CN119874937B - 一种重组i型单纯疱疹病毒疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组I型单纯疱疹病毒疫苗及其应用，属于疫苗技术领域。具体涉及到一种融合蛋白，由抗原分子gD1、人源免疫球蛋白抗体Fc结构域和人IgG1铰链区片段组成，其中，抗原分子gD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，并构建了一种重组疫苗。本发明所述重组疫苗融合了病毒抗原、免疫球蛋白重链Fc结构域和人IgG1铰链区片段，具有更优的与抗原提呈细胞表面的受体结合的能力，能够激活特异性CD4⁺T和CD8⁺T细胞，产生高滴度的抗体效价和特异性的细胞免疫，该疫苗可预防单纯疱疹I型病毒的感染和/或再感染。

Description

一种重组I型单纯疱疹病毒疫苗及其应用

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，尤其涉及一种重组I型单纯疱疹病毒疫苗及其应用。

背景技术

迄今为止，已经确证了8种与人类疾病相关的疱疹病毒，分别是：单纯疱疹病毒I型和II型(HSV-1和HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒6型、7型、8型。这8种疱疹病毒所引起的人类相关疾病在临床表现上各有不同，但是他们都具有一个共同的特点，那就是在对人体的初次感染后，每一种病毒都可能在体内维持很长时间，甚至是终生感染，这种长期感染常常以显性感染和潜伏感染的不同形式交替存在。

流行病学研究显示，全球估计有67％的人口存在HSV-1感染，初次感染后，HSV-1在感觉神经节中引起慢性感染，并可在黏膜和皮肤上再激活。感染通常无症状，但也可导致各种症状和体征。这些包括复发性口腔或口周病变(“冷疮”)、皮肤和黏膜病变(包括生殖器病变)、眼部感染(疱疹性角膜炎)以及严重的全身性疾病(脑炎和累及多个器官的新生儿疾病)。

HSV-1一旦感染便终身携带。大多数时候，感染者仅在急性发作时造成口唇疱疹和生殖器等部位的疱疹。HSV感染后病毒可潜伏在三叉神经节或腰骶神经节内，当机体出现免疫抑制、免疫缺陷，或遇到诱因如紫外线、发热、创伤和情绪紧张、细菌或其他病毒感染时，潜伏的HSV会被激活并大量复制，引起局部复发性疱疹。同时，潜伏在神经节内的病毒还可以通过神经逆向传输进入中枢神经系统。近十年来，越来越多的证据表明HSV对人类的影响可能并不只是疱疹那么简单，我们对HSV及其感染的认知还很有限，如过去认为多引起头面部感染的HSV-1，与HSV-2一样可以导致生殖器疱疹。一般来说HSV-1是口唇疱疹感染的主要病原体，HSV-2是生殖器疱疹感染的主要病原体。但是近年来流行病学数据显示，HSV-1感染生殖器官的病例逐渐增多，尤其在青春期和青年男女群体中，15～30岁年龄HSV-1感染率已超过了HSV-2，从病毒感染所引起的组织病理学改变的情况分析，HSV-1和HSV-2没有明显的区别，均表现为生殖器官局部的疱疹性溃疡，并伴有较为严重的疼痛。

HSV的生殖道感染已经成为全球感染率最高的性传播疾病之一。HSV感染会助长如人类免疫缺陷病毒HIV感染的风险，增加人乳头瘤病毒HPV等性传播病毒的传播，导致机体异常的免疫应答，进而发展成如宫颈癌等癌症。育龄期妇女感染HSV可导致生殖道损伤及功能紊乱，特别是孕妇感染HSV后可导致流产、早产、胎儿先天性发育异常和新生儿HSV脑炎等。除此以外，进入中枢神经系统的HSV会损害神经系统，不仅可引起单纯疱疹病毒性脑炎、贝尔面瘫、原发性三叉神经痛，而且与某些精神疾病和阿尔茨海默病的发生密切相关。这些新的流行病学数据改变了人们过去对HSV的认识，促使各个国家开始重视针对HSV感染情况的数据收集和开发新的疫苗设计策略。

HSV-1感染后可长期潜伏于神经系统。在机体应激状态或免疫低下时引起复发感染。现有的抗病毒药物，比如阿昔洛韦等，能有效控制感染症状，但是这些抗病毒药物极易导致基因突变，产生耐药性，另外药物不能预防疱疹病毒原发感染以及控制潜伏和复发感染。

HSV-1也是疱疹病毒性脑炎非常重要的病原体，有文献报道认为大约95％的疱疹病毒性脑炎的病原体均为HSV-1。而且它是散发性、致死性脑炎最常见的病原体。成人患者通常在发病前已具有抗HSV-1的特异性抗体，表明这是病毒再激活造成的感染。对于儿童，HSV-1多引起新生儿疱疹性脑炎，从临床表现上与其他疱疹病毒相似，表现为精神活动异常，突发性意识丧失，以及特定的神经系统体征，伴有发热，严重者导致神经系统后遗症，如小头、小脑症、多囊性脑软化症等。新生儿疱疹引起人们关注是在20世纪30年代，母体与胎儿和新生儿组织接触可造成母婴间垂直传播，HSV-1主要在子宫内传播，分娩过程中和出生后接触传播，结果可能导致死胎和新生儿疱疹。

从结构生物学角度看，疱疹病毒基本结构包括的特征有：由双链DNA基因组与DNA结合蛋白共同构成核心部分，呈球形，直径为75nm左右。核心外包裹有衣壳蛋白，有规律地由162个壳微粒组成一个二十面体的立体对称结构，直径为95～105nm，162个壳微粒中，有150个六聚体，12个五聚体，在核衣壳外面有一层球形蛋白组成的结构，称为皮层，皮层外是囊膜，囊膜上是多种糖蛋白，完整病毒直径120～300nm。

HSV-1DNA的长度为152260bp(17株，GenbankNo.X14112)，G+C含量68％，基因组由两个片段组成，即L片段和S片段，片段的两端均有重复序列。在基因组的严谨调控机制下遵循一个线性时间程序工作，线性时间过程可以分为三个阶段，分别是即刻早期、早期和晚期，对应的激活转录的基因分别为即刻早期基因(Immediately gene，IE)、早期基因(Earlygene，E)、晚期基因(Late gene，L)。它们之间按照严格的IE基因转录表达->产生IE基因产物->激活调控E基因转录表达->产生E基因产物->激活调控L基因产物的程序工作。

在疱疹病毒的囊膜上有多种膜蛋白，均是糖基化蛋白，主要有gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gL、gM、gN等。膜蛋白与宿主细胞膜上非特异性或特异性受体相互结合，使病毒进入细胞并完成其生物学功能。其中大约有5个膜蛋白和病毒进入细胞的过程直接相关，糖蛋白gB和gC所引起的作用是附着结合于细胞表面的硫酸肝素分子，在组织培养细胞上的研究结果提示gC对病毒感染不是绝对必需的，但是gC的存在能将病毒结合细胞的效率提高10倍。gB、gD、gH和gL对于病毒进入细胞这一步骤来说是必要的。但是在gL存在的情况下它们对病毒附着于细胞表面这一事件又不是必需的。因此，综合试验结果来看，gB、gD、gH和gL发挥的功能主要是引起病毒囊膜和细胞囊膜的融合，而其中能够与细胞的融合受体作用并启动融合过程的主要糖蛋白就是gD。

