[go: up one dir, main page]

CN119816522B - 5t4抗体药物偶联物及其应用 - Google Patents

5t4抗体药物偶联物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN119816522B
CN119816522B CN202480003886.7A CN202480003886A CN119816522B CN 119816522 B CN119816522 B CN 119816522B CN 202480003886 A CN202480003886 A CN 202480003886A CN 119816522 B CN119816522 B CN 119816522B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
solvate
variable region
chain variable
drug conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202480003886.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN119816522A (zh
Inventor
王延春
李鸿峰
刘文超
刘芳
巩文词
蔡知见
杨柳
高珊
蒋雯卿
方磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lepu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Lepu Biotechnology Co ltd
Lepu Chuangyi Biotechnology Shanghai Co ltd
Shanghai Miracogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lepu Biotechnology Co ltd, Lepu Chuangyi Biotechnology Shanghai Co ltd, Shanghai Miracogen Inc filed Critical Lepu Biotechnology Co ltd
Priority to CN202510733151.6A priority Critical patent/CN120361243A/zh
Publication of CN119816522A publication Critical patent/CN119816522A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN119816522B publication Critical patent/CN119816522B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

涉及5T4抗体药物偶联物及其应用，具体提供了抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，所述抗体药物偶联物具有式I所示的结构，其中，Ab为抗5T4抗体。抗体药物偶联物在体内和体外都具有良好的抑制肿瘤细胞生长活性，具有良好的应用前景。Ab‑(L‑D)p式I。

