CN119971002A

CN119971002A - 多发性硬化症中的免疫优势蛋白和片段

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Publication number: CN119971002A
Application number: CN202510128472.3A
Authority: CN
Inventors: M·索斯佩德拉拉莫斯; R·马丁
Original assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2025-05-13
Also published as: JP2021528965A; CO2020016105A2; MX2020014003A; ZA202007822B; EP4640282A2; US20210162019A1; PE20211739A1; EP3813865B1; CL2020003355A1; EP3813865A1; US12527846B2; CR20200642A; BR112020026458A2; CA3104231A1; AU2019294465A1; JP2024116146A; IL279608A; EP3586866A1; KR20210041559A; JOP20200329A1

Abstract

本公开内容涉及通过使用免疫优势蛋白或肽对多发性硬化症(MS)的治疗、诊断和/或预防。更具体地说，本发明涉及抗原特异性免疫疗法领域，例如耐受性的诱导。

Description

多发性硬化症中的免疫优势蛋白和片段

本申请是分案申请，对应的母案申请的申请号为201980050348.2，申请日期为2019年6月28日，发明名称为“多发性硬化症中的免疫优势蛋白和片段”。

技术领域

本发明涉及通过使用免疫优势蛋白或肽对多发性硬化症的治疗、诊断和/或预防。更具体地说，本发明涉及抗原特异性免疫疗法领域，例如耐受性的诱导。

背景技术

多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是一种破坏性的自身免疫性炎症性疾病，主要影响年轻人。MS是器官特异性自身免疫性疾病(AID)的原型实例，原因在于自身免疫性应答只靶向由脑和脊髓构成的中枢神经系统(CNS)。器官特异性AID是指患者的免疫系统通过自身反应性T细胞和/或抗体破坏特定的组织或细胞类型。

MS优先地影响20至40岁的年轻人，但儿童和老年人也可能发展MS。这种疾病在女性中的发病率为男性的约2-3倍。MS通常临床表现为视力(急性视神经炎)、感觉或运动和自主功能的暂时性问题，但可导致广泛的神经症状。

在首次表现时，如果已经排除了差异诊断，只要脑脊液(CSF)和磁共振成像(MRI)结果与诊断一致，该疾病被称为临床孤立综合征(CIS)。MRI显示位于MS的典型部位(即皮质旁、脑室旁、在脑干或脊髓中)的病灶。如果符合可以概括为空间扩散(一个以上的病灶或临床症状/体征)和时间扩散(一个以上的事件)的特定标准，那么就可以诊断为复发-缓解型多发性硬化症(relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS)。一个特殊的情况是偶然发现的MRI病灶符合无临床症状MS。这被称为放射学孤立综合征(RIS)，可被视为CIS和RRMS的前期阶段。超过80％的患者患有其中一种，大多数患者晚期发展所谓的继发性进行性MS(secondary progressive MS，SPMS)。此时，复发/恶化变得不那么频繁或完全停止，神经功能障碍在复发之间或没有复发时都稳步增加。

一种特殊形式的MS是原发性进行性MS(primary progressive MS，PPMS)，它从不复发，而是开始于神经症状的稳步恶化，例如行走能力的稳步恶化。PPMS影响大约10％的MS患者，并且男女发病率相同。其发作通常晚于CIS或RRMS。关于病因和疾病机制，认为PPMS与上述RIS-CIS-RRMS-SPMS相似。

通常，MS是根据修订后的McDonald或最近的Lublin标准诊断的。这些标准也允许区分MS的不同形式和疾病活动(Thompson等人，2018，Lancet Neurol，17(2)：162-173)。

MS是一种遗传背景复杂的疾病。在过去的十年中，已经鉴定出200多种MS风险等位基因或数量性状(以单核苷酸多态性(SNP)检测的基因的常见变体)，然而，迄今为止最重要的是人类白细胞抗原(HLA)-DR15单倍型。此外，还发现了一些环境/生活方式风险因素。这些包括感染埃巴病毒(EBV)、吸烟、低维生素D3水平和肥胖作为最重要因素。

所有的遗传和环境风险因素都是健康人群中许多个体共同共享的。为什么这种疾病开始于具有某些遗传和环境风险因素的个体的确切原因尚不清楚，但有人假设病毒和细菌感染，例如肠道微生物群的变化，可能是诱因。同卵双生子的同病率为10-30％，MS患者直系亲属的风险约为2-4％，而一般人群的风险为1/1000，这提供了遗传风险对比环境风险的估计，尽管两者之间的相互作用也很复杂。

为了确定MS中自身免疫反应所针对的CNS的成分，研究人员将研究重点放在MS中受影响的细胞和结构上，特别是髓鞘和轴突/神经元以及对这些细胞/结构特异性的蛋白。近三十年来，在动物模型(实验性自身免疫性脑脊髓炎；EAE)中，一些髓鞘蛋白如髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)已被鉴定为脑源性，即将其注射到易感啮齿类动物品系中导致与MS相似的疾病，但也可通过检验来自MS患者的免疫细胞(Sospedra和Martin，2005，Annu Rev Immunol，23:683-747)。上述自身抗原为CNS特异性的，仅在脑内表达(PLP和MOG)或几乎仅在脑内表达(MBP)。在MS中，一些非CNS特异性的自身抗原如α-B晶体蛋白和转醛醇酶-H也已被描述为潜在的靶点。

目前的证据表明，CD4+自身反应性T细胞是MS自身免疫发病机制的重要因素，可能不仅与自身免疫应答的诱导和维持有关，而且在组织损伤期间也如此(Sospedra和Martin，2005)。在MS患者中，与髓鞘的主要成分(如MBP、PLP和MOG)发生反应的高亲合力CD4+T细胞的频率增加(Bielekova等人，2004，J Immunol，172：3893-3904)。由于它们参与疾病的发病机制，CD4+T细胞成为治疗干预的靶标。

针对CNS特异性蛋白的免疫应答的详细研究表明，其某些肽被大比例的患者识别，并且在疾病相关的HLA-DR分子的背景下被识别。这样的肽被称为免疫优势的(Bielekova等人，2004)。

以下特征表明蛋白的某些肽在MS方面具有免疫优势：

a)这种肽被T细胞频繁识别，即被大约10％或更多的MS患者识别，通常在疾病相关的HLA等位基因或单倍型的背景下被识别(Sospedra和Martin，2005年)，和

b)与疾病相关的T细胞识别这种肽，例如那些对低浓度肽有反应的T细胞(高亲合力T细胞)(Bielekova等，2004)，因此被认为特别危险，和/或具有促炎性表型，和/或从靶器官或隔室(CNS)中分离,如果是MS，则是脑、脊髓或CSF浸润性T细胞。

然而，高亲合力识别不是先决条件，因为在人源化转基因小鼠模型中还显示出低亲合力的髓鞘特异性T细胞是致病性的(Quandt等人，2012，J Immunol，189(6)：2897-2908)。

最近已经证明，MS患者的T细胞在缺乏外源抗原的情况下显示出增加的体外增殖(Mohme等，2013，Brain，136：1783-1798)。这些“自增殖”T细胞富含归巢至MS患者的CNS隔室的细胞，并因此可以被认为是脑/CSF浸润性T细胞的外周血来源(Jelcic等人，2018，Cell，175(1)：85-100.e23)。

如果无法获得体外测试T细胞的数据，或者除了此类测试之外，还可以从与个体的HLA I类或II类等位基因良好结合并且分别用于CD8+和CD4+T细胞的那些肽中预测/推断肽的免疫识别。肽结合预测是技术人员众所周知的。可以通过完善的预测算法(NetMHCII-www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/；IEDB-www.iedb.org/)以及HLA结合基序的分析(SYFPEITHI-www.syfpeithi)来执行。

免疫优势肽可用于抗原特异性免疫疗法，例如耐受性诱导。一个实例是EP 2 205273 B1，其公开了MBP、PLP和MOG的免疫优势肽及其在MS治疗中的应用。在其中公开的方法中，肽偶联至白细胞或红细胞。

耐受性诱导是抗原特异性的并使自身反应性T细胞无功能或无变应性或诱导特异性抑制对所述靶抗原的不利自身免疫的调节性T(Treg)细胞。诱导对靶自身抗原的耐受性是自身免疫疾病中非常重要的治疗目标。它提供了以几乎没有副作用的有效方式特异性地减弱病原性自身免疫应答的机会。耐受性诱导还可以通过应用完整蛋白代替或补充作为该蛋白片段的免疫优势肽来实现(Kennedy MK等人，1990，J Immunol，144(3)：909-15)。

MS的一些病理特征反映在EAE模型中，EAE模型是Th1/Th17细胞驱动的自身免疫疾病的典范动物模型。对SJL小鼠的复发性EAE(R-EAE)进行的研究清楚地表明，慢性脱髓鞘涉及激活对免疫优势髓鞘肽(即PLP 139-154)的T细胞应答，最初的疾病加重指向免疫优势髓鞘肽。随后，免疫应答扩展至PLP、MBP和MOG的其他髓鞘肽，这一过程称为表位扩展。例如，当负载(pulsed)抗原肽的抗原呈递细胞(APC)例如用交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(ECDI；也简称为EDC)处理时，可以诱导T细胞的无应答性，即耐受性。

临床前实验已经证明，单一静脉内(i.v.)注射用脑致病性髓鞘肽混合物负载并用交联剂EDC固定的幼稚鼠脾细胞在体内诱导肽特异的耐受性方面非常有效。在EAE中，该方案不仅预防动物患病，甚至在疾病诱导后给予时还有效地降低所有后续复发的发作和严重程度，这表明特异的耐受性可以下调正在进行的自身免疫应答(Miller等人，1991，AcadSci，636：79-94)。与MS的治疗更相关的是，EAE中的研究已表明，使用脑致病性髓鞘肽的混合物可以同时诱导对多种表位的耐受性，从而提供靶向具有多种特异性的自身反应性T细胞的能力。

通过自体抗原偶联的细胞，例如经EDC处理的APC(Vandenbark等人，2000，IntImmunol，12：57-66)或无核细胞(即红细胞(RBC))，对人T细胞的耐受化处理(tolerization)在体外有效，如经耐受化处理的T细胞无法增殖或产生Th1细胞因子以及在这些细胞上共刺激分子表达的减少所显示的。

有证据表明，至少有两种不同的机制参与了这种机制对抗原特异的耐受性的诱导：

1)直接耐受性，其中由于不能接受足够的CD28介导的共刺激作用，遇到在抗原偶联的APC上的标称抗原(nominal antigen)/MHC复合物的Th1克隆变得不活跃(anergized)，和

2)间接机制，例如交叉耐受性，其中耐受性是由致耐受性宿主APC对抗原的再加工和重新呈递和/或Treg细胞的扩增所诱导的。

后者的交叉耐受性可能涉及抗原特异性Treg细胞的诱导和/或扩增，这一假设也得到本文公开的在Ib期试验中获得的数据的支持。此外，用EDC处理细胞可在相当比例的经处理细胞中诱导凋亡。因此，涉及固定的APC经历凋亡然后经历凋亡的APC由宿主APC处理并呈递的间接机制是可行的。在MHC缺陷和同种异体小鼠中有效诱导耐受性进一步支持了这一点。在体外骨髓衍生的树突细胞有效地吞噬并加工负载抗原的、固定的APC。

当前批准的MS疗法涉及各种抗原非特异性免疫调节或免疫抑制策略，其仅部分地有效。所有当前的治疗剂都需要每天口服或以各种时间间隔和长时间进行注射/输注。此外，它们与许多副作用有关，有时与严重的副作用有关。

一种针对MS发病机理的疗法，根本目的应是在不改变“正常”免疫系统的情况下特异性删除或功能性抑制病原性自身反应性细胞。这是重要的，因为全面的免疫调节和/或免疫抑制是以抑制有益的调节细胞和起到针对病原体的保护功能的免疫细胞为代价的。理想情况下，应在疾病的炎症阶段尽早实现对肽特异的免疫耐受性，即针对脑/脊髓组织的定向错误的自身免疫应答的特异性纠正，此时自身反应性免疫应答的阻断可抑制疾病的扩散和传播，并可以预防不可逆的障碍。因此，优选的目标患者群是在疾病过程早期的复发-缓解型MS患者，或甚至出现提示MS的首次临床事件(即CIS)的患者，或在RIS阶段更早发现疾病的患者。在这个时间点，MS患者的神经系统障碍程度通常较低，这使他们能够参与日常生活和工作的所有活动而不会造成显著损害。

发明内容

本发明的一个目的是鉴定适用于MS的治疗、诊断和/或预防的MS相关抗原，特别是适用于耐受化处理方法。本发明的另一方面是鉴定适合于耐受化处理的人类受试者。

本发明基于用于鉴定MS相关抗原的新颖方法：检查了在MS患者的脑中克隆扩增的T细胞(HLA DR15单倍型是纯合子，已知是MS中的主要遗传危险因素)，该MS患者死于非常高侵袭性形式的MS。因此，出于抗原鉴定的目的，第一次分析了源自靶器官并在靶器官中克隆扩增的T细胞。在所有以前的方法中，分析了外周血淋巴细胞以鉴定免疫优势抗原。

T细胞克隆(TCC)在MS脑病灶中的克隆扩增表明该细胞与MS相关。在此，已经鉴定了先前在Planas等人中描述的特定TCC的靶抗原(Planas等人，2015，Ann Clin TranslNeurol，2(9)：875-893)，即TCC21.1。此外，已经鉴定了同一患者的另一个TCC(TCC14)的靶抗原。在TCC14的情况下，该克隆是从外周血T细胞群体中分离出来的，该群体通过显示出增加的自发性增殖(自增殖)和脑归巢自体反应性T细胞的富集而被鉴定为与疾病相关。具体而言，即使已从外周血中分离出TCC14，还在MS脑病灶中发现TCC14得到克隆扩增。疾病相关T细胞(如TCC21.1和TCC14)的分离和鉴定示意性显示在图1中。

