液样品中提取基因组DNA。将尖端与Qiagen ATL缓冲液在56℃下孵育温育过夜。随后根据制造商的说明在平台上进行DNA提取。对所有样品进行单尖端提取，并且得到在109-358ng范围内的DNA产量。然后在MyVantageTM综合遗传性癌症组上测试DNA，并且在Illumina测序仪上进行下一代测序。用于评估覆盖区域成功测序的质量度量标准包括给定区域中每个覆盖位置最少有20个读取片段。
结果。图4(a)证明，对于单核苷酸变异(SNV)和插入/缺失(INDEL)检测，低至109ng的DNA输入水平(从单尖端获得)在MyVantageTM综合遗传性癌症组上显示出足够的覆盖量。
这些结果证明，本发明技术的方法能够在用体积计量吸收微量取样装置(例如尖端)收集的小体积干生物流体样品中检测本文所述的多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变。
等效内容
本发明技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，意图将所述实施方案作为本发明技术单独方面的单一说明。如本领域技术人员显而易见，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行多种修改和改变。本领域技术人员根据先前描述将显而易见除了本文所列举的方法和装置以外在本发明技术范围内的功能上等效的方法和装置。所述修改和改变意图属于本发明技术的范围内。应理解，本发明技术不受限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，而是当然可以改变的。还应理解，本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不意图具有限制性。
术语“包含”、“包括”、“含有”等应以可扩展且无限制的方式来理解。另外，本文采用的术语和表达已经被用作具有描述性而没有限制性的术语，并且在使用此类术语和表达时并非意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，而是认为在要求保护的公开文本的范围内可以进行各种修改。
另外，当本公开文本的特征或方面按马库什组(Markush group)来描述时，本领域技术人员将认为，本公开文本也从而按马库什组的任何单独成员或成员子组来描述。
本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别在提供书面描述方面，本文中公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合。任何所列范围都可以被容易地认为是充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中论述的每个范围都可以被容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且指随后可以被分解为上述子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等等。
本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都以全文引用的方式并入，包括所有图式和表格，并入程度使其不会与本说明书的明确教示不一致。

Claims (31)

1.一种用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的方法，其包括：
(a)从自微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中提取基因组DNA；
(b)产生包含对应于所述多个遗传性癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库，所述多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL，其中衔接子序列与所述多个扩增子的末端连接；以及
(c)使用高通量大规模平行测序检测所述多个扩增子中的至少一个中的至少一种突变。
2.权利要求1的方法，其中所述干生物流体样品是从患有或怀疑患有遗传性癌症的患者获得的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述干生物流体样品是干血浆、干血清或干全血。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述微量取样装置的吸收尖端上的干生物流体样品是通过手指针刺从患者收集的。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与裂解缓冲液和蛋白酶K接触来进行的。
6.权利要求5的方法，其中所述裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。
7.权利要求5或6的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与所述裂解缓冲液在90℃下接触长达15分钟来进行的。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达1小时来进行的。
9.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述干生物流体样品的洗脱是通过使所述微量取样装置的吸收尖端与蛋白酶K在56℃下接触长达16-18小时来进行的。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述微量取样装置是尖端。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述微量取样装置的样品体积不超过10-20μL。
12.权利要求2-11中任一项的方法，其中所述遗传性癌症是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌或皮肤癌。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中从所述微量取样装置的吸收尖端洗脱不超过400ng基因组DNA。