Description

5T4抗体药物偶联物及其应用
相关申请的交叉引用
本申请是以CN申请号为202311048671.0，申请日为2023年8月18日的申请为基础，并主张其优先权，该CN申请的内容在此作为整体引入本申请中。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及5T4抗体药物偶联物及其应用。
背景技术
癌胚蛋白5T4，又称滋养层糖蛋白(Trophoblast glycoprotein，TPBG)、Wnt激活抑制因子1(WAIF1)，是一种由TPBG基因编码，N端高度糖基化跨膜糖蛋白。TPBG蛋白的分子量约为72kDa，含420个氨基酸，由310个氨基酸的胞外结构域、20个氨基酸的跨膜区和44个氨基酸的胞浆结构域组成，其可通过与胞浆内含PDZ结构域的蛋白结合来影响细胞骨架的重建和细胞间的完整性。研究表明5T4与不同的生理、病理过程密切相关，如细胞间连接、细胞形态及运动、细胞黏附能力、细胞膜的完整性等。5T4在胚胎发育时期，相对广泛表达，而正常组织仅在某些特殊的上皮中存在，如基底层复层鳞状上皮、腺体和导管上皮，以及视网膜次级神经元和嗅球。
相比之下，5T4在许多恶性实体瘤中高表达，包括胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、宫颈癌、肾癌、胃癌和结直肠癌等。在结肠癌、胃癌或卵巢癌中有证据表明5T4的表达量与癌症的低治愈率相关。在非小细胞肺癌、肾癌或胰腺癌的组织中，5T4的表达高达95％以上。
现有肿瘤相关研究表明，5T4可能通过以下三个机制发挥作用：1)上皮-间质转化(EMT)；2)CXCL12/CXCR4生物轴的调节；3)抑制Wnt信号转导。
综上所述，5T4在多种实体肿瘤组织中的高表达，而正常的成熟组织中却很少存在，以及与肿瘤转移、不良预后的相关性，使其成为肿瘤药物的理想靶点之一。针对该靶点，在研临床药物涉及多种免疫疗法包括单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、ADC、肿瘤疫苗、CAR-raNK等。目前进入临床研究的ADC类药物有辉瑞开发的PF-06263507(A1-mcMMAF)、Asana BioSciences开发的ASN-004和Byondis BV开发的SYD-1875。PF-06263507(A1-mcMMAF)是由5T4特异性人源化抗体PF-06281192、不可切割的马来酰亚胺己基(mc)连接子和微管蛋白抑制剂一甲基澳瑞他汀F(MMAF)组成。ASN-004是由5T4特异性单链scFv-Fc抗体、Dolaflexin药物连接子(Mersana Therapeutics)、微管蛋白抑制剂澳瑞他汀衍生物(AF-HPA)组成。SYD-1875是由5T4特异性工程化半胱氨酸残基的抗体HCP41C、连接子有效载荷vc-seco-DUBA组成。根据报道，因PF-06263507没有观察到客观缓解，且观察到以眼部毒性为主的剂量限制性毒性(DLT)，辉瑞终止了PF-06263507的临床开发。另外，SYD-1875完成1期临床试验后没有进一步开展临床试验的信息。因此，我们有必要进一步开发新的、安全的、更有效的靶向于5T4的抗体药物偶联物。
发明内容
本申请的发明人通过大量实验和创造性劳动，制备得到了新的抗5T4抗体药物偶联物(antibody drug conjugate,ADC)，并证实其具有良好的生物学活性，由此完成了本发明。
为此，在本发明的第一方面，本发明提供了抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，所述抗体药物偶联物具有式Ⅰ所示的结构，
Ab-(L-D)p
式Ⅰ
其中：
Ab为抗5T4抗体或其抗原结合片段，所述抗5T4抗体包含重链可变区和轻链可变区，
重链可变区CDR1包含如SEQ ID NO：3所示的序列，
重链可变区CDR2包含如SEQ ID NO：4所示的序列，
重链可变区CDR3包含如SEQ ID NO：5所示的序列，
轻链可变区CDR1包含如SEQ ID NO：6所示的序列，
轻链可变区CDR2包含如SEQ ID NO：7所示的序列；
轻链可变区CDR3包含如SEQ ID NO：8所示的序列；
L为接头；
D为细胞毒素；
p为1-10之间的任意数值(如1、1.5、2、2.5、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10，或者如1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5、7.5-8、8-8.5、8.5-9、9-9.5或9.5-10)。
式I中，L-D表示接头与细胞毒素通过共价键相连，形成L-D分子；Ab-(L-D)p表示p个L-D分子通过共价键偶联至Ab。
本发明中，药物抗体比(drug antibody ratio,DAR)是指偶联到抗体的药物分子的个数(例如，式I中的p)。本文所述的抗体药物偶联物中包含的药物分子的个数可以是整数，也可以是小数。无论是整数还是小数，其指的均是每个抗体偶联的药物分子的平均数量。“p为1-10之间的任意数值”，其表示，p可以是选自1-10之间的任意整数(包括端点1和10)，也可以是选自1-10之间的任意小数。同时，本领域技术人员可以理解，即使采用相同的制备方法，不同的批次制备得到的抗体药物偶联物的DAR值也不一定完全相同，例如，可以在上下不超过0.5的范围内浮动。
药物抗体比(DAR)可以通过常规手段来测定，诸如质谱、ELISA测定法、HIC和HPLC。还可以测定ADC在p方面的定量分布。在有些情况中，将p为某数值的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分离、纯化和验证可以通过诸如HIC、反相HPLC或电泳的手段来实现。
在一些实施方案中，所述接头选自：MC-AAN、MCC-AAQ、6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)、马来酰亚氨基丙酰基(MP)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酰基(MCC)、N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。
在一些实施方案中，所述接头选自：MC-AAN、MCC-AAQ、6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)。
其中，MC、MCC、MC-vc-PAB的结构式如下所示：
在一些实施方案中，所述细胞毒素选自：拓扑异构酶抑制剂、Monomethylauristatin E(MMAE)、Monomethyl auristatin F(MMAF)、SN-38、吉西他滨(Gemcitabine)、美登木素生物碱(例如Maytansine DM1、Maytansine DM4)、卡奇霉素(calicheamicin)、MGBA(如duocarmycin)、阿霉素(doxorubicin)、蓖麻毒素、白喉毒素、倍癌霉素SA(Duocarmycin SA)、I131、白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子和纳米颗粒。
在一些实施方案中，拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂。示例性的拓扑异构酶I抑制剂包括喜树碱及其衍生物。示例性的喜树碱衍生物包括依喜替康(Exatecan)、贝洛替康(Belotecan)、SN-38、拓扑替康(Topotecan)、伊立替康(Irinotecan；cpt-11)、德鲁替康(Deruxtecan)等。
在一些实施方案中，所述细胞毒素选自：依喜替康(Exatecan，简写为Exa)、Monomethyl auristatin E(MMAE)、Monomethyl auristatin F(MMAF)。
在一些实施方案中，L-D选自：MC-AAN-Exa、MCC-AAQ-Exa、MC-vc-PAB-MMAE、MC-MMAF。
在一些实施方案中，L-D的结构式如下所示：
上述四个L-D通过共价键偶联至Ab上时，通过L-D末端的丁二酰亚胺与抗体中的巯基偶联形成。例如MC-AAN-Exa通过共价键偶联至Ab上时，形成的ADC的结构式如下所示：
其中，上述形成的ADC中，抗体Ab通过-S-与L-D末端的丁二酰亚胺的碳原子相连接，该-S-并非另外引入Ab的巯基，而是抗体Ab被还原而打开二硫键后的抗体自身所含有的巯基。
在一些实施方案中，所述抗5T4抗体的重链可变区CDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，重链可变区CDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，重链可变区CDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，轻链可变区CDR1的序列如SEQ ID NO：6所示，轻链可变区CDR2的序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区CDR3的序列如SEQ ID NO：8所示。
在一些实施方案中，所述抗5T4抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗5T4抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：2所示。
在一些实施方案中，所述抗5T4抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：9所示，所述抗5T4抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：10所示。
