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CN119907861A - 用于生产l-草铵膦及其磷酸脂的酶促催化方法 - Google Patents

用于生产l-草铵膦及其磷酸脂的酶促催化方法 Download PDF

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CN119907861A
CN119907861A CN202280100338.7A CN202280100338A CN119907861A CN 119907861 A CN119907861 A CN 119907861A CN 202280100338 A CN202280100338 A CN 202280100338A CN 119907861 A CN119907861 A CN 119907861A
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Evonik Operations GmbH
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Abstract

本发明涉及用于生产L‑草铵膦或其磷酸酯的酶促催化方法。该方法包括其中活化的L‑高丝氨酸HA(如乙酰或琥珀酰L‑高丝氨酸)与选自甲基次膦酸和甲基次膦酸的酯的底物S反应的步骤。硫化氢解酶E1(氨基羧丙基转移酶，EC 2.5.1)用于酶促催化。本发明在L‑草铵膦酸盐及其磷酸酯酶促生产中可达到新的底物。本发明使得在L‑草铵膦及其磷酸酯的酶促生产中可以使用新的底物。

Description

用于生产L-草铵膦及其磷酸脂的酶促催化方法
发明领域
本发明涉及用于生产L-草铵膦(“L-GA”或“LGA”)或其磷酸酯的酶促催化方法。该方法包括其中活化的L-高丝氨酸HA与选自甲基次膦酸和甲基次膦酸的酯的底物S反应的步骤。硫化氢解酶E1用于酶促催化。本发明在L-草铵膦及其磷酸酯的酶促生产中可使新的底物可用。
发明背景
有机磷光体化合物，即包含碳-磷光体键的化学试剂，在植物保护领域被广泛应用作除草剂。试剂如除草剂草甘膦和草铵膦以及生长调节剂草甘二膦用于此目的(例如由G.Rev.Environ.Containm.Toxicol.1994，138，73-145描述)。
P-甲基次膦酸的酯(例如P-甲基次膦酸丁酯；“MPBE”；CAS-No：6172-80-1)在合成非选择性除草剂草铵膦时具有作为构建要素的关键作用。这些酯可通过两个基本合成途径(在K.Haack，Chem.Unserer Zeit 2003，37，128-138的文章的第130页，图3a和3b中概述)获得：
a.用CH3MgCl与二乙基氯亚磷酸酯[ClP(OC2H5)2]反应提供甲基二乙氧基膦[H3CP(OC2H5)2；“DEMP”；CAS-No.15715-41-0]，其部分水解，得到相应的甲基次膦酸乙酯(MPEE；CAS-Nr：16391-07-4)。
b.或者，甲烷可以在500℃下与磷光体三氯化物反应，以得到甲基二氯膦烷H3CPCl2。然后可以在醇中将后者溶剂分解以得到相应的甲基次膦酸酯。
P-甲基次膦酸的酯区域选择性地(regioselectively)加入碳-碳双键。此性质用于合成用于形成第二磷光体-碳键的草铵膦。例如，H3CPH(O)OR(R＝烷基)在加成反应中与1-氰基烯丙基乙酸酯反应以提供中间体。随后乙酸取代基与氨的交换以及次膦酸部分的酯基和氰基的水解得到草铵膦。
丙烯酸酯是更便宜的替代起始材料。它可以与P-甲基次膦酸的酯反应生成3-[烷氧基(甲基)氧膦基]丙酸烷基酯。该二酯与草酸二乙酯的克莱森反应、水解和脱羧提供相应的α-酮酸，其可以被还原胺化以得到草铵膦。
本领域中(例如在WO 1999/009039 A1，EP 0508296 A1中)也描述了L-草铵膦的这些合成路线和进一步的合成路线。
WO 2020/145513 A1和WO 2020/145514 A1描述了合成L-草铵膦的化学途径。在此途径中，高丝氨酸衍生物如O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸用作起始材料，并且L-草铵膦通过包括内酯化和卤化的一系列反应获得。
WO 2020/145627 A1描述了类似的途径，其中在卤化期间获得溴衍生物。
CN 106083922 A公开的途径类似，但从L-甲硫氨酸开始。
EP 2402453 A2描述了通过将甲基硫醇和二甲基硫化物的混合物与O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸进行酶促反应来生产甲硫氨酸的酶促方法。
CN108516991 A描述了另一合成L-草铵膦的合成途径，从L-高丝氨酸的共沸脱水开始，以得到L-3,6-双(2-卤乙基)-2,5-二酮哌嗪，随后进行甲基亚膦酸盐二酯基团的引入和水解。
所有草铵膦合成路线的一般缺点是所获得的草铵膦是外消旋混合物。然而，由于D-对映体没有除草活性，L-草铵膦是经济上感兴趣的对映体。
对于L-草铵膦的对映选择性合成，在本领域中描述了酶促途径。
WO 2017/151573 A1公开了由D-草铵膦进行L-草铵膦的两步酶促合成。在第一步骤中，将D-草铵膦氧化脱氨以得到2-氧代-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(“PPO”)，随后将PPO特异性氨基化为L-草铵膦作为第二步骤。第一步通过D-氨基酸氧化酶的催化进行，第二步通过转氨酶催化。
WO 2020/051188 A1公开了将外消旋草铵膦转化成L-草铵膦对映体的类似方法。另外，公开了其中在用胺供体对PPO的氨基化期间形成的α-酮酸或酮副产物通过酮戊二酸脱羧酶转化以进一步将平衡转移至L-草铵膦的步骤。
WO 2019/018406 A1公开了从包含L-草铵膦和谷氨酸酯的混合物中纯化L-草铵膦的方法。通过谷氨酰胺酰基-肽基细胞环转移酶将谷氨酸酯酶促转化为焦谷氨酸酯，然后通过离子交换从所得混合物中纯化L-草铵膦。
本发明的目的是提供一种进一步的酶促过程，用于产生高对映体过量的L-草铵膦。特别地，此类方法应允许使用迄今未用于L-草铵膦的酶促合成的新底物。
发明概述
本发明通过提供用于从之前没有在L-草铵膦的酶促生产中使用的底物生产L-草铵膦的方法来解决上述问题。特别地，本发明提供了使用酶促催化途径由甲基次膦酸及其酯生产L-草铵膦或L-草铵膦的磷酸酯的方法。因此，这些磷光体化合物在L-草铵膦的生产中用作替代的底物，从而允许其中不依赖当前用于L-草铵膦生产的已知底物的生产灵活性。
特别地，此目的由本发明实现，其涉及用于产生L-草铵膦或其磷酸酯的酶促催化方法，包括步骤(a)，其中活化的L-高丝氨酸HA与底物S反应以产生这些化合物。
因此，本发明涉及用于生产L-草铵膦或其磷酸酯的酶促催化方法，包括步骤(a)，其中活化的L-高丝氨酸HA与以下结构(I)的底物S反应以产生以下结构(III)的化合物，
其中R1选自氢、烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，
并且其中活化的L-高丝氨酸HA具有以下结构(II)：
其中R2是具有1-15个碳原子的烃基，其任选地包含至少一个选自OH、COOH、NH的官能基团。
并且其中步骤(a)中的反应由硫化氢解酶E1酶促催化，
其中所述硫化氢解酶E1的多肽序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5的变体、SEQID NO:6和SEQ ID NO:6的变体、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:7的变体、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:8的变体。