然后可以鉴定被生物学相关(例如组织浸润性)T细胞识别的靶表位(图2)。

这种新颖的方法揭示了蛋白GDP-L-岩藻糖合酶(基因缩写：TSTA3；也称为：GDP-L-岩藻糖：NADP+4-氧化还原酶(3,5-差向异构化)或GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3,5-差向异构酶4-还原酶)和RASGRP(RAS鸟苷释放蛋白)家族的蛋白，包括RASGRP1、RASGRP2、RASGRP3和RASGRP4以及其剪接变体和同工型，在MS中特别相关。特别优选地是RASGRP2。因此，已经发现这些蛋白在MS中是免疫优势的并且是自身抗原。

还已经在来自CIS/MS患者的CSF浸润性CD4+T细胞中针对GDP-L-岩藻糖合酶并在外周血来源的单核细胞中针对RASGRP2测试相关性。在进一步的分析中，已经在来自CIS/MS患者的CSF浸润性CD4+T细胞中测试了GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2两者。

因此，本文实施例中所述的抗原是MS中的第一免疫优势抗原，其已通过检查在MS脑病灶中克隆扩增的T细胞的特异性而发现，并因此假设参与破坏脑中的自身免疫反应。导致其鉴定的方法，即组合肽文库，并不涉及上述对髓鞘/脑蛋白的关注，而是完全无偏倚的。以前没有描述过这种抗原被牵涉在MS中。此外，RNA测序和蛋白质组学已经表明，自身抗原GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2以及相关蛋白RASGRP1和-3均在MS脑组织中表达。

所鉴定的抗原可以用于MS的治疗、诊断和/或预防，特别是用于耐受化处理方法，并且用于鉴定适合于耐受化处理的人类受试者。通过鉴定适合于耐受化处理的人类受试者，可以在体外对人类受试者诊断MS。换句话说，所鉴定的自身抗原可以用于MS的体外诊断。这种体外测试可以由临床和影像学发现(即根据现有技术，特别是根据修订的McDonald标准进行的MS诊断)补充。因此，所鉴定的自身抗原可以在有或没有其他诊断测试的情况下用于诊断人类受试者中的MS。

附图说明

图1疾病相关T细胞的分离。

图2靶表位发现。

图3单一定义和双重定义的十肽位置扫描混合物与生物统计分析(biometricanalysis)相结合以鉴定TCC21.1的特异性。

图4用生物统计方法预测的，合成的并就刺激能力测试的人十肽的总结。

图5脑组织中鉴定出的GDP-L-岩藻糖合酶转录物和肽。

图6GDP-L-岩藻糖合酶、髓鞘质和CEF肽(来自巨细胞病毒、EB病毒和流感病毒的对照肽)。

图7来自CIS/MS患者的CSF浸润性CD4+T细胞对GDP-L-岩藻糖合酶肽的识别。

图8分离在MS脑病灶中发现的自增殖T细胞和自增殖T细胞。

图9使用位置扫描文库对自增殖的外周血分离的脑归巢TCC14进行肽配体鉴定的筛选程序。

图10外周血衍生的记忆T细胞的RASGRP2反应性。

图11RASGRP在外周血B细胞和脑中的表达。

图12脑组织中RASGRP1、2和3蛋白的肽段鉴定。

图13对生物素-PLP1偶联的细胞的染色。

图14来自105名MS患者的CSF浸润性CD4⁺T细胞对GDP-L-岩藻糖合酶和髓鞘肽的识别。

图15来自57名MS患者的CSF浸润性CD4⁺T细胞对RASGRP2和髓鞘肽的识别。

图16用与髓鞘肽偶联的红细胞进行体内耐受性诱导。

具体实施方式

理想地，用于鉴定免疫优势肽和相应蛋白的T细胞是与疾病在病原学上相关的那些T细胞。关于后者的特征，那些在MS的靶组织(脑、脊髓和CSF)中克隆扩增的T细胞对于鉴定与疾病相关的靶抗原具有最大的意义。根据Planas等人(2015)描述的方法，T细胞受体(TCR)β链互补或基因组DNA序列的下一代测序已用于鉴定MS患者脑尸体解剖病灶中克隆扩增的T细胞并分离出这些T细胞作为来自自体CSF和/或组织(包括活细胞，并通过例如活检或早期尸体解剖获得)的TCC，并就功能表型和抗原特异性对其进行表征。从而已分离出与疾病有关的TCC。具体而言，已鉴定并表征了TCC21.1：TCC21.1显示Th2表型，主要释放Th2细胞因子，并能够为抗体生产提供B细胞帮助。该策略已导致鉴定出GDP-L-岩藻糖合酶蛋白的相关性。

上述策略，即脑/脊髓/CSF浸润性T细胞的深度TCR测序，也已用于从外周血中分离与疾病相关的T细胞，并从自增殖的外周血单核细胞(PBMC)中克隆鉴定出的T细胞。该策略已导致鉴定出RASGRP蛋白家族的相关性。

本研究使用CSF浸润性T细胞(用于GDP-L-岩藻糖合酶，并在进一步分析中用于GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2两者)以及外周血T细胞(用于RASGRP2)表明，这些是MS的自身免疫应答中的免疫优势靶，GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2(以及RASGRP家族的其他成员)两者都被MS(包括CIS、RRMS和SPMS)中的脑浸润性T细胞所识别。NetMHCII和IEDB的计算机(insilico)肽结合预测算法也已用于鉴定相应蛋白内的免疫优势区域(如“实施例”中所述)。

胞质酶GDP-L-岩藻糖合酶将GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖转化为GDP-L-岩藻糖，然后由岩藻糖基转移酶用于岩藻糖基化所有寡糖。在哺乳动物中，岩藻糖基化的聚糖在许多生物学过程中起着重要作用，包括输血反应、宿主与微生物的相互作用、癌症发病机制以及脑中非炎性环境的维持。

RASGR蛋白存在于至少四种变体RASGRP1、RASGRP2、RASGRP3和RASGRP4中。特别地，RASGRP1、RASGRP2、RASGRP3与本发明有关。该蛋白家族的特征在于存在Ras超家族鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)结构域，该结构域起二酰基甘油(DAG)调控的核苷酸交换因子的作用，通过结合的GDP与GTP交换而特异性激活Ras。该蛋白家族的蛋白激活Erk/MAP激酶级联反应。它们参与减少EBV感染的B细胞的凋亡和肿瘤发生，B和T细胞信号传导、-粘附、-运动，并且对于维持B-T细胞稳态是至关重要的。至少存在RASGRP2的四个同工型，即剪接变体。

以前，鉴定出的抗原GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2(以及RASGRP1、RASGRP3和RASGRP4)尚未涉及MS病因或发病机制或其动物模型EAE。这两种蛋白或其片段、衍生物或剪接变体都是MS中自身免疫应答的免疫优势靶标的这一发现允许将它们用于MS的治疗、诊断和/或预防。

蛋白旨在表示寡肽、多肽以及蛋白本身。蛋白序列可以由GenBank条目定义。蛋白序列也可以通过UniProtKB/Swiss-Prot条目和/或GenPept条目定义。条目可以由数字定义，例如登录号。如果适用，数据库条目包括相应的登录号(即条目号)和版本号。蛋白也可以通过技术人员已知的任何其他数据库来定义。可以存在不同的同工型、衍生物和/或剪接变体，这些也涵盖在本发明中。因此，该序列可以不同于来自例如GenBank或UniProtKB/Swiss-Prot条目的已知序列。

除非另有明确说明，根据本发明的“一种”蛋白或“该”蛋白是指GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或RASGRP蛋白家族的蛋白，优选地为RASGRP2，或者是指GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或RASGRP蛋白家族的蛋白(优选地为RASGRP2)两者。

剪接变体来自基因表达过程中的可变剪接。根据本发明所述的剪接变体优选地是免疫优势的。

片段优选地是蛋白的任何部分，其比亲本蛋白更短，即具有更少的氨基酸。片段可以是肽。在一个实施方案中，片段包含5至50个、优选地5至20个。更优选地10至15个氨基酸，甚至更优选地15个氨基酸。根据本发明所述的片段优选是免疫优势的。

也可以使用一个以上根据本发明所述的片段。优选地，使用三个以上、五个以上、十个以上、十五个以上、甚至二十个以上的不同片段。在一个优选的实施方案中，使用5至20个、优选地5至15个不同的片段。如果一个片段不由相同的氨基酸序列组成，则它不同于另一个片段。

在另一个实施方案中，根据本发明所述的每种蛋白(GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或RASGRP蛋白家族的蛋白，优选地为RASGRP2)的至少一个片段组合使用。将根据本发明所述的每种蛋白的至少一个片段与至少一种现有技术水平的已知肽，特别是与至少一种髓鞘肽，特别是与SEQ ID NO：261至267所定义的髓鞘肽的至少一种或全部组合，是特别有利的。

序列的衍生物优选地定义为在其全长上与参考氨基酸序列的相应部分具有至少75％、更优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性的氨基酸序列。在本发明的意义上，“对应部分”优选地是指所述亲本序列的相同氨基酸区段。例如，如果长度为100个氨基酸的衍生物与SEQ ID NO：1的氨基酸区段(SEQ ID NO：1的氨基酸1至100)有20个氨基酸不同，则该特定衍生物与其对应部分即参考氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的1至100个氨基酸，在其整个长度上具有80％的同一性。根据本发明所述的衍生物优选地是免疫优势的。

根据本发明，优选地在参考氨基酸序列的整个长度上或在参考氨基酸序列的对应部分的整个长度上确定氨基酸序列的“同源性”或“同一性”，所述参考氨基酸序列对应于定义了同源性或同一性的序列。

“同一性”被定义为相同的氨基酸，“同源性”包括相同的氨基酸以及保守取代。本领域技术人员知晓保守取代，例如

-芳香族和芳香族F和W/Y

-带正电和带正电的R和K/H

-带负电的E和D或

-脂肪族V和L/M/I，或A和S/T。

编码本发明的任何蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列是指任何编码核苷酸序列，例如RNA或DNA，特别是mRNA或cDNA。在一个实施方案中，核苷酸序列是本领域技术人员已知的质粒或任何类型的载体。在一个优选的实施方案中，核苷酸序列不包含内含子，并且基因序列包含外显子和内含子。

在本发明的一方面，用于多发性硬化症(MS)的治疗、诊断和/或预防的蛋白是GDP-L-岩藻糖合酶或其片段、衍生物或剪接变体。在本发明的另一方面，蛋白是RASGRP家族的成员或其片段、衍生物或剪接变体。本发明还涉及编码所述蛋白或其片段、衍生物或剪接变体中的任一种的核苷酸序列，用于多发性硬化症(MS)的治疗、诊断和/或预防。

在一个优选的实施方案中，蛋白是人蛋白，和/或核苷酸序列和/或基因序列是人序列。

在一个实施方案中，GDP-L-岩藻糖合酶显示将GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖转化为GDP-L-岩藻糖的酶活性。

在另一个实施方案中，RASGRP家族的成员通过结合的GDP与GTP交换来激活Ras。另外地或备选地，所述蛋白激活Erk/MAP激酶级联。

在一个优选的实施方案中，GDP-L-岩藻糖合酶蛋白

a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或

b)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％相同的氨基酸序列，或

c)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％同源的氨基酸序列，或

d)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源的氨基酸序列并且所述蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段的抗体识别，或

e)由TSTA3基因编码，特别是由NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列编码，或由与NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列至少80％、优选地至少90％、甚至更优选地至少95％的基因编码相同。

在另一个优选的实施方案中，RASGRP蛋白家族的成员

f)具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中任一项所示的氨基酸序列，或

g)具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中任一个所示的氨基酸序列具有至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％相同的氨基酸序列，或

h)具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中任一项所示的氨基酸序列至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％同源的氨基酸序列，或

i)具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中任一项所示的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源的氨基酸序列并且所述蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：9中任一项所示的相应氨基酸序列或其片段的抗体识别，或

j)由RASGRP基因编码，特别是由以下的基因序列编码：

-NC_000015.10的核苷酸38488101至38565575，

-NC_000011.10的核苷酸64726911至64745456，

-NC_000002.12的核苷酸33436324至33564750，或

-NC_000019.10的核苷酸38409051至38426305，

或由与以下的基因序列至少80％、优选地至少90％、甚至更优选地至少95％相同的基因编码：

-NC_000015.10的核苷酸38488101至38565575，

-NC_000011.10的核苷酸64726911至64745456，

-NC_000002.12的核苷酸33436324至33564750，或

-NC_000019.10的核苷酸38409051至38426305。

与自体HLA等位基因的结合，被T细胞识别和/或被抗体识别可能表明该蛋白或其片段或剪接变体具有免疫优势。免疫优势也可以如下所述进行测试。

在一个特别优选的实施方案中，本发明中使用GDP-L-岩藻糖合酶或RASGRP2蛋白或其剪接变体，优选地GDP-L-岩藻糖合酶或RASGRP2蛋白。GDP-L-岩藻糖合酶蛋白具有例如SEQ ID NO：1所示的序列，RASGRP2蛋白具有例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的序列。

在一个实施方案中，所述片段包含5至50个、优选地5至20个、更优选地10至15个氨基酸，甚至更优选地15个氨基酸。

在另一个实施方案中，所述片段

a)与各个相应的氨基酸序列至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％相同，或

b)与各个相应的氨基酸序列至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％同源，或

c)与各个相应的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源并且结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别所述各个氨基酸序列的抗体识别。