在一些实施方案中，所述抗5T4抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO：11所示，所述抗5T4抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：10所示。
在一些实施方案中，所述抗5T4抗体的重链恒定区选自人源性IgG、IgM、IgA、IgD、IgE恒定区或上述恒定区的突变体。在一些实施方案中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一些实施方案中，所述抗5T4抗体的轻链恒定区选自人源性lambda恒定区、kappa恒定区或上述恒定区的突变体。
在一些实施方案中，p为2-8之间的任意数值。
在一些实施方案中，p为3-8之间的任意数值(例如3.8、4.1、4.2、7.9或8.0)。
在本发明的第二方面，本发明提供了药物组合物，其包含前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种药用辅料。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含用于治疗肿瘤的化疗药物、免疫治疗药物和免疫抑制剂中的至少一种。
在一些实施方案中，所述化疗药物例如为阿霉素(Adriamycin)、环磷酰胺、紫杉烷类【如紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Taxotere)】、卡培他滨(Xeloda)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(Navelbine)、他莫昔芬、芳香酶抑制剂(瑞宁得、弗隆、阿诺新)、5-FU加亚叶酸、伊立替康(camptosar)、奥沙利铂、顺铂、卡铂、雌莫司汀、米托蒽醌(Novantrone)、泼尼松、长春新碱(Oncovin)、多柔比星、强的松等，或它们的组合。
在一些实施方案中，所述免疫治疗药物例如为PD-1单抗(例如帕博利珠单抗、纳武利尤单抗)、PD-L1单抗(例如Atezolizumab)、TIGIT单抗、4-1BB单抗、VEGFR2单抗(例如Ramucirumab、阿帕替尼)、HER2单抗(例如曲妥珠单抗、Trastuzumab biosimilar、Trastuzumab-dkst)等，或它们的组合。
在一些实施方案中，所述免疫抑制剂选自：(1)糖皮质激素类，如可的松和强的松；(2)微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；(3)抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；(4)多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；(5)烷化剂类，如环磷酰胺。在一些具体的实施方案中，所述免疫抑制剂例如为甲基强的松龙、强的松、硫唑嘌呤、普乐可复、赛尼哌、舒莱、环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸酯、咪唑立宾、环磷酰胺、芬戈莫德等。
在本发明的第三方面，本发明提供了前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗与5T4相关的疾病。
在本发明的第四方面，本发明提供了前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者前述的药物组合物，其用于预防和/或治疗与5T4相关的疾病。
在本发明的第五方面，本发明提供了治疗和/或预防与5T4相关的疾病的方法，其包括：给予有需要的受试者治疗和/或预防有效量的前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者前述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述与5T4相关的疾病选自胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肺癌(如非小细胞肺癌)、乳腺癌、头颈癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、结直肠癌(如结肠癌)、胃癌、膀胱癌、甲状腺癌、淋巴瘤、急性髓样白血病。
在一些实施方案中，所述与5T4相关的疾病为乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤血管生成、延缓肿瘤进展、抑制肿瘤生长或抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括：将肿瘤细胞与前述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者前述的药物组合物进行接触，所述肿瘤为5T4表达的肿瘤。
在一些实施方案中，所述5T4表达的肿瘤选自胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤、肺癌(如非小细胞肺癌)、乳腺癌、头颈癌、宫颈癌、肾癌、胃癌、结直肠癌(如结肠癌)、胃癌、膀胱癌、甲状腺癌、淋巴瘤、急性髓样白血病。
在一些实施方案中，所述5T4表达的肿瘤选自乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌。
有益效果
1、本发明新开发的5T4-ADC在多种肿瘤(如乳腺癌、非小细胞肺癌)细胞中表现出较强的细胞杀伤作用。
2、本发明新开发的5T4-ADC在多种肿瘤模型(如人结直肠癌裸小鼠CRC#047PDX模型)中表现出了显著的抑制肿瘤细胞生长的药效作用。
附图说明
图1-1表示嵌合抗体14G12对人5T4-His蛋白和食蟹猴5T4-His蛋白的结合活性；
图1-2表示嵌合抗体14G12对CHOK1-hu5T4细胞结合活性；
图1-3表示人源化抗体14G12z28和14G12z43结合人5T4-His蛋白的活性和结合CHOK1-hu5T4细胞的活性，以及人源化抗体14G12z28结合MCF-7细胞的活性；
图2表示14G12-vcMMAE疏水作用色谱图；
图3表示14G12-MC-MMAF疏水作用色谱图；
图4表示14G12z28-MC-MMAF疏水作用色谱图；
图5表示14G12z43-MC-MMAF疏水作用色谱图；
图6表示14G12z28-MC-AAN-Exa疏水作用色谱图；
图7表示14G12z28-MCC-AAQ-Exa疏水作用色谱图；
图8表示各测试物对肿瘤细胞NCI-H1975的结合亲和力；
图9表示各测试物对肿瘤细胞HCT116的结合亲和力；
图10表示各测试物在HCT116细胞上的内化结果；
图11表示不同5T4-ADC对肿瘤细胞MCF7杀伤的代表性图；
图12表示不同5T4-ADC对肿瘤细胞NCI-H1975杀伤的代表性图；
图13表示不同5T4-ADC对肿瘤细胞MDA-MB-468杀伤的代表性图；
图14表示不同5T4-ADC在CRC#047PDX小鼠模型中的体内抗肿瘤活性；
图15表示不同5T4-ADC对CRC#047PDX小鼠模型体重的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中，除非另有说明，否则任何数值范围应理解为包括范围内的任何值或任何子范围。
在本发明中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体的轻链可分为κ和λ两类。重链可分为μ、δ、γ、α或ε五种，依据重链的不同可将抗体分为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE五类。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和补体系统的组分C1q的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为骨架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
在本发明中，“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有期望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。
在本发明中，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(singledomain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；NatBiotechnol,23:1126-1136中。
在本发明中，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
在本发明中，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
在本发明中，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成di-scFv，其指的是两个或两个以上单个scFv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scFv可形成(scFv)2，其指的是两个或两个以上单个scFv并联而形成抗体。
在本发明中，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak R.J.等人，Structure 2:1121-1123(1994))。
在本发明中，术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