发明详述
令人惊讶地发现，某些含磷光体的化合物，即甲基次膦酸和甲基次膦酸的酯，可以在酶促催化下与活化的L-高丝氨酸反应，从而打开了L-草铵膦和L-草铵膦磷酸酯的新合成途径。这尤其令人惊讶，因为类似的化合物如DEMP不在与活化的L-高丝氨酸的类似反应中进行反应。
因此，本发明涉及用于生产L-草铵膦或其磷酸酯的酶促催化方法，其包括步骤(a)，其中活化的L-高丝氨酸HA与以下结构(I)的底物S反应以产生以下结构(III)的化合物，
其中R1选自氢、烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基。
根据本发明的表示为“L-草铵膦或其磷酸酯”的化合物由结构(III)表示。当结构(III)中R1＝氢时，化合物为L-GA。
当结构(III)中R1选自烷基、烯基、炔基、羟基烷基、芳基时，化合物是L-GA的磷酸酯。
活化的L-高丝氨酸HA具有以下结构(II)：
其中R2是具有1-15个碳原子的烃基，其任选地包含至少一个选自OH、COOH、NH的官能基团。
步骤(a)中的反应由酶催化，所述酶为硫化氢解酶E1。
4.1底物S
根据本发明的底物S选自甲基次膦酸和甲基次膦酸的酯。
底物S具有结构(I)。在结构(I)中，R1选自氢、烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，
优选选自氢、烷基，
优选选自氢、具有1至6个、优选1至4个碳原子的烷基，
更优选选自氢、甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基，甚至更优选选自氢、甲基、乙基、正丁基，甚至更优选选自氢、甲基、正丁基，优选选自甲基、正丁基。最优选地，R1是正丁基。
当结构(I)中R1＝氢时，化合物是甲基次膦酸(也称为“P-甲基次膦酸”，“PMEA”)。
当结构(I)中R1选自烷基、烯基、炔基、羟基烷基、芳基时，化合物是甲基次膦酸的酯。
结构(I)和结构(III)中的R1相同。
4.2活化的L-高丝氨酸HA
根据本发明的反应中的另一反应伴侣是活化的L-高丝氨酸HA。
本领域技术人员知晓活化的L-高丝氨酸HA(有时也表示为“L-甲硫氨酸前体”，例如WO 2008/013432A1)，其特别是指O-酰基L-高丝氨酸。
4.2.1活化的L-高丝氨酸HA
活化的L-高丝氨酸具有以下化学结构(II)：
其中R2是具有1-15个碳原子的烃基，其任选地包含至少一个选自OH、COOH、NH的官能基团。
更优选地，活化的L-高丝氨酸选自O-乙酰-L-高丝氨酸[结构(II-A)]、O-琥珀酰-L-高丝氨酸[结构(II-B)]、O-丙酰-L-高丝氨酸[结构(II-C)]、O-乙酰乙酰-L-高丝氨酸[结构(II-D)]、O-香豆酰-L-高丝氨酸[结构(II-E)]、O-丙二酰-L-高丝氨酸[结构(II-F)]、O-羟甲基戊二酰-L-高丝氨酸[结构(II-G)]和O-庚二酰-L-高丝氨酸[结构(II-H)]。
甚至更优选地，活化的L-高丝氨酸选自O-乙酰-L-高丝氨酸[结构(II-A)]、O-琥珀酰-L-高丝氨酸[结构(II-B)]。
最优选地，活化的L-高丝氨酸是O-乙酰-L-高丝氨酸[结构(II-A)]。
4.2.2活化的L-高丝氨酸HA的化学合成
用于本发明的方法的活化的L-高丝氨酸HA可以通过本领域技术人员已知的有机化学合成途径获得。例如，M.Flavin，C.Slaughter，Biochemistry 1965，4，1370-1375中描述了O-琥珀酰高丝氨酸的合成。Nagai，M.Flavin，Methods in Enzymology，Metabolism ofAmino Acids and Amines Part B 1971，17(Part B)，423-424中描述了O-乙酰-高丝氨酸的合成。
例如通过M.D.Armstrong，J.Am.Chem.Soc.1948，70，1756-1759描述了潜在前体的化学合成。
4.2.3活化的L-高丝氨酸HA的生物技术合成
替代地并且优选地，本发明中使用的活化的L-高丝氨酸HA通过生物技术手段获得。例如，这在WO 2008/013432 A1中或通过H.Kase，K.Nakayama，Agr.BioI.Chem.1974，38，2021-2030描述。
产生活化的L-高丝氨酸HA的菌株优选选自埃希氏杆菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Provideia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、生丝单胞菌属(Hypomononassp.)、色杆菌属(Chromobacterium sp.)、诺卡氏菌属(Norcardiasp.)、真菌(其特别是酵母)。
本领域中(例如在US 3,598,701、US 6,303,348 B1、EP 0994190 A2、EP 1149911A2、WO 2004/067757A1中)也描述了用于获得L-高丝氨酸的生物技术过程。
4.3酶
根据本发明的方法是酶促催化的。
术语“酶”意指完全或大部分由或多或少特异性催化或促进一种或多种化学或生化反应的蛋白质或多肽组成的物质。
根据本发明的任何方面使用的任何酶可为分离的酶。特别地，根据本发明的任何方面使用的酶可在活性状态和在所有辅因子、底物、辅助和/或活化多肽或其活性必需的因子的存在下使用。
特别地，这也意味着术语“硫化氢解酶”，特别是“O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶”或“O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶”包括各自的酶与它们的功能所必需的所有辅因子的组合。特别地，此辅因子是吡哆醛5’-磷酸(“PLP”)。
“多肽”是被称为氨基酸的化学结构单元的链，其通过被称为肽键的化学键连接在一起。包括酶的蛋白质或多肽可为“天然的”或“野生型”，这意味着其天然地发生或具有天然蛋白质的氨基酸序列。这些术语有时可互换使用。多肽可糖基化或可不糖基化。
根据本发明的任何方面使用的酶可为重组的。如本文所用的术语“重组的”是指分子或由这样的分子编码的特别是多肽或核酸不天然存在但为基因工程化的结果，或指包含重组分子的细胞。例如，如果核酸分子包含在功能上与编码催化活性多肽的序列连接的启动子并且该启动子已被工程化使得催化活性多肽相对于包含原始未改变的核酸分子的相应野生型细胞中的多肽水平过表达，则核酸分子是重组的。作为进一步的实例，如果多肽与天然存在的多肽序列相同但是经工程化以含有一个或多个将其与天然存在的任何多肽序列区分开的点突变，则多肽是重组的。
如本文所使用的术语“过表达”意为编码或表达的相应多肽以比在为增加表达而进行的遗传修饰不存在的相同条件下在细胞中(例如在相应的野生型细胞中)通常发现的更高的水平或更高的活性表达。
如本文所用的术语“分离的”意为感兴趣的酶与其天然存在于其中的细胞相比被富集。酶可以通过SDS聚丙烯酰胺电泳和/或活性测定来富集。例如，如通过用考马斯蓝染料染色后的聚丙烯酰胺凝胶的目测来判断的，感兴趣的酶可构成在制剂中存在的所有多肽的5％、10％、20％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
4.3.1酶E1
根据本发明的方法的步骤(a)通过硫化氢解酶E1酶促催化。
本领域技术人员已知硫化氢解酶作为催化以下反应<1A>、<1B>中至少一种的酶：
<1A>O-乙酰-L-高丝氨酸+甲硫醇→L-甲硫氨酸+乙酸盐。
<1B>O-琥珀酰-L-高丝氨酸+甲硫醇→L-甲硫氨酸+琥珀酸盐。
