CN117916598A - 用于多发性硬化症的分层和治疗的方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及通过针对体液、诸如血液或CSF中的CD27‑Thl CD4+细胞来分析多发性硬化症(MS)患者的体液进行多发性硬化症(MS)分层的领域。本发明还涉及针对MS的抗原特异性免疫治疗的领域，例如诱导耐受，包括针对反应者的GDP‑L‑岩藻糖合酶。

Description

用于多发性硬化症的分层和治疗的方法

发明领域

本公开内容涉及通过分析多发性硬化症(MS)患者的体液进行多发性硬化症(MS)分层的领域。本发明还涉及抗原特异性免疫治疗领域，例如诱导耐受。

发明背景

多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是一种破坏性的自身免疫性炎症性疾病，主要影响年轻人。MS是器官特异性自身免疫性疾病(AID)的原型实例，原因在于自身免疫性应答只靶向由脑和脊髓构成的中枢神经系统(CNS)。器官特异性AID是指患者的免疫系统通过自身反应性T细胞和/或抗体破坏特定的组织或细胞类型。

MS优先地影响20至40岁的年轻人，但儿童和老年人也可能发展MS。这种疾病在女性中的发病率为男性的约2-3倍。MS通常临床表现为视力(急性视神经炎)、感觉或运动和自主功能的暂时性问题，但可导致广泛的神经症状。

在首次表现时，如果已经排除了差异诊断，只要脑脊液(CSF)和磁共振成像(MRI)结果与诊断一致，该疾病被称为临床孤立综合征(CIS)。MRI显示位于MS的典型部位(即皮质旁、脑室旁、在脑干或脊髓中)的病灶。如果符合可以概括为空间扩散(一个以上的病灶或临床症状/体征)和时间扩散(一个以上的事件)的特定标准，那么就可以诊断为复发-缓解型多发性硬化症(relapsing-remitting multiple sclerosis，RRMS)。一个特殊的情况是偶然发现的MRI病灶符合无临床症状MS。这被称为放射学孤立综合征(RIS)，可被视为CIS和RRMS的前期阶段。超过80％的患者患有其中一种，大多数患者晚期发展所谓的继发性进行性MS(secondary progressive MS，SPMS)。此时，复发/恶化变得不那么频繁或完全停止，神经功能障碍在复发之间或没有复发时都稳步增加。

一种特殊形式的MS是原发性进行性MS(primary progressive MS，PPMS)，它从不复发，而是开始于神经症状的稳步恶化，例如行走能力的稳步恶化。PPMS影响大约10％的MS患者，并且男女发病率相同。其发作通常晚于CIS或RRMS。关于病因和疾病机制，认为PPMS与上述RIS-CIS-RRMS-SPMS相似。

通常，MS是根据修订后的McDonald或最近的Lublin标准诊断的。这些标准也允许区分MS的不同形式和疾病活动(Thompson等人，2018，Lancet Neurol，17(2)：162-173)。

MS是一种遗传背景复杂的疾病。在过去的十年中，已经鉴定出200多种MS风险等位基因或数量性状(以单核苷酸多态性(SNP)检测的基因的常见变体)，然而，迄今为止最重要的是人类白细胞抗原(HLA)-DR15单倍型。此外，还发现了一些环境/生活方式风险因素。这些包括感染埃巴病毒(EBV)、吸烟、低维生素D3水平和肥胖作为最重要因素。

所有的遗传和环境风险因素都是健康人群中许多个体共同共享的。为什么这种疾病开始于具有某些遗传和环境风险因素的个体的确切原因尚不清楚，但有人假设病毒和细菌感染，例如肠道微生物群的变化，可能是诱因。同卵双生子的同病率为10-30％，MS患者直系亲属的风险约为2-4％，而一般人群的风险为1/1000，这提供了遗传风险对比环境风险的估计，尽管两者之间的相互作用也很复杂。

为了确定MS中自身免疫反应所针对的CNS的成分，研究人员将研究重点放在MS中受影响的细胞和结构上，特别是髓鞘和轴突/神经元以及对这些细胞/结构特异性的蛋白。近三十年来，在动物模型(实验性自身免疫性脑脊髓炎；EAE)中，一些髓鞘蛋白如髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)已被鉴定为脑源性，即将其注射到易感啮齿类动物品系中导致与MS相似的疾病，但也可通过检验来自MS患者的免疫细胞(Sospedra和Martin，2005，Annu Rev Immunol，23:683-747)。上述自身抗原为CNS特异性的，仅在脑内表达(PLP和MOG)或几乎仅在脑内表达(MBP)。在MS中，一些非CNS特异性的自身抗原如α-B晶体蛋白和转醛醇酶-H也已被描述为潜在的靶点。

最近，已鉴定出另一种MS相关抗原(GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)；WO2020/002674)。已发现该蛋白在MS中具有免疫优势，并且是一种自身抗原。

进一步的证据表明，CD4+自身反应性T细胞是MS自身免疫发病机制的重要因素，可能不仅与自身免疫应答的诱导和维持有关，而且在组织损伤期间也如此(Sospedra和Martin，2005)。在MS患者中，与髓鞘的主要成分(如MBP、PLP和MOG)发生反应的高亲合力CD4+T细胞的频率增加(Bielekova等人，2004，J Immunol，172：3893-3904)。由于它们参与疾病的发病机制，CD4+T细胞成为治疗干预的靶标。

针对CNS特异性蛋白的免疫应答的详细研究表明，其某些肽被大比例的患者识别，并且在疾病相关的HLA-DR分子的背景下被识别。这样的肽被称为免疫优势的(Bielekova等人，2004)。

以下特征表明蛋白的某些肽在MS方面具有免疫优势：

a)这种肽被T细胞频繁识别，即被大约10％或更多的MS患者识别，通常在疾病相关的HLA等位基因或单倍型的背景下被识别(Sospedra和Martin，2005)，和

b)与疾病相关的T细胞识别这种肽，例如那些对低浓度肽有反应的T细胞(高亲合力T细胞)(Bielekova等，2004)，因此被认为特别危险，和/或具有促炎性表型，和/或从靶器官或隔室(CNS)中分离,如果是MS，则是脑、脊髓或CSF浸润性T细胞。

然而，高亲合力识别不是先决条件，因为在人源化转基因小鼠模型中还显示出低亲合力的髓鞘特异性T细胞是致病性的(Quandt等人，2012，J Immunol，189(6)：2897-2908)。

最近已经证明，MS患者的T细胞在缺乏外源抗原的情况下显示出增加的体外增殖(Mohme等，2013，Brain，136：1783-1798)。这些“自增殖”T细胞富含归巢至MS患者的CNS隔室的细胞，并因此可以被认为是脑/CSF浸润性T细胞的外周血来源(Jelcic等人，2018，Cell，175(1)：85-100.e23)。

如果无法获得体外测试T细胞的数据，或者除了此类测试之外，还可以从与个体的HLA I类或II类等位基因良好结合并且分别用于CD8+和CD4+T细胞的那些肽中预测/推断肽的免疫识别。肽结合预测是技术人员众所周知的。可以通过完善的预测算法(NetMHCII-www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/；IEDB-www.iedb.org/)以及HLA结合基序的分析(SYFPEITHI-www.syfpeithi)来执行。

免疫优势肽可用于抗原特异性免疫疗法，例如耐受性诱导。一个实例是EP 2205273B1，其公开了MBP、PLP和MOG的免疫优势肽及其在MS治疗中的应用。在其中公开的方法中，肽偶联至白细胞或红细胞。

耐受性诱导是抗原特异性的并使自身反应性T细胞无功能或无变应性或诱导特异性抑制对所述靶抗原的不利自身免疫的调节性T(Treg)细胞。诱导对靶自身抗原的耐受性是自身免疫疾病中非常重要的治疗目标。它提供了以几乎没有副作用的有效方式特异性地减弱病原性自身免疫应答的机会。耐受性诱导还可以通过应用完整蛋白代替或补充作为该蛋白片段的免疫优势肽来实现(Kennedy等人，1990，JImmunol，144(3):909-915)。

MS的一些病理特征反映在EAE模型中，EAE模型是Th1/Th17细胞驱动的自身免疫疾病的典范动物模型。对SJL小鼠的复发性EAE(R-EAE)进行的研究清楚地表明，慢性脱髓鞘涉及激活对免疫优势髓磷脂肽(即PLP139-154)的T细胞应答，最初的疾病加重指向免疫优势髓磷脂肽。随后，免疫应答扩展至PLP、MBP和MOG的其他髓磷脂肽，这一过程称为表位扩展。例如，当负载(pulsed)抗原肽的抗原呈递细胞(APC)例如用交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(ECDI；也简称为EDC)处理时，可以诱导T细胞的无应答性，即耐受性。

临床前实验已经证明，单一静脉内(i.v.)注射用脑致病性髓磷脂肽混合物负载并用交联剂EDC固定的幼稚鼠脾细胞在体内诱导肽特异的耐受性方面非常有效。在EAE中，该方案不仅预防动物患病，甚至在疾病诱导后给予时还有效地降低所有后续复发的发作和严重程度，这表明特异的耐受性可以下调正在进行的自身免疫应答(Miller等人，1991，AcadSci，636：79-94)。与MS的治疗更相关的是，EAE中的研究已表明，使用脑致病性髓磷脂肽的混合物可以同时诱导对多种表位的耐受性，从而提供靶向具有多种特异性的自身反应性T细胞的能力。

通过自体抗原偶联的细胞，例如经EDC处理的APC(Vandenbark等人，2000，IntImmunol，12：57-66)或无核细胞(即红细胞(RBC))，对人T细胞的耐受化处理(tolerization)在体外有效，如经耐受化处理的T细胞无法增殖或产生Th1细胞因子以及在这些细胞上共刺激分子表达的减少所显示的。

有证据表明，至少有两种不同的机制参与了这种机制对抗原特异的耐受性的诱导：

1)直接耐受性，其中由于不能接受或检测到足够的CD28介导的共刺激作用，遇到在抗原偶联的APC上的标称抗原(nominal antigen)/MHC复合物的Th1克隆变得不活跃(anergized)，和

2)间接机制，例如交叉耐受性，其中耐受性是由致耐受性宿主APC对抗原的再加工和重新呈递和/或Treg细胞的扩增所诱导的。

后者的交叉耐受性可能涉及抗原特异性Treg细胞的诱导和/或扩增，这一假设也得到本文公开的在Ib期试验中获得的数据的支持。此外，用EDC处理细胞可在相当比例的经处理细胞中诱导凋亡。因此，涉及吸收正在凋亡的固定的细胞的APC然后其由宿主APC处理并呈递的间接机制是可行的。在MHC缺陷和同种异体小鼠中有效诱导耐受性进一步支持了这一点。在体外骨髓衍生的树突细胞有效地吞噬并加工负载抗原的、固定的APC。

当前批准的MS疗法涉及各种抗原非特异性免疫调节或免疫抑制策略，其仅部分地有效。所有当前的治疗剂都需要每天口服或以各种时间间隔和长时间进行注射/输注。此外，它们与许多副作用有关，有时与严重的副作用有关。