在本发明中，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)；Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(参见Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
在本发明中，用于确定序列同源性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的氨基酸序列同源性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。
在本发明中，所述氨基酸序列的突变体指的是与所述氨基酸序列的同源性大于70％，例如大于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列，例如具有3个、2个或1个取代、缺失或添加氨基酸的序列。优选的是，取代、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，取代、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，取代、添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。
“取代型”变体是天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被不同的氨基酸插入其相同位置的变体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一个氨基酸可被多个残基取代，其中这样的变体包括取代和插入二者。“插入型”(或“添加型”)变体是一个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变体。紧邻氨基酸意指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“缺失型”变体是天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸被除去的变体。通常情况下，缺失型变体在其分子的特定区域内有一个或两个氨基酸被缺失。
在某些实施方案中，在偶联反应中少于理论最大值的药物模块偶联至抗体。一般而言，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半胱氨酸硫醇基。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指，(i)本发明所提供的偶联物中存在的酸性官能团与适当的无机或者有机阳离子(碱)形成的盐，并且包括但不限于，碱金属盐，如钠盐、钾盐、锂盐等；碱土金属盐，如钙盐、镁盐等；其他金属盐，如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；无机碱盐，如铵盐；有机碱盐，如叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基胺盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐。以及，(ii)本发明所提供的偶联物中存在的碱性官能团与适当的无机或者有机阴离子(酸)形成的盐，并且包括但不限于，氢卤酸盐，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；低级烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐、对苯磺酸盐等；有机酸盐，如醋酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；氨基酸盐，如甘氨酸盐、三甲基甘氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等。
药学上可接受的盐可使用本领域熟知的标准程序获得，例如，通过将足量的碱性物质和提供药学上可以接受的阴离子的合适的酸反应，或者，通过将足量的酸性物质和提供药学上可以接受的阳离子的合适的碱反应。
在本发明中，溶剂合物表示这些形式的本发明的抗体药物偶联物：所述抗体药物偶联物通过与溶剂分子配位而形成的固态或液态形式的复合物。水合物是溶剂合物的一种具体形式，其具有配位的水分子。在本发明中，水合物是优选的溶剂合物。
制备各种含有一定量的活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述，制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。
本发明中，所述药用辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋型、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。根据其来源可分为天然物、半合成物和全合成物。根据其作用与用途可分为：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等；根据其给药途径可分为口服、注射、黏膜、经皮或局部给药、经鼻或口腔吸入给药和眼部给药等。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。
本发明中，所述药物组合物可根据给药途径制成各种适宜的剂型。例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、散剂、酊剂、糖浆剂、注射剂、栓剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、眼用制剂、丸剂、植入剂、气雾剂、粉雾剂、喷雾剂等。其中，所述的药物组合物或适宜的剂型可以含有0.01mg至1000mg的本发明的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物。
本文使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
在本发明中，“受试者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物指人。
在本发明中，“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量会低于治疗有效量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。
在本发明中，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其通过引用合并入本文。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
实施例1抗5T4嵌合抗体的制备，人源化改造及其相关性能检测
1、抗人5T4单克隆抗体免疫筛选
为了获取靶向人5T4蛋白的单克隆抗体，首先在SJL小鼠、Balb/c小鼠、C57BL/6小鼠中利用人5T4-His蛋白进行初次免疫接种，之后在免疫小鼠中利用人5T4-His蛋白或过表达人5T4的CHO-K1细胞(CHOK1-hu5T4)进行增强免疫。通过ELISA实验和FACS实验，检测免疫小鼠血清中抗人5T4-his蛋白的抗体滴度。选取血清抗体滴度高的免疫小鼠制备杂交瘤细胞。通过ELISA实验和FACS实验检测杂交瘤上清中抗体的结合活性，筛选能够同时结合人5T4-His蛋白(human 5T4)和食蟹猴5T4-His蛋白(cyno5T4)、且特异性结合CHOK1-hu5T4细胞的杂交瘤细胞。筛选得到的杂交瘤克隆14G12抗体，通过测序分析获得其可变区氨基酸序列，如表1-1所示。
表1-1：14G12抗体可变区序列
2、嵌合抗体14G12的结合活性
通过将14G12抗体的可变区序列连接到人IgG1/Cκ骨架上，构建嵌合抗体14G12。
通过SPR方法检测嵌合抗体14G12结合人5T4-His蛋白的亲和力特征。将嵌合抗体14G12固定到Protein A芯片上，通过不同抗原浓度条件下的结合曲线拟合，检测嵌合抗体14G12结合人5T4-His蛋白的亲和力，如表1-4所示。
通过ELISA实验检测嵌合抗体14G12对人5T4-His蛋白和食蟹猴5T4-His蛋白的结合活性。96孔板包被人5T4-His蛋白或食蟹猴5T4-His蛋白后，加入梯度稀释的嵌合抗体14G12，室温孵育60min。PBST清洗后，加入偶联HRP的mouse-anti-human IgG Fc抗体，室温孵育30min。PBST清洗后，加入TMB底物并分析OD 450nm吸光度。嵌合抗体14G12对人5T4-His蛋白和食蟹猴5T4-His蛋白的结合亲和力如表1-2和图1-1所示。与对照抗体naptumomab相比，嵌合抗体14G12具有相当的人5T4-His结合活性(图1-1A)和显著更优的食蟹猴5T4-His结合活性(图1-1B)。
表1-2：嵌合抗体14G12结合活性
通过FACS实验检测嵌合抗体14G12对CHOK1-hu5T4细胞或MCF-7细胞的结合活性。收集对数期生长的CHOK1-hu5T4细胞或MCF-7细胞。离心后，将细胞重悬于FACS缓冲液，并分至96孔U底细胞培养板中。加入用FACS缓冲液梯度稀释的抗体，4℃孵育30min。FACS缓冲液清洗孔内细胞后，加入用FACS缓冲液稀释的PE Goat anti-Human IgG Fc SecondaryAntibody(eBioscienceTM,Invitrogen)，4℃避光孵育30min。FACS缓冲液清洗孔内细胞后，用MACSQuant Analyzer 16流式细胞仪(Miltenyi)对细胞样品进行荧光信号分析。实验结果如图1-2所示，嵌合抗体14G12对CHOK1-hu5T4细胞具有不错的结合亲和力。