对于反应<1A>比对于反应<1B>具有更高的催化活性的硫化氢解酶可表示为“O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶”。
对于反应<1B>比对于反应<1A>具有更高的催化活性的硫化氢解酶可表示为“O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶”。
根据本发明的方法的步骤(a)由硫化氢解酶E1(其甚至更优选O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶，最优选O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶)催化。
可在根据本发明的方法的步骤(a)中使用的硫化氢解酶来源于迷踪菌属(Elusimicrobia sp.)，特别是迷踪细菌(Elusimicrobia bacterium)；生丝单胞菌属；分枝杆菌属(Myobacterium sp.)；假诺卡氏菌属(Pseudonocardia sp.)，特别是嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)。
可用于根据本发明的方法中的硫化氢解酶可为归类在EC类EC 2.5.149中的O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶或归类在EC类EC 2.5.1中的O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶。
这些酶是甲硫氨酸生物合成的直接硫酰化(sulfurylation)途径的部分并且是PMP依赖性的。它们例如由M.P.Ferla和W.M.Patrick，Microbiology 2014，160，1571-1584描述。
WO 02/18613A1、WO 2007/024933 A2、EP 2657345 A1、EP 2657250 A2、WO 2015/165746A1和WO 2008/013432 A1公开了根据本发明的具有O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的实例。
适用于根据本发明的方法的O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶可源自迷踪菌属特别是迷踪细菌；分枝杆菌属；假诺卡氏菌属特别是嗜热假诺卡氏菌。
适用于根据本发明的方法的O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶可源自生丝单胞菌属。
相应的序列可来源于数据库，如Braunschweig酶数据库(BRENDA，Germany，在www.benda-enzyme.org/index.php下可获得)、国家生物技术信息中心(NCBI，在https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/下可获得)或Kyoto基因和基因组百科全书(KEGG，Japan，在www.https://www.genome.jp/keg/下可获得)。
下表1给出了可在根据本发明的方法的步骤(a)中使用的硫化氢解酶的优选实例。编码硫化氢解酶的基因对于O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(“AHS”)表示为“MET43”、“MET46”和“MET52”，并且对于O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(“SHS”)表示为“MET17”。
表1
菌株 基因名称 NCBI登录号 多肽的SEQ ID NO:
生丝单胞菌属 MET17 WP_011647651.1 SEQ ID NO:5
分枝杆菌属 MET43 MCB0926676.1 SEQ ID NO:6
嗜热假诺卡氏菌 MET46 WP_073459782.1 SEQ ID NO:7
迷踪细菌 MET52 MBI4397379.1 SEQ ID NO:8
步骤(a)至少由硫化氢解酶E1催化，其中硫化氢解酶水解酶E1的多肽序列选自SEQID NO:5和SEQ ID NO:5的变体、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:6的变体、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:7的变体、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:8的变体。
在本发明的方法的甚至更优选的实施方式中，步骤(a)中的反应由选自SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:6的变体、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:7的变体、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:8的变体的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶以及选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5的变体的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的硫化氢解酶E1催化。
下文进一步解释了术语“变体”(项4.3.3.1)。在本申请的上下文中，应理解其意指与相应多肽序列具有至少80％序列相同性的多肽序列。
4.3.2用于获得酶的方法
可用于根据本发明的方法中的酶可通过本领域技术人员已知的方法合成。
一种途径是在微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)(＝“E.coli”)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等中表达酶，并将整个细胞作为全细胞生物催化剂添加至反应。另一途径是表达酶、裂解微生物并添加细胞裂解物。又另一途径是纯化或部分纯化来自裂解物的酶并将纯的或部分纯的酶添加到反应中。如果反应需要多种酶，则酶可在一种或数种微生物中表达，包括在单个微生物内表达所有酶。
例如，本领域技术人员可通过在细胞中表达、特别是过表达(在下文中，“表达，特别是过表达”缩写为(过)表达”)本发明的酶及其后续分离来获得这些酶，例如在DE10031999A1中所述。例如，采用脂质体质粒来增加相应基因的表达。在此类质粒中，待(过)表达或编码待(过)表达的多肽或酶的核酸分子可置于位于基因上游的强诱导型启动子如lac启动子的控制下。启动子是由约40-50个碱基对组成的DNA序列，其构成RNA聚合酶全酶的结合位点和转录起始点(M.Pátek，J.Hollátko，T.Busche，J.Kalinowski，J.Needera，Microbial Biotechnology 2013，6，103-117)，由此受控制的多核苷酸或基因的表达强度可能受到影响。“功能性连接”通过启动子与基因的顺序布置获得，这导致基因的转录。