一种针对MS发病机理的疗法，根本目的应是在不改变“正常”免疫系统的情况下特异性删除或功能性抑制病原性自身反应性细胞。这是重要的，因为全面的免疫调节和/或免疫抑制是以抑制有益的调节细胞和起到针对病原体的保护功能的免疫细胞为代价的。

理想情况下，治疗应考虑患者的具体特征(例如遗传背景或患者免疫系统对某些抗原作出反应的能力)进行个性化。

因此，个性化治疗可以帮助改善患者的结局。对于个性化治疗方案，MS分层很重要，即对某种治疗特别具有反应性的亚型的识别。

发明概述

本发明的一个目的是改善MS患者分层以便开发个性化治疗方案。本发明的另一个目的是开发抗原特异性耐受策略，特别是治疗某些MS患者亚组。

在本发明的第一方面，提供了一种用于对多发性硬化症(MS)患者进行分层的方法，包括以下步骤：

-从MS患者获取体液，特别是血液，优选外周血，或脑脊液(CSF)，以及

-检测体液中的CD27-Th1CD4+细胞。

在一个具体的实施方案中，该方法还包括：

-检测体液中T细胞和/或抗体对蛋白质GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

在进一步具体的实施方案中，GDP-L-FS蛋白

a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或

b)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列，或

c)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的氨基酸序列，或

d)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源的氨基酸序列，并且蛋白或其片段或剪接变体与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被抗体识别，所述抗体结合或识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段，或

e)由TSTA3基因编码，特别是由NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列编码，或者由与NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列至少80％、优选至少90％、甚至更优选至少95％相同的基因编码。

在一个实施方案中，HLA等位基因是HLA等位基因DRB3*02:02或HLA等位基因DRB3*03:01。

优选地，该片段包含5至50个、优选5至20个、更优选10至15个氨基酸、甚至更优选15个氨基酸。

优选地，该片段

a)与各自对应的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同，或

b)与各自对应的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源，或

c)与各自对应的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源并与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被结合或识别相应氨基酸序列的抗体识别。

在进一步优选的实施方案中，该片段包含选自包含SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37的组的序列，优选地由选自包含SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37的组的序列组成。在另一个优选的实施方案中，该片段包含位于SEQ ID NO：37所定义的序列内的任何序列或由其组成。

在本发明的第二方面，提供了如上文所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列，其用于治疗MS患者中的MS，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

在一个具体的实施方案中，先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

在本发明的第三方面，提供了至少一种如上定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，和/或与至少一种如上定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，其用于在MS患者中诱导对自身抗原的抗原特异性耐受的方法中，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

在一个具体实施方案中，先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

在进一步具体的实施方案中，所述至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与所述至少一种GDP-L-FS蛋白、片段，衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体通过鼻腔、吸入、口服、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用来施加，优选通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口服、吸入或鼻腔施用来施加。

在本发明的第四方面，提供了用于监测对上文公开的诱导抗原特异性耐受的方法的反应的方法中的CD27-Th1CD4+细胞，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测所述CD27-Th1CD4+细胞。

在具体的实施方案中，另外地检测先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对如上文所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

优选地，CD27-Th1CD4+细胞还针对标记物CCR7和/或CD45RA呈阴性。

在具体的实施方案中，MS患者具有以下特征中的一项或多项：

-中枢神经系统中的炎症和/或神经变性，特别以Gd对比增强T1病变和/或FLAIRT2病变为特征，

-与健康对照相比，与Th1细胞或细胞毒性相关的基因和/或编码促炎细胞因子例如IL-2和/或IFN-γ的基因的更高的表达，

-HLA同种异型HLA-DRB3*02:02或DRB3*03:01。

另一方面，本文描述了用于对MS患者进行分层的方法，该方法包括：检测从患者获得的样品中的CD27-Th1CD4+细胞，从而对患者进行分层。

在一个实施方案中，样品包括体液。

在一个实施方案中，体液包括血液，例如外周血或脑脊液(CSF)。

在一个实施方案中，该方法包括检测体液中的T细胞和/或抗体对蛋白质GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

另一方面，本文描述了用于治疗MS患者的方法，该方法包括：检测从患者获得的样品中的CD27-Th1CD4+细胞，以及向患者施用MS疗法，从而治疗患者。

在一个实施方案中，先前从患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

在一个实施方案中，MS疗法包括免疫优势肽。

在一个实施方案中，MS疗法包括用抗原特异性免疫疗法例如耐受诱导来治疗患者。

在一个实施方案中，治疗患者包括向患者施用选自MBP、PLP和MOG的免疫优势肽，例如在EP2205273B1中公开的。

在一个实施方案中，治疗患者包括向患者施用免疫优势蛋白质或肽，其选自GDP-L-FS或其片段、衍生物或剪接变体，以及来自RASGRP家族的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体，例如在WO2020/002674中公开的。

在一个实施方案中，免疫优势肽例如化学地偶联至白细胞或红细胞。

在一个实施方案中，样品包括体液。

在一个实施方案中，体液包括血液，例如外周血或脑脊液(CSF)。

附图简要说明

图1.流式细胞术门控策略。(A-C)首先排除双联体，然后按大小鉴定淋巴细胞。A.鉴定出CD3-，其中包括浆细胞(CD19-CD138+)、浆母细胞(CD19+CD138+)、B细胞(CD19+CD138-)和CD19-CD138-细胞。在B细胞中，还鉴定了幼稚(IgD+CD27-)、未转换记忆(IgD+CD27+)、转换记忆(IgD-CD27+)和双阴性(IgD-CD27-)的B细胞亚群。B.在CD3+T细胞中，首先鉴定CD3+CD8+细胞，然后将其分离为CM(CCR7+CD45RA-)、EM(CCR7-CD45RA-)、TEMRA(CCR7-CD45RA+)和幼稚(CCR7+CD45RA+)。然后将CM、EM和TEMRCD8+T细胞分离为CD28+和CD28-。这些CD8+T细胞中的每一个首先分离为CCR6-和CCR6+，然后分离为Th1(CCR6-CCR4-CRTH2-),Th2-A(CCR6-CCR4+CRTH2-),Th2-B(CCR6-CCR4+CRTH2+),CCR6-CCR4-CRTH2+,Th1*(CCR6+CCR4-CRTH2-),Th17(CCR6-CCR4+CRTH2-),CCR6+CCR4+CRTH2+和CCR6+CCR4-CRTH2+细胞。C.在CD3+T细胞中，首先鉴定CD3+CD4+细胞，然后分离为CM(CCR7+CD45RA-),EM(CCR7-CD45RA-),TEMRA(CCR7-CD45RA+)和幼稚(CCR7+CD45RA+)。然后将CM、EM和TEMRACD4+T细胞分离为CD28+CD27+、CD28+CD27-和CD28-。这些CD4+T细胞中的每一个首先分离为CCR6-和CCR6+，然后分离为Th1(CCR6-CCR4-CRTH2-),Th2-A(CCR6-CCR4+CRTH2-),Th2-B(CCR6-CCR4+CRTH2+),CCR6-CCR4-CRTH2+,Th1*(CCR6+CCR4-CRTH2-),Th17(CCR6-CCR4+CRTH2-),CCR6+CCR4+CRTH2+和CCR6+CCR4-CRTH2+细胞。SPHEROTM AccuCount颗粒已用于确定绝对计数。抗体：抗CD3AF700,抗CD4PE TR,抗CD8BV510,抗CD45RA BV711,抗CCR7BV421,抗CD27APC Cy7,抗CD28PE Cy7,抗CCR4APC,抗CRTh2PE,抗CCR6BV785,抗CD19PerCPCy5.5,抗IgD BV605和抗CD138FITC。

图2.来自MS患者的CSF浸润CD4+T细胞对GDP-L-FS和髓磷脂衍生肽的识别。A+B.针对由自体PBMC呈递的GDP-L-FS、髓磷脂(MBP、MOG(1-20)、MOG(35-55)、PLP)和CEF肽的PHA扩增的CSF浸润CD4+T细胞的表达为刺激指数(SI)的增殖反应和表达为(pg/ml)的IFN-γ释放。每个点代表一个孔。每种肽均在105名MS患者中进行了四次测试(4个孔)(每种肽总共420个孔)。虚线显示阳性阈值(对于增殖SI≥2，和对于IFN-γ释放IFN-γ的pg/ml≥20)。Kruskal-Wallis检验用于比较肽反应。显示了所有比较的统计显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)。C.对于每种肽，使用IFN-γ释放和增殖的阳性孔百分比的比率。D.对于GDP-L-FS、MBP、MOG(1-20)、MOG(35-55)和PLP(139-154)肽，SI与IFN-γ释放(pg/ml)之间的相关性。Spearman r用于检验变量之间的线性相关性。显示了r和p值。

图3.GDP-L-FS和髓磷脂反应患者的鉴定。棋盘图显示了每个MS患者对个体肽的反应。填充和阴影单元格是增殖(3A)和IFN-γ释放(3B)的阳性反应。无反应者显示为3C(增殖)和3D(IFN-γ释放)。显示了GDP-L-FS-、MBP-、MOG(35-55)-反应者和无反应者的数量。

图4.GDP-L-FS-、MOG(35-55)-反应者和无反应患者中不同的CSF浸润和循环淋巴细胞。A.点图显示来自GDP-L-FS-反应者和无反应者的CSF浸润和外周循环EM CD4⁺细胞上的CD28和CD27表达。显示了EM CD27-细胞的百分比。B-C.GDP-L-FS、MOG 35-55反应者和无反应者中CSF浸润的频率(B)以及外周循环EM CD27-和EM CD27-Th1细胞的频率和绝对数量(C)。使用SPHEROTM AccuCount颗粒测定细胞计数。每个点对应一个患者，条形显示平均值。Kruskal-Wallis检验用于比较患者。显示了统计显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)。

图5.CSF浸润和循环T淋巴细胞的离体流式细胞术免疫表型分析。基于趋化因子受体表达的具有以下功能表型的表达CD28+CD27+、CD28+CD27-和CD28-以及EM CD28+CD27-CD4+T细胞的中央记忆(CM，CCR7+CD45RA-)、效应记忆(EM，CCR7-CD45RA-)和TEMRA(CCR7-CD45RA+)CD4+T细胞亚群的CSF浸润(A-B)和外周循环(C-F)频率以及实际计数：Th2A(CCR6-CCR4+CRth2-),Th2B(CCR6-CCR4+CRth2+),CCR6-CCR4-CRth2+,Th1(CCR6-CCR4-CRTh2-),Th17(CCR6+CCR4+CRth2-),CCR6+CCR4+CRth2+,CCR6+CCR4-CRth2+和Th1*(CCR6+CCR4-CRth2-)。图中的每个点对应于单个患者，条形显示平均值。使用SPHEROTM AccuCount颗粒测定细胞计数。Kruskal-Wallis检验用于比较GDP-L-FS、MOG35-55和无反应患者。显示了统计显著性(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001)。