“各个相应的氨基酸序列”是指相应氨基酸序列(即，SEQ ID NO：1)的各个片段，其具有与同源片段相同的长度(也参见上文“相应部分”的定义)。具有这些同一性和/或同源性的片段可以包含5至50个、优选地5至20个、更优选地10至15个、甚至更优选15个氨基酸。在各个片段的整个长度上确定同一性和/或同源性。换句话说，“相应的氨基酸序列”是指未改变的序列，即当SEQ ID NO：1所示的序列的片段与各个相应地氨基酸85％相同时，该片段与从SEQ ID NO：1“切下的”(即，直接取自或复制自SEQ ID NO：1)未改变的片段85％相同(在该片段的整个长度上)。

因此，在一个实施方案中，蛋白(GDP-L-岩藻糖合酶或RASGRP蛋白家族的成员)具有与SEQ ID NO所示地各个描绘的序列具有一定同源性(至少60％，优选地至少70％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％)的氨基酸序列，另外要求该蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，被T细胞识别或被结合或识别各个SEQ ID NO所示氨基酸序列或其片段的抗体识别。在另一个实施方案中，所述蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，并被T细胞识别，该T细胞结合或识别各个SEQ ID NO所示的氨基酸序列或其片段。

用于测量和/或预测与自体HLA等位基因的结合、被T细胞的识别或被抗体的识别的测定法是本领域技术人员众所周知的。例如，可以通过使用公认的NetMHCII(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)或IEDB(http://www.iedb.com)计算机肽结合预测算法预测肽与HLA等位基因的结合。T细胞识别可以例如通过T细胞增殖测定法，例如通过测量掺入的放射性来测量。肽和/或蛋白与抗体的结合可以通过本领域技术人员已知的标准测定法来测量，例如通过ELISA。与自体HLA等位基因的结合、被T细胞的识别或被抗体的识别可能指示肽或蛋白的免疫优势。免疫抗原性也可以如下所述进行测试。

在一个实施方案中，所述片段代表连续氨基酸的区段(例如20至30个氨基酸)，其在RASGRP家族的蛋白之间至少90％相同或同源。

在优选的实施方案中，根据本发明所述用于治疗的肽是GDP-L-岩藻糖合酶的片段或RASGRP蛋白家族的蛋白的片段，并包含选自由SEQ ID NO：10至98组成的组的序列。在特别优选的实施方案中，肽由如SEQ ID NO：10至98之一所示的氨基酸序列组成。SEQ ID NO：10至35的序列是优选的。

由于被疾病相关的T细胞识别，并随后验证被CSF浸润性大量T细胞对GDP-L-岩藻糖合酶和PBMC对RASGRP2的识别，已经鉴定了根据SEQ ID NO：10至35的序列为免疫优势肽(参见“实施例”)。根据SEQ ID NO：36和37的氨基酸序列代表RASGRP2和RASGRP3之间的相同序列的区段(UniProtKB/Swiss-Prot Q7LDG7-1和UniProtKB/Swiss-Prot Q8IV61的比对)。根据SEQ ID NO：38至98的氨基酸包含在肽库中，该肽库引起来自MS患者的记忆T细胞反应(参见实施例的9和图10)。具有SEQ ID NO：12、21、23、28和32(GDP-L-岩藻糖合酶)和SEQ IDNO：46(RASGRP2)的序列已在用CSF浸润性CD4⁺T细胞的进一步分析中得到验证(参见“实施例”的13以及图14和15)。

SEQ ID NO：1-98的序列也列在下表1中：

表1：蛋白序列、位置和数据库条目。序列Q7LDG7-1是RASGRP2蛋白的规范序列，也指RASGRP2同工型1。下面描述的蛋白和肽是本发明特别优选的实施方案。

以下基因序列(表2)代表蛋白GDP-L-岩藻糖合酶(基因：TSTA3)、RASGRP1、RASGRP2、RASGRP3和RASGRP4的基因序列(表2)。所述蛋白或其衍生物或剪接变体优选地由各个基因编码。

表2：基因序列和数据库条目

以下核苷酸序列(表3)代表编码本发明的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体中的任一种的优选核苷酸序列。该表还包括编码序列(CDS)，即蛋白或多肽，其也可用于多发性硬化症(MS)的治疗、诊断和/或预防。

表3：核苷酸序列和蛋白序列以及相应的数据库条目(Genbank登录号)

所有序列均于2018年6月22日从各个在线数据库中检索到。

在一个实施方案中，根据本发明所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体可以用于鉴定适于在MS、优选地早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者。鉴定适于在MS、优选地早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者优选地包括测量在所述人类受试者中T细胞和/或抗体对自身抗原的阳性反应性。由此，还可以对人类受试者在体外诊断MS。换句话说，所鉴定的自身抗原也可以用于MS的体外诊断。

MS的体外诊断优选包括以下步骤：从受试者的血液、CSF或其他体液分离T细胞(优选地CD4+T细胞)和/或抗体，并测量所述T细胞和/或抗体针对根据本发明所述的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的反应性。本领域技术人员知晓用于从受试者的血液、CSF或其他体液中分离T细胞和/或抗体并且测量T细胞和/或抗体针对所述蛋白、片段、衍生物或剪接变体的反应性的方法。T细胞(优选地CD4+T细胞)和/或抗体针对所测试的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的反应性可以指示该受试者患有MS。诊断还可以与临床和影像学发现(即，根据现有技术，特别是根据修订的McDonald标准进行的MS诊断)相组合。

在另一个实施方案中，根据本发明所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体可以用于区分MS亚组。特别地，根据本发明所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体可以用于诊断人类受试者中的模式II MS。

以下特征表明蛋白的某些肽在MS方面是免疫优势的：

a)T细胞对这种肽的频繁识别，即被大约10％或更多的MS患者识别，通常是在疾病相关的HLA等位基因或单倍型的背景下被识别(Sospedra和Martin，2005年)，以及

b)与疾病相关的T细胞识别这种肽，例如那些对低浓度肽有应答的T细胞(高亲合力T细胞)(Bielekova等人，2004)，并因此被认为特别危险的，和/或具有促炎性表型，和/或从靶器官或隔室(CNS)中分离，如果是MS，则是脑、脊髓或CSF浸润性T细胞。

然而，高亲合力识别并不是先决条件，因为在人源化转基因小鼠模型中还显示出低亲合力的髓鞘特异性T细胞是致病性的(Quandt等人，2012)。

因此，可以测试在MS的情况下蛋白或其片段、衍生物或剪接变体是否是免疫优势的。这种测试优选地是体外测试。特别合适的是体外测试，该测试允许测量从被诊断出患有MS的人类受试者的血液、CSF或其他体液中获得的T细胞和/或抗体(优选地CSF浸润性CD4⁺T细胞)对测试的蛋白或片段、衍生物或剪接变体的反应性。本领域技术人员知道测试T细胞(优选CD4⁺T细胞)和/或抗体的反应性的方法。例如，可以测试CD4⁺T细胞的增殖和/或它们的IFN-γ分泌或在ELISPOT/FLUOROSPOT测定法中的反应性或对HLA-肽四聚体的反应性。如果测试的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体在已诊断出患有MS的人类受试者中诱导反应性，则在T细胞反应性，尤其是刺激指数(SI)高于2和/或IFN-γ分泌高于20pg/ml的情况下，测试的蛋白或片段、衍生物或剪接变体可以称为是免疫优势的。还可以选择10名被诊断出患有MS的患者进行此类测试。如果在至少2名患者中诱导了反应性，则测试的蛋白或片段、衍生物或剪接变体可以称为是免疫优势的。优选地，根据已建立的修订的McDonald标准，已经将10名患者诊断为患有RRMS。

最近已经证明，MS患者的T细胞在缺乏外源抗原的情况下显示出体外增殖的增加(Mohme等人，2013；Jelcic等人，2018)。这些“自增殖”T细胞富含归巢至MS患者的CNS隔室的细胞，并因此可以认为是脑/CSF浸润性T细胞的外周血来源。

如果无法获得体外T细胞测试的数据或除了此类测试之外，还可以从与个体的HLAI类或II类等位基因良好结合并且分别用于CD8+和CD4+T细胞的那些肽中预测/推断肽的免疫识别。肽结合预测是技术人员众所周知的。可以通过完善的预测算法(NetMHCII-www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/；IEDB-www.iedb.org/)以及HLA结合基序的分析(SYFPEITHI-www.syfpeithi)来执行，参见“实施例”的11。

根据本发明，已经将蛋白GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP蛋白家族的成员(特别是RASGRP2)，鉴定为在MS中是免疫优势的，因此已将它们鉴定为自身抗原。

不需要与HLA等位基因的结合是特别牢固的。实际上，与HLA等位基因结合不良的肽也可能发生免疫优势(Muraro等人，1997，J Clin Invest；100(2)：339-349)。

耐受性诱导是抗原特异性的，并使自身反应性T细胞无功能或无变应性，或诱导特异性抑制对所述靶抗原的不利自身免疫性的Treg细胞。诱导对靶自身抗原的耐受性在自身免疫疾病中是非常重要的治疗目标。它提供了以几乎没有副作用的有效方式特异性减弱病原性自身免疫应答的机会。耐受性诱导也可以通过应用完整蛋白代替或补充是该蛋白片段的免疫优势肽来实现(Kennedy MK等人，1990)。本文已显示，经静脉内(i.v.)注射与红细胞偶联的免疫优势肽可在人类患者中诱导与耐受性一致的免疫学改变(实施例的14)。因此，免疫优势肽可以用于耐受性诱导。

蛋白和/或片段的免疫优势因此允许使用所述蛋白和/或其片段、衍生物或剪接变体进行抗原特异性免疫疗法，例如耐受性诱导。

根据本发明，抗原特异的耐受化处理可用于所有形式的MS：在首次表现时，当已经排除了差异诊断，只要CSF和MRI结果与诊断相一致，疾病被称为CIS。MRI揭示了位于MS的典型部位(即皮质旁、脑室旁、在脑干或脊髓中)的病灶。如果符合可以概括为空间扩散(一个以上的病灶或临床症状/体征)和时间扩散(一个以上的事件)的特定标准，则可以做出RRMS诊断。一种特殊的情况是偶然发现了与无临床症状MS相符的MRI病灶。这称为RIS，可以视为CIS和RRMS的前期阶段。超过80％的患者患有其中一种，大多数患者后来发展出所谓的SPMS。此时，复发/加重变得不那么频繁或完全停止，并且神经功能障碍在复发之间或没有复发时都稳步增加。

一种特殊形式的MS是PPMS，它从不复发，而是开始于神经学症状的稳步恶化，例如行走能力的稳步恶化。PPMS影响大约10％的MS患者并且男女发病率相同。它的发作通常晚于CIS或RRMS。关于原因和疾病机制，认为PPMS与上述RIS-CIS-RRMS-SPMS相似。

通常，MS是根据修订的McDonald标准诊断的。这些标准还允许区分MS的不同形式和疾病活性(Thompson等人，2018，Lancet Neurol，17(2)：162-173)。

优选地，耐受化处理方法在早期阶段(即，RIS、CIS和早期RRMS)应用，因为假定在该阶段的免疫过程主要由自身反应性T淋巴细胞介导，而组织损伤(即所谓的退行性改变)在疾病进展时逐渐变得越来越重要。但是，只要存在针对用于耐受化处理的抗原的自身反应性T细胞应答(在SPMS和PPMS期间也是如此)，耐受化处理就有意义。

在一个特别优选的实施方案中，在早期阶段，即RIS、CIS和早期RRMS，在耐受化处理方法中使用GDP-L-岩藻糖合酶或RASGRP2蛋白或其剪接变体，优选地GDP-L-岩藻糖合酶或RASGRP2蛋白。GDP-L-岩藻糖合酶蛋白具有例如SEQ ID NO：1所示的序列，RASGRP2蛋白具有例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的序列。

在本发明的一个方面，提供了一种在患有MS或处于发展MS风险的人类受试者中诱导对自身抗原的抗原特异的耐受性的方法。该方法包括以下步骤：对有此需要的患者(即人类受试者)施加至少一种蛋白，所述蛋白选自：GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP蛋白家族的成员，其片段(肽)、衍生物和/或剪接变体，编码所述蛋白或其片段、衍生物或剪接变体中任一种的核苷酸序列和/或本文所述的基因序列，或者施加包含至少一种本文所述的蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列的至少一种承载体。

在一个实施方案中，通过承载体(例如细胞)将核苷酸序列或基因序列施加于患者。随后由所述承载体(例如细胞)表达抗原。将自身抗原编码RNA/DNA转移到承载体(例如细胞)中，并因此也想到这样编码上述自身抗原与使用抗原编码RNA的肿瘤疫苗接种方法相似。

特别优选地使用GDP-L-岩藻糖合酶的完整蛋白(SEQ ID NO：1)或RASGRP2的完整蛋白(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6、7、8或9)用于诱导抗原特异的耐受性。在另一个优选的实施方案中，使用任何这些蛋白的片段。特别优选地使用SEQ ID NO：10至98中任一项所示的片段。甚至更优选地是SEQ ID NO：10至35中任一项所示的肽。

所述至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列可以通过鼻腔、吸入、口腔、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌肉内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用，优选地通过被认为具有致耐受性的施用途径，例如通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口腔、吸入、鼻腔或与致耐受性承载体(优选地RBC)偶联而施加。

特别地，该方法可用于在早期MS或甚至疾病的临床前阶段中诱导针对自身抗原的抗原特异的耐受性。

本文提供的抗原特异的耐受性方案可以选择性地靶向对使疾病持续的多种潜在的致脑病性表位具有特异性的激活的和幼稚的自身反应性T细胞。

耐受化处理方法也可用于预防MS。该方法可以包括鉴定那些具有发展MS的高风险的个体(例如，在有MS患者的家庭中)。例如，可能耐受化处理例如患有MS的母亲的孩子或患有MS的患者的同卵双胞胎，他们发展MS的风险特别高。