3、嵌合抗体14G12的人源化改造
通过比较14G12抗体可变区骨架序列和现有人IgG可变区骨架序列，筛选匹配度高的人源序列。将14G12抗体CDR序列移植到选取的人IgG可变区骨架序列中，并进行回复突变改造后，获得一系列14G12人源化抗体。
通过SPR方法、ELISA实验和FACS实验(具体方法同前)，筛选得到结合活性最优的人源化抗体14G12z28(又名Hu14G12-28)和14G12z43(又名Hu14G12-43)，其可变区氨基酸序列如表1-3所示。
表1-3：人源化抗体可变区序列
如表1-4所示，人源化抗体14G12z28和14G12z43结合人5T4-His蛋白的亲和力略弱于嵌合抗体14G12。
表1-4：嵌合抗体和人源化抗体亲和力
如图1-3所示，人源化抗体14G12z28和14G12z43结合人5T4-His蛋白的活性与嵌合抗体14G12相当(图1-3A,B)，结合CHOK1-hu5T4细胞的活性略优于与嵌合抗体14G12(图1-3C,D)。此外，人源化抗体14G12z28对MCF-7细胞具有不错的结合亲和力(图1-3E)。
实施例2连接子药物偶联物(linker-payload)的制备
一、MC-AAN-Exatecan的制备
1.中间体一的合成
将Fmoc-Ala-OH(N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸，CAS号：35661-39-3)经HOSu(N-羟基丁二酰亚胺，CAS号：6066-82-6)活化后，与L-Ala(L-丙氨酸，CAS号：56-41-7)反应得到中间体一；具体的步骤是，反应瓶内加入Fmoc-Ala-OH(3g，1.0eq)、HOSu(1.45g，1.3eq)，加入21mL的THF，控制温度在室温，搅拌条件下缓慢加入DCC(2.59g，1.3eq)，后室温进行反应，用HPLC监控，反应结束后，将反应液过滤，滤饼用THF(6mL)淋洗。滤液中加入纯化水(15mL)，后加入L-Ala(1.12g，1.3eq)，碳酸氢钠固体(0.81g，1.0eq)，室温搅拌反应，HPLC监控，反应结束后加入柠檬酸(2.02g，1.0eq)搅拌，然后反应液用乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，加入DMF(12mL)溶解产品，过滤后通过prep-HPLC(制备高效液相色谱)，浓缩制备液至无明显液滴流出后，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯相浓缩至干得到中间体一，反应式如下：
2.中间体二的合成
将中间体一(N-[芴甲氧羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸，CAS号：87512-31-0)经HOSu(N-羟基丁二酰亚胺，CAS号：6066-82-6)活化后，与L-Asn(L-天冬酰胺，CAS号：70-47-3)反应得到中间体二；具体的步骤是，反应瓶中加入中间体一(0.87g，1.0eq)、HOSu(0.34g，1.3eq)、THF(9mL)，控制温度在室温，搅拌条件下缓慢加入DCC(0.61g，1.3eq)，室温进行反应，用HPLC监控，反应结束后，将反应液过滤，滤饼用THF(2mL)淋洗。滤液中加入纯化水(10mL)，加入L-Asn(0.34g，1.1eq)，碳酸氢钠固体(0.19g，1.0eq)，室温搅拌反应，HPLC监控，反应结束后，加入一水合柠檬酸(0.48g，1.0eq)搅拌，浓缩反应液除去大部分溶剂，制备纯化残余物，浓缩制备液至无明显液滴流出后，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干得到中间体二，反应式如下：
3.中间体三的合成
中间体二加DEA(二乙胺，CAS号：109-89-7)脱Fmoc后，得到中间体三；具体的步骤是，反应瓶中加入中间体二(100mg)、DMF(1.5mL)，控制温度在室温，滴加DEA(300μL)，室温进行反应，HPLC监控，至中间体二无剩余，浓缩除去DMF，加入DCM(4mL)，纯化水(4mL)，搅拌后分液，将水相浓缩至干得到中间体三，反应式如下：
4.中间体四的合成
中间体三与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(CAS号：55750-63-5)反应得到中间体四；具体步骤是，反应瓶中加入中间体三(92mg，1.0eq)、6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(135mg，1.3eq)、DMF(1.5mL)、DIPEA(0.059mL，1.0eq)，HPLC监控，反应完成后，制备纯化，浓缩制备液，得到中间体四，反应式如下：
5.产品的合成
中间体四与依喜替康甲磺酸盐(CAS号：169869-90-3)经缩合反应得到产品；具体的步骤是，室温条件下，反应瓶中加入中间体四(26mg，1.0eq)，加入DMF(1.5mL)，依次加入依喜替康甲磺酸盐(29.6mg，1.0eq)、EEDQ(20.7mg，
1.5eq)，HATU(31.8mg，1.5eq)、DMAP(0.7mg，0.1eq)、DIPEA(29.2μL，3.0eq)，室温进行反应。HPLC监控，反应完成后，制备纯化，浓缩制备液，得到产品，反应式如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.22-8.29(d,J＝2.0Hz,1H),7.94-8.05(d,J＝2.0Hz,3H)，7.83-7.88(d,J＝2.0Hz,1H)，7.75-7.82(d,J＝2.0Hz,1H)，7.34-7.40(m,1H)，7.28-7.33(m,1H)，6.96-7.02(d,J＝8.0Hz,2H)，6.87-6.94(m,1H)，5.42-5.55(m,1H)，5.41-5.46(m,2H)，5.21-5.26(m,1H)，4.41-4.49(m,1H)，4.00-4.12(m,2H)，3.32-3.40(m,2H)，3.12-3.17(m,2H)，2.86-2.96(m,2H)，2.71-2.76(m,2H)，2.36-2.43(m,2H)，2.14-2.24(m,1H)，1.97-2.07(m,3H)，1.81-1.93(m,2H)，1.36-1.52(m,4H)，1.05-1.25(m,8H)，0.83-0.93(m,3H).
二、MCC-AAQ-Exatecan的制备
1.中间体一的合成Fmoc-Gln-Exatecan
将Fmoc-Gln-OH(N-芴甲氧羰基-L-谷氨酰胺)(76.3mg 1.1eq.)、Exatecan(100mg1.0eq.)加入反应瓶中，加入DMF(1ml)，DIEA(29mg 1.5eq.)，TBTU(72.5mg1.1eq.)，室温反应，HPLC监控，无原料剩余。反应结束后，中压过柱纯化(DCM/MeoH)。收集产品，浓缩干，得到中间体一。
反应式如下：
2.中间体二的合成Gln-Exatecan
将中间体一Fmoc-Gln-Exatecan(130mg 1.0eq.)加入反应瓶中，加入DCM(2ml)，室温搅拌。加入DEA(0.5ml)，室温反应，HPLC监控，无原料剩余。停止反应，缓慢加入MTBE(10ml)，析出大量固体，搅拌30min。过滤，MTBE洗涤，得到灰白色固体，干燥，得到中间体二。
反应式如下:
3.中间体三的合成Fmoc-Ala-Ala-Gln-Exatecan
将中间体二Gln-Exatecan(100mg 1.0eq.)加入反应瓶中，DMF(1mL)，Fmoc-Ala-Ala-OH(67.8mg 1.0eq)，TBTU(68.4mg 1.2eq.)DIEA(34.4mg 1.5eq.),室温反应，HPLC监控至反应结束。中压过柱纯化(DCM/MeOH)，收集产品得到中间体三。
反应式如下：
4.中间体四的合成Ala-Ala-Gln-Exatecan
将中间体三Fmoc-Ala-Ala-Gln-Exatecan(140mg 1.0eq.)加入反应瓶中，加入DCM(2ml)，室温搅拌。加入DEA(0.5ml)，室温反应，HPLC监控至反应结束。缓慢加入MTBE(10ml)，析出大量固体，搅拌30min。过滤，MTBE洗涤，得到灰白色固体，干燥，得到中间体四。
反应式如下：
5.产品合成MCC-Ala-Ala-Gln-Exatecan
将中间体四Ala-Ala-Gln-Exatecan(50mg 1.0eq.)加入反应瓶中，DMF(1mL)，再加入MCC(18mg 1.1eq)，DIEA(12.1mg 1.5eq.),室温反应，HPLC监控至中间体四无剩余，停止反应。Prep-HPLC纯化，收集产品，浓缩干，得到产品。
反应式如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.17-8.26(d,J＝2.0Hz,1H),7.83-7.91(d,J＝2.0Hz,2H)，7.65-7.74(d,J＝2.0Hz,2H)，7.21-7.28(d,J＝8.0Hz,2H)，6.98-7.04(m,2H)，5.43-5.50(m,1H)，5.36-5.43(m,2H)，5.15-5.24(m,1H)，5.01-5.11(m,1H)，4.14-4.24(m,1H)，3.97-4.08(m,1H)，3.47-3.57(m,1H)，3.20-3.27(m,1H)，3.05-3.16(m,2H)，2.30-2.36(m,2H)，2.00-2.15(m,4H)，1.77-1.92(m,3H)，1.65-2.00(m,5H)，1.45-1.64(m,4H)，1.09-1.24(m,5H)，0.95-1.07(m,4H)，0.79-0.94(m,5H).
实施例3 5T4-ADC的制备
1.抗体偶联物5T4抗体-vcMMAE和5T4抗体-MC-MMAF的制备