图6.EM CD27+/CD27-细胞的纯化和转录组分析。A.用于从四名GDP-L-FS反应MS患者和四名HD中分离表达或不表达CD27的EM CD28+CD4+T细胞的门控策略。显示了来自一名代表性GDP-L-FS反应MS患者和一名HD患者的在细胞分选之前和之后的表达或不表达CD27的EM CD28+CD4+T细胞的频率。Mann-Whitney检验已用于比较GDP-L-FS反应患者和HD中EMCD27细胞的频率，并显示了统计显著性(*p<0.05)。B.热图显示了通过RNA测序分析鉴定的145个差异表达的转录物的逐行z分数，以及来自GDP-L-FS反应者的EM CD27-(5-8列)相对来自HD的EM CD27-(E-H列)的成对比较(Log2Ratio>0.5)，p<0.001)。热图还显示了来自GDP-L-FS反应者(1-4列)和HD(A-D列)的EM CD27+细胞中这145个转录物的逐行z分数。详细显示了与细胞毒性、Th1和其他Th亚群相关的所选转录物的逐行z分数。粗体是通过RNA-seq分析和GDP-L-FS患者中EM CD27-相对EM CD27+的成对比较也被鉴定为差异表达的基因(Log2Ratio>0.5，p<0.001)。

图7.EM CD27-和EM CD27+CD4+T细胞的转录组分析。A.热图显示来自四个GDP-L-FS-反应患者的EM CD27+(1-4列)和EM CD27-(5-8列)细胞之间差异表达的265个转录物的逐行z分数(Log2Ratio>0.5，p<0.001)。还显示了来自HD的EM CD27+(A-D列)和EM CD27-(E-H列)细胞中这些基因的Z分数。详细显示了与细胞毒性、Th1和其他Th亚群相关的所选基因的Z分数。粗体是在GDP-L-FS反应者的EM CD27-相对HD的EM CD27-中差异表达的基因(Log2Ratio>0.5，p<0.001)。B.GDP-L-FS-反应者和HD的EM CD27+和CD27-细胞中Th1/细胞毒性基因和与其他Th亚群相关的基因的log2(每百万每千碱基的片段数(FPKM)+0.1)的分布。

图8.GDP-L-FS和MOG(35-55)特异性反应的表征。A+B.上图，GDP-L-FS-和MOG(35-55)-反应者的CSF浸润CD4⁺T细胞在用自体PBMC呈递的特定肽(GDP-L-FS和MOG(35-55))刺激后释放的细胞因子。对于每位患者汇集四个孔。下图，GDP-L-FS-和MOG(35-55)-反应者的CSF中存在的细胞因子。细胞因子以pg/ml表示。C.上图：GDP-L-FS-和MOG(35-55)-反应者的CSF浸润CD4⁺T细胞在用自体PBMC或抗CD3、抗CD28、抗-CD2刺激珠呈递的特定肽刺激后的增殖反应。增殖反应表示为SI。下图：GDP-L-FS-和MOG35-55-反应者中CSF浸润和血液循环幼稚(IgD+CD27-)B(CD19+CD138-)细胞的频率。图中的每个点对应于单个患者和条形显示平均值。Mann-Whitney检验用于比较GDP-L-F-和MOG(35-55)-反应者。显示了统计显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)。

图9.来自患者和对照的CSF的其他特征。A.MOG(35-55)反应者和MOGAD患者的CSF中存在的细胞因子。细胞因子释放以pg/ml表示。B-C.GDP-L-FS-和MOG(35-55)-反应者和CP的B.CXCL13、几丁质酶3样蛋白1(CHI3L1)和鞘内IgG合成IgG(loc)；C.颗粒溶素、颗粒酶H(GZMH)、颗粒酶A(GZMA)和神经丝轻链(NfL)的鞘内丰度。图中的每个点对应一个患者，条形显示平均值。Mann-Whitney检验用于比较MOG(35-55)反应者和抗MOG患者，Kruskal-Wallis检验用于比较GDP-L-FS反应者、MOG(35-55)反应者和CP。显示了统计显著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001)。

图10.GDP-L-FS和MOG 35-55反应患者中的HLA II类表达。A.GDP-L-FS-、MOG(35-55)-反应者和无反应者以及两个参考队列中表达DR15(左)和DRB3*02:02/03:01(右)基因的患者的频率。显示了对GDP-L-FS有反应或无反应以及表达(Y，是)或不表达(N，不是)DRB3*02:02/03:01基因的患者数量以及Fisher精确检验的P值。B+C.来自表达或不表达DRB3*02:02/03:01基因的患者的对GDP-L-FS、MBP、MOG(1-20)、MOG(35-55)、PLP和CEF肽以及抗CD2、抗CD28、抗CD3刺激珠的CSF浸润CD4⁺T细胞反应(增殖(SI)和IFN-γ释放)。图中的每个点对应于一个孔。Mann-Whitney检验用于比较表达DRB3*02:02/03:01和其他DR的患者。显示了统计显著性(***p<0.001和****p<0.0001)。

图11.GDP-L-FS和MOG35-55反应患者的表征。A+B.GDP-L-FS-、MOG35-55-反应者和无反应者中冬季/春季和夏季/秋季获得的LP的月度分布和样品的频率。显示了其中在冬季/春季获得(Y，是)或没有获得(N，不是)LP的对GDP-L-FS有反应或没有反应的患者数量，以及Fisher精确检验的P值。C.GDP-L-FS-和MOG(35-55)-反应者中对比增强T1病变的总数量和flair T2病变的总体积(以mL表示)。图中的每个点对应一个患者，条形显示平均值。针对正态分布变量使用T检验来比较两组患者。显示了统计显著性(**p<0.01)。

发明详述

已经找到了一种对MS患者进行分层的方法，该方法允许为个体患者特别定制治疗方法(个性化治疗)。例如，可以选择那些患者用于耐受方法，其中体液，特别是血液，优选外周血，或CSF(先前从MS患者获得)中，已检测到CD27-Th1CD4+细胞，优选CCR7-CD45RA-CD27-Th1CD4+细胞。优选地，患者的免疫系统，特别是体液中的T细胞和/或抗体，对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应性，即作出反应。

分层优选是指取决于方法的结果将MS患者分为不同的组。例如，可以通过本申请的方法鉴定的患者亚组的特征在于体液特别是外周血或CSF中的CD27-Th1CD4+细胞。在一个实施方案中，同一患者亚组的特征还可在于体液中的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。在另一具体的实施方案中，该患者亚组的特征还可在于具有以下一个或多个特征：

-中枢神经系统中的炎症和/或神经变性，特别以Gd对比增强T1病变和/或FLAIRT2病变为特征，

-与健康对照相比，与Th1细胞或细胞毒性相关的基因和/或编码促炎细胞因子(例如IL-2和/或IFN-γ)的基因的更高的表达，

-HLA同种异型HLA-DRB3*02:02或DRB3*03:01。

根据本发明的一个实施方案，在体液特别是外周血或CSF中检测到的CD27-Th1CD4+细胞对于标记物CCR7和/或CD45RA进一步呈阴性。在优选的实施方案中，CD27-Th1CD4+细胞对于标记物CCR7和CD45RA均呈阴性。

在一个特别优选的实施方案中，患者的T细胞对SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37中所定义的至少一种肽作出反应。在另一个优选的实施方案中，该片段包含位于SEQ IDNO：37中所定义的序列内的任何序列或由其组成。这些肽也可以被称为免疫优势肽。

对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应的T细胞优选是CD4+T细胞，更优选CSF浸润CD4+T细胞。

对特定刺激的T细胞反应可以例如通过T细胞的增殖和/或通过其细胞因子特别是IFN-γ的释放来测量。本领域技术人员知道测量增殖和细胞因子例如IFN-γ的释放/分泌的方法。例如，可以通过3H-胸苷测定来测量增殖反应。例如，细胞因子的定量可以通过常规的ELISA测试或通过基于珠子的免疫测定来进行，所述免疫测定允许使用流式细胞仪同时定量多种细胞因子。

当患者表现出阳性增殖反应和/或可以响应于刺激(即优选地肽)检测到细胞因子(例如IFN-γ)时，优选将患者分类为反应者。

胞质酶GDP-L-岩藻糖合酶将GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖转化为GDP-L-岩藻糖，然后由岩藻糖基转移酶用于岩藻糖基化所有寡糖。在哺乳动物中，岩藻糖基化的聚糖在许多生物学过程中起着重要作用，包括输血反应、宿主与微生物的相互作用、癌症发病机制以及脑中非炎性环境的维持。在一个实施方案中，GDP-L-岩藻糖合酶显示出将GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖转化成GDP-L-岩藻糖的酶活性。

蛋白旨在表示寡肽、多肽以及蛋白本身。蛋白序列可以由GenBank条目定义。蛋白序列也可以通过UniProtKB/Swiss-Prot条目和/或GenPept条目定义。条目可以由数字定义，例如登录号。如果适用，数据库条目包括相应的登录号(即条目号)和版本号。蛋白也可以通过技术人员已知的任何其他数据库来定义。可以存在不同的同工型、衍生物和/或剪接变体，这些也涵盖在本发明中。因此，该序列可以不同于来自例如GenBank或UniProtKB/Swiss-Prot条目的已知序列。

除非另有明确说明，根据本发明的“一种”蛋白或“该”蛋白例如是指GDP-L-岩藻糖合酶蛋白。

在优选的实施方案中，蛋白质是人蛋白质和/或核苷酸序列和/或基因序列是人序列。

剪接变体来自基因表达过程中的可变剪接。根据本发明所述的剪接变体优选地是免疫优势的。

片段优选地是蛋白的任何部分，其比亲本蛋白更短，即具有更少的氨基酸。片段可以是肽。在一个实施方案中，片段包含5至50个、优选地5至20个。更优选地10至15个氨基酸，甚至更优选地15个氨基酸。根据本发明所述的片段优选是免疫优势的。

序列的衍生物优选地定义为在其全长上与参考氨基酸序列的相应部分具有至少75％、更优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性的氨基酸序列。在本发明的意义上，“对应部分”优选地是指所述亲本序列的相同氨基酸区段。例如，如果长度为100个氨基酸的衍生物与SEQ ID NO：1的氨基酸区段(SEQ ID NO：1的氨基酸1至100)有20个氨基酸不同，则该特定衍生物与其对应部分即参考氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的1至100个氨基酸，在其整个长度上具有80％的同一性。根据本发明所述的衍生物优选地是免疫优势的。

根据本发明，优选地在参考氨基酸序列的整个长度上或在参考氨基酸序列的对应部分的整个长度上确定氨基酸序列的“同源性”或“同一性”，所述参考氨基酸序列对应于定义了同源性或同一性的序列。

“同一性”被定义为相同的氨基酸，“同源性”包括相同的氨基酸以及保守取代。本领域技术人员知晓保守取代，例如

-芳香族和芳香族F和W/Y

-带正电和带正电的R和K/H

-带负电的E和D或

-脂肪族V和L/M/I，或A和S/T。

编码本发明的任何蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列是指任何编码核苷酸序列，例如RNA或DNA，特别是mRNA或cDNA。在一个实施方案中，核苷酸序列是本领域技术人员已知的质粒或任何类型的载体。在一个优选的实施方案中，核苷酸序列不包含内含子，并且基因序列包含外显子和内含子。

在一个优选的实施方案中，GDP-L-岩藻糖合酶蛋白

a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或

b)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列，或

c)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的氨基酸序列，或

d)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源的氨基酸序列，并且蛋白或其片段或剪接变体与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被抗体识别，所述抗体结合或识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段，或

e)由TSTA3基因编码，特别是由NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列编码，或者由与NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列至少80％、优选至少90％、甚至更优选至少95％相同的基因编码。