从HSV-1的人类宿主细胞角度看，于HSV-1进入相关的受体至少有三类，包括疱疹病毒进入的介导蛋白HVEM,一个肿瘤坏死因子受体家族成员；免疫球蛋白超家族成员nectin-1和nectin-2。上述受体都能够和gD1分子结合并诱导病毒进入细胞。在生物学实验的基础上，有关的研究进一步探讨HSV-1的gD1与相应受体结合的拓扑学机理。一些有关gD1和HVEM空间结构的分析对二者的立体构象进行了细致的解读，尤其是一些动态的分析表明，gD1在单独存在和与HVEM结合时所呈现的空间构象是有所差别的，而造成这种空间结构差异的热动力学原因是由gD1分子的氨基末端约32个氨基酸的序列决定的，这一段序列中7～15位氨基酸和24～32位氨基酸是gD1与HVEM结合的重要部位，同时也是控制nectin-2识别的部位，但是不影响nectin-1的识别，而在这段序列的下游，则是结合nectin-1和nectin-2的部位，从拓扑学上看，这段序列形成了一个发夹状结构。

进一步的抗原表位分析证明，在HSV-1gD1分子的结构中，有至少12个区域存在可能的CD4⁺T细胞表位，其长度约为27～34个氨基酸，这些表位所对应引起的CD4⁺T细胞反应，均具有保护意义，CD4⁺T细胞反应在抗HSV-1病毒感染中具有重要作用，决定了特异性体液免疫和特异性细胞反应的强度和范围。

有研究从不同角度证明了CD8⁺T细胞反应在HSV-1感染中的重要性，在一项HSV-1和HSV-2共感染的病人中的分析注意到，针对HSV-1的特异性CD8⁺T细胞的数量与生殖器官部位疱疹病变的严重程度呈现负相关。在HSV病变反复发作的部位，CD8⁺T细胞的浸润通常发生在CD4⁺T细胞的浸润之后，而且此类生殖器官疱疹病变的复发部位，CD8⁺T细胞呈现富集现象。这种CD8⁺T细胞的富集现象多和病毒在短时间内被从局部清除的可能性相联系。这些现象表明，疱疹病毒感染过程中所诱导的CD8⁺T细胞反应在机体控制，清除病毒方面具有重要意义。HSV-1感染引起的角膜损伤的相关研究表明，CD8⁺T和CD4⁺T在机体针对角膜损伤所形成的保护性反应中同等重要。进一步研究发现，当HSV-1从外周进入三叉神经的感觉神经元之后，也即进入了病毒的潜伏感染阶段，此时免疫病理学检测表明CD8⁺T在三叉神经周围大量存在，这一存在具有使病毒稳定于潜伏状态而不被激活的作用。相对应的三叉神经节细胞的组织培养感染HSV-1模型表明，在CD8⁺T细胞存在时，病毒可以表达某些即刻早期基因，但不能表达早期基因和晚期基因。若加入抗CD8⁺T细胞的特异性抗体，仅5天之后，病毒即可从潜伏的神经细胞中再激活，由此，上述存在于神经细胞周围的CD8⁺T可能是由神经细胞中处于潜伏感染状态的病毒所表达的IE蛋白所激活，而激活的CD8⁺T反过来对潜伏状态的病毒形成了有效的监视，一旦相关病毒在神经细胞中出现再激活，也就是病毒复制增殖现象，这些CD8⁺T细胞就可能以特异性CTL反应的形式，将受到感染的神经细胞破坏杀死。HSV-2也得到类似结果。因此，设计一款可诱导CD8⁺T细胞反应的疫苗是解决问题的关键。

现有的资料表明，人类疱疹病毒在感染人体的过程中，尽管可以形成潜伏性感染，在临床上形成慢性迁延型长期感染，很难从机体中彻底清除。但是机体对于这些病毒的感染，均能形成完整的免疫反应，而根据这些免疫反应的原理和基础，一些疫苗的尝试也被证明是具有可行性的，HSV-1疫苗是预防I型单纯疱疹病毒的最理想方法，但是至今还没有具有较强免疫效果的疫苗问世。

灭活病毒疫苗是最经典的技术路线，1992年有人尝试用福尔马林灭活HSV感染的兔脑等动物组织，然后提取全病毒制备疫苗。灭活病毒保留了全部的抗原分子，可以引起广泛的免疫反应，但是该类疫苗免疫原性不高，保护性不好。尝试其他灭活方法，如加热、化学处理、紫外照射等，均未取得好的结果。

HSV-1和VZV同属于α疱疹病毒，HSV-1减毒活疫苗路线参考水痘减毒活疫苗开展研究，研究者从临床样本分离HSV-1病毒，在人二倍体细胞和豚鼠胚胎成纤维细胞上连续传代得到了减毒株，如KOS-63，减毒株在兔模型中表现出明显的低神经毒性，但是仍可以潜伏于神经系统并导致复发感染，针对这一问题，对病毒基因组进行编辑，使得毒力减弱，建立潜伏感染和复发的能力降低，同时保持增殖能力和免疫原性，但是研究表明减毒株反复在细胞中传代，可能再次恢复毒性。

亚单位疫苗具有抗原组成相对简单，易于制备，耐受性好，安全性高，无潜伏感染的风险，但是亚单位疫苗对潜伏感染和复发感染的作用效果尚不明确。

复制受限疫苗路线备受关注，构建的gK基因缺失株诱导小鼠产生长效的T细胞反应，免疫后的小鼠在生殖道攻击实验中有效抑制疾病的发生，保护率高达90％。复制受限的毒株毒力较弱，不会在体内复制，能诱导有效的免疫保护，但是该类毒株必须在经过遗传改造的细胞中生长，细胞含有表达缺失的基因，制备方法直接局限了该类毒株的应用，遗传改造的细胞有一定的致癌风险，毒株在改造过的细胞中传代也有恢复毒力的风险。

活载体疫苗是将表达HSV-1相关抗原基因插入到能复制的病毒或细菌载体上，免疫接种后，病毒或细菌载体能表达相应的抗原蛋白，诱导机体产生相应的免疫反应。研究较多的是牛痘病毒、腺病毒、沙门氏菌等。也有研究将gD1蛋白基因克隆到噬菌体基因组中，gD1蛋白通过与噬菌体表面蛋白融合表达而展示在噬菌体表面，将重组的噬菌体颗粒免疫小鼠，gD1抗原被细胞提呈，诱导了特异性免疫应答。噬菌体作为载体安全性好，易于大规模生产，能诱导免疫应答，避免了HSV-1潜伏毒性等问题，但是噬菌体载体疫苗剂量和程序等诸多问题尚未研究清楚。