对MS或其形式之一的诊断是通过证明与MS相符的神经学缺损和/或MRI病灶在空间和时间上传播来进行的。针对新型靶蛋白GDP-L-岩藻糖合酶及RASGRP家族和/或其片段、衍生物和/或剪接变体的自身免疫应答的阳性实验室测试可用于鉴定特别可能从抗原特异的耐受性诱导中受益的患者，即允许个性化抗原特异的耐受性方法。通过鉴定特别可能从抗原特异的耐受性诱导中获益的患者，可以在体外诊断出患有MS的患者。换句话说，所鉴定的自身抗原GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP家族(特别是RASGRP2)和/或其片段和/或衍生物和/或剪接变体可以用于MS的体外诊断。因此，这种体外测试可以由临床和影像学结果(即根据现有技术，特别是根据修订的McDonald标准进行的MS诊断)补充。

在本发明的另一方面，提供了一种鉴定适合于在MS、优选早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者的方法。从而确定将从治疗中受益或适合所述治疗的个体患者。该方法还可用于体外诊断MS。患有CIS(可能还有RIS)和RRMS患者最适合进行耐受化处理，尽管只要患者对耐受化治疗中包括的至少一种抗原肽有应答，则耐受化处理似乎对任何形式的MS(包括SPMS和PPMS)都有意义。该方法的步骤包括从受试者的血液、CSF或其他体液中分离T细胞(优选CD4+T细胞)和/或抗体，并测量所述T细胞和/或抗体对根据本发明所述的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的反应性。本领域技术人员知晓用于从受试者的血液、CSF或其他体液中分离T细胞和/或抗体并且测量T细胞和/或抗体对蛋白、片段、衍生物或剪接变体的反应性的方法。

如果个体对一种或多种蛋白或片段中的一种有应答，那么他/她就可以由此在体外被诊断为患有MS，并且适合治疗并且是好的候选。进一步的选择步骤可以是HLAII类分型和与MS相关的HLA-DR等位基因的存在。

因此，可以使用衍生自与疾病相关的抗原的蛋白，尤其是GDP-L-岩藻糖酶合酶蛋白或RASGRP家族的蛋白，尤其是RASGRP2，或其片段、衍生物或剪接变体，来鉴定具有针对各自自身抗原的现有的和/或特别强烈的促炎性(潜在有害)T细胞或抗体应答的患者或患者亚组。通过鉴定具有针对各自自身抗原的现有和/或特别强的促炎性(潜在有害)T细胞或抗体应答的那些患者或患者亚组，因此可以在体外诊断患有MS的患者。在这种情况下，用合适的测试对患者进行预测试以评估对自身抗原的反应性，还可以针对个体患者或患者亚组量身定制耐受化处理治疗(例如，用于耐受化处理的肽/蛋白的组合物)，目标在于使耐受化处理尽可能地有特异性，并避免潜在的不利影响。然而，抗原特异性耐受化处理也可以在尚未显示出对耐受化处理抗原的T细胞应答的患者中进行。因此，在一个实施方案中，根据本发明所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体可以用于对诊断出患有MS的人类受试者或处于发展MS风险中的人类受试者的体外预测试。

在本发明的一个方面，提供了一种承载体(carrier)，其包含至少一种本文所述的蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列。所述承载体可以与至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体偶联，和/或所述承载体可以包含至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列。在一个实施方案中，术语“包含”是指蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列在承载体内部而不是在其表面上。蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体也可以与承载体偶联并包含在承载体内，这意味着蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体的一部分与承载体偶联并且蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体的另一部分包含在承载体内。

本领域技术人员熟悉可能的承载体。例如，承载体可以是任何细胞、蛋白、脂质、糖脂、珠粒、纳米颗粒、病毒样颗粒(VLP)或分子(例如糖分子)，或其任何组合，所述承载体适合于在人类中应用并且可以通过偶联方法与一种或多种蛋白和/或片段偶联，例如通过化学偶联方法，优选通过EDC偶联。承载体可以衍生自天然存在的承载体或为合成的承载体。优选地，细胞、分子、珠粒、纳米颗粒或VLP在体内是生物可降解的，或者至少适用于活人，并且在体内分解，或者从施用承载体的身体中消除。术语细胞还包括细胞前体，例如RBC前体。优选地，承载体是血细胞，甚至更优选地是红细胞或白细胞。白细胞可以是脾细胞或PBMC或通常是APC。

在一实施方案中，蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体由细胞(优选地血细胞)表达。由此，在细胞表达蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体之前，将编码所述蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体的遗传信息引入细胞。

可以使用将蛋白和/或其片段与承载体偶联的任何偶联剂或方法。例如，合成的或天然的接头可用于偶联。这种接头的一个实例是存在于RBC表面上的糖蛋白A。在一实施方案中，执行化学交联。在一个优选的实施方案中，使用了催化游离氨基和羧基之间的肽键形成的化学交联剂EDC。特别是在存在EDC的情况下，可以将多种肽偶联至承载体的表面，从而允许同时靶向多种T细胞特异性。优选地，3种以上、5种以上、10种以上、15种以上或甚至20种以上不同的肽偶联至承载体的表面。在一个优选的实施方案中，使用5至20种、优选地5至15种不同的肽。如果一个肽不是由相同的氨基酸序列组成，则它不同于另一个肽。承载体优选地是细胞但不一定是细胞。只要存在游离氨基，EDC便可用于偶联至任何承载体。

在另一个实施方案中，根据本发明所述的每种蛋白(GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或RASGRP蛋白家族的蛋白，优选地RASGRP2)的至少一个肽组合使用并偶联至承载体。特别有利地是将根据本发明所述的每种蛋白的至少一种肽与至少一种现有技术的已知肽，特别是与至少一种髓鞘肽，特别是与SEQ ID NO：261至267所定义的髓鞘肽的至少一种或全部组合。

在一个优选的实施方案中，承载体是血细胞，并且血细胞通过偶联剂，优选地通过EDC化学偶联至至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体。还提供了一种制造这种化学偶联的(即抗原偶联的)血细胞的方法，其包括从人类受试者分离血细胞，添加至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体，即抗原，然后加入偶联剂，优选地EDC。

通过EDC与肽偶联的细胞的作用机制尚未完全了解，但涉及将肽的氨基和羧基与细胞表面分子共价连接，肽偶联(即抗原偶联的)细胞的随后程序性细胞死亡(对于有核细胞，是细胞凋亡；对于RBC，是红细胞衰亡)，然后体内垂死细胞的致耐受性呈递(tolerogenic presentation)。

可以滴定用于偶联反应的EDC剂量，以获得最大的安全性和最佳功效。在高浓度下，EDC可能导致细胞特别是RBC的裂解。为了使RBC具有最佳的稳定性，可以使用小于15mg/ml、优选地小于10mg/ml、甚至更优选地小于5mg/ml、甚至更优选地约3mg/ml的EDC终浓度。最佳剂量也可以变化。本领域技术人员知晓如何确定RBC的最佳稳定性和EDC的最佳剂量。

待偶联的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体可以以本领域技术人员容易确定的量加入。本领域技术人员知晓用最佳量的EDC确定相互作用中的最佳量的措施。

孵育时间可以针对每个特定的偶联反应进行变化和定制(例如，15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟)。随着孵育时间的延长，偶联效率可以更好。在一实施方案中，在60分钟后达到最大值。

孵育温度也可以变化。例如，可以使用15-25℃或2-8℃。在一个实施方案中，当在15-25℃执行偶联反应时，偶联效率更高。

可以使用允许偶联反应的任何赋形剂。在一实施方案中，赋形剂是无菌的且无内毒素。在一个优选的实施方案中，赋形剂是无菌的、无内毒素的盐水(NaCl 0.9％)。盐水获批准用于人类，并提供最大的安全性。

本领域技术人员知晓如何确定最佳孵育时间和温度以及如何确定可能的赋形剂。

在本发明的一方面，提供了一种药物组合物，其包含至少一种本文所述的蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列以及药学上可接受的承载体。

在本发明的另一方面，提供了用于对人类受试者中的MS进行治疗性处理、预防或诊断的方法，其包括向所述受试者中施用治疗有效量的本文所述的蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或本文所述的承载体。因此，包含至少一种根据本发明所述的蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列的承载体，特别是与至少一种根据本发明所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体偶联的承载体，和/或含有至少一种根据本发明所述的蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列的承载体可以用于MS的治疗、诊断和/或预防。

在本发明的另一个方面，根据本发明所述的肽，优选地包含5至50个、优选地5至20个、更优选地10至15个、甚至更优选地15个氨基酸的肽用作药物。

用作药物的优选肽是

c)与各个相应的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源，并且结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别各个氨基酸序列的抗体识别。

甚至更优选用作药物的是具有选自包括SEQ ID NOs：10至98、优选地SEQ ID NO：10至35的组的序列的肽，甚至更优选地是由选自包括SEQ ID NO：10至98、优选地SEQ IDNO：10至35的组的序列组成的肽。

另一方面，图3(ii)E的肽基序(SEQ ID NO：99)，如图5所示的GDP-L-岩藻糖合酶肽(SEQ ID NO：199-215)，图6(I和II)表格中的GDP-L-岩藻糖合酶肽(SEQ ID NO：10-14、19-20、22-23、25-32和216-290)以及图12表格中的RASGRP1、RASGRP2和RASGRP3肽(SEQ ID NO：291-309)都是本发明的主题，并且可以根据本发明使用。

实施例

GDP-L-岩藻糖合酶特异性

1.TCC21.1的表征

使用位置扫描合成组合文库(ps-SCL)进行的无偏靶抗原识别方法如图2示意显示。克隆TCC21.1已按照Planas等人(2015)所述进行了鉴定。TCC21.1是从CSF浸润性细胞中分离出的CD4+TCC，并在来自模式II脱髓鞘的SPMS患者(1154SA)的两个活跃的白质脱髓鞘MS病灶(LI和LIII)中克隆扩增。TCC21.1释放Th2细胞因子并在非特异性激活后帮助自体B细胞的增殖和抗体产生。为了使用十肽位置扫描文库研究被未知特异性的该TCC所识别的肽，首先鉴定了TCC21.1用于识别肽混合物的HLA II类分子。这是使用肽文库/生物统计分析方法进行靶抗原的无偏鉴定的前提条件(Zhao等人，2001，J Immunol，167：2130-2141；Sospedra等人，2010，J Immunol Methods，353(1-2)：93-101)。由于患者1154SA对DR15单倍型是纯合的，因此最初用具有在第5位定义的氨基酸(AA)混合物测试了TCC21.1，该混合物由转染有不同单个自体HLA DR/DQ分子的EBV永生化裸淋巴细胞综合征(bare lymphocytesyndrome，BLS)B细胞系(BCL)细胞呈递(DRA*01:01/DRB5*01:01＝DR2a，DRA*01:01/DRB1*15:01＝DR2b和DQA1*01:02/DQB1*06:02)。由于TCC21.1在用抗CD3和PMA进行非特异性刺激后释放了GM-CSF细胞因子，因此使用了T细胞激活GM-CSF产生的读数(Planas等人，2015)。仅由表达DRB1*15:01(DR2b)II类分子的BCL呈递的混合物具有刺激性(数据未显示)。

2.位置扫描合成组合文库作为鉴定抗原/鉴定GDP-L-岩藻糖合酶的方法

然后用完整的十肽位置扫描文库(200种混合物；即代表10-mer的10个位置和20个L-氨基酸之一在每个固定位置的混合物)测试TCC21.1，该文库由表达DRB1*15:01II类分子的BCL呈递。响应完整文库的GM-CSF释放如图3A所示。IL-10释放获得类似的响应模式。接下来，如前所述(Zhao等人，2001)，通过将数字值分配给十肽文库的十个位置中每个位置的20个定义的AA每种的刺激电位，来生成生物统计分析评分矩阵。在这里，这些值被计算为存在混合物时三个独立实验的中值GM-CSF分泌(pg/ml)的以10为底的对数，减去不存在混合物时的分泌(图3B)。根据单个AA对肽抗原识别的独立贡献模型，给定肽的预测刺激评分是该肽在每个位置含有的每个AA的矩阵值之和(Zhao等人，2001)。根据他们的刺激性评分(预测其刺激性潜力)，使用该评分方法对UniProt人蛋白数据库中蛋白序列的所有天然重叠10-mers肽进行排序。基于这些预测值，合成了得分最高的50种预测人类天然肽，并以5μg/ml进行了测试(图4)。出乎意料的是，没有一种肽具有明显的刺激性(图3C)。对于该TCC，将位置扫描文库和生物统计分析相组合的上述方法的预测能力低于以前研究中的其他方法。如图3B所示，最具刺激性的混合物在连续位置具有相同定义的AA，这表明可能识别在多个框架中的一个AA基序。为了能够使用图2中概述的方法分析数据，设计、合成和测试了22种双重定义的混合物(即，具有两个定义位置的位置扫描混合物)的集合(图3D)；结果证实存在具有不同侧翼残基的独特识别基序(LHSXFEV，SEQ ID NO：99)(图3E)。为了将该在两个框架中的识别基序应用于原始GM-CSF衍生的矩阵并进行生物统计分析，调和平均模型(HM)用于将某些双重定义混合物的刺激应答(图3D，框架1/2-HM混合物)整合到原始矩阵中。使用新的“调和增强”框架1和框架2矩阵，对来自UniProt人类蛋白数据库的所有天然重叠的10-mers肽进行评分和排序，如图2示意性所示。合成对两个矩阵具有最高得分的50个预测的天然肽并对GM-CSF释放进行测试(图4)。这两种矩阵可以鉴定出三种明显刺激性的肽(图3F)。两个最具刺激性的肽是由调和加强框架1预测的NVLHSAFEVG(SEQ ID NO：16)和由调和加强框架2预测的DNVLHSAFEV(SEQ ID NO：15)，属于由TSTA3基因编码的GDP-L-岩藻糖合酶，并有9个AA重叠。