与自体HLA等位基因的结合、被T细胞的识别和/或被抗体的识别可以指示蛋白或其片段或剪接变体的免疫优势。免疫优势也可以如下文所公开的进行测试。

在一个实施方案中，该片段包含5至50个、优选5至20个、更优选10至15个、甚至更优选15个氨基酸。

在另一个实施方案中，该片段

a)与各自对应的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同，或

b)与各自对应的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源，或

c)与各自对应的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源并与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被结合或识别相应氨基酸序列的抗体识别。

“各自对应的氨基酸序列”是指相应氨基酸序列(即，SEQ ID NO：1)的各个片段，其具有与同源片段相同的长度(也参见上文“相应部分”的定义)。具有这些同一性和/或同源性的片段可以包含5至50个、优选地5至20个、更优选地10至15个、甚至更优选15个氨基酸。在各个片段的整个长度上确定同一性和/或同源性。换句话说，“相应的氨基酸序列”是指未改变的序列，即当SEQ ID NO：1所示的序列的片段与各个相应地氨基酸85％相同时，该片段与从SEQ ID NO：1“切下的”(即，直接取自或复制自SEQ ID NO：1)未改变的片段85％相同(在该片段的整个长度上)。

因此，在一个实施方案中，蛋白GDP-L-岩藻糖合酶具有与SEQ ID NO所示地各个描绘的序列具有一定同源性(至少60％，优选地至少70％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％)的氨基酸序列，另外要求该蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，被T细胞识别或被结合或识别各个SEQ ID NO所示氨基酸序列或其片段的抗体识别。在另一个实施方案中，所述蛋白或其片段或剪接变体结合自体HLA等位基因，并被T细胞识别，该T细胞结合或识别各个SEQ ID NO所示的氨基酸序列或其片段。

用于测量和/或预测与自体HLA等位基因的结合、被T细胞的识别或被抗体的识别的测定法是本领域技术人员众所周知的。例如，可以通过使用公认的NetMHCII(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)或IEDB(http://www.iedb.org)计算机肽结合预测算法预测肽与HLA等位基因的结合。T细胞识别可以例如通过T细胞增殖测定法，例如通过测量掺入的放射性来测量。肽和/或蛋白与抗体的结合可以通过本领域技术人员已知的标准测定法来测量，例如通过ELISA。与自体HLA等位基因的结合、被T细胞的识别或被抗体的识别可能指示肽或蛋白的免疫优势。免疫抗原性也可以如下所述进行测试。

在一个优选的实施方案中，用于根据本发明的治疗的肽包含GDP-L-岩藻糖合酶的片段并且包含选自由SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37组成的组的至少一个序列。在优选的实施方案中，肽由SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37之一所示的氨基酸序列组成。在另一个优选的实施方案中，片段包含位于SEQ ID NO：37所定义的序列内的任何序列或由其组成。

由于被疾病相关T细胞识别，以及被CSF浸润性大量T细胞识别的验证(WO2020/002674)，根据SEQ ID NO：2至6的序列先前已被鉴定为免疫优势肽。

氨基酸序列列于下文表2中。TSTA3的基因序列(编码GDP-L-FS)可以通过NCBI参考序列：NC_000008.11(REGION：143612618..143618048)来鉴定。

以下核苷酸序列代表编码本发明的GDP-L-FS(基因名：TSTA3)或其片段、衍生物或剪接变体的优选核苷酸序列。还包括编码序列(CDS)，即蛋白质或肽，其也可用于治疗MS：

RNA：XM_011517269.1、NM_003313.3、NM_001317783.1、XM_005251051.3

蛋白质：XP_011515571.1、NP_003304.1、NP_001304712.1、XP_005251108.2

所有序列均于2018年6月22日从各自的在线数据库中检索得到。

以下特征表明蛋白的某些肽在MS方面是免疫优势的：

a)T细胞对这种肽的频繁识别，即被大约10％或更多的MS患者识别，通常是在疾病相关的HLA等位基因或单倍型的背景下被识别(Sospedra和Martin，2005)，以及

b)与疾病相关的T细胞识别这种肽，例如那些对低浓度肽有反应的T细胞(高亲合力T细胞)(Bielekova等人，2004)，并因此被认为特别危险的，和/或具有促炎性表型，和/或从靶器官或隔室(CNS)中分离，如果是MS，则是脑、脊髓或CSF浸润性T细胞。

然而，高亲合力识别并不是先决条件，因为在人源化转基因小鼠模型中还显示出低亲合力的髓鞘特异性T细胞是致病性的(Quandt等人，2012)。

因此，可以测试在MS的情况下蛋白或其片段、衍生物或剪接变体是否是免疫优势的。这种测试优选地是体外测试。特别合适的是体外测试，该测试允许测量从被诊断出患有MS的人类受试者的血液、CSF或其他体液中获得的T细胞和/或抗体(优选地CSF浸润性CD4⁺T细胞)对测试的蛋白或片段、衍生物或剪接变体的反应性。本领域技术人员知道测试T细胞(优选CD4⁺T细胞)和/或抗体的反应性的方法。例如，可以测试CD4⁺T细胞的增殖和/或它们的IFN-γ分泌或在ELISPOT/FLUOROSPOT测定法中的反应性或对HLA-肽四聚体的反应性。如果测试的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体在已诊断出患有MS的人类受试者中诱导反应性，则在T细胞反应性，尤其是刺激指数(SI)高于2和/或IFN-γ分泌高于20pg/ml的情况下，测试的蛋白或片段、衍生物或剪接变体可以称为是免疫优势的。还可以选择10名被诊断出患有MS的患者进行此类测试。如果在至少2名患者中诱导了反应性，则测试的蛋白或片段、衍生物或剪接变体可以称为是免疫优势的。优选地，根据已建立的修订的McDonald标准，已经将10名患者诊断为患有RRMS。

最近已经证明，MS患者的T细胞在缺乏外源抗原的情况下显示出体外增殖的增加(Mohme等人，2013；Jelcic等人，2018)。这些“自增殖”T细胞富含归巢至MS患者的CNS隔室的细胞，并因此可以认为是脑/CSF浸润性T细胞的外周血来源。

如果无法获得体外T细胞测试的数据或除了此类测试之外，还可以从与个体的HLAI类或II类等位基因良好结合并且分别用于CD8+和CD4+T细胞的那些肽中预测/推断肽的免疫识别。肽结合预测是技术人员众所周知的。可以通过完善的预测算法(NetMHCII-www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/；IEDB-www.iedb.org/)以及HLA结合基序的分析(SYFPEITHI-www.syfpeithi.de/)来执行。

GDP-L-岩藻糖合酶蛋白先前已被鉴定为在MS中具有免疫优势，因此它已被鉴定为自身抗原(WO2020/002674)。

与HLA等位基因的结合不一定特别强。事实上，对于与HLA等位基因结合不良的肽也可能出现免疫优势(Muraro等人，1997,J Clin Invest,100(2):339-349)。

在本发明的一方面，GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列用于治疗MS患者中的MS，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

例如，治疗包括耐受诱导。

在优选的实施方案中，先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

因此，选择用于治疗的MS患者以这样的方式分层，即仅治疗在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中显示出CD27-Th1CD4+细胞的那些患者。特别地，MS患者也对GDP-L-FS肽有反应。

在本发明的另一个方面，至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体用于在MS患者中诱导对自身抗原的抗原特异性耐受的方法中，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

在优选的实施方案中，先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

因此，根据上述标准选择耐受的患者。

耐受诱导是抗原特异性的，并使自身反应性T细胞无功能或无变应性，或诱导特异性抑制对所述靶抗原的不利自身免疫性的Treg细胞。诱导对靶自身抗原的耐受在自身免疫疾病中是非常重要的治疗目标。它提供了以几乎没有副作用的有效方式特异性减弱病原性自身免疫反应的机会。耐受诱导也可以通过应用完整蛋白代替或补充是该蛋白片段的免疫优势肽来实现(Kennedy等人，1990)。

蛋白和/或片段的免疫优势因此允许使用所述蛋白和/或其片段、衍生物或剪接变体进行抗原特异性免疫疗法，例如耐受诱导。

根据本发明，抗原特异的耐受化处理可用于所有形式的MS：在首次表现时，当已经排除了差异诊断，只要CSF和MRI结果与诊断相一致，疾病被称为CIS。MRI揭示了位于MS的典型部位(即皮质旁、脑室旁、在脑干或脊髓中)的病灶。如果符合可以概括为空间扩散(一个以上的病灶或临床症状/体征)和时间扩散(一个以上的事件)的特定标准，则可以做出RRMS诊断。一种特殊的情况是偶然发现了与无临床症状MS相符的MRI病灶。这称为RIS，可以视为CIS和RRMS的前期阶段。超过80％的患者患有其中一种，大多数患者后来发展出所谓的SPMS。此时，复发/加重变得不那么频繁或完全停止，并且神经功能障碍在复发之间或没有复发时都稳步增加。

一种特殊形式的MS是PPMS，它从不复发，而是开始于神经学症状的稳步恶化，例如行走能力的稳步恶化。PPMS影响大约10％的MS患者并且男女发病率相同。它的发作通常晚于CIS或RRMS。关于原因和疾病机制，认为PPMS与上述RIS-CIS-RRMS-SPMS相似。

通常，MS是根据修订的McDonald标准诊断的。这些标准还允许区分MS的不同形式和疾病活性(Thompson等人，2018，Lancet Neurol，17(2)：162-173)。根据本发明的MS患者是已被诊断患有MS的人。

优选地，耐受化处理方法在早期阶段(即，RIS、CIS和早期RRMS)应用，因为假定在该阶段的免疫过程主要由自身反应性T淋巴细胞介导，而组织损伤(即所谓的退行性改变)在疾病进展时逐渐变得越来越重要。但是，只要存在针对用于耐受化处理的抗原的自身反应性T细胞反应(在SPMS和PPMS期间也是如此)，耐受化处理就有意义。

在一个特别优选的实施方案中，在早期阶段，即RIS、CIS和早期RRMS，在耐受化处理方法中使用GDP-L-岩藻糖合酶蛋白或其剪接变体，优选地GDP-L-岩藻糖合酶蛋白。GDP-L-岩藻糖合酶蛋白具有例SEQ ID NO：1所示的序列。

用于诱导耐受的方法优选包括向有需要的MS患者(即向人类受试者)施加至少一种GDP-L-FS蛋白或其片段(肽)、其衍生物和/或剪接变体、编码如本文所述的任何所述蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列和/或基因序列或施加包含如本文所述的至少一种蛋白质、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列的至少一种载体的步骤。

特别优选使用GDP-L-岩藻糖合酶(SEQ ID NO：1)的完整蛋白来诱导抗原特异性耐受。在另一个优选的实施方案中，使用蛋白质的片段(肽)。特别优选使用SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37中任一个所示的片段。在另一个优选的实施方案中，该片段包含位于SEQ IDNO：37所定义的序列内的任何序列或由其组成。