14.权利要求1-12中任一项的方法，其中从所述微量取样装置的吸收尖端洗脱约100ng至约400ng基因组DNA。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述高通量大规模平行测序是使用焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、Helioscope单分子测序、边合成边测序、边连接边测序或SMRTTM测序来进行的。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述衔接子序列是P5衔接子、P7衔接子、P1衔接子、A衔接子或Ion XpressTM条形码衔接子。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述多个扩增子还包含唯一性索引序列。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中使用诱饵组富集所述多个扩增子，所述诱饵组包含与所述多个扩增子中的至少一个互补的核酸序列。
19.权利要求18的方法，其中所述诱饵组的核酸序列是RNA诱饵、DNA诱饵或其组合。
20.一种用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的方法，其包括从用裂解缓冲液和蛋白酶K从微量取样装置的吸收尖端洗脱的干生物流体样品中分离基因组DNA，其中所述多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。
21.权利要求20的方法，其中使用高通量大规模平行测序检测所述多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变。
22.权利要求20或21的方法，其中所述裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween20和Triton X-100。
23.一种用于选择表现出癌症症状的患者或有患遗传性癌症风险的患者以用抗癌治疗剂治疗的方法，其包括
(a)在使基因组DNA从血细胞中释放的条件下洗脱干血液样品，其中用体积计量吸收微量取样装置从所述患者收集所述干血液样品；
(b)从所洗脱的干血液样品中分离基因组DNA；
(c)产生包含对应于多个遗传性癌症相关基因中的每一个的扩增子的文库，所述多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL，其中衔接子序列与所述多个扩增子的末端连接；
(d)使用高通量大规模平行测序检测所述多个扩增子中的至少一个中的至少一种突变；以及
(e)如果在对应于以下中的一或多个的所述多个扩增子中的至少一个中检测到突变，则选择所述患者来用抗癌治疗剂治疗：APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。
24.权利要求23的方法，其中所述体积计量吸收微量取样装置是尖端。
25.权利要求23-24中任一项的方法，其中所述患者患有选自乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌或结肠癌的遗传性癌症或有患所述遗传性癌症的风险。
26.权利要求23-25中任一项的方法，其中所述抗癌治疗剂是选自以下的一种或多种药剂：环磷酰胺、氟尿嘧啶(或5-氟尿嘧啶或5-FU)、甲氨蝶呤、依达曲沙(10-乙基-10-脱氮-氨基喋呤)、塞替派、卡铂、顺铂、紫杉烷、紫杉醇、蛋白质结合的紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、替莫唑胺、托泊替康、长春新碱、长春碱、艾日布林、突变霉素、卡培他滨、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、亮丙瑞林、阿巴瑞克、布舍瑞林、戈舍瑞林、醋酸甲地孕酮、利塞膦酸盐、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、阿仑膦酸盐、地诺单抗、唑来膦酸盐、曲妥珠单抗、拉帕替尼、蒽环霉素、贝伐单抗、阿地白介素、考比替尼、达拉非尼、达卡巴嗪、拉他莫金、咪喹莫特、重组干扰素α-2b、伊匹单抗、派姆单抗、曲美替尼、纳武单抗、聚乙二醇干扰素α-2b、索尼德吉、维莫德吉、维罗非尼、西妥昔单抗、伊立替康盐酸盐、甲酰四氢叶酸钙、三氟尿苷和替比嘧啶盐酸盐、奥沙利铂、帕尼单抗、雷莫芦单抗、瑞格非尼和阿柏西普。
27.一种用于在干生物流体样品中检测多个遗传性癌症相关基因中的至少一种突变的试剂盒，其包含皮肤穿刺工具、体积计量吸收微量取样装置、裂解缓冲液和蛋白酶K，其中所述多个遗传性癌症相关基因包含APC、ATM、BARD1、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CDK4、CDKN2A(p14ARF和p16)、CHEK2、EPCAM、MEN1、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、POLD1、POLE、PTEN、RAD51C、RAD51D、RET、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、STK11、TP53和VHL。
28.权利要求27的试剂盒，其还包含与所述多个遗传性癌症相关基因中的一个或多个的一个或多个区域或外显子杂交的一个或多个引物对。
29.权利要求27或28的试剂盒，其还包含与所述多个遗传性癌症相关基因中的一个或多个的一个或多个区域或外显子杂交的一个或多个诱饵序列。
30.权利要求27-29中任一项的试剂盒，其中所述体积计量吸收微量取样装置是尖端。
31.权利要求27-30中任一项的试剂盒，其中所述裂解缓冲液包含盐酸胍、Tris·Cl、EDTA、Tween 20和Triton X-100。
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