具体而言，图3显示：A.TCC21.1响应由仅表达DRB1*15:01的BLS细胞呈递的完整十肽位置扫描文库(200种混合物)产生GM-CSF。B.评分矩阵设计采用三个独立实验的GM-CSF产生的中值的log10。粗体边框显示为双重定义混合物选择的混合物。C.TCC21.1响应使用基于GM-CSF的评分矩阵预测的具有最高得分的50个肽产生GM-CSF。D.TCC21.1响应22种双重定义混合物产生GM-CSF。在框架1中具有TCR基序的定义的AA的混合物显示为灰色，在框架2中的显示为黑色。使用调和平均模型将以粗体显示的混合物的刺激性应答(框架1/2-HM)整合到原始矩阵中。E.基于调和平均模型选择的TCR基序和双重定义的混合物活性值，并将其纳入原始矩阵，框架1-HM为灰色，框架2-HM为黑色。F.TCC21.1响应使用调和加强框架1和2得分矩阵预测的具有较高得分的50个肽产生GM-CSF。表达DRB1*15:01的BLS细胞呈递完整的十肽文库、双重定义的混合物和单个十肽。混合物在200μg/ml测试，单个十肽在5μg/ml测试。直方图显示三个独立实验的平均值±标准误差(SEM)和点图显示三个独立实验的平均值。释放的细胞因子总表示为由TCC21.1响应刺激释放的pg/ml减去无刺激时释放的pg/ml(阴性对照)。

图4显示了用生物统计方法预测的人类十肽的总结，这些十肽已被合成，然后根据GM-CSF的释放在5mg/ml进行刺激性能力测试。对于HM加强框架1和2，肽分别从1到50排序。

3.RNASeq/转录物组和蛋白质组数据证明在脑组织中GDP-L-岩藻糖合酶的表达

图5显示了自体脑LI和LIII中GDP-L-岩藻糖合酶的转录水平，表示为“每千碱基外显子模型每百万映射读数的读数”(reads per kilo base of exon model per millionmapped reads，RPKM)。还显示其他脑特异性基因的转录值作为样品的质量对照，并作为以高(MBP、PLP1)和中(髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMG))水平表达的基因的参考。

通过蛋白质组学分析，在来自其他MS患者和非MS对照的白质和灰质脑组织中鉴定出17种GDP-L-岩藻糖合酶肽。图5列出了肽序列以及不同样品中的肽谱匹配(peptidespectrum matches，PSM)。被鉴定的肽覆盖的GDP-L-岩藻糖合酶AA序列的百分比为56％。位置参考UniProtKB/Swiss Prot：Q13630.1的序列。作为参考的其他脑特异性蛋白的分析也包括在内(图5)。

总之，已显示GDP-L-岩藻糖合酶在脑中表达(RNA和蛋白)。

4.GDP-L-岩藻糖合酶作为脑浸润性TCC的主要自身抗原

为了鉴定在已知TCC21.1在其中克隆扩增的两个自体脑病灶(LI和III(Planas等人，2015))中由TCC21.1识别的自身抗原，然后使用调和加强框架1和框架2矩阵根据其刺激性评分，对利用来自这两个病灶的基于RNASeq的转录物组数据创建的脑蛋白子数据库中的蛋白序列中的所有天然重叠的10-mer肽(GSE60943)进行评分和排序。在框架1矩阵具有最高得分的40个预测的天然脑肽中，38个肽已经从无偏的UniProt人类数据库中预测出来。对于框架2矩阵，先前预测了前40个肽(图4)。合成并测试了两个新的框架1肽。发现NVLHSAFEVG(GDP-L-岩藻糖合酶96-105，SEQ ID NO:16)和DNVLHSAFEV(95-104，SEQ ID NO:15)刺激TCC21.1(图4)。

5.对GDP-L-岩藻糖合酶识别的表征/对应答的表征

如上所述，由TCC21.1识别的两个GDP-L-岩藻糖合酶肽有9个AA重叠。在表达DRB1*15:01的BCL细胞上，合成并测试了有9个AA重叠的另外9个10-mer肽，并鉴定了诱导GM-CSF释放的另外一种肽VLHSAFEVGA(97-106，SEQ ID NO：18)。肽NVLHSAFEVG(96-105，SEQ IDNO：16)给出了最佳应答，EC50为0.2μg/ml，由DRB1*15:01和DQB1*06:02分子呈递。三种刺激性肽的共同AA是VLHSAFEV(97-104)(数据未显示)。

接下来，表征了TCC21.1对由自体辐照的PBMC和BCL呈递的GDP-L-岩藻糖合酶肽的应答。由两种类型的APC呈递的GDP-L-岩藻糖合酶肽能够诱导增殖。还分析了该应答的功能表型。TCC21.1显示Th2表型，主要释放Th2细胞因子以及较低水平的IL-22和IL-10。出乎意料的是，当肽由自体BCL呈递时，它们诱导更高水平的IFNγ。此外，TCC21.1还响应GDP-L-岩藻糖合酶肽而释放了GM-CSF和IL-3。与从具有不同病况的患者中生成的其他Th1、Th1*或Th1/2TCC相比，这两种细胞因子的释放似乎是该TCC的特定特征。细胞内细胞因子染色证实了响应GDP-L-岩藻糖合酶(96-105，SEQ ID NO：16)的TCC21.1的Th2功能表型。用GDP-L-岩藻糖合酶(96-105，SEQ ID NO：16)刺激后，超过60％的TCC21.1细胞为IL-4+，而仅约12％为IFNγ+。约60％的细胞为GM-CSF+，其中47.7％的细胞也为IL-4+。TCC21.1的进一步表征证明了CD28和趋化因子受体CRTh2的表达(数据未显示)。

6.来自患者1154SA的CSF浸润性CD4+T细胞对GDP-L-岩藻糖合酶的识别

合成了重叠10个AA并覆盖整个GDP-L-岩藻糖合酶蛋白的62个15-mer肽(图6)，并测试了当由自体PBMC呈递时它们诱导TCC21.1增殖的能力。平行测试了七个免疫优势/致脑炎性髓鞘肽(Bielekova等人，2004)、CEF(巨细胞病毒、EBV、流感病毒和破伤风类毒素)肽库和对照珠粒(图6)。TCC21.1识别两个重叠的GDP-L-岩藻糖合酶肽，即91-105(SEQ ID NO：14)和96-110(SEQ ID NO：17)，其包含三个之前鉴定的刺激性十肽(即，95-104(SEQ ID NO：15)，96-105(SEQ ID NO：16)和97-106(SEQ ID NO：18))。

7.来自CIS/MS患者的CSF浸润性CD4+T细胞对GDP-L-岩藻糖合酶的识别

为了找出在患有不同形式的MS(大多数CIS和RRMS)患者的CSF浸润性CD4+T细胞中是否发生对GDP-L-岩藻糖合酶的特异性识别，开发了新的方案以在单轮中大数量地扩增新鲜的CSF浸润性CD4+T细胞，以最小化原始T细胞库中的差异。来自31位CIS/MS患者的静息PHA扩增的CSF浸润性CD4+T细胞(也衍生自CNS隔室的T细胞)一式四份用由自体辐照的PBMC呈递的62个重叠的GDP-L-岩藻糖合酶肽，以及七种髓鞘肽、CEF肽库和对照珠粒进行测试。汇总所有刺激指数(SI；对照珠粒除外)，将小于1的SI值视为具有单位值。执行聚类k-均值分析以确定最佳临界值，以区分该患者群体中有应答的SI值与无应答的SI值。K平均值聚类得出的临界值为1.455，以区分阳性应答和阴性应答。随后，对于每名患者，将中值SI(一式四份孔中)大于1.455的所有肽鉴定为阳性应答。

接下来，通过计算每种应答性肽中值SI的总和，以对该肽有应答的总患者数加权来构建患者评分。这样，考虑了每种肽的SI值本身以及每种肽的相对免疫原性，以评估针对特定抗原的免疫应答的频率和强度。三聚类k均值分析基于10个患者评分进行，并将患者明确分为三类：“无应答者”、“中等应答者”和“高应答者”。因此，有19名患者(61.3％)被表征为对GDP-L-岩藻糖合酶的无应答者，6名(19.35％)为中等应答者，并且6名(19.35％)为高应答者(数据未显示)。对于CEF应答或者对于阳性或阴性对照，三组之间没有发现显著差异。免疫优势肽定义为能够在至少10％的患者中诱导阳性应答的肽。达到此标准的14种GDP-L-岩藻糖肽如图7所示。对某些免疫优势肽最强应答的功能分析揭示主要产生IFN-γ的Th1表型(数据未显示)。

详细地，图7显示：具有对GDP-L-岩藻糖合酶肽有应答的CSF浸润性CD4+T细胞的CIS/MS患者的数量。黑色显示在至少三名患者中呈阳性的免疫优势肽。黑色方块为高应答者，白色方块为中等应答者患者。

总之，约20-25％的MS患者(CIS、RRMS、SPMS)显示出对不同免疫优势GDP-L-岩藻糖合酶肽的免疫应答；这些GDP-L-岩藻糖合酶特异性T细胞的大多数具有Th1表型(MS患者中最常见的表型)。与对7种髓鞘肽(ETIMS肽)反应的比较表明，与GDP-L-岩藻糖合酶相比，对这些肽有反应的患者显著更少。

RASGRP2特异性

8.鉴定TCC14并用TCC14测试ps-SCL以鉴定RASGRP2

TCC14是从MS患者1(HLA-DR15的纯合子)以类似方法鉴定的，但是，在这种情况下，是来自自增殖(无刺激增殖)的外周血T细胞中的级分，该级分富含脑归巢T细胞。TCC14也通过对浸润患者脑病灶的细胞的深度TCR测序显示，所述细胞在脑中克隆繁殖。如图1示意所示(右面部分)，生成了TCC14。自增殖T细胞的分离更详细地显示在图8A中。详细地，在用染料羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记并没有刺激后，将外周血单核细胞接种在重复孔中。培养7天后，通过流式细胞术鉴定增殖细胞(CFSE^dim)和非增殖细胞(CFSE^hi)，并通过细胞分选分离自增殖T细胞(CFSE^dim)。比较了MS脑病灶和CFSE^dim(自增生)群体之间的TCRβV序列。超过20％的CFSE^dim群体的TCRβV序列也在MS脑病灶中发现(图8B)。

然后如图2所示对TCC14进行扩增和测试，如上文所述使用位置扫描组合肽文库和生物统计分析，使用无偏方法以鉴定TCC14的一种或多种靶抗原。TCC14扩增得足够好，足以用全套200种位置扫描文库混合物进行测试。因为TCC衍生自HLA-DR15纯合的MS患者，用转染有表达HLA II类等位基因的HLA-DR15单倍型(DR2a、DR2b或DQw6)的BLS细胞测试了对TCC14的限制性。确定其HLA II类限制性(DRB1*15:01)后，使用转染有DRB1*15:01的BLS细胞测试了针对所有200个样品的反应性，并显示了针对10个位置每个位置中的单个或多个氨基酸(aa)的阳性应答。72小时后，基于胸苷掺入测定法的增殖(刺激指数＝SI；虚线SI＝2)用作TCC应答的读数(图9，小图I)。在测试多个剂量后，使用评分矩阵以总结TCC14针对十肽文库的10个位置每个中所有20种L-aa的反应性，使用生物统计分析过程预测了被TCC14识别的肽(图9小图II)(Zhao等人，2001)。来自三个重复实验的平均应答用于生成用于潜在肽配体的最佳氨基酸组合的矩阵。从中分离出TCC的患者1的脑转录物组数据和相应的蛋白被用作搜索数据库。合成了92个序列，并根据它们在至少一种所用矩阵中的前50种预测肽中的出现(SI>3的刺激应答)，测试了被TCC14的识别(图9，小图III)。如先前对于其他TCC所示，由于TCC14识别了许多高评分肽，因此预测的高排名与T细胞应答之间存在良好的关系(Sospedra等人，2010；Zhao等人，2001)。为了评估对这些肽的功能亲合力，使用给出阳性应答的33种肽执行剂量滴定实验。其中有具有SEQ ID NO：33至35的肽。72小时后，使用BLSDR2b对降低浓度的刺激性肽测试TCC14的增殖应答。(图9，小图IV)。以高抗原亲合力(EC50＝0.012μM)识别来自RASGRP2的肽(SEQ ID NO：33)，但是来自其他几种RASGRP同工型(RASGRP1，-3、4)的肽和其他肽也给出了阳性应答(图9，小图IV)。TCC14对RASGRP2肽的识别导致Th2细胞因子以及IFN-γ的分泌(数据未显示)。