在一个优选的实施方案中，GDP-L-FS蛋白或肽或相应的核苷酸序列或基因序列，优选肽(或相应的核苷酸序列或基因序列)GDP-L-FS 51-65(SEQ ID NO：2)、GDP-L-FS136-150(SEQ ID NO：3)、GDP-L-FS 161-175(SEQ ID NO：4)、GDP-L-FS246-260(SEQ ID NO：5)、GDP-L-FS296-310(SEQ ID NO：6)和GDP-L-FS226-270(SEQ ID NO：37)中的至少一种)，以及另外一种或多种以下肽(或相应的核苷酸序列或基因序列)，可用于耐受诱导：

MBP 13-32(SEQ ID NO:7)

MBP 83-99(SEQ ID NO:8)

MBP 111-129(SEQ ID NO:9)

MBP 146-170(SEQ ID NO:10)

MOG 1-20(SEQ ID NO:11)

MOG 35-55(SEQ ID NO:12)

PLP 139-154(SEQ ID NO:13)

可用于耐受诱导的优选实施方案还可以包括(替代或附加于上述一种或多种肽)至少一种肽(或相应的核苷酸序列或基因序列)，其序列位于GDP-L-FS226-270(SEQ ID NO：37)的区段内。优选地，位于GDP-L-FS226-270(SEQ ID NO：37)的区段内的该区段包含10至20个氨基酸，优选15个氨基酸。

在一个实施方案中，核苷酸序列或基因序列通过载体例如细胞施用于患者。然后抗原可以由载体例如细胞表达。将编码自身抗原的RNA/DNA转移到载体例如细胞中并因此编码上述自身抗原也可以想象到，类似于使用编码抗原的RNA的肿瘤疫苗接种方法。

至少一种蛋白质、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列可以通过鼻腔、吸入、口服、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用来施加，优选通过被认为是致耐受性的施用途径施加，例如通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口服、吸入、鼻腔或与致耐受性载体(优选红细胞(RBC))偶联。载体优选全身施用，特别是静脉内施用。

特别地，该方法可用于在早期MS或甚至疾病的临床前阶段诱导对自身抗原的抗原特异性耐受。

本文提供的抗原特异性耐受方案可以选择性地靶向对使疾病持续存在的多个潜在致脑炎表位特异的活化的和幼稚的自身反应性T细胞。

耐受方法也可用于预防MS。该方法可以包括鉴定处于发展MS的高风险的那些个体(例如，在具有如本文所公开的选择的MS患者的家庭中)。例如，可以耐受例如患有MS的母亲的孩子或患有MS的患者的同卵双胞胎，他们的发展MS的风险特别高。

MS或其一种形式的诊断是通过证明与MS相符且在空间和时间上传播的神经缺陷和/或MRI病变来进行的。本发明可用于鉴定特别可能受益于抗原特异性耐受诱导的患者，即允许个性化抗原特异性耐受方法。通过鉴定特别可能受益于抗原特异性耐受诱导的患者，可以在体外诊断患者患有MS，特别是患有MS的亚型。因此，这种体外测试可以与临床和影像学发现相补充，即根据现有技术，特别是根据修订后的McDonald标准进行的MS诊断。

可以通过本发明鉴定的患者亚组可能具有侵袭性形式的MS。侵袭性形式的特征可能是神经变形和/或神经炎症过程，尤其是在疾病的早期阶段。因此，在疾病的早期阶段已可以鉴定患者亚组。除了检测患者体液中的CD27-Th1CD4+细胞，优选CCR7-CD45RA-CD27-Th1CD4+细胞以及针对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性之外，特定的特征可以是：

-中枢神经系统中的炎症和/或神经变性，特别以Gd对比增强T1病变和/或FLAIRT2病变为特征，

-与健康对照相比，与Th1细胞或细胞毒性相关的基因和/或编码促炎细胞因子(例如IL-2和/或IFN-γ)的基因的较高的表达，和/或

-HLA同种异型HLA-DRB3*02:02或DRB3*03:01。

本领域技术人员知道如何检测患者CNS中的炎症和/或神经变性。例如，作为用于鉴定脱髓鞘病变的标准成像技术的磁共振成像(MRI)可以在这方面使用。最常见的MRI序列是T1加权和T2加权扫描，其可以分别通过Gd对比增强或液体衰减反转恢复(FLAIR)进一步细化。

与健康对照相比，与Th1细胞或细胞毒性相关的基因和/或编码促炎细胞因子(例如IL-2和/或IFN-γ)的基因的较高表达可以例如通过标准技术在体液，特别是血液，优选外周血或脑脊液(CSF)中测量。

检测HLA同种异型对于MS分层尤为重要。

可以通过本发明鉴定的患者亚组的特征还可以在于MS患者的CSF中的生物标记物优选神经丝(NF-L)和/或几丁质酶(YKL-40)的升高的水平(与健康对照相比)，MS患者优选对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

因此，生物标记物神经丝(NF-L)和/或几丁质酶(YKL-40)可用于鉴定MS患者亚组。因此，在一个实施方案中，公开了生物标记物特别是神经丝(NF-L)和/或几丁质酶(YKL-40)用于鉴定MS患者亚组的用途，其中在MS患者的体液，优选CSF中检测神经丝(NF-L)和/或几丁质酶(YKL-40)的水平，并与健康对照的体液优选CSF中神经丝(NF-L)和/或几丁质酶(YKL-40)的水平进行比较，其中体液优选CSF先前已从MS患者和健康对照获得。

可以通过本发明鉴定的患者亚组的特征还可以在于相对于MOG(35-55)反应者和/或非反应者而言对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应的患者中CSF和/或配对血特别是外周血中CD4+记忆(中央记忆(CM)和效应记忆(EM))Th1细胞的升高的水平(频率和/或绝对数量的富集)。特别是，CD4+EM Th1(CD28+CD27-CCR6-CCR4-CRTh2-)群体可能会富集。因此，CD4+记忆Th1细胞，特别是CD4+EM Th1(CD28+CD27-CCR6-CCR4-CRTh2-)细胞，可以用作鉴定MS患者亚组的生物标记物，其中在GDP-L-FS反应者(对蛋白GDP-L-FS或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应)的CSF和/或配对血液特别是外周血中检测CD4+记忆Th1细胞特别是CD4+EM Th1(CD28+CD27-CCR6-CCR4-CRTh2-)细胞的水平，并与MOG(35-55)反应者和/或无反应者进行比较，其中CSF和血液先前已从MS患者获得。该患者亚组的鉴定尤其在疾病的早期阶段是可能的。

通过鉴定具有针对相应自身抗原的现有的和/或特别强的促炎性(可能有害的)T细胞或抗体反应的那些患者或患者亚组，患者因此可以被体外诊断为患有MS，特别是患有特别是在疾病的早期阶段很有价值的MS亚型的患者。在这种情况下，用合适的测试对患者进行预测试以评估患者是否属于特定亚组也将允许针对个体患者或患者亚组定制耐受治疗(例如用于耐受的肽/蛋白质的组合物)，以使耐受性尽可能特异，并避免潜在的不利影响。然而，抗原特异性耐受也可以在尚未显示出对耐受抗原的T细胞反应的患者中进行。

在本发明的一个方面，提供CD27-Th1CD4+细胞用于监测对如上所述的诱导抗原特异性耐受的方法的反应的方法中，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

在优选的实施方案中，另外检测先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对如上文所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

监测对诱导抗原特异性耐受的方法的反应优选意味着可以控制耐受诱导的成功。在耐受诱导成功的情况下，体液(特别是血液，优选外周血或CSF)中的CD27-Th1CD4+细胞(特别是对于标记物CCR7和/或CD45RA也呈阴性的那些)的数量在耐受诱导过程中减少。因此，为了监测对诱导抗原特异性耐受的方法的反应，优选测量体液中CD27-Th1CD4+细胞，特别是对于标记物CCR7和/或CD45RA也呈阴性的那些的数量。测量可以例如通过流式细胞术或通过使用寡核苷酸标记的抗体和随后的基于测序或PCR的方法，或通过允许定量细胞的任何其他方法(例如使用抗体和合适的检测方法)来完成。

在一个实施方案中，在耐受化后4至12周、优选耐受化后6至10周、优选耐受化后8周监测反应。耐受化优选是指在患者中诱导耐受的日期，即向有需要的MS患者(即向人类受试者)施加至少一种GDP-L-FS蛋白或其片段(肽)、衍生物和/或剪接变体、编码任何蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列和/或本文所述的基因序列或施加包含如本文所述的至少一种蛋白质、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列的至少一种载体的日期。在施用进行超过一次的情况下，耐受化优选是指施用的第一天。

在一个实施方案中，可以在较长的时间段内监测对耐受诱导的反应(例如每6个月重新测试)，以测试耐受效应的维持。

在本发明的一方面，提供了与如上文所定义的用于在MS患者中诱导对自身抗原的抗原特异性耐受的方法的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的载体，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

本领域技术人员熟悉可能的载体。例如，载体可以是任何细胞、蛋白、脂质、糖脂、珠粒、纳米颗粒、病毒样颗粒(VLP)或分子(例如糖分子)，或其任何组合，所述载体适合于在人类中应用并且可以通过偶联方法与一种或多种蛋白和/或片段偶联，例如通过化学偶联方法，优选通过EDC偶联。载体可以衍生自天然存在的载体或为合成的载体。优选地，细胞、分子、珠粒、纳米颗粒或VLP在体内是生物可降解的，或者至少适用于活人，并且在体内分解，或者从施用载体的身体中消除。术语细胞还包括细胞前体，例如RBC前体。优选地，载体是血细胞，甚至更优选地是红细胞或白细胞。白细胞可以是脾细胞或PBMC或通常是APC。

在一个实施方案中，蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体由细胞(优选地血细胞)表达。由此，在细胞表达蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体之前，将编码所述蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体的遗传信息引入细胞。

可以使用将蛋白和/或其片段与载体偶联的任何偶联剂或方法。例如，合成的或天然的接头可用于偶联。这种接头的一个实例是存在于红细胞(RBC)表面上的糖蛋白A。在一个实施方案中，执行化学交联。在一个优选的实施方案中，使用了催化游离氨基和羧基之间的肽键形成的化学交联剂EDC。特别是在存在EDC的情况下，可以将多种肽偶联至载体的表面，从而允许同时靶向多种T细胞特异性。优选地，3种以上、5种以上、10种以上、15种以上或甚至20种以上不同的肽偶联至载体的表面。在一个优选的实施方案中，使用5至20种、优选地5至15种不同的肽。如果一个肽不是由相同的氨基酸序列组成，则它不同于另一个肽。载体优选地是细胞但不一定是细胞。只要存在游离氨基，EDC便可用于偶联至任何载体。

在另一个实施方案中，根据本发明的GDP-L-FS蛋白的至少一种肽，特别是SEQ IDNO：2至6和SEQ ID NO：37所定义的至少一种肽(或位于SEQ ID NO：37所定义的序列内的任何肽)与现有技术的肽一起使用，特别是与至少一种髓磷脂肽，特别是与SEQ ID NO：7至13所定义的至少一种或全部髓磷脂肽一起使用。