用于增加表达的此类启动子的合适的强启动子或方法从文献(例如S.Liser&H.Margalit，Nucleic Acid Research 1993，21，1507-1516；M.Patho和J.Nesvera inH.Yukawa and M Inui(eds.)，Corynebacterium gluticum，Microbiology Monograph 23，Springer Verlag Berlin Heidelberg 2013，51-88；B.J.Eikmanns，E.Kleinertz，W.Liebl，H.Sahm，Gene1991，102，93-98)中已知。例如，可通过就增加功能上连接至天然启动子的基因的表达而言在已知共有序列的方向上改变启动子序列来优化这些启动子(M.Pátek，B.J.Eigkmann，J.Pátek，H.Saham，Microbiology 1996，142，1297-1309；M.Pátek，J.Hollátko，T.Busche，J.Kalinowski，J.Needera，Microbial Biotechnology 2013，6，103-117)。
组成型启动子也适用于(过)表达，其中编码酶活性的基因在启动子例如葡萄糖依赖性deo启动子的控制下连续表达。化学诱导的启动子也是合适的，如tac、lac或trp。用于诱导启动子的最广泛的系统是大肠杆菌的lac操纵子。在此情况下，使用乳糖或异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂。此外，使用阿拉伯糖(例如pBAD系统)或鼠李糖(例如大肠杆菌KRX)的系统作为诱导剂是常见的。用于物理诱导的系统是例如基于来自Takara或Lambda PL的大肠杆菌cspA启动子的温度诱导的冷休克启动子系统以及渗透诱导型启动子例如osmB的(例如WO95/25785A1)。
合适的质粒或载体原则上是本领域技术人员出于此目的可用的所有实施方式。本领域的状态描述了可用于此目的的标准质粒，例如以pET-3a或pET-28a(+)(可商购自Novagen)为典型的载体pET系统。进一步的质粒和载体可例如从公司Novagen、Promega、NewEngland Biolabs、Clontech或Gibco BRL的手册中取得。进一步优选的质粒和载体可以在Glover，D.M.(1985)DNA cloning:a practical approach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.and Denhardt，D.T(eds)(1988)Vectors:asurvey of molecularcloning vectors and their uses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.(1990)Systems for heterologous gene expression，Methods Enzymol.185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloning:alaboratorymanual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中找到。
然后将含有待扩增的基因的质粒载体例如通过缀合或转化转变为期望的菌株。共轭方法例如由A.J.Kalinowski，A.Pühler，Applied and EnvironmentalMicrobiology1994，60，756-759描述。用于转化的方法例如在G.Thierbach，A.Schwarzer，A.Pühler，Applied Microbiology and Biotechnology 1988，29，356-362，L.K.Dunican&E.Shivnan，Bio/Technology 1989，7，1067-1070and A.Tauch，O.Kirchner，L.Wehmeier，J.Kalinowski，A.Pühler，FEMS Microbiology Letters 1994，123，343-347中描述。在通过“交叉(cross-over)”事件进行同源重组后，所得菌株含有至少两个有关基因的拷贝。
可通过以本领域技术人员已知的方式破坏含有期望的活性的细胞来分离期望的酶，例如借助于球磨机、法式压滤壶(French press)或超声波粉碎机，随后通过在13000rpm和4℃下离心10分钟来分离细胞、细胞碎片和破碎辅助物例如玻璃珠。然后可使用所得无细胞粗提取物进行产物的酶测定和随后的LC-ESI-MS检测。或者，酶可通过色谱方法(如镍-次氮基三乙酸亲合色谱法、链霉抗生物素亲和层析、凝胶过滤色谱或离子交换色谱)以本领域技术人员已知的方式富集，或纯化为同质。
核酸或多肽是否(过)表达可通过定量PCR反应(在核酸分子的情况下)、SDS聚丙烯酰胺电泳、蛋白质印迹或比较活性测定(在多肽的情况下)来确定。遗传修饰可涉及在选定和/或指定的培养条件下导致酶活性和/或选择性的改变的转录、翻译和/或翻译后修饰。
4.3.3定义
4.3.3.1“变体”
在本发明的上下文中，关于多肽序列的术语“变体”是指与参考序列的相同性程度为至少80％，更优选至少81％，更优选至少82％，更优选至少83％，更优选至少84％，更优选至少85％，更优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的多肽序列。在又进一步的特定实施方式中，相同性程度为至少98.0％，更优选至少98.2％，更优选至少98.4％，更优选至少98.6％，更优选至少98.8％，更优选至少99.0％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，或至少更优选至少99.9％。不言而喻，某些多肽序列的“变体”与多肽序列不相同。
此类变体可通过引入缺失、插入、取代或其组合(特别是氨基酸序列)，以及包含此类大分子或其变体的融合来制备。
对给定多肽序列的氨基酸残基的修饰对给定多肽的性质和功能没有显著改变是本领域技术人员已知的。由此例如许多氨基酸经常可以彼此交换而没有问题；此类合适的氨基酸取代的实例是：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；Ile至Leu或Val；Leu至Met或Val；Lys至Arg或Gln或Glu；Met至Leu或Ile；Phe至Met或Leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；Val至Ile或Leu。还已知修饰，特别是在例如以氨基酸插入或缺失形式在多肽的N-或C-末端进行的修饰经常不对多肽的功能施加显著影响。
与此一致，本发明的根据SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项的变体分别具有包含对于功能(例如蛋白质的催化活性或蛋白质的折叠或结构)必需的相应序列的氨基酸的多肽序列。其它氨基酸可被删除、被插入取代或替换，或者必需氨基酸以保守方式被替换为酶(特别是硫化氢解酶)的活性被保留的效果。
4.3.3.2“序列相同性”
本领域技术人员知晓多种计算机程序可用于计算两个核苷酸或氨基酸序列之间的相似性或相同性。
用于确定相同性的优选方法最初生成待比较序列之间的最大程度对齐。用于确定相同性的计算机程序包括但不限于GCG程序包，包括
-GAP[j.]Deveyy等，Nucleic Acid Research 1984,12，第387页，GeneticsComputer Group University of Wisconsin，Medicine(WI)]，和
-BLASTP、BLASTN和FASTA(S.Altschul等，Journal of Molecular Biology 1990，215，403-410)。BLAST程序可以从National Center for Biotechnology Information(NCBI)和从其它来源(BLAST Handbook，S.Altschul等，NCBI NLM NIH BeethesdaND22894；S.Altschul等，上方)获得。