a.取5T4抗体(如14G12、14G12z28或14G12z43)，用Tris-EDTA溶液调节抗体pH至约7.5左右；用Nanodrop检测蛋白浓度，并称量抗体溶液净重，计算蛋白总量。向抗体中加入TCEP溶液，置于3D摇床上，室温下，反应120min以上，连续混匀将抗体链间二硫键部分还原。
b.向还原后的抗体溶液加入过量的MC-vc-PAB-MMAE溶液(上海美雅珂生物技术有限责任公司委托湖北华世通生物医药科技有限公司生产，溶于DMSO)或MC-MMAF溶液(购买自博瑞医药生物(苏州)股份有限公司，溶于DMSO)，混匀后置于3D摇床上，室温下，反应30min以上，连续混匀。反应结束后向反应液中加入过量的N-乙酰半胱氨酸溶液，置于3D摇床上，室温下，反应30min以上，连续混匀。
c.使用30KD超滤离心管将偶联产物进行纯化，并置换到储存液(10mM Histidine，pH5.5左右)中，置换倍数大于1000倍。然后用0.22um的除菌过滤器进行过滤，即得到抗体药物偶联物14G12-vcMMAE、14G12-MC-MMAF、14G12z28-MC-MMAF、14G12z43-MC-MMAF于4℃进行保存。
d.用UV/BCA的方法检测抗体药物偶联物的蛋白浓度，用HIC进行DAR检测(如图2～图5所示)，DAR分别为3.8、3.8、4.2和4.1，SEC进行纯度检测。
2.抗体偶联物5T4抗体-MC-AAN-Exatecan和5T4抗体-MCC-AAQ-Exatecan的制备
a.取5T4抗体如14G12z28，用Tris-EDTA溶液调节抗体pH至约7.5左右；用Nanodrop检测蛋白浓度，并称量抗体溶液净重，计算蛋白总量。向抗体中加入TCEP溶液，置于3D摇床上，室温下，反应120min以上，连续混匀将抗体链间二硫键部分还原。
b.向还原后的抗体溶液加入过量的MC-AAN-Exatecan溶液或MCC-AAQ-Exatecan(溶于DMSO)，混匀后置于3D摇床上，室温下，反应30min以上，连续混匀。反应结束后向反应液中加入过量的N-乙酰半胱氨酸溶液，置于3D摇床上，室温下，反应30min以上，连续混匀。
c.使用30KD超滤离心管将偶联产物进行纯化，并置换到储存液(10mM Histidine，pH5.5左右)中，置换倍数大于1000倍。然后用0.22um的除菌过滤器进行过滤，即得到抗体药物偶联物14G12z28-MC-AAN-Exa和14G12z28-MCC-AAQ-Exa 4℃进行保存。
d.用UV/BCA的方法检测抗体药物偶联物的蛋白浓度，用HIC进行DAR检测(如图6～图7所示)，DAR分别为8.0和8.0，SEC进行纯度检测。
实施例4 5T4-ADC药理药效学研究
1、5T4-ADC的细胞结合活性
通过FACS实验确认ADC对靶向抗原表达的细胞结合活性在抗体偶联前后基本不受影响。
收集对数期生长的NCI-H1975肺癌细胞或HCT116结直肠癌细胞。离心后，将细胞重悬于FACS缓冲液(PBS+3％ FBS)，调整细胞密度，并将细胞分至96孔U底细胞培养板中，使每孔内含200,000～500,000个细胞。加入用FACS缓冲液4倍梯度稀释的抗体或ADC并混匀，使各样品最终起始终浓度为10μg/mL。将96孔板置于4℃孵育45～90min。用FACS缓冲液对孔内细胞进行充分清洗，除去未结合的抗体或ADC。加入用FACS缓冲液1:1,000稀释的Goatanti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 488或647(Invitrogen，#A-11013或#A-21445)，于4℃避光孵育30～60min。用FACS缓冲液对孔内细胞进行充分清洗，除去未结合的二抗。用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)对细胞样品进行荧光信号分析。实验结果如图8～图9所示，嵌合抗体14G12、人源化抗体14G12z28在偶联细胞毒素前后对表达5T4的NCI-H1975或HCT116细胞的结合亲和力未表现出显著变化，表明抗体与毒素偶联前后基本不影响其细胞结合活性。各测试物对肿瘤细胞的结合亲和力如表2和图8～图9所示。
表2：5T4抗体及ADC对肿瘤细胞的结合(EC50)
2、5T4-ADC中抗体的内化
确认靶向5T4的单抗及其ADC的细胞内化能力。
收集对数期生长的HCT116结直肠细胞。离心后，对细胞清洗一次，将细胞重悬于预冷的含3％ FBS的细胞培养基中，调整细胞密度，并将细胞分至96孔U底细胞培养板中，使每孔内含500,000～800,000个细胞。加入用含3％FBS的DMEM培养基稀释的抗体或ADC并混匀，使样品终浓度为10μg/mL。将96孔板置于冰上孵育60min。用预冷的FACS缓冲液(PBS+3％FBS)对孔内细胞进行充分清洗，除去未结合的抗体或ADC。将孔内细胞均分至4块96孔U底板中，离心后，用细胞培养基重悬细胞。1块96孔板置于冰上，另外3块则置于37℃的细胞培养箱中孵育。0.5h、1h和2h后，分别将37℃的1块培养板转移至冰上。待第3块培养板转移至冰上5～10min后，加入稀释的Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed SecondaryAntibody,Alexa Fluor 647(Invitrogen，#A-21445)，于冰上避光孵育30～60min。用预冷的FACS缓冲液对孔内细胞进行清洗，除去未结合的二抗。用CytoFLEX流式细胞仪(BeckmanCoulter)对细胞样品进行荧光信号分析，用MFI(GeoMean fluorescence intensity)表示。除37℃孵育外，整个实验过程均保持在冰上或4℃。
细胞表面分子减少百分比的计算方法如下：
细胞表面分子减少％＝(MFI冰上-MFI37℃)/MFI冰上*100％。
实验结果如表3所示，靶向5T4的人源化抗体14G12z28在偶联细胞毒素前后对于HCT116细胞的内化能力没有改变，说明偶联毒素对抗体的细胞内化无显著影响。各测试物在HCT116细胞上的内化(以细胞表面分子减少百分比表示)结果如表3和图10所示。
表3：5T4抗体及ADC在HCT116细胞上的内化
实施例5体外药效学研究
对偶联多种linker-payload的靶向5T4的ADC分子的细胞杀伤活性进行评估。
收集对数期生长的肿瘤细胞。离心后，将细胞重悬于新的培养基中，并对细胞进行计数。将细胞接种于96孔底透黑色细胞培养板(Costar)中，并于细胞培养箱内培养过夜。第二天，用培养基对ADC分子进行4倍梯度稀释，小心转移稀释液至黑色培养板中，使各样品最终起始终浓度为200ng/mL或10,000ng/mL。置于细胞培养箱内培养4天(MMAE或MMAF ADC)或6天(Exatecan ADC)，然后加入1/10孔内体积的PrestoBlue试剂(Invitrogen)，细胞培养箱内孵育1h。用SpectraMax M5读板仪对荧光信号进行读取，将仪器的激发和发射波长分别设为560nm和590nm。所得荧光信号数据用SoftMax Pro 6.5软件进行分析。
1、实验试剂及来源：
表4：受试药物
表5：细胞杀伤活性实验使用的细胞株
2、实验结果：
各5T4-ADC细胞杀伤活性的EC50的平均值见表6。图11～图13为不同5T4-ADC对肿瘤细胞杀伤的代表性图。
表6：不同5T4-ADC在肿瘤细胞中细胞杀伤活性的EC50值
从表6和图11～图13的结果可以看出，偶联毒素的5T4抗体形成的本发明的ADC都表现出较强的细胞杀伤活性。
实施例6体内药效学研究
在CRC#047PDX小鼠模型中对不同5T4-ADC的体内抗肿瘤活性进行了测试。
CRC#047PDX模型经FACS分析证实该模型的细胞有5T4阳性表达。人结直肠癌裸小鼠CRC#047PDX模型的建立过程为：将体积大小约为30mm3的肿瘤组织移植于BALB/c裸小鼠背部右侧皮下。当肿瘤体积达到200-300mm3时，用随机区组法分组，分组当日记为Day 0。每组6只小鼠，保证各组间肿瘤体积均一并兼顾体重，共4组，包括溶媒组、Non-binding-MC-AAN-Exa(10mg/kg)对照给药组与14G12z28-MC-AAN-Exa(10和3mg/kg)给药组。在Day 0与Day 7时，各进行一次尾静脉给药。其中，Non-binding表示抗体是非结合的人IgG1同型对照，与实验所用肿瘤细胞表面的靶点无结合，用于作为阴性对照抗体。
数据分析：实验期间，每周测定两次肿瘤体积。肿瘤体积(Tumor Volume，TV)的计算公式为：TV＝l×w2/2。其中l、w分别代表肿瘤测量长和宽。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，RTV＝Vf/V0。其中V0为分组给药时(即Day 0)测量所得肿瘤体积，Vf为最后一天测量的肿瘤体积。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(给药组RTV/Vehicle组RTV)×100％。当T/C(％)≤40％，且P<0.05时认为供试品对肿瘤生长有显著抑制作用。
实验结果如图14～图15所示。Day 28时，14G12z28-MC-AAN-Exa(10mg/kg)给药组的相对肿瘤增殖率T/C(％)为10.02％(P<0.0001)；14G12z28-MC-AAN-Exa(3mg/kg)给药组的相对肿瘤增殖率T/C(％)为13.28％(P<0.0001)；Non-binding-MC-AAN-Exa(10mg/kg)对照给药组的相对肿瘤增殖率T/C(％)为55.54％(P＞0.05)。与Day 0相比，Day 28时各组小鼠的平均体重变化在3.74％～5.21％范围内。
实验结果表明，给药剂量为3mg/kg和10mg/kg时，14G12z28-MC-AAN-Exa对肿瘤生长都有显著的抑制作用。荷瘤小鼠对全部供试品均有很好的耐受性。