在一个优选的实施方案中，载体是血细胞，并且血细胞通过偶联剂，优选地通过EDC化学偶联至至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体。制造这种化学偶联的(即抗原偶联的)血细胞的方法例如包括从人类受试者分离血细胞，添加至少一种蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体，即抗原，然后加入偶联剂，优选地EDC。

通过EDC与肽偶联的细胞的作用机制尚未完全了解，但涉及将肽的氨基和羧基与细胞表面分子共价连接，肽偶联(即抗原偶联的)细胞的随后程序性细胞死亡(对于有核细胞，是细胞凋亡；对于RBC，是红细胞衰亡)，然后体内垂死细胞的致耐受呈递(tolerogenicpresentation)。

可以滴定用于偶联反应的EDC剂量，以获得最大的安全性和最佳功效。在高浓度下，EDC可能导致细胞特别是RBC的裂解。为了使RBC具有最佳的稳定性，可以使用小于15mg/ml、优选地小于10mg/ml、甚至更优选地小于5mg/ml、甚至更优选地约3mg/ml的EDC终浓度。最佳剂量也可以变化。本领域技术人员知晓如何确定RBC的最佳稳定性和EDC的最佳剂量。

待偶联的蛋白、片段、衍生物和/或剪接变体可以以本领域技术人员容易确定的量加入。本领域技术人员知晓用最佳量的EDC确定相互作用中的最佳量的措施。

孵育时间可以针对每个特定的偶联反应进行变化和定制(例如，15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟)。随着孵育时间的延长，偶联效率可以更好。在一个实施方案中，在60分钟后达到最大值。

孵育温度也可以变化。例如，可以使用15-25℃或2-8℃。在一个实施方案中，当在15-25℃执行偶联反应时，偶联效率更高。

可以使用允许偶联反应的任何赋形剂。在一个实施方案中，赋形剂是无菌的且无内毒素。在一个优选的实施方案中，赋形剂是无菌的、无内毒素的盐水(NaCl 0.9％)。盐水获批准用于人类，并提供最大的安全性。

本领域技术人员知晓如何确定最佳孵育时间和温度以及如何确定可能的赋形剂。

实施例

材料和方法

患者样品

配对的CSF和血液样品采集自105名未经治疗的MS患者，从11名对照患者(CP)和10名针对抗AQP4抗体呈阴性的MOGAD患者仅采集了CSF，从4名健康供体(HD)仅采集了外周血单核细胞(PBMC)(表1)。84名MS患者(80％)从未接受过治疗，而21名患者(20％)之前接受过治疗，但在腰椎穿刺时被认为未接受治疗(表1)。患者和对照是从苏黎世大学医院神经病学系NIMS神经免疫学和MS研究科招募的。MS诊断基于修订后的McDonald标准(Polman等人2011,Ann Neurol,69(2):292-302)。

表1.患者和对照的人口统计学和临床特征。

标准方案批准、注册和患者同意

苏黎世州伦理委员会批准了研究程序(EC-No.2013-0001)。从所有患者获得了知情同意。

CSF和血清测量

ENREF 20白蛋白商和CSF特异性寡克隆带(OCB)如之前报道的那样进行分析(Puthenparampil等人,Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm,2021,8(2):e951)。鞘内Ig合成(Ig(loc))根据Reiber计算(Reiber等人,2009,Mult Scler,15(12):1466-1480)。

细胞培养和刺激

使用Ficoll(Eurobio，Germany)密度梯度离心新鲜分离PBMC。使用之前报道的旨在减少TCR库偏差的方案，在单轮刺激中用PHA扩增CSF浸润的CD4⁺T细胞(Planas等人,2008,Sci Transl Med,10(462):eaat4301)。将6x10⁴个PHA扩增的CSF浸润CD4⁺T细胞与2x10⁵个经辐照的自体PBMC作为抗原呈递细胞一起一式四份接种，并用终浓度为10μM的肽(表2)和T细胞激活试剂盒(抗-CD3、抗CD28、抗CD2珠)(Miltenyi Biotec)作为阳性对照进行刺激。

表2.GDP-L-FS、髓磷脂和CEF肽(氨基酸序列)

增殖反应

如先前报道(Planas等人，2018)，使用3H-胸苷(Hartmann Analytic,Braunschweig,Germany)刺激后72小时测量增殖。单孔的刺激指数(SI)如下计算：SI＝(具有肽的cpm孔)/(没有肽的平均cpm孔)。如果SI≥2，则认为孔为阳性。如果四个孔的平均SI≥2并且四个孔中至少有3个显示SI≥2，则认为患者对肽呈阳性。

细胞因子的定量

根据制造商的说明，使用ELISA MAX^TM Deluxe Set Human IFN-γ(Biolegend,SanDiego,CA,USA)测量IFN-γ的释放。如果IFN-γ≥20pg/ml，则认为该孔为阳性，如果4个孔的平均IFN-γ≥20pg/ml，且4个孔中至少有3个呈阳性，则认为患者对肽呈阳性。

根据制造商的说明，使用人类T辅助细胞因子组LEGENDplex珠基免疫测定(Biolegend)测量上清液和CSF中的细胞因子。

免疫表型分析

按照之前的报道(Puthenparampil等人,2021；Brodie等人,2016,Cytometry,89(7):629-32)在66名MS患者的子队列中进行鞘内和配对循环淋巴细胞的离体免疫表型分析(表1，同上)。添加ENREF 24SPHEROTM AccuCount颗粒(Spherotech,Inc.Lake Forest,IL,USA)以按照制造商的说明计算绝对数量。使用LSR Fortessa细胞计数仪(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)采集样品，并使用FACSDiva(BD)和FlowJO(TreeStar Inc.,Ashland,OR,USA)软件进行分析。图1总结了门控策略。

细胞亚群的分选

来自四名MS患者和四名年龄和性别匹配的HD患者的PBMC用针对CD4(APC)、CD45RA(BV711)、CCR7(BV421)、CD27(PE)和CD28(APC-Cy7)的抗体(均来自BioLegend)并用活-死aqua染料(Invitrogen)进行标记。CD4+CCR7-CD45RA-CD28+CD27+和CD4+CCR7-CD45RA-CD28+CD27-活细胞在Sony SH800SFP细胞分选仪(4个激光器，Sony)中使用100μm分选芯片进行分选。将来自每个细胞群的20,000个分选的细胞转移至无RNase的管中，重悬于Qiazol(QIAGEN，Germany)中并冷冻于-80℃。

RNA提取、测序和分析

根据制造商的说明，使用PicoPure RNA分离试剂盒(Life Technologies)从冷冻细胞沉淀中提取RNA。如先前报道(Jelcic等人,2018,Multiple Sclerosis Cell,175(1):85-100)，RNA测序(RNAseq)是在苏黎世功能基因组中心使用Illumina Sequencing 200M进行的。RNAseq数据分析包括：(i)使用Trimmomatic(版本0.36)清理原始读数(Bolger等人,2014,Bioinformatics,30(15):2114-2120)；(ii)序列与人类参考基因组的伪比对(构建GRCh38.p13，来自GENCODE Release32的基因注释)并使用Kallisto(版本0.44)进行基因表达定量(Bray等人,2016,Nat Biotechnol,34(5):525-527)；(iii)使用STAR(v2.7.3)(Bray等人，2016)进行读数比对，以及(iv)使用软件包EdgeR(R版本：3.6.1，EdgeR版本：3.28.0)中实现的基于计数的负二项式模型进行差异表达基因检测(Robinson等人,2010,Bioinformatics,26(1):139-140)。使用适用于过度分散数据的广义线性模型来评估差异表达。对于改变的表达显示p值<0.001的基因被认为是差异表达的。

ELISA

根据制造商的说明使用以下ELISA试剂盒：NF-L(Human Diagnostics，Umea，Sweden)；CXCL13/BLC/BCA-1、颗粒酶A和颗粒溶素(R&D System,MN,USA)；CHI3L1(MicroVue,Athens,OH,USA)；穿孔素、颗粒酶B和颗粒酶H(Invitrogen-Thermo FisherScientific,MA,USA)。

HLA分型

如之前报道的那样(Puthenparampil等人，2021)，对患者针对HLA I类(A*和B*)和HLA II类(DRB1*、DRB3*、DRB4*、DRB5*、DQA1*和DQB1*)进行了分型。

MOG-抗体检测测定

如前所述，针对MOG IgG抗体分析血清和CSF样品(Reindl等人,2020,NeurolNeuroimmunol Neuroinflamm,7(2))。为了进行筛查，血清样品按1:20和1:40稀释，CSF样品按1:2稀释。如最近所述(Reindl等人，2020)，对阳性样品进行终点滴定，并使用抗人IgG(Fc)特异性二抗确认MOG-IgG阳性。

MRI

8名患者使用3T Philips Ingenia进行扫描，22名患者使用3TSiemens Skyra进行扫描。MRI方案包括3D钆剂前和后对比增强梯度回波脉冲序列(MPRAGE)以及3D流体衰减反转恢复(FLAIR)序列。

根据FLAIR，所有高信号病变的数量和总体积(以ml为单位)通过基于卷积神经网络的自动算法确定(Kruger等人，2020,Neuroimage Clin,28:102445)。所有结果均由两位经验丰富的技术评估员手动纠正。纠正中的差异通过在第二次读取阶段中的协商一致得到解决。类似地，确定了对比增强病变的数量。

使用自动处理管线Biometrica分析平台(版本2.1，jung diagnosticsGmbH,Hamburg,Germany)在对比前MPRAGE图像上确定全脑、灰质和丘脑体积(以ml为单位)(Schippling等人，2017,JNeurol,264(3):520-528)。

统计数据

GraphPad Prism8.0(GraphPad Software，La Jolla，California,USA)用于进行统计分析。未配对的T检验用于比较两组正态分布变量，U检验(Mann-Whitney)用于比较非正态分布变量。为了比较多余两组患者，Kruskal-Wallis检验用于非正态分布变量。Spearman r用于检验非正态分布变量之间的线性相关性。显著性水平设置为p<0.05。患者特异性、LP的季节性分布和HLA之间的关联采用Fisher精确检验进行，显著性为5％。

结果

GDP-L-FS反应者和髓磷脂反应者的鉴定

图2A+B显示了针对5种免疫优势GDP-L-FS(Planas等人，2018)和7种髓磷脂肽(Bielekova等人，2004)的来自105名MS患者的CSF浸润CD4⁺T细胞的增殖和IFN-γ释放。GDP-L-FS肽诱导阳性孔的最高频率，其使用增殖作为读出，MOG(35-55)肽使用IFN-γ释放作为读出(表3)。

表3.使用增殖和IFN-γ释放的每种肽的阳性孔和患者的百分比。

还分析了对病毒/细菌肽池(CEF)的反应(图2A+B和表3)。对于髓鞘质和CEF肽，IFN-γ分泌鉴定出比增殖更多的阳性孔，但对于GDP-L-FS肽，结果是相当的(图2C)。因此，对于GDP-L-FS肽发现增殖与IFN-γ之间的最强相关性(图2D)。