例如，两个氨基酸序列之间的百分比相同性可以通过由S.B.Needleman和C.D.Wunsch，J.Mol.Biol.1970，48，443-453开发的算法确定，其已使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的间隙权重和1、2、3、4、5或6的长度整合到GCG软件包中的GAP程序中。本领域技术人员将认识到使用不同的参数将导致稍微不同的结果，但两个氨基酸序列之间的百分比相同性总体上不会显著不同。BLOSUM62矩阵通常用于应用默认设置(间隙权重：12，长度权重：1)。
在本发明的上下文中，根据上述算法的80％的序列相同性意味着80％的同源性。同样结论适用于更高的相同性。
最优选地，在本发明的上下文中，序列之间的相同性程度通过程序“Needle”使用置换矩阵BLOSUM62、10的缺口打开惩罚和0.5的缺口延伸惩罚来确定。Needle程序实现了S.B.Needleman和C.D.Wunsch，J.Mol.Biol.1970，48，443-453中描述的全局对齐算法。根据本发明使用的置换矩阵是BLOSUM62，间隙打开惩罚是10，并且间隙扩展惩罚是0.5。在本发明的上下文中使用的优选版本是由F.Madeira，Y.M.Park，J.Lee，N.Buso，T.Gur，N.Madhusoodanan，P.Basutkar，A.R.N.Tivey，S.C.Potter，R.D.Finn，Nucleic AcidsResearch 2019，47，W636–W641，Web Server issue呈现的(优选版本在2021年3月31日通过https://www.ebio.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/在线可访问)。
在一个特定实施方式中，通过以下确定多肽的氨基酸序列与参考多肽序列的相同性百分比：i)使用Needle程序以BLOSUM62置换矩阵、缺口打开惩罚10和缺口延伸惩罚0.5将两个氨基酸序列对齐；ii)将对齐中的精确匹配的数目进行计数；iii)将精确匹配的数目除以两个氨基酸序列中最长的长度，以及iv)将iii)的除法的结果转换成百分比。
4.3.3.3“鉴定特定活性变体的优选测定”
4.3.3.3.1测定A
在本发明的上下文中，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项的尤其优选的多肽变体可分别被本领域技术人员识别为在以下测定(“测定A”)中显示活性的那些。
测定A通过以下步骤进行：
A1)首先，通过以下步骤A1.1)、A1.2)和A1.3)如下确定待测试的变体的活性：
A1.1)制备含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM O-乙酰L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’-磷酸一水合物和1.0nmol待测试的多肽的反应溶液990μl并加热至50℃。
A1.2)通过加入10μl 200mM丁基-P-甲基次膦酸盐(MPBE，CAS#6172-80-1)溶液开始反应。反应溶液中MPBE的浓度为2mM。
A1.3)加入MPBE后，反应在50℃下进行120分钟。然后，通过添加10μl 1％甲酸盐溶液和在冰上冷却停止反应。
A2)然后通过以下步骤A2.1)、A2.2)和A2.3)如下进行空白测试：
A2.1)制备含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM O-乙酰L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’-磷酸一水合物的反应溶液990μl并加热至50℃。
A2.2)通过加入10μl 200mM丁基-P-甲基次膦酸盐(MPBE，CAS#6172-80-1)溶液开始反应。
A2.3)加入MPBE后，反应在50℃下进行120分钟。然后，通过添加10μl 1％甲酸盐溶液和在冰上冷却停止反应。
A3)最终，优选通过在项5.7下描述的LC-MS分析测定并比较分别在A1.3)和A2.3)的反应溶液中获得的L-GA的丁基-磷酸酯(即根据式(III)的化合物，R1＝正丁基)的量(以摩尔计)。
A4)如果针对A1.3)确定的L-GA的丁基-磷酸酯的量大于针对A2.3)确定的丁基-磷酸酯的量，则待测试的变体在测定A中显示活性。
如果针对A1.3)确定的L-GA的丁基-磷酸酯的量与针对A2.3)确定的丁基-磷酸酯的量相同或小于针对A2.3)确定的丁基-磷酸酯的量，则待测试的变体在测定A中不显示活性。
步骤A1.3)和A2.3)中优选的甲酸盐溶液是甲酸铵或甲酸钠溶液。或者，也可以通过加入甲醇(优选1ml甲醇)停止步骤A1.3)和A2.3)中的反应。
4.3.3.3.2测定B
在进一步的测定(“测定B”)中，可确定SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一种的多肽变体分别相对于所述多肽的活性。
测定B通过以下步骤进行：
B1)首先，“标准”多肽标准(即选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQID NO:8的一个多肽序列)的活性通过以下步骤B1.1)、B1.2)和B1.3)如下确定：
B1.1)制备含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM O-乙酰L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’-磷酸一水合物和1.0nmol待测试的“标准”多肽的反应溶液990μl并加热至50℃。
B1.2)通过加入10μl 200mM丁基-P-甲基次膦酸盐(MPBE，CAS#6172-80-1)溶液开始反应。反应溶液中MPBE的浓度为2mM。
B1.3)加入MPBE后，反应在50℃下进行120分钟。然后，通过添加10μl 1％甲酸盐溶液和在冰上冷却停止反应。
B2)然后，用变体重复步骤B1.1)、B1.2)和B1.3)：
B2.1)制备含有磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)、3mM O-乙酰L-高丝氨酸-HCl、10μM吡哆醛5’-磷酸单水合物和1.0nmol的待测试的“变体”多肽的反应溶液990μl并加热至50℃。
B2.2)通过加入10μl 200mM丁基-P-甲基次膦酸盐(MPBE，CAS#6172-80-1)溶液开始反应。反应溶液中MPBE的浓度为2mM。
B2.3)加入MPBE后，反应在50℃下进行120分钟。然后，通过添加10μl 1％甲酸盐溶液和在冰上冷却停止反应。
B3)最终，优选通过在项5.7下描述的LC-MS分析测定并比较在B1.3)和B2.3)的反应溶液中获得的L-GA的丁基-磷酸酯(即根据式(III)的化合物，R1＝正丁基)的量。
B4)然后，将B2.3)中获得的L-GA的丁基-磷酸酯的量(以摩尔计)除以B1.3)中获得的L-GA的丁基-磷酸酯的量(以摩尔计)得到比率。然后将该比率乘以因子100，给出变体多肽相对于“标准”多肽的相对活性的百分比。
步骤B1.3)和B2.3)中优选的甲酸盐溶液是甲酸铵或甲酸钠溶液。或者，也可以通过加入甲醇(优选1ml甲醇)停止步骤B1.3)和B2.3)中的反应。
4.3.3.4“优选变体”
4.3.3.4.1“SEQ ID NO:5的变体”
特别地，SEQ ID NO:5的变体是与多肽序列SEQ ID NO:5具有≥80％，更优选≥85％，更优选≥90％，更优选≥91％，更优选≥92％，更优选≥93％，更优选≥94％，更优选≥95％，更优选≥96％，更优选≥97％，更优选≥98％，更优选≥99％，更优选≥99.9％的序列相同性的多肽。