Claims (14)

1.抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，所述抗体药物偶联物具有式Ⅰ所示的结构，
Ab-(L-D)p
式Ⅰ
其中：
Ab为抗5T4抗体或其抗原结合片段，所述抗5T4抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，
重链可变区CDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，
重链可变区CDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，
重链可变区CDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，
轻链可变区CDR1的序列如SEQ ID NO：6所示，
轻链可变区CDR2的序列如SEQ ID NO：7所示，
轻链可变区CDR3的序列如SEQ ID NO：8所示；
L-D选自：MC-AAN-Exa、MCC-AAQ-Exa、MC-vc-PAB-MMAE、MC-MMAF；
p为1-10之间的任意数值。
2.权利要求1所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述抗5T4抗体具有选自以下（i）-（ii）中的一项技术特征：
（i）所述抗5T4抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO：9所示的序列，所述抗5T4抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO：10所示的序列；
（ii）所述抗5T4抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO：11所示的序列，所述抗5T4抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO：10所示的序列。
3.权利要求1所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述抗5T4抗体具有选自以下（i）-（ii）中的一项或多项技术特征：
（i）所述抗5T4抗体的重链恒定区选自人源性IgG、IgM、IgA、IgD、IgE恒定区；
（ii）所述抗5T4抗体的轻链恒定区选自人源性lambda恒定区、kappa恒定区。
4.权利要求3所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
5.权利要求1所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，p为2-8之间的任意数值。
6.权利要求1所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，p为3-8之间的任意数值。
7.权利要求1所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物，其中，p为3.8、4.1、4.2、7.9或8.0。
8.药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物。
9.权利要求8所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含至少一种药用辅料。
10.权利要求8所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含用于治疗肿瘤的化疗药物、免疫治疗药物和免疫抑制剂中的至少一种。
11.权利要求1-7任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者权利要求8-10任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗与5T4相关的疾病；
所述与5T4相关的疾病选自非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌。
12.权利要求11所述的用途，其中，所述结直肠癌为结肠癌。
13.一种体外非治疗性延缓肿瘤进展、抑制肿瘤生长或抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括：将肿瘤细胞与权利要求1-7任一项所述的抗体药物偶联物、或其药学上可接受的盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物或者权利要求8-10任一项所述的药物组合物进行接触，所述肿瘤为5T4表达的肿瘤；
所述5T4表达的肿瘤选自非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌。
14.权利要求13所述的方法，其中，所述结直肠癌为结肠癌。
CN202480003886.7A 2023-08-18 2024-08-16 5t4抗体药物偶联物及其应用 Active CN119816522B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510733151.6A CN120361243A (zh) 2023-08-18 2024-08-16 5t4抗体药物偶联物及其应用