核酸疫苗也是研究热点之一，将抗原基因插入真核表达载体，直接接种，在体内表达抗原。有研究将HSV-1的gD1和人白细胞介素12基因一起构建到DNA上，并将DNA疫苗包裹在纳米颗粒中，通过角膜免疫小鼠产生了高水平的特异性中和抗体；眼泪中的分泌型IgA、血清中的IFN-γ和IL-4水平均明显升高；脾细胞和NK细胞的细胞毒效应均显著增强；野毒株攻击后，小鼠疱疹基质性角膜炎也明显减弱。

免疫复合物定义：一个免疫复合物分子最低组成是至少一个抗原与两个抗体分子结合在一起。感染期间形成的复合物既可以通过靶向抗原到提呈细胞的Fc受体放大免疫应答，又可以激活补体，或者从血液循环中螯合多量的抗原到肝脏或脾脏。Fc融合蛋白已经广泛用作抗体衍生物的骨架，比如抗体-药物偶联，抗体-细胞因子偶联，人体中显示出良好的药效和无不良反应。应用Fc融合技术开发疫苗有很多优势：1、使用proteinA/G亲和色谱很容易纯化抗原；2、Fc促进融合蛋白正确折叠和APC细胞结合，增加抗原的免疫原性；3、Fc融合蛋白能改善重组免疫原的溶解性和稳定性，延长半衰期。

然而，使用单独抗体或者抗体重链恒定区Fc结构域递送抗原至免疫细胞有一个主要的局限，由于是仅含1个Fc的单体，仅能结合高亲和力的FcγRI(CD64)，但是不能交联多个FcγRs或者结合低亲和力的FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，FcγRI主要在单核细胞和中性粒细胞上表达，以高亲和力与配体结合，结合单体IgG和免疫复合物。FcγRII可在每个带有FcγR的细胞上表达(NK细胞除外)，FcγRII以低亲和力与配体结合，FcγRII可促进免疫复合物的吞噬/内吞作用以及B细胞活化。FcγRIII在巨噬细胞、NK细胞、骨髓前体细胞和中性粒细胞系上表达，巨噬细胞上的FcγRIII表达受IFN-γ调控，可介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。FcγRIIA和FcγRIII对于增强免疫应答是非常重要的。经典的免疫复合物是机体内的抗原分子与众多的抗体分子结合而形成的，含有多个Fc结构域，能通过增加与所有FcγRs结合活性加强抗原摄取，这是因为多克隆抗体结合于同一抗原形成多聚体，众多的Fc与APC细胞表面的FcRs结合，诱导受体交联，促进复合物被APC细胞内吞，抗原进处理后提呈给T细胞。

单克隆抗体能部分复制这一过程，当抗体结合于完整微生物以及表面抗原密度足够高，允许FcγR形成交联。而常规亚单位疫苗中的可溶性抗原就不具备这一能力。类似地，Fc融合蛋白也不能形成多聚体复合物，因此做疫苗是不具备增强免疫效果作用的。尽管Fc融合蛋白具有很多优势，但采用基因工程的方法制备出含两个或多个Fc的类免疫复合物仍存在着不小的障碍，是免疫复合物疫苗研发难点。迄今为止，国际上尝试了很多方案，这些研究已经表明采用基因工程的方法表达抗原、抗体，然后组合形成免疫复合物也是一个非常有吸引力的免疫策略，当前最大的挑战是对免疫复合物的分子设计、进行有效的表达和纯化，以及能在符合GMP的条件下进行规模化生产的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒I型疫苗及其应用。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种融合蛋白，由4个抗原分子gD1、2个人免疫球蛋白抗体Fc结构域、2个人IgG1铰链区片段组成；

所述抗原分子gD1肽链C端分别与抗体Fc结构域肽链N端连接，与抗体Fc结构域连接的抗原分子gD1中一个肽链的N端串联1个人IgG1铰链区片段；2个人IgG1铰链区片段以链间二硫键形式连接；

所述抗原分子gD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述人IgG1铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；

所述序列SEQ ID NO.6和序列SEQ ID NO.21通过linker串联。

进一步的，所述linker序列长度为10-20aa，所述linker序列为包含甘氨酸、丝氨酸组合的氨基酸序列。

进一步的，所述linker序列如SEQ ID NO.22所示。

进一步的，所述人免疫球蛋白抗体Fc选自人IgG、IgM、IgD、IgA和IgE中的任意一种。

进一步的，所述人IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任意一种。

进一步的，当两条IgG1抗体Fc结构域肽链氨基酸序列相同时，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

当两条IgG1抗体Fc结构域肽链氨基酸序列不同时，其中一条Fc肽链含有两个突变点S354C和T366Y，所述序列如SEQ ID NO.8所示；另一条Fc肽链也含有两个突变点Y349C和Y407T，所述序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了融合蛋白在制备重组I型单纯疱疹病毒疫苗中的应用。

本发明还提供了一种重组I型单纯疱疹病毒疫苗，包含上述所述的融合蛋白。

进一步的，所述疫苗中还包括药学上可接受的氢氧化铝佐剂、角鲨烯、QS-21、寡核苷酸一种或多种免疫刺激物。

另外，本发明还提供了疫苗在制备预防和/或治疗I型单纯疱疹病毒感染的产品中的应用。

本发明是一种重组I型单纯疱疹病毒(HSV-1)疫苗，所采用的抗原是病毒蛋白，优选的是病毒外膜糖蛋白D(以下简称gD1)，所述的类免疫复合物设计是：两条gD1多肽链的C端分别与人免疫球蛋白的Fc连接，形成gD1-Fc融合蛋白，其中一条肽链的N端含有至少两个半胱氨酸以形成链间二硫键，该融合蛋白在哺乳类动物细胞表达后两条或四条Fc单链之间可以组装成二聚体或四聚体；其四聚体形式的gD1-Fc融合蛋白包含有四条gD1多肽链，两个Fc结构域。

为实现结构单元通过共价键连接，在其中一条链的N端融合一段含DKTHTCPPCPAPELLGGGSTSGSGKPGSGEG(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列，该序列内含有两个半胱氨酸残基，该段序列C端的14个氨基酸可以被含有甘氨酸、丝氨酸组合的序列替换。

所构建的含两个Fc的融合蛋白类似于机体内天然抗原与两个抗体分子形成的免疫复合物(类免疫复合物，不含抗体的Fab部分)，免疫后，在体内能够迅速和抗原呈递细胞表面的两个FcγRs结合，实现主动的抗原提呈，启动体液免疫和细胞免疫应答。

Fc结构域数量≥2，两个或两个以上Fc结构域在免疫细胞表面与受体结合，随后启动细胞内信号转导，和相应的抗原提呈和免疫应答。

异源二聚体gD1_kFc序列为SEQ ID No.2，gD1_hFc序列为SEQ ID No.3。同源二聚体gD1_Fc链序列为SEQ ID No.4，SS_gD1_Fc链序列为SEQ ID No.5。