优选的SEQ ID NO:5的变体在项4.3.3.3.1下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，SEQ ID NO:5的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:5的活性的至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，SEQ ID NO:5的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:5的活性的1至1000％的范围内，优选地5至500％的范围内，更优选地10至400％的范围内，更优选地40至200％的范围内，更优选地50至150％的范围内，更优选地60至140％的范围内，更优选地70％至130％的范围内，更优选地80％至120％的范围内，更优选地90％至110％的范围内，更优选地100％。
4.3.3.4.2“SEQ ID NO:6的变体”
特别地，SEQ ID NO:6的变体是与多肽序列SEQ ID NO:6具有≥80％，更优选≥85％，更优选≥90％，更优选≥91％，更优选≥92％，更优选≥93％，更优选≥94％，更优选≥95％，更优选≥96％，更优选≥97％，更优选≥98％，更优选≥99％，更优选≥99.9％的序列相同性的多肽。
优选的SEQ ID NO:6的变体在项4.3.3.3.1下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，SEQ ID NO:6的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:6的活性的至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，SEQ ID NO:6的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:6的活性的1至1000％的范围内，优选地5至500％的范围内，更优选地10至400％的范围内，更优选地40至200％的范围内，更优选地50至150％的范围内，更优选地60至140％的范围内，更优选地70％至130％的范围内，更优选地80％至120％的范围内，更优选地90％至110％的范围内，更优选地100％。
4.3.3.4.3“SEQ ID NO:7的变体”
特别地，SEQ ID NO:7的变体是与多肽序列SEQ ID NO:7具有≥80％，更优选≥85％，更优选≥90％，更优选≥91％，更优选≥92％，更优选≥93％，更优选≥94％，更优选≥95％，更优选≥96％，更优选≥97％，更优选≥98％，更优选≥99％，更优选≥99.9％的序列相同性的多肽。
优选的SEQ ID NO:7的变体在项4.3.3.3.1下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，SEQ ID NO:7的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:7的活性的至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，SEQ ID NO:7的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:7的活性的1至1000％的范围内，优选地5至500％的范围内，更优选地10至400％的范围内，更优选地40至200％的范围内，更优选地50至150％的范围内，更优选地60至140％的范围内，更优选地70％至130％的范围内，更优选地80％至120％的范围内，更优选地90％至110％的范围内，更优选地100％。
4.3.3.4.4“SEQ ID NO:8的变体”
特别地，SEQ ID NO:8的变体是与多肽序列SEQ ID NO:8具有≥80％，更优选≥85％，更优选≥90％，更优选≥91％，更优选≥92％，更优选≥93％，更优选≥94％，更优选≥95％，更优选≥96％，更优选≥97％，更优选≥98％，更优选≥99％，更优选≥99.9％的序列相同性的多肽。
优选的SEQ ID NO:8的变体在项4.3.3.3.1下的测定A中显示活性。
甚至更优选地，SEQ ID NO:8的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:8的活性的至少1％，优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少99％。
甚至更优选地，SEQ ID NO:8的相应变体的活性为相对于在项4.3.3.3.2下的测定B中确定的SEQ ID NO:8的活性的1至1000％的范围内，优选地5至500％的范围内，更优选地10至400％的范围内，更优选地40至200％的范围内，更优选地50至150％的范围内，更优选地60至140％的范围内，更优选地70％至130％的范围内，更优选地80％至120％的范围内，更优选地90％至110％的范围内，更优选地100％。
4.4方法条件
根据本发明的方法的步骤a)中的反应可以在本领域技术人员已知的条件下进行。
活化的L-高丝氨酸HA与底物S反应的反应介质优选是水性的，更优选是水性缓冲液。
通常在生物转化反应中使用并且有利地在本文中使用的示例性缓冲剂包括Tris、磷酸盐或Good's缓冲剂中的任一种，如2-(N-吗啉代)乙磺酸(“MES”)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(“ADA”)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(“PIPES”)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(“ACES”)、P-羟基-4-吗啉丙磺酸(“MOPSO”)、氯化胺、3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(“BES”)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(“TES”)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(“HEPES”)、3-(双(2-羟乙基)氨基)-2-羟丙基-1-磺酸(“DIPSO”)、乙酰氨基甘氨酸、3-(N-三(羟甲基)甲基氨基(2-羟丙基)磺酸(“TAPSO”)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(“POPSO”)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)(“HEPPSO”)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(“HEPPS”)、tricine、甘氨酰胺、二甘氨酸或3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]丙基-1-磺酸(“TAPS”)。
在一些实施方式中，铵可以充当缓冲剂。也可以向反应中加入一种或多种有机溶剂。
优选地，根据本发明的方法的步骤a)在磷酸盐缓冲液中进行。
该方法的步骤a)中反应介质的pH优选为2-10，更优选为5-8，最优选为7.5。
根据本发明的方法优选在20℃-70℃，更优选30℃-55℃，最优选50℃的温度下进行。
4.5L-草铵膦磷酸酯
根据本发明的方法的产物是以下结构(III)的化合物：
根据结构(III)的化合物是L-草铵膦(R1＝H)或L-草铵膦磷酸酯(R1＝烷基、烯基、炔基、羟烷基或芳基)。