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2023110486710 2023-08-18
CN202311048671 2023-08-18
PCT/CN2024/112592 WO2025040000A1 (zh) 2023-08-18 2024-08-16 5t4抗体药物偶联物及其应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510733151.6A Division CN120361243A (zh) 2023-08-18 2024-08-16 5t4抗体药物偶联物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN119816522A CN119816522A (zh) 2025-04-11
CN119816522B true CN119816522B (zh) 2025-06-24

Family

ID=94731384

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202480003886.7A Active CN119816522B (zh) 2023-08-18 2024-08-16 5t4抗体药物偶联物及其应用
CN202510733151.6A Pending CN120361243A (zh) 2023-08-18 2024-08-16 5t4抗体药物偶联物及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510733151.6A Pending CN120361243A (zh) 2023-08-18 2024-08-16 5t4抗体药物偶联物及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (2) CN119816522B (zh)
WO (1) WO2025040000A1 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108187065A (zh) * 2017-12-29 2018-06-22 广东众生药业股份有限公司 抗5t4抗体与美登素衍生物dm4偶联复合物及制备方法和用途
CN115337406A (zh) * 2021-05-13 2022-11-15 清华大学 一种抗体药物偶联物及其制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5677972B2 (ja) * 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
BR112013025186A2 (pt) * 2011-04-01 2018-09-11 Wyeth Llc conjugados de anticorpo-fármaco
CR20180484A (es) * 2016-04-15 2019-03-05 Macrogenics Inc Moléculas de unón b7-h3 novedosas, conjugados anticuerpos-fármaco de los mismos y métodos de uso de los mismos
CN108285487B (zh) * 2017-01-08 2021-02-19 浙江昭华生物医药有限公司 抗5t4抗体-药物偶联物及其应用
KR102677225B1 (ko) * 2017-07-10 2024-06-24 이나뜨 파르마 에스.에이. Siglec-9 중화 항체
US20230293709A1 (en) * 2020-05-03 2023-09-21 Shanghai Miracogen Inc. Antibody-drug conjugate and preparation thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108187065A (zh) * 2017-12-29 2018-06-22 广东众生药业股份有限公司 抗5t4抗体与美登素衍生物dm4偶联复合物及制备方法和用途
CN115337406A (zh) * 2021-05-13 2022-11-15 清华大学 一种抗体药物偶联物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN120361243A (zh) 2025-07-25
CN119816522A (zh) 2025-04-11
WO2025040000A1 (zh) 2025-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP4494657A1 (en) Exatecan derivative-antibody conjugate and medical use thereof
JP7536188B2 (ja) エキサテカン誘導体及びそのリンカー－ペイロードとコンジュゲート
JP2024521629A (ja) 抗体薬物コンジュゲート、及びその調製方法及びその使用
TWI854047B (zh) 抗人Trop-2抗體及其應用
JP2024508081A (ja) 生物活性物質コンジュゲート、その調製方法及びその使用
CA3233254A1 (en) Antibody, antibody-drug conjugate thereof and use thereof
JP7730836B2 (ja) 抗体薬物複合体の調製方法
JP7724866B2 (ja) 抗体薬物複合体およびその用途
JP2024517776A (ja) ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート並びにその調製方法及びその使用
EP4480499A1 (en) Conjugate of antibody-eribulin or derivative thereof, intermediate thereof, preparation method therefor, pharmaceutical composition thereof and use thereof
JP2025510606A (ja) Ｂ７ｈ４抗体薬物複合体及びその使用
EP4552654A1 (en) Antibody-drug conjugate, and preparation method therefor and use thereof
CN110090306B (zh) 双醛连接臂的配体-药物偶联物、其制备方法及其应用
CN117645608A (zh) 抗体药物偶联物及其应用
CN120225226A (zh) B7-h3抗体药物偶联物及其应用
KR20240150781A (ko) B7-h4 항체 약물 접합체를 포함하는 암 치료를 위한 병용요법
CN119816522B (zh) 5t4抗体药物偶联物及其应用
EP4659764A1 (en) Linker drug, and preparation method and use of antibody-drug conjugate thereof
WO2025036480A1 (zh) 化合物以及含有该化合物的抗体偶联药物
CN119300868A (zh) 喜树碱类化合物及其偶联物、其制备方法和用途
CN120202203A (zh) 杂环化合物及其制备方法和用途
TW202525864A (zh) 靶向ｇｐｃ３的抗體藥物偶聯物及其應用
EP4591887A1 (en) Gpc3 antibody-drug conjugate and use thereof
TWI908142B (zh) Nectin-4抗體及抗體藥物結合物
WO2025183174A1 (ja) 抗ｃｄｈ３ヒト化抗体と薬物とのコンジュゲート、およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20250924

Address after: 201114 Shanghai Minhang District, Su Zhao Road No. 1628, Building 1, Room C280

Patentee after: Lepu Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 201112 Shanghai City Minhang District Pujing Town Lianheng Road No. 651 Building 4 5th Floor

Patentee before: SHANGHAI MIRACOGEN Inc.

Country or region before: China

Patentee before: Lepu Chuangyi Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

Patentee before: Lepu Biotechnology Co.,Ltd.