总之，克隆TCC14可以识别多个RASGRP版本，其中RASGRP2具有目前最高的亲合力(即，在较低的抗原浓度下)，从而强调了其生物学相关性。

9.外周血细胞的RASGRP2反应性

为了测试外周血衍生的记忆T细胞对RASGRP2的反应性，将经那他珠单抗治疗的MS患者(NAT；n＝8)的冷冻保存的PBMC(1×10⁸个细胞)解冻，然后用磁性细胞分选(Miltenyi)耗尽表达CD45RA的细胞。在X-Vivo培养基中每孔接种2×10⁵个CD45RA耗尽的PBMC(每种条件10-15个重复孔)，并用媒介物(DMSO)处理，用CD2/CD3/CD28珠处理处理或用RASGRP2肽库(库的最终浓度为10μM)或完整纯化的RASGRP2蛋白(Origene；0.3μg/ml)负载。覆盖整个RASGRP2蛋白的15mer重叠肽(SEQ ID NO：38-98)分为9个肽库，每个库有7个肽，覆盖了从N-端(库1)到C端(库9)的RASGRP2序列。胸苷掺入测定法用于测量对RASGRP2的增殖应答。在第7天，将细胞每孔用1μCi甲基-³H胸苷(Hartmann Analytic)负载，并在15小时后收集到膜(Tomtec)上。通过β-闪烁计数(Wallac 1450，PerkinElmer)测量掺入。结果显示为点(平均值±SEM)。刺激指数(SI)计算为肽或蛋白刺激与媒介物对照的比率。SI值>2认为是阳性的(图10)。

总而言之，图10显示来自对RASGRP2具有高自增殖反应的MS患者的记忆T细胞。所有8个供体均对RASGRP2肽的单个或多个肽库(包括库2，其中包含具有与TCC 14的靶标肽(SEQ ID NO：33)重叠的SEQ ID NO：46的肽)和/或整个蛋白有反应，证明RASGRP2是一种自身抗原，被具有高度自增殖的MS患者广泛识别。

10.RNASeq/转录物组和蛋白质组数据证明RASGRP2在B细胞和在脑中的表达

在外周B细胞和脑中，在RNA和蛋白水平测试了RASGRP1-4的表达(图11)。RASGRP1-3在患者1的脑和自增殖性记忆B细胞的转录物组中均表达(图11)。

详细地，图11显示：(A)MS患者1(RPKM)活跃脑病灶III(RPKM)和来自6个RRMS(REM)患者的自增殖(CFSE^dim)外周血B细胞(RPKM)中的刺激性肽起源转录物的表达水平。低于0.1的表达水平或无转录物表达设为0.1。还显示了脑(MOBP)和B细胞(CD19)的对照转录物的表达。(B)MS患者的RRMS外周血B细胞(REM，nihil；n＝4)和脑组织(灰质，合并，n＝6)的质谱分析。RASGRP1-4的蛋白覆盖率(柱)和光谱计数(数字)描述为蛋白丰度的量度。

对照和MS患者的脑组织(白质和灰质)也用蛋白质组学使用质谱法进行测试。在脑组织中鉴定出了RASGRP1、2和3蛋白的肽，特别是RASGRP2的丰度很高(图12)。该位置是指以下的序列：GenBank AAC97349.1(RASGRP1)、GenBank AAI10307.1(RASGRP2)和GenBankAAY15037.1(RASGRP3)。

此外，执行了免疫组织化学(IHC)研究并且显示了RASGRP2蛋白在脑灰质(特别是在皮层神经元)和脾脏中的表达(数据未显示)。

11.在GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2序列中鉴定其他免疫优势肽

此外，已经根据常用的搜索算法和假设鉴定了具有潜在免疫原性的肽。已经从肿瘤疫苗接种的背景中采用了该方法，其中在自身蛋白(来自肿瘤)中寻找免疫原性肽是标准程序。在这种情况下，蛋白序列筛选预计与疾病相关的HLA等位基因(或给定肿瘤患者的HLA等位基因)结合的肽。因此，采用了GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2序列，并且使用公认的NetMHCII(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)和IEDB(http://www.iedb.org/)计算机肽结合预测算法来预测强(SB)或弱(WB)结合肽。可以在两种搜索算法的网站上容易地找到有关如何执行搜索的详细信息。简而言之，搜索需要将目标蛋白的序列复制到网络工具中，并选择感兴趣的HLAII类(或I类，如果感兴趣)等位基因。然后，该算法将产生肽序列及其各自预测的与HLAII类等位基因的结合。对于无法进行NetMHCII搜索的等位基因，使用了IEDB。已使用已知与MS相关的HLA等位基因。如果现在考虑两种蛋白的所有区域，这些区域预计是WB(在自身抗原的背景下最受关注)或SB(NetMHCII搜索)，或者预测的结合等级为25％或更低(IEDB)，则这些氨基酸区段将覆盖几乎所有的完整GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2蛋白：

对于GDP-L-岩藻糖合酶蛋白，预计跨氨基酸1至315的区域的肽结合。

对于RASGRP2蛋白，预计跨越氨基酸9至449和457至659的区域的肽结合。

使用了以下等位基因：

-HLA-DRB1*15:01(NetMHCII)

-HLA-DRB5*01:01(NetMHCII)

-HLA-DRB1*03:01(NetMHCII)

-HLA-DRB1*13:03(IEDB)

-HLA-DRB1*08:01(IEDB)

-HLA-DRB3*02:02(IEDB)

-HLA-DRB1*04:01(NetMHCII)

-HLA-DRB1*04:04(NetMHCII)

-HLA-DQw6(DQA1*01:01；DQB1*06:02)(IEDB)

使用了以下蛋白序列：

GDP-L-岩藻糖合酶：GenBank：AAH93061.1

RASGRP2：GenBank：AAI10307.1

总之，完整蛋白和免疫优势肽适合用于MS的治疗、诊断和/或预防。

12.制造化学偶联的红细胞

EDC作为化学交联剂

已经将用生物素残基合成的肽(生物素-PLP1；PLP1＝PLP 139-154)用于使用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白对肽进行高度特异性的检测。简而言之，将外周血单核细胞分别用生物素-PLP1(终浓度0.05mg/ml)、EDC(终浓度10mg/ml)(都在PBS中)于4℃负载1小时。在两个洗涤步骤之后，将细胞用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白染色，并通过流式细胞术(链霉抗生物素蛋白-APC)进行分析。

如图13所示，只有在两者同时存在时(生物素-PLP肽和EDC)才能观察到有效的肽结合。

13.对105名MS患者(针对GDP-L-岩藻糖合酶)和57名MS患者(针对RASGRP2)进行了进一步分析

对105名MS患者(针对GDP-L-岩藻糖合酶)和57名MS患者(针对RASGRP2)进行了进一步分析，以验证GDP-L-岩藻糖合酶肽51-65、136-150、161-175、246-260和296-310(SEQID NO：12、21、23、28和32)和RASGRP2肽78-92(SEQ ID NO：46)的免疫优势。将与MS的致病性高度相关的CSF浸润性CD4+T细胞对测试肽的反应性与对已知免疫优势参考肽MBP 13-32、MBP 83-99、MBP 111-129、MBP 146-170、MOG 1-20、MOG 35-55和PLP 139-154的反应性进行了比较。

结果如图14和15所示。数据显示，作为本文鉴定的蛋白GDP-L-岩藻糖合酶和RASGRP2的片段的测试肽与已知的免疫优势参考肽具有相同的反应性或甚至更高的反应性。因此，测试肽再次被确认是免疫优势的。研究CSF浸润性T细胞及其对假定的自身抗原的应答特别有意义，因为已经浸润到靶器官(即，脑、脊髓或CSF)的自身反应性T细胞被认为可能具有生物学相关性。

增殖应答和IFN-γ分泌按上文“7.”和下文“15.材料和方法”进行检测，除非另有规定。

具体而言，图14显示：A.增殖应答，其表示为CSF浸润性CD4⁺T细胞(单轮PHA扩增)对由自体PBMC呈递的5种GDP-L-岩藻糖合酶肽(51-65、136-150、161-175、246-260和296-310)、4种MBP肽(13-32、83-99、111-129和146-170)、两种MOG肽(1-20和35-55)、一种PLP肽(139-154)和CEF肽的刺激指数(SI)和IFN-γ分泌(pg/ml)。所有的肽都以四个孔/患者进行测试。每个点代表一个孔，并且每个肽在420个孔(4个孔x 105名患者)中进行了测试。阳性孔是SI大于2(虚线)或IFN-γ大于20pg/ml(虚线)的孔。还显示了阳性孔的百分比以及IFN-γ和SI阳性孔百分比之间的比率。B.具有对不同肽有特异性或无鉴定的特异性的CSF浸润性CD4⁺T细胞的阳性患者百分比。阳性患者定义为4个孔中有2个孔以上对于SI(左侧直方图)、IFN-γ(中间直方图)和SI或IFN-γ(右侧直方图)为阳性的患者。

具体而言，图15显示：A.增殖应答，其表示为CSF浸润性CD4⁺T细胞(单轮PHA扩增)对由自体PBMC呈递的一种RASGRP2肽(78-92)、四种MBP肽(13-32、83-99、111-129和146-170)、两种MOG肽(1-20和35-55)、一种PLP肽(139-154)和CEF肽的刺激指数(SI)和IFN-γ分泌(pg/ml)。所有的肽都以四个孔/患者进行测试。每个点代表一个孔，每个肽在228个孔(4个孔x 57名患者)中进行了测试。阳性孔是SI大于2(虚线)或IFN-γ大于20pg/ml(虚线)的孔。还显示了阳性孔的百分比以及IFN-γ和SI阳性孔百分比之间的比率。B.具有对不同肽有特异性或无鉴定的特异性的CSF浸润性CD4⁺T细胞的阳性患者百分比。阳性患者定义为4个孔中有2个孔以上对于SI(左侧直方图)、IFN-γ(中间直方图)和SI或IFN-γ(右侧直方图)为阳性的患者。

14.在Ib期试验用髓鞘肽进行的体内耐受性诱导

对10名诊断患有MS的患者测试耐受性诱导。特别是，在Ib期试验中，通过静脉内(i.v.)注射化学(通过EDC)偶联到一组髓鞘肽(MBP13-32、MBP 83-99、MBP 111-129、MBP146-170、MOG 1-20、MOG 35-55和PLP 139-154)(SEQ ID No：261-267)的自体红细胞，对他们测试在体内肽偶联的、EDC固定的红细胞的安全性和耐受力和测试在体内的耐受性诱导的指示剂。简而言之，从每名患者取血并分离红细胞。然后在无菌条件下，将红细胞与髓鞘肽离体化学偶联，并静脉内(i.v.)注射到患者体内。2名患者接受1x10¹⁰个细胞，3名患者接受1x10¹¹个细胞，5名患者接受3x10¹¹个细胞。注射当天定义为第0天。

在注射前6周(耐受化处理前)和注射后12周(耐受化处理后)也采血。在这些日期，获得外周血淋巴细胞，并使用荧光标记的抗体通过流式细胞术检查是否存在多种不同的细胞类型，包括下述的几种亚群：T细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞、自然杀伤细胞，包括表达诱导的T调节细胞(Tr1)或自然T调节细胞(nTregs)的标志物的那些。后两种细胞类型可通过以下标志物来表征：

-T调节1(Tr1)细胞(CD3+CD4+CD45RA-CD49b+LAG3+)

-FoxP3+天然T调节(nTreg)细胞(CD4+CD25hi FOXP3+)

此外，对于外周血T细胞和对于CSF浸润性T细胞单独地测量T细胞对所有七种肽的反应性，如下文“来自CIS和RRMS患者的CSF衍生的大量T细胞针对GDP-L-岩藻糖合酶和髓鞘肽的测试”和“T细胞刺激”中所述，在相同的日期，即注射前6周和注射后12周进行测量。

图16显示，如通过Tr1和FoxP3+nTreg细胞的增加以及肽特异性T细胞反应性的降低所测量的，在注射偶联的红细胞后的抗原特异的耐受性诱导的迹象是可检测的。这些数据表明，通过施用免疫优势肽，可以诱导对各个免疫优势肽的耐受性。

详细地，图16显示了：

A.注射前6周(＝耐受化处理前)和注射后12周(＝耐受化处理后)CD4+记忆细胞的Tr1细胞百分比。B.注射前6周(＝耐受化处理前)和注射后12周(＝耐受化处理后)CD4+记忆细胞中FoxP3+nTreg细胞百分比。C.注射前6周和注射后12周接受3x10¹¹个细胞的5名患者中的T细胞反应性(灰点：注射前；黑点：注射后)。上图显示了对所有肽有应答的细胞的百分比。下图显示了每个单独微孔的增殖情况(总共60个)。

15.材料和方法

患者材料

GDP-L-岩藻糖合酶

患者1154SA：如前所述(Planas等人，2015)，从具有II型脱髓鞘病灶的SPMS患者获得CSF衍生的单核细胞和PBMC。该患者中的HLA I和II类的类型是：A*32:01、A*33:01、B*14:02、B*51:01、DRB1*15:01、DRB5*01:01、DQB1*06:02、DQA1*01:02。

收集来自31名未经治疗的MS患者的诊断性腰椎穿刺的CSF和配对的外周血：其中8名患者患有CIS，20名患者患有RRMS和3名患者患有SPMS。患者从汉堡-埃彭多夫大学医学中心(University Medical Center Hamburg-Eppendorf)的inims门诊和日间医院以及苏黎世大学医院(University Hospital Zurich)神经科门诊nims科招募。MS诊断是基于修订后的McDonald标准。通过等电聚焦(IEF)检测到所有CIS患者具有CSF特异性寡克隆条带。在入组前至少4周未服用类固醇或在过去3个月内未服用任何免疫调节剂或免疫抑制剂的患者视为未接受治疗并纳入研究。来自这些患者的新鲜CSF细胞在体外扩增(见下文)。用Ficoll密度梯度离心法(PAA，Pasching，Austria)从含EDTA的血液试管中新鲜地分离PBMC，并冷冻保存。汉堡道德委员会(the Ethik KommissionHamburg，项目号：2758)和苏黎世州伦理委员会(the Cantonal Ethical Committee of Zurich，研究项目EC-No：2013-0001)批准了研究程序。从所有患者或家属获得知情同意书。