根据结构(III)的化合物(其中R1＝正丁基)缩写为“L-GA-Bu”或“LGA-Bu”。
本领域技术人员理解根据结构(III)的化合物中残基R1的身份(identity)取决于底物结构(I)中残基R1的身份。
如果R1为氢，根据本发明的方法直接得到L-草铵膦。
在优选的实施方式(其中R1选自烷基、烯基、炔基、羟基烷基、芳基，优选烷基，更优选甲基、乙基、正丁基)中，化合物(III)是L-草铵膦磷酸酯。
在这些实施方式中，进一步优选的是根据本发明的方法包含进一步的步骤b)，其中在步骤(a)中获得的结构(III)的化合物(并且其中R1选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，优选烷基，更优选甲基、乙基、正丁基)被皂化以得到L-草铵膦。
这可以通过本领域技术人员已知的方法进行。
优选地，这样的皂化在酸性条件下进行，更优选通过将1体积的含有结构(III)化合物(其在步骤(a)中获得)的反应介质和4体积的6N HCl混合2h，并在50℃至150℃的温度下(优选在100℃下)孵育所得混合物。
或者，可以进行酶促皂化。
实施例
测试了不同来源的编码硫化氢解酶(EC2.5.1.-和EC2.5.1.49)的基因的与活化的高丝氨酸衍生物和不同的根据结构(I)的底物反应以形成草铵膦衍生物的能力。
5.1合适的酶的鉴定和质粒的构建
5.1.1检查的酶
在表2中概述了在实施例中使用的编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶(“SHS”)或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(“AHS”)的基因的书目细节(Bibliographic details)(“AA”＝多肽)。
表2
5.1.2基因表达质粒的制备
5.1.2.1来源于生丝单胞菌属的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶MET17
来源于生丝单胞菌属的MET17基因编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶。编码的多肽序列可以在NCBI以NCBI参考序列WP_0116476511找到：
为实现酶的表达，使用表达载体pET-28a(+)(Novagen EMD Millipore)。因此，根据SEQ ID NO:9的MET17_Hy多核苷酸由Geneart(Thermo Fisher Scientific(Waltham，USA))合成。
为组装表达载体pET-28a(+)_MET17_Hy，载体pET-28a(+)和MET17_Hy多核苷酸都用NdeI和XhoI处理，连接，并且连接混合物用于转化大肠杆菌。
表达载体pET-28a(+)_MET17_Hy的DNA与转化体分离。
5.1.2.2来源于分枝杆菌属的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶MET43
来源于分枝杆菌属的MET43基因编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。编码的多肽序列可以在NCBI以NCBI参考序列MCB0926676.1找到。
为实现酶的表达，使用表达载体pET-28a(+)(Novagen EMD Millipore)。因此，根据SEQ ID NO:10的MET43_Ms多核苷酸由Geneart(Thermo Fisher Scientific(Waltham，USA))合成。
为组装表达载体pET-28a(+)_MET43_Ms，载体pET-28a(+)和MET43_Ms多核苷酸都用NdeI和XhoI处理，连接，并且连接混合物用于转化大肠杆菌。
表达载体pET-28a(+)_MET43_Ms的DNA与转化体分离。
5.1.2.3来源于嗜热假诺卡氏菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶MET46
来源于嗜热假诺卡氏菌的MET46基因编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。编码的多肽序列可以在NCBI以NCBI参考序列WP_073459782.1找到。
为实现酶的表达，使用表达载体pET-28a(+)(Novagen EMD Millipore)。因此，根据SEQ ID NO:11的MET46_Pt多核苷酸由Geneart(Thermo Fisher Scientific(Waltham，USA))合成。
为组装表达载体pET-28a(+)_MET46_Pt，载体pET-28a(+)和MET46_Pt多核苷酸都用NdeI和XhoI处理，连接，并且连接混合物用于转化大肠杆菌。
表达载体pET-28a(+)_MET46_Pt的DNA与转化体分离。
5.1.2.4来源于迷踪细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶MET52
来源于迷踪细菌的MET52基因编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。编码的多肽序列可以在NCBI以NCBI参考序列MBI4397379.1找到。
为实现酶的表达，使用表达载体pET-28a(+)(Novagen EMD Millipore)。因此，根据SEQ ID NO:12的MET52_Eb多核苷酸由Geneart(Thermo Fisher Scientific(Waltham，USA))合成。
为组装表达载体pET-28a(+)_MET52_Eb，载体pET-28a(+)和MET52_Eb多核苷酸都用NdeI和XhoI处理，连接，并且连接混合物用于转化大肠杆菌。
表达载体pET-28a(+)_MET52_Eb的DNA与转化体分离。
5.2O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的转化和表达
在大肠杆菌BL21(DE3)(New England Biolabs)中分别转化携带O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶基因的这些载体，其随后在37℃下在具有50mg/l卡那霉素的LB培养基琼脂平板上培养16h。携带没有任何插入物的载体pET-28a(+)的菌株BL21用作阴性对照。
得到的菌株分别命名为Ec BL21pET-28a(+)_MET17-Hy、Ec BL21pET-28a(+)_MET43-Ms、Ec BL21pET-28a(+)_MET46-Pt和Ec BL21pET-28a(+)_MET52-Eb。
在每种情况下已选择了菌落，其接种到10ml具有50mg/l卡那霉素的LB培养基中并在37℃、250rpm下培养6小时。50μl LB培养基随后用50mg/l卡那霉素处理并用50μl生长细胞培养物接种并在28℃、250rpm下孵育16h。用含有50μg/l卡那霉素的200ml新鲜LB培养基在2L烧瓶中将此细胞培养物稀释至OD为0.15，并在相同条件下进一步培养直至达到OD为0.5(circa 4h)。然后通过添加200μl 300mM IPTG原液(终浓度300μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，Sigma-Aldrich，Germany)来影响基因表达诱导的起始点。在28℃、250rpm下进行诱导4h。然后收获培养物(8ml标准化至OD＝1)，通过离心除去上清液(20分钟，4000rpm，4℃)，并用800μl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)洗涤沉淀的细胞两次，并在1ml缓冲液中取出。在FastPrep FP120仪器(QBiotene，Heidelberg)中进行机械细胞消化，其中用300mg玻璃珠在消化容器中以6.5m/s摇动细胞30s四次。然后将粗提取物在12000rpm、4℃下离心20分钟以除去未消化的细胞和细胞碎片。