表3总结了对不同肽呈阳性反应的患者的频率。在14名患者(13.34％)中，增殖和/或IFN-γ释放的主要反应是针对几种GDP-L-FS肽，并被分类为GDP-L-FS反应者(图3A+B)。其中，6名患者(42.8％)对髓磷脂肽也表现出阳性反应。GDP-L-FS反应性和对髓磷脂肽的反应性之间的关联是显著的(p＝<0.0001，Fisher精确检验)。4名患者(3.8％)仅对MBP肽有反应，并被归类为MBP反应者，而仅对MOG(35-55)有反应的11名患者(10.4％)被归类为MOG(35-55)反应者。76名患者(72.4％)对任何自身抗原没有反应，并被归类为无反应者(图3C+D)。不同组患者对CEF肽的反应是相当的，除MOG(35-55)反应者(其中反应较低)外(图3A+B)。由于MBP反应者数量较少(<5)，因此未对该组进行进一步分析。

GDP-L-FS反应者中独特的CSF浸润和循环T细胞

在MS患者的子队列中进行了CSF浸润和循环淋巴细胞的免疫表型分析ENREF 22(表1，同上)，该子队列的组成为：GDP-L-FS-(n＝7)、MOG(35-55)-(n＝7)和无反应者(n＝52)患者(表4)。

表4.离体免疫表型分析结果总结

表达CD28但不表达CD27的效应记忆(EM，CCR7^-CD45RA^-)CD4⁺T细胞(EM CD27-)，在GDP-L-FS反应者的CSF中显著更丰富(图4A-B和图5A)。在这些EM CD27-细胞中，只有具有Th1(CCR6^-CCR4^-CRTh2^-)功能表型的细胞(EM CD27-Th1)显示出显著更高的频率(图4B和图5B)。对配对血液样品的分析表明，这些细胞在血液中的频率和绝对计数也显著丰富(图4A&C和图5C-F)。具有TEMRA(CCR7^-CD45RA⁺)分化状态以及共刺激分子CD28⁺CD27^-和CD28-的CSF浸润和循环CD4⁺T细胞在GDP-L-FS反应者中也更丰富(图5A和C-F)。

GDP-L-FS反应者中EM CD27-CD4+T细胞的转录特征

从四名GDP-L-FS反应者的外周血中分选EM CD27-和CD27+CD4⁺T细胞(图6A)，并通过RNAseq分析转录组。在EM CD27-相对EM CD27+细胞中，鉴定出265个差异表达基因(倍数变化1.5，p<0.001)，其中119个上调，146个下调(图7A)。上调的基因包括：(i)与细胞毒性CD8+(Hidalgo等人,2008,Am J Transplant,8(3):627-636)和CD4+(Patil等人,2018,SciImmunol,3(19))T细胞相关的转录物，例如ADGRG1(GPR56),ADGRG5(GPR114),CCL4,CCL5,CST7,CTSW,CX3CR1,ENC1,FCRL6,FGFBP2,GNLY,GZMB,GZMH,MYO6,PRF1,PRSS23,S1PR5,SLAMF7,SPON2,TGFBR3,TRGC2和ZEB2；(ii)在细胞毒性CD4⁺T细胞发育中重要的转录因子(TF)，例如Eomes(Pearce等人,2003,Sci,302(5647):1041-1043)和T-bet(由TBX21编码)(Eshima等人,2012,Immunol Lett,144(1-2):7-15)；和(iii)与Th1细胞相关的其他基因，例如IFNG和GZMA。相反，与其他Th亚群相关的细胞因子、趋化因子受体和TF(CCR4、CCR6、IL4R、IL6R、GATA3和FoxP3)在EM CD27-细胞中下调。

还分析了来自四个HD的相同分选的EM亚群(图6A)。GDP-L-FS反应者中区分EMCD27-和CD27+细胞的265个基因并不能区分HD中的EM亚群(图7A)。对来自GDP-L-FS反应者和HD的EM CD27-细胞的差异基因表达分析还鉴定了145个差异表达基因(倍数变化1.5，p<0.001)，其中66个在GDP-L-FS反应者中上调，其中包括19个与细胞毒性和Th1T细胞相关的基因，79个下调，包括与其他T细胞亚群相关的基因(图6B和图7A)。

与来自HD的相同细胞和EM CD27+细胞相比，在来自GDP-L-FS反应者的EM CD27-细胞中，与Th1细胞和细胞毒性特征性相关的基因(TBX21、GZMA、EOMES、GNLY、GZMH和SLAMF7)的转录总体增加，而与其他Th亚群相关的基因(GATA3、CCR4和CCR6)的转录减少(图7B)。

图6和图7中鉴定的基因具有以下标识符(GENCODE数据库，版本32(GRCh38.p13))：

GDP-L-FS-和MOG(35-55)-特异性反应的表征

在用同源抗原刺激的阳性孔的上清液中分析GDP-L-FS和MOG(35-55)特异性CD4⁺T细胞的功能表型(图8A+B)。GDP-L-FS特异性细胞释放比MOG(35-55)特异性细胞显著更高量的IL-2。这种较高的IL-2很可能与GDP-L-FS特异性细胞响应特定肽而增殖的显著更强的能力有关，而GDP-L-FS-和MOG(35-55)-特异性细胞中对非特异性刺激珠的增殖相当(图8C上图)。IFN-γ是GDP-L-FS特异性细胞释放的主要细胞因子，指示Th1功能表型。除了IFN-γ外，MOG(35-55)特异性细胞还释放与其他Th亚群(IL-9、IL-6和IL-10)相关的细胞因子，表明其具有多功能表型(图8A+B)。MOG(35-55)反应者的CSF中的IL-10以及Th2相关细胞因子也显著较高(图8A+B)。由于MOG(35-55)特异性细胞释放的一些细胞因子在来自MOGAD患者的CSF中被发现升高(Kaneko等人,2018,J Neurol Neurosurg Psychiatry,89(9):927-936)，并且由于两组患者共有靶抗原，因此证实没有MS患者在血清或CSF中具有阳性抗MOGIgG滴度(表5)，并且分析了来自MOGAD患者的CSF中的细胞因子谱(表1(同上文)和图9A)。

表5.CSF和配对血清样品中的抗MOG抗体

尽管诸如IL-9、IL-22和IL-6的细胞因子在两组中均较高，但MOG(35-55)反应者中Th2相关细胞因子IL-4和IL-10显著较高(图9A)。

支持体液免疫在MOG(35-55)反应者中的作用，在这些患者中发现CSF浸润但非循环性幼稚B细胞的显著较高的频率(图8C下图)。与对照患者相比，MOG(35-55)反应者中CXCL13的鞘内量(Ansel等人,2000,Nature,406(6793):309-314)较高，在GDP-L-FS反应者中CHI3L1(炎症的一般性标记物)(Bonneh-Barkay等人,2012,Brain Pathol,22(4):530-546)的鞘内量较高(CP，表1(同上文))(图9B)。两组患者均显示比CP显著更高的鞘内IgG(图9B)。

细胞毒性和神经变性标记物的进一步CSF分析在GDP-L-FS-反应者中显示穿孔素和颗粒酶B的无法检测到的量，颗粒溶素没有显著差异，以及较高水平的颗粒酶H、颗粒酶A和神经丝轻链(NfL)(Bergman等人,2016,Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm,3(5):e271)(图9C)。

GDP-L-FS反应性与HLA-DRB3*02:02/03:01的关联

所有患者均进行HLA分型(表6)。

表6.MS患者的HLA分型

图10A总结了表达MS相关DR15单倍型和DRB3*02:02/03:01等位基因的GDP-L-FS-、MOG(35-55)-反应者和无反应者的频率。基于之前分型的两个MS队列(German队列(n＝1270)和Swiss队列(n＝367))，预计40-50％的MS患者表达DR15单倍型，30-40％表达DRB3*02:02/03:01等位基因。表达DR15单倍型的GDP-L-FS反应者的频率(21.4％)低于预期，而表达DRB3*02:02/03:01等位基因的GDP-L-FS反应者的频率(92.8％)则要高得多。GDP-L-FS特异性与DRB3*02:02/03:01等位基因之间的关联是显著的(p＝<0.0001，Fisher精确检验，图10A)。

图10B+C显示表达或不表达DRB3*02:02/03:01等位基因的患者中对GDP-L-FS、髓磷脂和CEF肽以及刺激珠的CSF浸润CD4⁺T细胞反应。在DRB3*02:02/03:01患者中与表达其他HLA II类等位基因的患者相比仅对GDP-L-FS肽的反应显著更高(在增殖和IFN-γ释放上均如此)。

具有不同特异性的患者的人口统计学和临床特征

GDP-L-FS-、MOG(35-55)-反应和无反应患者的人口统计学和临床特征没有显示出显著差异(表7)。

表7.具有不同特异性的MS患者的特征

*PMS、SPMS和PPMS。**BBB破坏(QALB-QNORM>0)。***在6名GDP-L-FS和8名MOG35-55反应患者中进行了脑MRI半自动分析，在LP时从这些患者可获得脑MRI。****z值，考虑年龄和颅内容积的脑容量。*****p.为了比较两组患者，我们对正态分布变量使用非配对T检验，对非正态分布变量使用U检验(Mann-Whitney)。

进一步的表征揭示了关于进行LP的时间点的不同季节分布(图11A+B)，其中GDP-L-FS特异性和冬季/春季月份期间的LP之间存在显著关联(＝<0.0001，Fisher精确检验)。

还检查了受损的BBB通透性的标记物、疾病活动性和几个MRI参数(表7，上文)。虽然大多数这些标记物在GDP-L-FS-和MOG(35-55)-反应者之间是相当的，但对来自6个GDP-L-FS-和8个MOG(35-55)-反应者的回顾性收集的脑MRI扫描的半自动和盲法分析显示出统计上显著的差异。与MOG(35-55)-反应者相比，GDP-L-FS-反应者中对比增强T1病变的总数以及FLAIR T2病变的总体积(图11C)显著更高。

主要结果总结

这项研究代表了迄今为止在MS中进行的最全面的T细胞特异性分析，因为它：(i)分析了CSF浸润CD4⁺T细胞而不是PBMC，(ii)评估了不仅仅针对七种长期已知的免疫优势/致脑炎髓磷脂肽的反应性(Bielekova等人，2004)，还有对最近发现的五种免疫优势GDP-L-FS肽的反应性，(iii)基于Th1细胞在MS中的相关作用，除了增殖之外，还用作读出IFN-γ释放(Bielekova等人,2000,Nat Med,6(10):1167-1175；Planas等人,2018；Jelcic等人,2018；Bielekova等人,2004)，并且(iv)在105名MS患者的大型队列中进行。增殖证实了对GDP-L-FS肽的更强反应性，而IFN-γ释放则鉴定MOG(35-55)是最强的刺激肽。鉴定出14个GDP-L-FS-、4个MBP-和11个MOG(35-55)-反应者。

GDP-L-FS反应者也经常识别髓磷脂肽。有趣的是，离体免疫表型分析表明EMCD27-Th1CD4+在GDP-L-FS反应者的CSF和外周血中显著更丰富，并且血液中的这些细胞表达Th1-和细胞毒性-相关基因(Patil等人，2018)。