所制备的高纯度抗原在5～200微克/剂的范围内经肌肉或皮下注射后，能够激活CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞，诱导机体的免疫系统产生相应的特异性抗体和细胞免疫，预防HSV-1引起的感染。

本发明设计了一种重组HSV-1单纯疱疹病毒疫苗，它是一种独特的类免疫复合物抗原分子，每个分子包含有4个病毒糖蛋白抗原分子gD1和2个人源IgG1Fc结构域，优选的Fc结构域的多肽链呈非对称组合，是一种杵臼(Knob into Hole)设计，易于形成异源二聚体，其中优选的，在其中一条肽链的N末端融合串联表达一段短肽序列DKTHTCPPCPAPELLGGGSTSGSGKPGSGEG(SEQ ID NO.1)，该序列可以形成两个链间二硫键，通过链间二硫键将两个免疫复合物分子偶联在一起，构建成一个含两个Fc的完整的疫苗抗原分子。

在本发明中，构成类免疫复合物的两条肽链N端抗原肽链均是来源于病毒的外膜蛋白，C末端是人免疫球蛋白的Fc片段，这两条肽链可以是相同的，也可以是不相同的，其中一条肽链的N末端含有上述可以形成链间二硫键的结构，另一条不含。也可以是来源于病毒皮层蛋白(tegument)，是本发明的主要抗原表位区，能够提供有效的免疫刺激物，可以是病毒结构蛋白，也可以是病毒非结构蛋白，本发明优选HSV-1的外膜糖蛋白gD1为例进行论述，当然其他有效的HSV-1抗原也包含在本发明之内。

在本发明设计中，所构建的免疫复合物分子是在病毒抗原肽链的C末端连接人抗体恒定区结构域Fc。在Fc种类的选择上，可以是来源于人IgG、IgM、IgD、IgA和IgE中的任意一种，优选的是IgG。根据抗原提呈需求，IgG抗体亚型也在可优化选择的范围之内，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，不同的亚型具有不同的Fc受体结合倾向性，本发明优选IgG1的Fc作为实施例进行技术说明。Fc结构域的功能是与免疫细胞受体结合，完成特定路径的抗原提呈，因此，截取IgG1的Fc恒定区一部分用于本发明，可以满足设计需求，优选的是选用人IgG1抗体的铰链区、CH2、CH3区的氨基酸序列，通过铰链区的两个半胱氨酸形成链间二硫键，即形成二聚体，这样的恒定区是成对出现的，本发明称之为Fc结构域。Fc结构域优选天然序列，保留完整的与FcRs受体结合的活性，当然也可以选择非天然的Fc序列，但是保留FcRs结合活性至关重要，同时也保留与补体系统激活活性相应的氨基酸序列。

在本发明设计中，Fc结构域也可以采用对称设计，即不采用KiH设计，也可以实现本发明所设计的分子结构。具体是将含有序列SEQ ID No.1的SEQ IDNo.5肽链和不含有SEQID No.1的肽链SEQ ID No.4构建到同一表达载体上，转入CHO细胞，两个肽链在各自的启动子的作用下共表达，可以获得抗原gD1二聚体，同时也包含双Fc结构域的双免疫复合物分子，根据测试结果，也符合本发明设计标准。但是理论上KiH方案错配率更低，收获率更高。

总之，本发明所设计的分子具有双Fc结构域，与APC提呈细胞表面受体结合，促使gD1抗原分子被提呈细胞吞噬，可以激活CD4⁺T、CD8⁺T以及产生中和抗体。Fc数量≥2，快速提呈抗原，激活相应信号通路，产生保护性免疫。试验表明更多表现为MHC I交叉提呈，激活CD8⁺T细胞，根据前面论述可以知道激活CD8⁺T是疱疹疫苗发挥作用的至关重要的要素，当然同时也激活CD4⁺T和B细胞免疫应答。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的含有两个Fc的病原微生物抗原融合蛋白，可以定向提呈抗原，激活机体的体液免疫和细胞免疫，预防HSV-1感染和/或预防再感染发病；该融合蛋白可以用哺乳类动物细胞表达，抗原分子自组装成类免疫复合物的融合蛋白，经纯化后制成供人用或动物使用的疫苗。

附图说明

图1为抗原N端短肽序列形成的链间二硫键示意图；

图2为LZ920类免疫复合物分子结构示意图；

图3为LZ921类免疫复合物分子结构示意图；

图4为实施例3中LZ920疫苗抗原SDS-PAGE还原型电泳图；

图5为实施例3中LZ921疫苗抗原SDS-PAGE还原型电泳图；

图6为实施例4中LZ920疫苗原液SEC-HPLC纯度检定图；

图7为实施例4中LZ921疫苗原液SEC-HPLC纯度检定图；

图8为实施例5中小鼠免疫后血清抗体效价检测结果图；

图9为实施例8中CD4⁺T特异性免疫应答结果图；

图10为实施例8中CD8⁺T特异性免疫应答结果图；

具体实施方式

为对本发明进行更好的说明，特列举实施例如下。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖非排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面以HSV-1的gD1为例对本发明的实施进行说明。

本发明所涉及的氨基酸序列如下表1：

表1本发明涉及的氨基酸序列和引物序列

实施例1：基因序列设计

SS序列SEQ ID No.1：DKTHTCPPCPAPELLGGGSTSGSGKPGSGEG(31aa)含有两个半胱氨酸残基，该序列截取自人IgG1铰链区17个氨基酸DKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO.21)，C端添加了14个氨基酸Linker:GSTSGSGKPGSGEG(SEQ ID NO.22)，表达后能够形成链间二硫键，如图1所示。

gD1_kFc序列SEQ ID No.2是Knob链，由糖蛋白序列gD1 SEQ ID No.6和序列kFcSEQ ID No.8链连接而成，野生型gD1(KOS标准株)全长394个氨基酸，形成gB-gH/gL-gD复合物，与细胞受体HVEM，NECTIN-1或硫酸乙酰肝素结合，触发细胞膜融合。野生型gD1氨基酸序列的1～25氨基酸是信号肽，26～340氨基酸位于病毒粒子表面，341～361氨基酸是α螺旋结构构成穿膜区，362～394氨基酸处于病毒粒子内部。gD1与糖蛋白gB和gH/gL相互作用触发膜融合的功能区位于26～340氨基酸之内，该区域含有病毒感染的关键抗原决定簇序列，参考本领域内其他研发团队的技术方案，从第26个氨基酸残基开始，截取其中307个氨基酸作为本发明的疫苗候选抗原序列。该序列含有3对链内二硫键，91<->214，131<->227和143<->152。三个N糖基化位点，第119，146和287位氨基酸残基。

与gD1糖蛋白氨基酸C末端连接的kFc肽链是Knob链，该序列截取自人IgG1重链恒定区，包含铰链区、CH2和CH3区，其中野生型CH1区与轻链连接的半胱氨酸被去除，以减少二硫键错配几率。另外突变CH3区的两个氨基酸S354C和T366Y，T366Y突变的氨基酸具有更大的侧链，形成类似“Knob”样突出结构，辅助kFc正确配对。