来自13名MS患者(7名SPMS、5名PPMS和1名原发性复发(PR)MS)和7名非MS对照的脑尸体解剖组织获自英国多发性硬化症组织库(UK Multiple Sclerosis Tissue Bank，英国多中心研究伦理委员会(UK Multicentre Research Ethics Committee)，MREC/02/2/39)。

关于GDP-L-岩藻糖合酶的进一步分析(“实施例”的13)，收集来自105名患者的CSF。105名患者中，女性：男性之比为1.9，平均年龄为35.68岁(范围在17～58岁)，4名患者诊断患有RIS，10名患者诊断患有CIS，82名患者诊断患有RRMS，4名患者诊断患有SPMS，5名患者诊断患有PPMS。

RASGRP2型

通过Ficoll密度离心法从患者1154SA分离PBMC。

关于RASGRP2的进一步分析(“实施例”的13)。收集来自57名患者的CSF。这57名患者属于针对GDP-L-岩藻糖合酶进行测试的105名患者。57名患者中，女性：男性之比为2.5，平均年龄为35.33岁(范围在17～55岁)，2名患者诊断患有RIS，8名患者诊断患有CIS，43名患者诊断患有RRMS，1名患者诊断患有SPMS，3名患者诊断患有PPMS。

自增殖测定

用含有100U/mL青霉素/链霉素(Corning)、50μg/mL庆大霉素(Sigma-Aldrich)、2mmol/L L-谷氨酰胺(PAA)和5％加热去补体的人血清(HS，PAA)的完全IMDM培养基(GEHealthcare)解冻PBMC，然后用含有人白蛋白的无血清AIM-V培养基(GIBCO，Thermo FisherScientific)洗涤一次。细胞在含有50U/ml DNA酶(Roche)的AIM-V培养基中于37℃孵育15分钟以避免细胞团形成。在用含有0.1％ HS的PBS进行两个洗涤步骤后，将细胞以10×10⁶个细胞/ml的浓度重悬在PBS/0.1％ HS中，然后在室温以0.5μM CFSE(Sigma-Aldrich)的最终浓度标记3分钟。通过用5x过量体积的含10％ HS的冷完全RPMI(PAN-Biotech)培养基进行猝灭而终止标记。在用AIM-V进行另一个洗涤步骤后，在37℃，5％ CO₂，无外源刺激(＝自增殖)的情况下，将CFSE标记的细胞以2×10⁵个PBMC/200μl/孔接种在96孔U型底微量滴定板(Greiner Bio one)中的AIM-V中(每个供体和条件10-12个重复孔)。对于常规T细胞反应，对于相同的供体，使用PHA(0.5μg/ml)作为TCR非依赖性刺激物，破伤风类毒素(TTx，5μg/ml，Novartis Behring)作为外来抗原刺激物，并且混合的淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reaction，MLR)作为同种异体抗原刺激物。7天后，收集CFSE标记的细胞，并将来自重复孔的细胞合并，用PBS洗涤，用人IgG(Sigma-Aldrich)进行Fc封闭，并在4℃用Aqua(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)标记。用含有2mM EDTA和2％FCS的冷PBS洗涤后，使用荧光色素缀合的抗体(关键资源表)直接对细胞进行表面标志物的染色。在LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上执行测量，并用FlowJo(Tree Star)分析数据。通过将CFSE标记的PBMC在抗HLA-DR、抗CD4、抗IFN-γ和抗GM-CSF抗体(10μg/ml)或适当的同种型对照存在下孵育7天，利用该测定法进一步检测自增殖的竞争。对于胸苷掺入测定法，2×10⁵个PBMC/孔(每个供体和条件10-12个重复孔)用无血清AIM-V培养基在96孔U型底微量滴定板中于37℃、5％ CO₂培养，并且在第7天每孔用1μCi甲基-³H-胸苷(Hartmann Analytic)负载，并在15小时后收集细胞(Tomtec)。通过β-闪烁计数法(Wallac1450，PerkinElmer)测定掺入。

T细胞克隆

为了从自增殖隔室生成TCC，从MS患者1(用于TCRVβ测序，如上所述)的CFSE^dim细胞的分选细胞库(20000个细胞)分出500个CFSE^dim细胞，并如之前所述执行限制性稀释(Aly等人，2011)。TCC通过使用PHA(Sigma)和人IL-2的扩增方案进行富集(Aly等人，2011)。如之前所述(Yousef等人，2012)，对生成的TCC的TCR重排的测序进行了分析。为了评估TCC的细胞因子应答，使用加载有抗CD2/CD3/CD28抗体的MACSibead颗粒(Miltenyi)刺激7个重复孔中的每个TCC，其中每孔具有在X-Vivo培养基(Lonza)中的200000个细胞。如上所述，48小时后收集上清液并测量细胞因子应答。对于趋化因子受体的表达，在解冻和静置细胞过夜后，用Live/dead Aqua和针对CXCR3和CCR6的抗体对TCC进行染色。

转录物组分析

如之前所述，对脑病灶执行转录物组学分析(Planas等人，2015)。讨论的数据保存在NCBI的基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus)中并且可通过GEO系列登录号GSE60943访问。

蛋白质组学分析

对于蛋白质组学分析，使用压力循环仪(barocycler)(2320EXT，BioSciences，Inc，South Easton，MA)执行压力辅助的蛋白提取和消化。在样品用Lys-C和胰蛋白酶消化之前，对匀浆物进行还原和烷基化。肽在固相萃取柱(C18 Finisterre，Wicom Germany)上脱盐，真空干燥，重新溶解并测量(Nanodrop 1000，分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA))。所得肽通过亲水性相互作用色谱法(HILIC，Agilent LC1200，配备有聚酰胺II柱250x 3.0mm5μm)进行纯化和分离，之后注入连接到Orbitrap Fusion仪器(Thermo Fisher)的纳米液相色谱系统Easy nLC。采用MASCOT软件，使用人类UniProtKB/Swiss Prot蛋白数据库(2016年3月22日，40912个条目)执行数据分析。搜索参数为0.05Da片段质量耐受性和10ppm前体质量，肽2的最小数量，FDR(错误发现率)为0.1％，允许胰蛋白酶片段发生2次错误切割。将在半胱氨酸处的脲甲基化(carbamidomethylation)设定为固定修饰，并且将甲硫氨酸的氧化、n端乙酰化设定为可变修饰。

位置扫描肽文库和单独的肽

GDP-L-岩藻糖合酶

制备采用位置扫描形式的合成的N-乙酰化、C-酰胺L-氨基酸(AA)十肽组合文库(200个混合物)和22个双重定义的混合物。单独的肽(图4和图6)由Peptides andElephants GmbH(Potsdam，德国)合成。

RASGRP2

采用标准方法制备了L-aa十肽位置扫描文库(N-乙酰化和C-酰胺TPI 2040)。使用胸苷掺入测定法，通过TCC14对文库的200种混合物中的每一种(以40、120和200μg/ml)测试其增殖活性。由于TCC衍生自HLA-DR15纯合的MS患者，因此TCC14的限制性使用转染有表达HLA II类等位基因的HLA-DR15单倍型(DR2a(＝DRB5*01:01)、DR2b(＝DRB1*15:01)或DQw6(＝DQB1*0602))的BLS细胞进行检测。用针对DR2a、DR2b和DQ的特异性抗体验证BLS细胞系的HLA II类表达，并且测试细胞对支原体是阴性的。结果被组织成四个矩阵(数据未显示)：三个矩阵各自代表在上述剂量之一的活性，并且一个矩阵使用实现3倍增殖的浓度以将所有三个剂量组合成一个单一活性。利用针对来自MS患者1154SA的脑的转录物组蛋白数据库的生物统计分析过程(Zhao等人，2001)，为四个矩阵中的每一个生成预测肽列表。由于预测列表之间的大量一致性，在至少一个矩阵的预测列表中的前50个预测肽中总共出现了92个不同的十聚体肽。选择合成这些肽(Peptides and Elephants GmbH，Potsdam，德国)并进行测试。

细胞和培养条件

如之前所报道的，来自患者1154SA的大量CSF衍生的单核细胞得到扩增(Planas等人，2015)。简言之，将每孔2000个细胞接种在96孔U型底微量滴定板中，连同2x 10⁵个同种异体辐照的PBMC(45Gy)、1μg/ml PHA-L(Sigma，St Louis，MO)和IL-2上清液(500U/ml)。培养基由含有100U/ml青霉素/链霉素(PAA)、50μg/ml庆大霉素(BioWhittaker，Cambrex)、2mML-谷氨酰胺(Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)和5％加热去补体的人血清(PAA)的IMDM(PAA)组成。每3-4天添加另外的IL-2。使用抗CD4磁珠(CD4 Micro Beads human MACS,Miltenyi Biotec Inc,CA,USA)阳性选择CSF浸润性CD4+T细胞，并再次用PHA-L、IL-2和同种异体照射的PBMC重新刺激。

如之前所述，TCC21.1由CSF浸润性细胞建立，TCC14由PBMC衍生的自增殖T细胞建立(Planas et al.，2015)。

来自CIS和RRMS患者的CSF衍生的大量T细胞针对GDP-L-岩藻糖合酶和髓鞘肽的测试

将来自31名CIS/MS患者的新鲜的大量CSF衍生的单核细胞与5×10⁶个同种异体辐照的PBMC混合，用抗CD4磁珠阳性选择CD4+T细胞。然后将CD4+级分以每孔1500个细胞接种于96孔U型底微量滴定板中，连同1.5x 10⁵个同种异体辐照的PBMC、1μg/ml PHA-L和IL-2上清液。培养基由不含Hepes(Pan-Biotech,Aidenbach,Germany)但补充有2mM谷氨酰胺(Pan-Biotech)、1％(vol/vol)非必需氨基酸(Gibco)、1％(vol/vol)丙酮酸钠(Gibco)、50μg/ml青霉素-链霉素(Corning,NY,USA)、0.00001％β-巯基乙醇(Gibco)和5％人血清(BloodBank Basel)的RPMI 1640组成。每4天添加另外的IL-2。将生长孔转移到48孔板中，最后转移到75cm3烧瓶中，直到细胞充分静息(20-25天)。细胞在单一轮刺激中得到高度扩增。

关于GDP-L-岩藻糖合酶肽和RASGRP2肽的进一步分析(“实施例”的13)，执行了相同的方法。

患者1154SA的自体BCL通过EBV转化生成。将单个HLA II类分子DR2a(DRA1*01:01，DRB5*01:01)、DR2b(DRA1*01:01，DRB1*15:01)和DQw6(DQA1*01:02，DQB1*06:02)转染BLS细胞。

T细胞刺激

TCC对单一/双重定义的肽混合物或单独十肽的应答通过在包含或不包含组合的肽混合物或单独的十肽的条件下一式两份接种2x 10⁴个T细胞和5x 10⁴个辐照的BLS细胞系或自体BCL或1x 10⁵个辐照的PBMC(如所示)而进行测试。如所示，2.5μg/ml PHA和10^-7M PMA(Sigma)、1μg/ml表面包被的抗CD3(OKT3，Ortho Biotech Products，Raritan，NJ)和0.5μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend，San Diego，CA)以及T细胞活化试剂盒(抗CD3、抗CD28、抗CD2珠粒)(Miltenyi Biotec)作为阳性对照。

PHA扩增的CSF浸润性CD4+T细胞对GDP-L-岩藻糖合酶、髓鞘和CEF肽的应答(图6)通过在包含肽或不包含肽的条件下以四次重复接种6x 10⁴个T细胞和2x 10⁵个辐照的自体PBMC进行测试。对于EdU实验，使用BLSDRB1*15:01作为APC。使用T细胞活化试剂盒作为阳性对照。

关于GDP-L-岩藻糖合酶肽和RASGRP2肽的进一步分析(“实施例”的13)，执行与PHA扩增的CSF浸润性CD4+T细胞对GDP-L-岩藻糖合酶的应答相同的方法。

细胞因子测量

GDP-L-岩藻糖合酶

根据制造商的使用说明，使用基于人T辅助细胞因子组LEGENDplex珠粒的免疫测定法(Human T Helper Cytokine Panel LEGENDplex bead-based immunoassay，Biolegend)、GM-CSF ELISA(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)和IL-3ELISA(Biolegend)，在刺激后48小时测量受刺激的TCC21.1和扩增的CSF细胞的上清液中的细胞因子。

对于细胞内细胞因子染色，在刺激后48小时对TCC21.1进行分析。在存在GolgiStop蛋白转运抑制剂(BD Biosciences)的条件下5小时后，用Aqua(Invitrogen)标记T细胞。在用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定和透化后，用在含有皂苷和BSA的PBS中针对CD4(APC-Cy7，Biolegend)、IFN-γ(FITC，Biolegend)、IL-4(PE，BD Biosciences)、GM-CSF(APC，Biolegend)和IL-3(PE，Biolegend)的抗体对细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析。

对于GDP-L-岩藻糖合酶肽和RASGRP2肽的进一步分析(“实施例”的13)，根据制造商的使用说明，在所有单个孔中一式两份使用IFN-γELISA(Biolegend)培养48小时后，测量受刺激的和未受刺激的扩增的CSF浸润性T细胞的上清液中IFN-γ的分泌。

增殖应答

GDP-L-岩藻糖合酶

在闪烁计数器(Wallac 1450，PerkinElmer，Rodgau-Jürgesheim，德国)中，通过3H-胸苷(Hartmann Analytic,Braunschweig,Germany)掺入刺激后72小时测量增殖。刺激指数(SI)计算如下：SI＝中值(重复cpm肽)/中值(重复cpm没有肽)。还使用Click-iTTM-EdU流式细胞术测定试剂盒(APC，Molecular Probes，Invitrogen)按照制造商的使用说明测量增殖。用以下抗体对细胞进行染色：抗CD3(PE-Cy-7，e-Bioscience，San Diego，CA)和抗TRBV-21(FITC，Beckman-Coulter，Brea，CA)，并通过流式细胞术进行分析。

RASGRP2

按9.所述测试增殖应答。

对于GDP-L-岩藻糖合酶肽和RASGRP2肽的进一步分析(“实施例”的13)，增殖应答如上文对GDP-L-岩藻糖合酶所述进行测量。

表面受体表达

用针对CD4(PE-Texas Red，Thermo Fischer，Waltham，MA)、TRBV21(FITC，BeckmanCoulter)、CD28(PE-Cy7，BioLegend)、CCR4(APC，BioLegend)、CCR6(BV785，BioLegend)和CRTh2(PE，BioLegend)的抗体对静息TCC21.1进行染色，并通过流式细胞术进行分析。

流式细胞术分析

使用LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)用Diva软件进行样品采集，并使用FlowJo(Tree Star，Ashland，OR)分析数据。

RT-PCR与对TCR重排的测序

TCC21.1的RNA提取、逆转录和TCRα/β链(TRA/BV)测序如先前报道的那样进行了评估(Planas等人，2015)。TCR基因命名符合IMGT命名法(ImMunoGeneTics，www.IMGT.org).