使用HisPur Cobalt Resin(Thermo Fischer Scientific，Germany)纯化含有HisTag序列的所述蛋白。使用从Thermo Fischer Scientific可获得的标准程序进行纯化过程。新鲜纯化的蛋白质裂解物用于酶测定。裂解液中多肽的浓度由SDS PAGE测定，并通过软件(Biochem Lab Solutions)分析相应条带。
5.3发明实施例I1至I4
进行以下测定以确定相应的多肽是否催化相应的含磷光体的底物和活化的L-高丝氨酸的反应。O-乙酰L-高丝氨酸用作活化的L-高丝氨酸底物。
向含1nmol的待测试的多肽的880μl磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)中加入100μl的30mM O-乙酰高丝氨酸-HCl水溶液，10μl的1mM吡哆醛5’-磷酸一水合物水溶液(1mM)，和10μl 200mM丁基P-甲基次膦酸盐(CAS-No.6172-80-1；“MPBE”)水溶液。反应在50℃下进行120分钟。然后，将100μl分批溶液在100μl甲醇中稀释并应用在LC-MS QQQ(项5.7)上以分析LGA-Bu。
5.4发明实施例I5和I6
进行以下测定以确定根据SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的多肽是否催化P-甲基-次膦酸[“PMEA”；结构(I)与R1＝H]和活化的L-高丝氨酸的反应。O-乙酰L-高丝氨酸用作活化的L-高丝氨酸底物。
向含1nmol的此多肽的880μl磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.5)中加入100μl的30mM O-乙酰高丝氨酸-HCl水溶液，10μl的1mM吡哆醛5’-磷酸一水合物水溶液(1mM)，和10μl的200mM PMEA水溶液。反应在50℃下进行120分钟。然后，将100μl分批溶液在100μl甲醇中稀释并应用在LC-MS QQQ(项5.7)上以分析LGA-Bu。
结果概括在下表3中。所用缩写为
“MPBE”＝丁基P-甲基次膦酸盐(CAS-No.6172-80-1)；
“PMEA”＝P-甲基次膦酸(CAS-No.4206-94-4)。
表3
实例 酶 多肽 底物 产物
I1 MET17 SEQ ID NO:5 MTBE 是
I2 MET43 SEQ ID NO:6 MTBE 是
I3 MET46 SEQ ID NO:7 MTBE 是
I4 MET52 SEQ ID NO:8 MTBE 是
I5 MET17 SEQ ID NO:5 PMEA 是
I6 MET52 SEQ ID NO:8 PMEA 是
5.6结果
表3中概述的结果表明，所测试的多肽接受甲基次膦酸化合物，例如MPBE和PMEA作为底物，并催化它们与活化的L-高丝氨酸反应至相应的LGA的正丁基P-酯或游离的LGA。
此发现甚至更令人惊讶，因为本领域技术人员不期望这些酶催化这些反应，因为其它磷酸化合物如DEMP不作为底物起作用。
该发现为LGA及其衍生物开放了新的酶促途径。
5.7分析方法
已通过LC-MS QQQ系统上的扫描进行了实验的所有分析测量。将样品在甲醇中稀释(v:v＝1:2)。
应用的HPLC属于来自Agilent的1260Infinity系列，其连接到具有电喷射电离的质谱仪6420三重四极。通过阳性检测模式中的保留时间和分子质量进行峰值检测。
通过没有零的二次校准和峰面积进行数据评估。
获取方法细节
离子源ESI(电喷雾电离)
时间参数
质量范围 m/z＝50-300
每秒扫描 400
分段 40V
极性 正(扫描模式)
源参数
气体温度 350℃
气流 12升/分钟
喷雾器 50psi
毛细管 4000V
二元泵
注入体积2.00μL
流0.60mL/min
溶剂组合物
溶剂A H2O中的100mM乙酸铵+0.1％(v/v)甲酸
溶剂B乙腈中的0.1％甲酸
梯度见表4。
表4
时间(min) 溶剂A(％) 溶剂B(％)
0.5 5 95
1.2 45 55
4.0 45 55
4.1 95 5
7.0 95 5
7.1 5 95
10.0 5 95
柱
类型 Luna HILIC；100×2mm；3μm；Phenomenex 00D-4449-BO
温度 30.0℃
6.序列概述
下表提供了本申请上下文中提到的DNA和蛋白质序列的概述：

Claims (8)

1.一种用于生产L-草铵膦或其磷酸酯的酶促催化方法，包括步骤(a)，其中活化的L-高丝氨酸HA与以下结构(I)的底物S反应以产生以下结构(III)的化合物，
其中R1选自氢、烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，
并且其中所述活化的L-高丝氨酸HA具有以下结构(II)：
其中R2是具有1-15个碳原子的烃基，其任选地包含至少一个选自OH、COOH、NH的官能基团。
并且其中步骤(a)中的所述反应由硫化氢解酶E1酶促催化，
其中所述硫化氢解酶E1的多肽序列选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5的变体、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:6的变体、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:7的变体、SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:8的变体。
2.根据权利要求1的方法，其中所述活化的L-高丝氨酸HA选自O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸。
3.根据权利要求2的方法，其中所述活化的L-高丝氨酸HA是O-乙酰-L-高丝氨酸。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中R1选自氢、烷基。
5.根据权利要求4的方法，其中所述烷基基团选自甲基、乙基、正丁基。
6.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中R1选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、芳基，进一步包括步骤(b)，其中将在步骤(a)中获得的结构(III)的化合物皂化以得到L-草铵膦。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述活化的L-高丝氨酸HA通过对产生活化的L-高丝氨酸HA的菌株进行发酵来制备。
8.根据权利要求7的方法。其中产生活化的L-高丝氨酸HA的菌株选自埃希氏杆菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Provideia sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、短杆菌属(Brevibacteriumsp.)、生丝单胞菌属(Hypomononas sp.)、色杆菌属(Chromobacteriumsp.)和诺卡氏菌属(Norcardia sp.)、真菌。
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