SS_gD1_hFc序列SEQ ID No.3是Hole链，由三部分组成，从N端开始分别是序列SSSEQ ID No.1、序列gD1 SEQ ID No.6和序列hFc SEQ ID No.9。其中hFc是Hole链，含有两个突变点：Y349C和Y407T，Y407T突变是将大的氨基酸侧链酪氨酸(Y)变为苏氨酸(T)小的侧链，形成类似“Hole”样凹陷结构，与Knob链配合，辅助hFc正确配对。

KiH设计是一类经典的技术路线，常常用于双特异性抗体设计中，减少错配几率。本发明采用的KiH突变方案是为了更好的描述本发明而提供的技术方法，通过该方法可以获得所需的疫苗抗原结构，其他Fc突变方案也可以达到本发明的提高收率，减少错配的目标，也在本发明保护范围之内。

有趣的是，当我们不采用KiH设计时，而采用序列gD1_Fc SEQ ID No.4和序列SS_gD1_Fc SEQ ID No.5设计时，SEQ ID No.5的N端短肽SS SEQ ID No.1也能够实现链间二硫键，同样可以得到正确配对的抗原。两种策略都在本发明保护范围之内，不同的Fc突变对于抗原分子与细胞受体结合活性有不同的影响，两种策略在收率与药效方面需要平衡取舍。分子设计结构示意图详见图2和图3。

实施例2：构建克隆质粒

将氨基酸序列转换为核苷酸序列，优化基因密码子，委托南京金斯瑞生物科技公司合成序列gD1 SEQ ID No.6、序列SS_gD1 SEQ ID No.7、序列kFc SEQ IDNo.8、序列hFcSEQ ID No.9和序列Fc SEQ ID No.10，并装载到克隆质粒上(质粒选择GS Xceed系统中常用质粒即可)。委托华大基因合成引物SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQID No.20，具体序列如上表1。

构建SEQ ID No.2表达载体Ek2：以含SEQ ID No.6的质粒为模板，引物SEQ IDNo.12和SEQ ID No.18PCR扩增目的基因片段kP1，以含SEQ ID No.8的质粒为模板，引物SEQID No.17和SEQ ID No.16PCR扩增目的基因片段kP2，扩增条件是98℃10s，55℃5s，72℃7s35个循环，72℃延伸10min。

采用重叠延伸PCR技术将上述两种产物进行连接。通过采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。将PCR产物kP1和kP2各15μl混合，加入15μl PrimeSTAR Polymerase聚合酶以及15μl注射用水，再次PCR，反应条件是：98℃10s，55℃5s，72℃15s 10个循环，72℃延伸10min。拼接好的产物为kP3。

将表达载体质粒转化DH5α并筛选阳性克隆，随机挑取单菌落扩大培养，采用商业化试剂盒提取质粒，限制性内切酶(HindIII/EcoRI)双酶切质粒，回收载体片段。将PCR法制备的KP3目的基因片段与经双酶切(HindIII/EcoRI)的载体片段混合，加入Exnase II同源重组酶以及缓冲液，在基因扩增仪中37℃反应30min，立即冰水浴，再与同样经过冰水浴融化的DH5α感受态混匀，42℃热激90s，补加适量LB培养基37℃孵育45min，涂布抗性平板，筛选阳性克隆。

构建SEQ ID No.3表达载体Eh3：以含SEQ ID No.7的质粒为模板，引物SEQ IDNo.11和SEQ ID No.20PCR扩增目的基因片段hP1，以含SEQ ID No.9的质粒为模板，引物SEQID No.19和SEQ ID No.16PCR扩增目的基因片段hP2，扩增条件是98℃10s，55℃5s，72℃7s35个循环，72℃延伸10min。

采用重叠延伸PCR技术将上述两种产物进行连接。将PCR产物hP1和hP2各15μl混合，加入15μl PrimeSTAR Polymerase聚合酶以及15μl注射用水，再次PCR，反应条件是：98℃10s，55℃5s，72℃15s 10个循环，72℃延伸10min。拼接好的产物为hP3。

将表达载体质粒转化DH5α并筛选阳性克隆，随机挑取单菌落扩大培养，采用商业化试剂盒提取质粒，限制性内切酶(HindIII/EcoRI)双酶切质粒，回收载体片段。将PCR法制备的hP3目的基因片段与经双酶切(HindIII/EcoRI)的载体片段混合，加入Exnase II同源重组酶以及缓冲液，在基因扩增仪中37℃反应30min，立即冰水浴，再与同样经过冰水浴融化的DH5α感受态混匀，42℃热激90s，补加适量LB培养基37℃孵育45min，涂布抗性平板，筛选阳性克隆。

构建SEQ ID No.4表达载体EL4：以含SEQ ID No.6的质粒为模板，引物SEQ IDNo.11和SEQ ID No.13PCR扩增目的基因片段L1，以含SEQ ID No.10的质粒为模板，引物SEQID No.14和SEQ ID No.15PCR扩增目的基因片段L2，扩增条件是98℃10s，55℃5s，72℃7s35个循环，72℃延伸10min。

采用重叠延伸PCR技术将上述两种产物进行连接。将PCR产物L1和L2各15μl混合，加入15μl PrimeSTAR Polymerase聚合酶以及15μl注射用水，再次PCR，反应条件是：98℃10s，55℃5s，72℃15s 10个循环，72℃延伸10min。拼接好的产物为L3。

将表达载体质粒转化DH5α并筛选阳性克隆，随机挑取单菌落扩大培养，采用商业化试剂盒提取质粒，限制性内切酶(HindIII/EcoRI)双酶切质粒，回收载体片段。将PCR法制备的L3目的基因片段与经双酶切(HindIII/EcoRI)的载体片段混合，加入Exnase II同源重组酶以及缓冲液，在基因扩增仪中37℃反应30min，立即冰水浴，再与同样经过冰水浴融化的DH5α感受态混匀，42℃热激90s，补加适量LB培养基37℃孵育45min，涂布抗性平板，筛选阳性克隆。

构建SEQ ID No.5表达载体ES5：以含SEQ ID No.7的质粒为模板，引物SEQ IDNo.12和SEQ ID No.13PCR扩增目的基因片段H1，以含SEQ ID No.10的质粒为模板，引物SEQID No.14和SEQ ID No.15PCR扩增目的基因片段H2，扩增条件是98℃10s，55℃5s，72℃7s35个循环，72℃延伸10min。

采用重叠延伸PCR技术将上述两种产物进行连接。将PCR产物H1和H2各15μl混合，加入15μl PrimeSTAR Polymerase聚合酶以及15μl注射用水，再次PCR，反应条件是：98℃10s，55℃5s，72℃15s 10个循环，72℃延伸10min。拼接好的产物为H3。