HLA

在美国纽约的Histogenetics LLC(Histogenetics LLC,NY,USA)对个体进行HLAI类和II类分子分型。使用Triton裂解缓冲液和蛋白酶K处理，通过标准DNA分离方案执行从全血中分离最终浓度为15ng/μl的DNA。使用高分辨率的基于HLA序列的分型(SBT)将样品分型为HLA I类(A*和B*)和HLAII类(DRB1*、DRB3*、DRB4*、DRB5*、DQA1*和DQB1*)。使用IEDB分析资源一致性工具进行HLAII类结合预测。

统计学分析

对患者评分执行三聚类k均值分析，将患者分为三类。肽的应答水平、患者和HLA状态之间的关联均采用费希尔精确检验(Fisher’s Exact Test)执行，适当时应用Bonferroni-Holm校正，具有5％的显著性。

实施方案

1.GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或RASGRP蛋白家族的蛋白，或者其片段、衍生物或剪接变体，或者编码所述蛋白或其片段、衍生物或剪接变体中任一种的核苷酸序列,用于多发性硬化症(MS)的治疗、诊断和/或预防。

特别优选地是GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或RASGRP蛋白家族的蛋白，特别是RASGRP2，或其片段。

2.根据实施方案1所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，

其中GDP-L-岩藻糖合酶蛋白

a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或

b)具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％相同的氨基酸序列，或

c)具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％同源的氨基酸序列，或

d)具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源的氨基酸序列，并且所述蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其片段的抗体识别，或

e)由TSTA3基因编码，特别是由NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列编码，或由与NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列至少80％、优选地至少90％、甚至更优选地至少95％相同的基因编码；

和/或

其中RASGRP蛋白家族的成员

f)具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列，或

g)具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％相同的氨基酸序列，或

h)具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％同源的氨基酸序列，或

i)具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源的氨基酸序列，并且所述蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9中任一项所示的各个氨基酸序列或其片段的抗体识别，或

j)由RASGRP基因编码，特别是由以下的基因序列编码：

-NC_000015.10的核苷酸38488101至38565575，

-NC_000011.10的核苷酸64726911至64745456，

-NC_000002.12的核苷酸33436324至33564750，或

-NC_000019.10的核苷酸38409051至38426305，

-NC_000015.10的核苷酸38488101至38565575，

-NC_000011.10的核苷酸64726911至64745456，

-NC_000002.12的核苷酸33436324至33564750，或

-NC_000019.10的核苷酸38409051至38426305。

特别优选地是具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或具有至少90％同一性的蛋白或其片段。还特别优选地具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的RASGRP蛋白或具有至少90％同一性的蛋白或其片段。

3.根据实施方案1或2所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，其中片段包含5至50个、优选地5至20个、更优选地10至15个氨基酸，甚至更优选地15个氨基酸。

特别优选地是长度为10至15个氨基酸的片段。

4.根据实施方案2或3的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，其中片段是

c)与各个相应的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源并且结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别各个氨基酸序列的抗体识别。

特别优选地，所述片段与各个相应的氨基酸序列至少90％相同。

5.根据前述实施方案中任一项所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，其中所述片段包含选自包含SEQ ID NO:10至98、优选地SEQ ID NO:10至35的组的序列，优选地由选自包含SEQ ID NO:10至98、优选地SEQ ID NO:10至35的组的序列组成。

所述片段优选地包含选自包含SEQ ID NO:10至35的组的序列。

6.根据前述实施方案中任一项所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，用于鉴定适于在MS、优选地早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者。特别优选地是使用所述蛋白或其片段。

7.根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，用于诊断人类受试者中的模式II MS。特别优选地是使用所述蛋白或其片段。

8.一种承载体，其包含根据实施方案1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列。特别优选地是所述承载体包含至少一种蛋白、片段或核苷酸序列。

9.根据实施方案8所述的承载体，其中所述承载体偶联至至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体，和/或所述承载体包含至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列。

特别优选地是所述承载体偶联至至少一种蛋白或片段和/或所述承载体包含核苷酸序列。

10.根据实施方案8或9所述的承载体，其中所述承载体选自包含细胞(优选地血细胞)、蛋白、脂质、糖脂、珠粒、纳米颗粒、病毒样颗粒(VLP)和分子(例如糖分子)及其任何组合的组。

所述承载体优选地是血细胞。

11.根据实施方案10所述的承载体，其中所述蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体由细胞(优选地血细胞)表达。

特别优选地是所述蛋白由血细胞表达。

12.根据实施方案10或11所述的承载体，其中所述血细胞为红细胞或白细胞。

13.根据实施方案10至12中任一项所述的承载体，其中所述承载体是血细胞并且血细胞通过偶联剂、优选地通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(ECDI/EDC)与至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体进行化学偶联。优选地，通过EDC将至少一种蛋白或片段偶联至血细胞。

14.一种制造实施方案13所述的化学偶联的血细胞的方法，所述方法包括从人类受试者分离血细胞，添加所述至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体，且随后添加偶联剂，优选地EDC。优选地，添加至少一种蛋白或片段。

15.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列以及药学上可接受的承载体。所述药物组合物优选地包含至少一种蛋白或其片段或核苷酸序列以及药学上可接受的承载体。

16.一种用于在患有MS或处于发展MS风险的人类受试者中诱导对自身抗原的抗原特异的耐受性的方法，所述方法包括将以下施加于人类受试者的步骤

a)根据实施方案1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，和/或

b)根据实施方案8至13中任一项所述的至少一种承载体。

优选地是一种诱导抗原特异的耐受性的方法，其中施加至少一种蛋白或其片段或者偶联至所述至少一种蛋白或片段的承载体或者含有核苷酸序列的承载体。

17.根据实施方案16所述的方法，其中至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列通过鼻腔、吸入、口腔、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌肉内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用而施加，优选地通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口腔、吸入、鼻腔或偶联至承载体，优选地红细胞而施加。

18.根据实施方案16或17所述的方法，用于在早期MS中诱导针对自身抗原的抗原特异的耐受性。

19.一种用于鉴定适于在MS、优选地早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者的方法，所述方法包括从受试者的血液、CSF或其他体液中分离T细胞和/或抗体，并测量所述T细胞和/或抗体针对根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。特别优选地是测量所述T细胞和/或抗体针对片段的反应性。

20.根据实施方案3至5中任一项所述的片段，优选地根据实施方案5所述的片段，用作药物。所述片段优选地包含选自包含SEQ ID NO:10至35的组的序列。

21.根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体在MS的体外诊断中的用途。特别优选地是使用所述蛋白或其片段。

22.一种使用根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体进行MS体外诊断的方法。特别优选地是使用所述蛋白或其片段。

23.根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体在诊断患有MS的人类受试者或处于发展MS风险的人类受试者的体外预测试中的用途。特别优选地是使用所述蛋白或其片段。

24.根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体在制造用于MS的治疗、诊断和/或预防的药物中的用途。特别优选地是使用所述蛋白或其片段。

25.根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体，其中所述衍生物是在其整个长度上与参考氨基酸序列的对应部分共享至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性的氨基酸序列。

26.一种用于鉴定适于在MS、优选地早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者的体外方法，所述方法包括使用先前从受试者的血液、CSF或其他体液中获得的T细胞和/或抗体，测量所述T细胞和/或抗体针对根据实施方案1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。特别优选地是使用所述蛋白或其片段。

27.根据实施方案1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，和/或根据实施方案8至13中任一项所述的至少一种承载体，用于在患有MS或处于发展MS风险的人类受试者中诱导对自身抗原的抗原特异的耐受性的方法，所述方法包括将根据实施方案1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，和/或根据实施方案8至13中任一项所述的至少一种承载体施加于所述人类受试者的步骤。特别优选地是使用所述蛋白或其片段和/或偶联至所述蛋白或其片段的至少一种承载体。

28.根据实施方案27所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或根据实施方案27所述的至少一种承载体，其中所述至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列通过鼻腔、吸入、口腔、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌肉内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用而施加，优选地通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口腔、吸入、鼻腔或偶联至承载体(优选地红细胞)而施加。特别优选地是使用所述蛋白或其片段和/或偶联至所述蛋白或其片段的至少一种承载体。

29.根据实施方案1至5中任一项的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，和/或根据实施方案8至13中任一项的至少一种承载体，用于在早期MS中诱导对自身抗原的抗原特异的耐受性。特别优选地是使用所述蛋白或其片段和/或偶联到所述蛋白或其片段的至少一种承载体。

Claims

1.GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或RASGRP蛋白家族的蛋白，或者其片段、衍生物或剪接变体，或者编码所述蛋白或其片段、衍生物或剪接变体中任一种的核苷酸序列，用于多发性硬化症(MS)的治疗、诊断和/或预防。

2.根据权利要求1所述使用的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，

其中GDP-L-岩藻糖合酶蛋白

a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或

和/或

其中RASGRP蛋白家族的成员

f)具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列，或

g)具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列至少85％、优选地至少90％、更优选地至少95％相同的氨基酸序列，或

h)具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％同源的氨基酸序列，或

i)具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％同源的氨基酸序列，并且所述蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，被T细胞识别和/或被结合或识别SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9中任一项所示的各个氨基酸序列或其片段的抗体识别，或

j)由RASGRP基因编码，特别是由以下的基因序列编码：

-NC_000015.10的核苷酸38488101至38565575，

-NC_000011.10的核苷酸64726911至64745456，

-NC_000002.12的核苷酸33436324至33564750，或

-NC_000019.10的核苷酸38409051至38426305，

-NC_000015.10的核苷酸38488101至38565575，

-NC_000011.10的核苷酸64726911至64745456，

-NC_000002.12的核苷酸33436324至33564750，或

-NC_000019.10的核苷酸38409051至38426305。

3.根据权利要求1或2所述使用的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，其中所述片段包含5至50个、优选地5至20个、更优选地10至15个氨基酸，甚至更优选地15个氨基酸。

4.根据权利要求2或3所述使用的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，其中所述片段

5.根据前述权利要求中任一项所述使用的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，其中所述片段包含选自包含SEQ ID NO:10至98、优选地SEQ ID NO:10至35的组的序列，优选地由选自包含SEQ ID NO:10至98、优选地SEQ ID NO:10至35的组的序列组成。

6.根据前述权利要求中任一项所述使用的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，用于鉴定适于在MS、优选地早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者。

7.据权利要求1至5中任一项所述使用的蛋白、片段、衍生物或剪接变体，用于诊断人类受试者中的模式II MS。

8.一种承载体，包含根据权利要求1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，用于MS的治疗、诊断和/或预防。

9.根据权利要求8所述的承载体，其中所述承载体偶联至所述至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体，和/或所述承载体包含所述至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列。

10.根据权利要求8或9所述的承载体，其中所述承载体选自包含细胞优选地血细胞、蛋白、脂质、糖脂、珠粒、纳米颗粒、病毒样颗粒(VLP)和分子例如糖分子、及其任何组合的组。

11.根据权利要求10所述的承载体，其中所述蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体由细胞、优选地血细胞表达。

12.根据权利要求10或11所述的承载体，其中所述血细胞为红细胞或白细胞。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的承载体，其中所述承载体是血细胞，并且所述血细胞通过偶联剂、优选地通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(ECDI/EDC)与至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体进行化学偶联。

14.一种制造权利要求13所述的化学偶联的血细胞的方法，所述方法包括从人类受试者分离血细胞，添加所述至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体，且随后添加偶联剂，优选地EDC。

15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列以及药学上可接受的承载体。

16.一种用于在患有MS或处于发展MS风险的人类受试者中诱导对自身抗原的抗原特异的耐受性的方法，所述方法包括将以下施加于人类受试者的步骤：

a)根据权利要求1至5中任一项所述的至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，和/或

b)根据权利要求8至13中任一项所述的至少一种承载体。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列通过鼻腔、吸入、口腔、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌肉内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用而施加，优选地通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口腔、吸入、鼻腔或偶联至承载体，优选地红细胞而施加。

18.根据权利要求16或17所述的方法，所述方法用于在早期MS中诱导针对自身抗原的抗原特异的耐受性。

19.一种用于鉴定适于在MS、优选地早期MS中对自身抗原进行耐受化处理的人类受试者的方法，所述方法包括从受试者的血液、CSF或其他体液中分离T细胞和/或抗体，并测量所述T细胞和/或抗体针对根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

20.根据权利要求3至5中任一项所述的片段，优选地根据权利要求5所述的片段，用作药物。