细胞因子分析显示Th1反应在GDP-L-FS反应者中的作用，Th2在MOG(35-55)反应者中的作用。

GDP-L-FS特异性反应与DRB3*02:02/03:01等位基因相关，并且在冬季和春季获得的CSF样品中显著更频繁。

最后，GDP-L-FS和MOG(35-55)反应者在MRI发现方面也存在差异。值得注意的是，GDP-L-FS反应者显示出明显更高数量的对比增强T1病变和更高体积的FLAIR T2病变，表明更高的炎症和更广泛的脱髓鞘，相应地具有更具破坏性的免疫反应。

总之，结果首次揭示了T细胞介导的自身免疫性疾病中T细胞特异性与疾病异质性的特征之间的关联。这些结果可能对针对抗原特异性耐受的个性化治疗方法具有重要意义。

实施方案

1.一种用于对多发性硬化症(MS)患者进行分层的方法，包括以下步骤：

-从MS患者获取体液，特别是血液，优选外周血，或脑脊液(CSF)，以及

-检测体液中的CD27-Th1CD4+细胞。

2.根据实施方案1所述的方法，其中所述方法还包括：

-检测体液中T细胞和/或抗体对蛋白质GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

也就是说，根据实施方案1的方法被提供为实施方案2，该方法还包括：

-检测体液中T细胞和/或抗体对GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

用于对多发性硬化症(MS)患者进行分层的方法是特别优选的，其包括

-从MS患者获取外周血或脑脊液(CSF)，以及

-检测外周血或CSF中的CD27-Th1CD4+细胞，以及

-检测外周血或CSF中的T细胞和/或抗体对蛋白质GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

GDP-L-FS蛋白已被鉴定为自身抗原。因此，根据实施方案1的方法被提供为实施方案2，其中该方法还包括：

-检测体液中的T细胞和/或抗体对自身抗原的反应性，其中所述自身抗原是蛋白质GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)或其片段、衍生物和/或剪接变体。

也就是说，根据实施方案1的方法被提供为实施方案2，其中该方法还包括：

-检测体液中的T细胞和/或抗体对自身抗原的反应性，其中所述自身抗原是GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体。

3.根据实施方案2的方法，其中GDP-L-FS蛋白

a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或

b)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列，或

c)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的氨基酸序列，或

d)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源的氨基酸序列，并且蛋白或其片段或剪接变体与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被抗体识别，所述抗体结合或识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段，或

e)由TSTA3基因编码，特别是由NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列编码，或者由与NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列至少80％、优选至少90％、甚至更优选至少95％相同的基因编码。

4.根据实施方案2或3的方法，其中所述片段包含5至50个、优选5至20个、更优选10至15个氨基酸、甚至更优选15个氨基酸。

5.根据实施方案2至4中任一项所述的方法，其中所述片段

a)与各自对应的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同，或

b)与各自对应的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源，或

c)与各自对应的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源并与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被结合或识别相应氨基酸序列的抗体识别。

6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述片段包含选自包含SEQ IDNO：2至6和SEQ ID NO：37的组的序列，优选地由选自包含SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37的组的序列组成。

7.如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列，其用于治疗MS患者中的MS，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

8.根据实施方案7使用的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列，其中先前从MS患者的体液中获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

在一个特别优选的实施方案中，提供了用于治疗MS患者中的MS的如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列，其中已在先前从MS患者获得的外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞，并且其中先前从MS患者的外周血或CSF获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

9.至少一种如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列，和/或与至少一种如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，用于在MS患者中诱导对自身抗原的抗原特异性耐受的方法中，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

10.根据实施方案9使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，其中先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

在一个特别优选的实施方案中，提供了用于在MS患者中诱导对自身抗原的抗原特异性耐受的方法中的至少一种如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，其中已在先前从MS患者获得的外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞，并且其中先前从MS患者的外周血或CSF获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

11.根据实施方案9或10使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，其中所述至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体通过鼻腔、吸入、口服、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用来施加，优选通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口服、吸入或鼻腔施用来施加。

12.CD27-Th1CD4+细胞，其用于监测对根据实施方案9至11中任一项所述的用于诱导抗原特异性耐受的方法的反应的方法中，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测所述CD27-Th1CD4+细胞。

13.根据实施方案12使用的CD27-Th1CD4+细胞，其中另外地检测先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

14.根据实施方案12或13使用的CD27-Th1CD4+细胞，其中体液中CD27-Th1CD4+细胞的数量，特别是对于标记物CCR7和/或CD45RA也呈阴性的那些，在耐受诱导过程中减少。

15.根据实施方案1至6中任一项所述的方法、根据实施方案7或8所述使用的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列、根据实施方案9至11中任一项所述使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体或根据实施方案12至14中任一项所述使用的CD27-Th1CD4+细胞，其中所述CD27-Th1CD4+细胞还针对标记物CCR7和/或CD45RA呈阴性。

16.根据实施方案1至6或15中任一项所述的方法、根据实施方案7或8或15所述使用的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列、根据实施方案9至11或15中任一项所述使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体或根据实施方案12至14中任一项所述使用的CD27-Th1CD4+细胞，其中MS患者具有以下特征中的一项或多项：

-中枢神经系统中的炎症和/或神经变性，特别以Gd对比增强T1病变和/或FLAIRT2病变为特征，

-与健康对照相比，与Th1细胞或细胞毒性相关的基因和/或编码促炎细胞因子例如IL-2和/或IFN-γ的基因的更高的表达，

-HLA同种异型HLA-DRB3*02:02或DRB3*03:01。

17.一种用于对MS患者进行分层的方法，该方法包括：检测从患者获得的样品中的CD27-Th1CD4+细胞，从而对患者进行分层。

18.根据实施方案17所述的方法，其中所述样品包括体液。

19.根据实施方案17或18的方法，其中所述体液包括血液，例如外周血或脑脊液(CSF)。

20.根据实施方案17至19中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测体液中的T细胞和/或抗体对蛋白质GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

21.一种用于治疗MS患者的方法，该方法包括：检测从患者获得的样品中的CD27-Th1CD4+细胞，以及向患者施用MS疗法，从而治疗患者。

22.根据实施方案21的方法，其中所述样品包括体液。

23.根据实施方案21或22的方法，其中所述体液包括血液，例如外周血或脑脊液(CSF)。

24.根据实施方案21至23中任一项的方法，其中先前从患者的样品获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

25.根据实施方案21至24中任一项所述的方法，其中所述MS疗法包括免疫优势肽。

26.根据实施方案21至25中任一项的方法，其中MS疗法包括用抗原特异性免疫疗法例如耐受诱导来治疗患者。

27.根据实施方案21至26中任一项的方法，其中治疗患者包括向患者施用选自MBP、PLP和MOG的免疫优势肽，例如在EP2205273B1中公开的。

28.根据实施方案21至27中任一项的方法，其中治疗患者包括向患者施用免疫优势蛋白质或肽，其选自GDP-L-FS或其片段、衍生物或剪接变体，以及来自RASGRP家族的蛋白或其片段、衍生物或剪接变体，例如在WO2020/002674中公开的。

29.根据实施方案25至28中任一项的方法，其中所述免疫优势肽例如化学地偶联至白细胞或红细胞。

30.如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列用于制造用于治疗MS患者中的MS的药物的用途，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞。

31.根据实施方案30的用途，其中先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

在一个特别优选的实施方案中，如实施方案3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列用于制造用于治疗MS患者中的MS的药物，其中已经在先前从MS患者获得的外周血或CSF中检测到CD27-Th1CD4+细胞，并且其中先前从MS患者的外周血或CSF获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

Claims (15)

1.一种用于对多发性硬化症(MS)患者进行分层的方法，包括以下步骤：

-从MS患者获取体液，特别是血液，优选外周血，或脑脊液(CSF)，以及

-检测体液中的CD27-Th1 CD4+细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括：

-检测体液中T细胞和/或抗体对蛋白质GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-FS)或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述GDP-L-FS蛋白

a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或

b)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同的氨基酸序列，或

c)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的氨基酸序列，或

d)具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源的氨基酸序列，并且蛋白或其片段或剪接变体与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被抗体识别，所述抗体结合或识别SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其片段，或

e)由TSTA3基因编码，特别是由NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列编码，或者由与NC_000008.11的核苷酸143612618至143618048的基因序列至少80％、优选至少90％、甚至更优选至少95％相同的基因编码。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述片段包含5至50个、优选5至20个、更优选10至15个氨基酸、甚至更优选15个氨基酸。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述片段

a)与各自对应的氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％相同，或

b)与各自对应的氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源，或

c)与各自对应的氨基酸序列至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％同源并与自体HLA等位基因结合，被T细胞识别和/或被结合或识别相应氨基酸序列的抗体识别。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述片段包含选自包含SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37的组的序列，优选地由选自包含SEQ ID NO：2至6和SEQ ID NO：37的组的序列组成。

7.如权利要求3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体，或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列，其用于治疗MS患者中的MS，其中CD27-Th1CD4+细胞存在于先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中。

8.根据权利要求7所述使用的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体，或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列，其中先前从MS患者的体液中获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

9.至少一种如权利要求3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种如权利要求3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，其用于在MS患者中诱导对自身抗原的抗原特异性耐受的方法中，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测到CD27-Th1 CD4+细胞。

10.根据权利要求9所述使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，其中先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体有反应。

11.根据权利要求9或10所述使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体，其中所述至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体通过鼻腔、吸入、口服、皮下(s.c.)、体腔内(i.c.)、肌内(i.m.)、皮内(i.d.)、透皮(t.d.)或静脉内(i.v.)施用来施加，优选通过i.v.、s.c.、i.d.、t.d.、口服、吸入或鼻腔施用来施加。

12.CD27-Th1 CD4+细胞，其用于监测对根据权利要求9至11中任一项所述的诱导抗原特异性耐受的方法的反应的方法中，其中在先前从MS患者获得的体液，特别是血液，优选外周血或CSF中检测所述CD27-Th1 CD4+细胞。

13.根据权利要求12使用的CD27-Th1 CD4+细胞，其中另外地检测先前从MS患者的体液获得的T细胞和/或抗体对如权利要求3至6中任一项所定义的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物和/或剪接变体的反应性。

14.根据权利要求1至6中任一项所述的方法、根据权利要求7或8所述使用的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列、根据权利要求9至11中任一项所述使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体或根据权利要求12或13所述使用的CD27-Th1 CD4+细胞，其中所述CD27-Th1 CD4+细胞还针对标记物CCR7和/或CD45RA呈阴性。

15.根据权利要求1至6或14中任一项所述的方法、根据权利要求7或8或14所述使用的GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体或编码GDP-L-FS蛋白或其片段、衍生物或剪接变体的核苷酸序列、根据权利要求9至11或14中任一项所述使用的至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列和/或与至少一种GDP-L-FS蛋白、片段、衍生物、剪接变体、核苷酸序列和/或基因序列偶联的至少一种载体或根据权利要求12至14中任一项所述使用的CD27-Th1 CD4+细胞，其中MS患者具有以下特征中的一项或多项：

-中枢神经系统中的炎症和/或神经变性，特别以Gd对比增强T1病变和/或FLAIR T2病变为特征，

-与健康对照相比，与Th1细胞或细胞毒性相关的基因和/或编码促炎细胞因子例如IL-2和/或IFN-γ的基因的更高的表达，

-HLA同种异型HLA-DRB3*02:02或DRB3*03:01。