将表达载体质粒转化DH5α并筛选阳性克隆，随机挑取单菌落扩大培养，采用商业化试剂盒提取质粒，限制性内切酶(HindIII/EcoRI)双酶切质粒，回收载体片段。将PCR法制备的H3目的基因片段与经双酶切(HindIII/EcoRI)的载体片段混合，加入Exnase II同源重组酶以及缓冲液，在基因扩增仪中37℃反应30min，立即冰水浴，再与同样经过冰水浴融化的DH5α感受态混匀，42℃热激90s，补加适量LB培养基37℃孵育45min，涂布抗性平板，筛选阳性克隆。

将上述阳性克隆扩增，大量制备质粒Ek2、Eh3、EL4和ES5，双酶切(PvuI/NotI)，切胶回收表达线性化的载体Ek2_P/N、Eh3_P/N、EL4_P/N和ES5_P/N。

以Ek2_P/N和Eh3_P/N为一组混合，加入DNA连接酶以及反应缓冲液，2～8℃反应过夜，再将连接产物转化DH5α感受态细胞，制备双表达质粒。使用商业化试剂盒大量提取质粒，并用限制性内切酶PvuI进行酶切，使双表达载体线性化，由此构建完成了异源二聚体表达基因盒的构建，编号921。

以EL4_P/N和ES5_P/N为一组混合，加入DNA连接酶以及反应缓冲液，2～8℃反应过夜，再将连接产物转化DH5α感受态细胞，制备双表达质粒。使用商业化试剂盒大量提取质粒，并用限制性内切酶PvuI进行酶切，使双表达载体线性化，构建成同源二聚体表达基因盒，编号920。

实施例3构建高表达工程细胞株

稳定克隆株的建立和筛选：制备CHO K1细胞悬液0.8ml(1.5×10⁶cells/ml)，依次加入线性化质粒20μg和转染试剂，设定基因脉冲发生器Gene Pulser Xcell(Bio-Rad)的穿孔电压为300V电压、900μF单脉冲、电阻无穷大，间隙为4mm的一次性电击杯(Bio-Rad)，电击时间12～20ms，将电击杯内的细胞转移至培养瓶内，加入30ml CHO培养液，于37℃、5％CO₂摇床上培养，136转/min，培养24hr之后，800rpm低速离心收集细胞，更换为含50μM MSX的CHO培养液(不含谷氨酰胺)，进行加压筛选，通过有限稀释法将细胞转入96孔平底培养板内，将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，倒置显微镜下观察，标记单克隆细胞孔，之后通过ELISA的方法，依次筛选24孔和6孔细胞培养板中的阳性细胞，筛选出表达量较高的单克隆株，连续传代培养，检测，最终获得高表达目的基因的细胞克隆株。

将由线性化质粒920转染CHO K1获得的阳性细胞株，收集培养物上清，用亲和层析色谱进行抗原捕获纯化，SDS-PAGE电泳进行鉴别检定，结果见图4，将符合标准的细胞株命名为LZ920株；将由线性化质粒921转染CHO K1获得的阳性细胞株，收集培养物上清，用亲和层析色谱进行抗原捕获纯化，SDS-PAGE电泳进行鉴别检定，结果见图5，将符合标准的细胞株命名为LZ921株。

实施例4：工程细胞的发酵和疫苗抗原纯化

将细胞株扩大培养后接种到含500ml CHO细胞培养液的2L三角瓶内，于37℃、5％CO₂摇床上培养，130～140转/min，培养4～5天之后，转种生物反应器培养。反应器培养条件：反应器初始接种密度：50万～100万细胞/ml，培养温度37℃，pH6.5～7.5，溶氧50％±20％，搅拌转数50～120转/min，培养期间采用间歇补料方式进行补料(补料如：糖、培养基或碱液等)，每天取样检查细胞数和细胞活性，一般培养12～14天，当活细胞占比降至85％以下时，停止发酵培养，收获发酵液。

将收获的发酵液10000r/min离心30min去除细胞碎片等大的不溶性颗粒物或使用深层滤器去除细胞及细胞碎片，收集细胞培养物上清。之后用0.45μm的澄清滤器过滤培养物上清，过滤后的中间品可以2～8℃保存，也可以直接进入下一纯化工序。

上述经过过滤处理的收获液可以直接上样到protein A亲和色谱凝胶柱(ProteinAt Bead LX、Mabselect Sure LX等)纯化，亲和色谱柱用20mM PBS(pH7.4，含135mM NaCl)缓冲液平衡，上样后用20mM PBS缓冲液流洗至紫外检测仪显示值回到基线附近；之后用0.1mol/L柠檬酸(pH3.5)进行解离，根据A280吸光值收集洗脱峰，亲和层析后蛋白纯度达到90％以上。将亲和层析液室温孵育60min，进行病毒灭活处理，然后加入适量2MTris溶液，中和至pH值7.2～7.6为止。

将上述经中和后的亲和层析溶液直接上样到装填好的Sephacryl S-400HR(或Sepharose 4Fast Flow、或Sephadex 200PG)凝胶色谱柱，上样体积不超过柱床体积的2％。使用40mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4，含150mM NaCl)作为流动相，紫外检测器A280吸光值上升时，分段收集层析柱流出液，直到吸光值下降到接近基线水平时停止收样，合并纯度达到95％以上的收集液。

将上述纯化后的液体用纯化水稀释到原体积的4倍，上样到已经平衡好的DEAESepharose 4Fast Flow色谱柱上，上样完成后用平衡缓冲液继续流洗3个柱体积，然后用含适宜氯化钠浓度的液体洗脱，收集洗脱液。

将上述洗脱液用连接有深层滤器的20nm孔径的除病毒滤器过滤，然后用0.2μm的除菌滤膜过滤，即为疫苗原液，分别命名为LZ920抗原蛋白原液和LZ921抗原蛋白原液，取样进行SEC-HPLC纯度检定，检测图谱详见图6和图7，结果表明HPLC纯度均达到了94％以上，符合设计标准，满足后续药效评价需要。

实施例5：小鼠巨噬细胞吞噬试验

巨噬细胞的分离培养：随机选取BALB/c小鼠，腹腔注射不含胎牛血清的1640培养液5ml，轻柔腹部2-3min，静置5min，用无菌注射器抽取腹腔液，1000r/min离心5min，用1640培养液洗涤细胞2次，再用含10％胎牛血清的1640培养液重悬巨噬细胞。接种于96孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养12hr，后更换培养液。

将FITC标记的LZ920抗原蛋白、LZ921抗原蛋白、LZ901蛋白(含2个Fc的VZV gE-Fc融合蛋白，阳性对照)和IgG(阴性对照)用1640培养液进行稀释至浓度为10μg/100μl。将稀释好的LZ920-FITC、LZ921-FITC、LZ901-FITC和IgG-FITC加入到接种巨噬细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μl。将96孔细胞培养板放入37℃、5％CO₂培养箱中，孵育2hr，用20mM的PBS清洗2次，加入100μl RBITC标记的CD68多克隆抗体(100倍稀释)，该抗体可以与巨噬细胞特异性结合显红色荧光，37℃、5％CO₂培养箱中孵育1hr后，用20mM的PBS清洗2次，将96孔细胞培养板放在荧光显微镜下拍照并记录。巨噬细胞吞噬FITC标记LZ920、LZ921抗原蛋白原液检定结果见图8。

结果显示，在巨噬细胞中加入LZ920-FITC，LZ921-FITC后，LZ920和LZ921抗原蛋白可以被巨噬细胞吞噬，产生明显的绿色荧光。而加入IgG-FITC的对照组，未产生明显的荧光，说明其并未被巨噬细胞吞噬。

实验结果证明，LZ920和LZ921蛋白原液，其中的两个Fc片段可以与巨噬细胞表面Fc受体结合，激活巨噬细胞启动吞噬作用，进一步发挥巨噬细胞抗原提呈的作用，启动特异性免疫应答。

实施例6：小鼠免疫实验

用氢氧化铝佐剂稀释疫苗原液，分别配制成含LZ920和LZ921抗原20μg/0.5ml、10μg/0.5ml、5μg/0.5ml、2μg/0.5ml、1μg/0.5ml、0.5μg/0.5ml的疫苗。将4～7周龄的雌性BLAB/c小鼠随机分成14组，每组5只，对照组每只小鼠腹腔注射铝佐剂0.5ml。

LZ920抗原6个实验组分别腹腔注射0.5ml抗原含量分别为20μg、10μg、5μg、2μg、1μg、0.5μg，初次免疫后间隔3周再次免疫，共免疫2次，第2次免疫前尾静脉采集血液，分离血清后冻存于-20℃以下，第2次免疫后14天眼眶后静脉采血，分离血清后冻存于-20℃以下。

LZ921抗原6个实验组与LZ920实验组相同操作，第2次免疫后间隔3周进行第3次免疫，共免疫3次，第2次及第3次免疫前尾静脉采集血液，分离血清后冻存于-20℃以下，第3次免疫后14天眼眶后静脉采血，分离血清后冻存于-20℃以下，并取脾脏分离淋巴细胞。详细分组见表2。

表2LZ920和LZ921小鼠免疫分组以及免疫程序

实施例7：血清抗体效价测定(ELISA)

用碳酸盐缓冲液将重组HSV gD1-His蛋白稀释到0.2μg/ml，包被96孔酶标板，每孔100μl，37℃放置2hr后，2～8℃放置过夜；弃掉96孔板内的液体，用洗液20mM PBS-T洗3次，之后每孔加入200μl封闭液(2％牛血清白蛋白洗液)，37℃封闭60min；吸出孔内的封闭液，用20mM PBS-T洗液洗涤3遍，将经过1:100(或1:1000)预稀释的小鼠血清加入到96孔板的第一列孔内，之后进行2倍系列倍比稀释，阴性对照为仅使用铝佐剂腹腔免疫的小鼠血清(1:100)，37℃反应60min后，吸出孔内的封闭液，用20mM PBS-T溶液洗涤3遍，加入1:100倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP结合物，每孔100μl，37℃反应60min；吸出孔内液体，用20mM PBS-T溶液洗涤3遍，每孔加入TMB显色液100μl，10min后加入50μl终止液终止反应，之后用TECANInfinit200酶标仪测定各孔的A450吸光值。以阴性对照(氢氧化铝佐剂小鼠血清)吸光均值(如吸光值小于0.1，按0.1计算)的3倍作为Cutoff值，小鼠免疫血清的吸光均值高于Cutoff值时对应的最大稀释度即小鼠免疫血清抗体效价。

LZ920实验组小鼠的血清中抗HSV gD抗体滴度的几何平均值及标准差见表3，除20μg/0.5ml/只剂量组1免后有1只小鼠未阳转外，其他各剂量组BALB/c小鼠血清阳转率均为100％，2免后，所有小鼠均阳转。各实验组动物测定的抗体效价进行统计分析显示，1免后各剂量组的抗体效价基本一致：范围在1131～2111之间，在第2次免疫后，除10μg/0.5ml/只剂量组表现出小鼠个体差异外，其他所有小鼠血清抗体效价均在128000～512000之间，说明LZ920二次免疫BALB/c小鼠3周后所得血清抗体效价明显升高，并且已达到稳定的水平，各组小鼠血清抗体效价无明显差异。LZ920免疫BALB/c小鼠0.5μg/0.5ml/只剂量组，与其他免疫剂量相比小鼠血清抗体效价无明显差异，说明0.5μg/0.5ml/只剂量组已经较强的免疫原性。

表3LZ920实验组BALB/c小鼠血清抗体效价检测结果(ELISA)

LZ921实验组小鼠的血清中抗HSV gD抗体滴度的几何平均值及标准差见表4，除2μg/0.5ml/只、0.5μg/0.5ml/只剂量组1免后阳转率分别为80％、60％外，其他各剂量组BALB/c小鼠血清阳转率均为100％，2免及3免后，各剂量组BALB/c小鼠血清阳转率均为100％。各实验组动物测定的抗体效价进行统计分析显示，1免后各剂量组的抗体效价基本一致，范围在528～2425之间，在第2次免疫后，各剂量组的抗体效价进一步提高并且达到相对稳定的水平，各组小鼠血清抗体效价基本上无明显差异，范围在97006～256000之间。在第3次免疫后，各剂量组的抗体效价相比二次免疫后又有明显提高，各组小鼠血清抗体效价无明显差异，范围在844485～1688970之间。综上所述，LZ921免疫BALB/c小鼠0.5μg/0.5ml/只剂量组，与其他免疫剂量相比小鼠血清抗体效价基本上无明显差异，说明0.5μg/0.5ml/只剂量组已经较强的免疫原性。

表4LZ921实验组BALB/c小鼠免疫后血清抗体效价检测结果(ELISA)

实施例8：CD4⁺T和CD8⁺T细胞应答检测

LZ921实验组小鼠脾脏淋巴细胞提取：断颈处死小鼠，浸泡于75％的乙醇中。在超净台中取出小鼠脾脏。在研磨器中加入4ml-5ml小鼠淋巴细胞分离液(取用前恢复至室温并摇匀)，研磨后，把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15ml离心管中，覆盖1000μl的RPMI1640培养基(保持液面分界明显)。室温，2500rpm离心30min。设置较慢的加速度和减速度，离心结束后细胞分层，吸出淋巴细胞层，再加入10ml RPMI1640培养基，颠倒洗涤。室温，1500rpm离心10min收集细胞，重悬后计数。

细胞因子检测：取定量重悬后的各小鼠血淋巴细胞(4.0×10⁶cells/ml)，加入24孔细胞板内，500μl/孔。每份淋巴细胞分别加两孔：其中一孔加入细胞培养液，500μl/孔，作为未刺激对照；另一孔加入稀释后的gD-His蛋白溶液，500μl/孔，作为特异性抗原刺激后样本，每孔最终细胞数为2.0×10⁶。取定量的淋巴细胞500μl，加至24孔细胞培养板中相应位置，再加入细胞培养液500μl，作为实验的空白对照。取定量的人外周血淋巴细胞500μl，加至24孔细胞培养板中相应位置，再加入细胞培养液500μl，作为实验的单阳对照和荧光减一对照。将24孔细胞培养板放入37.0℃、5.0％CO₂培养箱，培养24hr。

取样：取出24孔板内细胞悬液于离心管内。将离心管置于台式离心机中，3500转离心3min，弃上清液，轻弹管底至细胞成松散状。

阻断Fc受体：用特异性针对Fc受体的抗体(BD Fc Block)封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。BD Fc Block稀释50倍，100μl/孔，4℃孵育15min。随后用StainingBuffer清洗细胞2次。

细胞表面染色：CD3、CD4、CD8分别取4μl、1μl和2μl至39μl Stain Buffer溶液中，加至样品组，50μl/孔。单阳对照组分别加入50μl Staining Buffer，再分别加入相应的单个荧光抗体。荧光减一对照组分别加入50μl Stain Buffer，再分别加入相应的去除单个抗体的混合荧光抗体(CD3、CD4、CD8的加入量分别为4μl、4μl、1μl和2μl)。空白对照组加入50μl Staining Buffer重悬细胞，4℃避光孵育30min。随后用Staining Buffer清洗细胞2次。

细胞固定和破膜：向离心管中加入250μl的Fixation Permeabilizationsolution，4℃避光孵育20min。随后用1×BD Perm/washbuffer清洗细胞2次。

胞内因子染色：INF-γ、IL-2、IL-4、TNF-α分别取2μl、2μl、2μl和2μl至42μl BDPerm/wash buffer溶液中，加至样品组，50μl/孔。单阳对照组和荧光减一对照组分别加入50μl BD Perm/wash buffer，再分别加入单个荧光抗体和去除单个的混合荧光抗体(INF-γ、IL-2、IL-4、TNF-α的加入量分别为2μl、2μl、2μl和2μl)，空白对照组加50μl StainBuffer重悬细胞，4℃避光孵育30min。随后用BD Perm/wash buffer清洗细胞2次，StainingBuffer重悬，上流式细胞仪检测。

样品数据采集：BD FACS Canto PLUS流式细胞仪参数设置，启动BD FACS CantoPLUS流式细胞仪，仪器预热与液流启动程序结束后，选择通道参数为FSC、SSC，FITC、PE、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV450、BV650测试面积(A)，样本流速为中速；上样前混匀样本，停止采集事件数为P3门(CD3⁺)100000events。样品用Staining Buffer重悬后，移至流式管中，首先用一个空白对照管上样采集数据并设门，圈定去黏连的P2门。然后使用单阳对照调节电压(读数过程中调节)。电压调节完毕，即可读取单阳对照和荧光减一对照组的数据，P2门采集20000events。用所读取的荧光减一对照组数据调节荧光补偿，所有参数设定完毕后，圈出P3门(CD3⁺)，采集供试样本，P3门(CD3⁺)100000events。

结果分析：将流式细胞仪读取的样本数据分别标记CD4⁺和CD8⁺，各自圈门，在CD4⁺和CD8⁺门内统计IL-2、IL-4、INF-γ、TNF-α阳性细胞数，未刺激与刺激后作对比，统计细胞数的变化情况。

细胞免疫CD4⁺T细胞结果：结果如图9所示：各剂量组小鼠未刺激与刺激后作对比，IL-2、IL-4、INF-γ、TNF-α细胞因子中均有两个及两个以上的细胞因子呈阳性，其中0.5ug/0.5ml剂量组，2因子阳性占比20％、3因子阳性占比20％、4因子阳性占比60％，1ug/0.5ml剂量组，2因子阳性占比20％、3因子阳性占比20％、4因子阳性占比60％，2ug/0.5ml剂量组，2因子阳性占比20％、3因子阳性占比60％、4因子阳性占比20％，5ug/0.5ml剂量组，3因子阳性占比60％、4因子阳性占比40％，10ug/0.5ml剂量组，2因子阳性占比60％、3因子阳性占比40％，20ug/0.5ml剂量组，2因子阳性占比60％、3因子阳性占比20％、4因子阳性占比20％，佐剂组小鼠60％未阳转，40％为单因子阳转。综上可知，各剂量组小鼠CD4⁺T细胞两个及两个以上的细胞因子阳性率均为100％，说明各组间无明显差异，并且阳转率及阳转的细胞因子种类明显优于佐剂组。

细胞免疫CD8⁺T细胞结果：结果如图10所示：0.5ug/0.5ml剂量组，无细胞因子阳转的占比为40％、单因子阳性占比40％、4因子阳性占比20％，1ug/0.5ml剂量组，无细胞因子阳转的占比为40％、单因子阳性占比40％、2因子阳性占比20％，2ug/0.5ml剂量组，无细胞因子阳转的占比为40％、单因子阳性占比20％、2因子阳性占比40％，5ug/0.5ml剂量组，无细胞因子阳转的占比为20％、单因子阳性占比20％、2因子阳性占比20％、3因子阳性占比20％、4因子阳性占比20％，10ug/0.5ml剂量组，但因子阳性占比40％、3因子阳性占比60％，20ug/0.5ml剂量组，无细胞因子阳转的占比为60％、单因子阳性占比20％、2因子阳性占比20％，佐剂组小鼠60％未阳转，40％为单因子阳转。综上可知，各剂量组小鼠CD8⁺T细胞，1个及1个以上细胞因子阳性率在40％～100％，说明各组间无明显差异，并且阳转率及阳转的细胞因子种类明显优于佐剂组。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种融合蛋白，其特征在于，由4个抗原分子gD1、2个人免疫球蛋白抗体Fc结构域、2个人IgG1铰链区片段组成；

所述抗原分子gD1肽链C端分别与抗体Fc结构域肽链N端连接，与抗体Fc结构域连接的抗原分子gD1中一个肽链的N端串联1个人IgG1铰链区片段；2个人IgG1铰链区片段以链间二硫键形式连接；

所述抗原分子gD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述人IgG1铰链区片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；

所述序列SEQ ID NO.6和序列SEQ ID NO.21通过linker串联。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述linker序列长度为10-20aa，所述linker序列为包含甘氨酸、丝氨酸组合的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述linker序列如SEQ ID NO.22所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白抗体Fc选自人IgG、IgM、IgD、IgA和IgE中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，

当两条IgG1抗体Fc结构域肽链氨基酸序列相同时，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

当两条IgG1抗体Fc结构域肽链氨基酸序列不同时，其中一条Fc肽链含有两个突变点S354C和T366Y，所述序列如SEQ ID NO.8所示；另一条Fc肽链也含有两个突变点Y349C和Y407T，所述序列如SEQ ID NO.9所示。

7.权利要求1-6任一项所述的融合蛋白在制备重组I型单纯疱疹病毒疫苗中的应用。

8.一种重组I型单纯疱疹病毒疫苗，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中还包括药学上可接受的佐剂，所述佐剂选自氢氧化铝、角鲨烯、QS-21、寡核苷酸中的任意一种或多种。