CN1197978C

CN1197978C - 人类乙型肝炎病毒(hbv)dna聚合酶的体外活性试验及其在hbv dna聚合酶抑制剂的筛选中的应用

Info

Publication number: CN1197978C
Application number: CNB998115274A
Authority: CN
Inventors: 温崇仁; 陈维宁; 林玉娇; 梁爱玲
Original assignee: Government of The Republic of Singapore
Current assignee: Government of The Republic of Singapore
Priority date: 1998-09-29
Filing date: 1999-03-13
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2019-03-13
Also published as: IL142288A0; YU23601A; JP2002525130A; WO2000018968A1; CA2344282A1; KR20010083879A; WO2000018968A8; TR200100899T2; NZ510704A; UA75028C2; WO2000018958A2; HRP20010230B1; MY123274A; HUP0103735A2; EP1117843A1; RU2202620C2; BR9914099A; AU772819B2; AU9372698A; CN1320167A

Abstract

本发明提供人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的体外活性试验，其包括利用已掺入了SP6病毒启动子的寡核苷酸作为5’寡核苷酸从样品中经PCR扩增HBV DNA聚合酶，在有放射性标记试剂存在的情况下直接转录和翻译所述PCR产物，并测定HBV DNA聚合酶的引发。本发明还提供这样一种试验在各种血清样品的活性测试中的应用，在HBV DNA聚合酶抑制剂的筛选中的应用，以及在检测和/或筛选潜在的抗HBV药物对人类HBV DNA聚合酶的DNA引发活性的抑制能力方面的应用。

Description

人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的体外活性试验及其在HBV DNA聚合酶抑制剂的筛选中的应用

发明背景

聚合酶是对活生物体十分重要的一种基础酶。它们负责合成核酸并将它们转化为合成蛋白质必需的其它核酸。因此，在所有细胞类型包括致病性DNA病毒乙型肝炎病毒(HBV)中均可找到聚合酶。

HBV可导致肝炎，它是最常见的人类传染病之一，所引发的肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的癌症之一。目前预防HBV感染和发病的最有效措施是通过免疫接种抵抗HBV。目前认可的HBV疫苗由天然形式(质粒衍生的)或重组形式(从酵母细胞纯化)的主要表面抗原(HBsAg)组成。疫苗所诱导的抗体已显示可结合大多数位于HBsAg的第124至147位残基之间的抗原性‘a’表位，从而有效中和HBV复制。

尽管这类主动免疫接种计划已使人群中HBV感染降低，但所述‘a’表位内的突变在不断增多。疫苗诱导的这些HBV突变株受到关注，因为它们能逃避现有的基于免疫的有效诊断系统并能独立复制。

HBsAg的‘a’表位上的突变使HBV DNA聚合酶的重叠区产生氨基酸置换，尤其是改变它们在逆转录酶结构域内部的位置，这可能意味着疫苗诱导的这些突变已改变了逆转录酶(病毒复制的关键因素)的活性。

HBV是一类通过逆转录RNA中间体而复制它们的基因组的DNA病毒。将该RNA前基因组包装进核衣壳并启动复制主要取决于HBVDNA聚合酶与衣壳包装信号的相互作用。在所述前基因组RNA上有两套衣壳包装信号。只有其中的5’拷贝可作为引发反应的模板。负链DNA合成开始后，DNA寡聚体(4个核苷酸)以一种未知机制被转移至前基因组RNA的3’端，在那里它与它的互补序列杂交。逆转录随后持续至该RNA模板的5’端。HBVDNA聚合酶与前基因组RNA的相互作用使DNA聚合酶N末端的酪氨酸残基与所述衣壳包装信号内一段特异性核苷酸之间的共价连接。HBV逆转录酶是DNA聚合酶大区内的4个结构域之一。其它结构域包括：i)N末端蛋白质，其使聚合酶与前基因组RNA共价连接；ii)间隔壁区，其很少发生突变；以及iii)RNA酶H结构域，其与mRNA中间体的降解有关。

与其它聚合酶相似，对HBV DNA聚合酶活性的体外检测可用于以下三种情况：

-鉴定新分离的复制型病毒，评估其与其它已知病毒的差异。这尤其常见于表面抗原带有突变的HBV变体；

-确定对已知感染者的待测物质中病毒的成功分离；

-评估有可能作为抗病毒试剂的聚合酶抑制剂的体外效力。

已建立各种系统用于测量缺乏病毒复制和其它病毒蛋白时HBV DNA聚合酶的体外活性。一个有趣的发现是，检测HBV DNA聚合酶的引发活性不仅需要N末端蛋白质还需要有功能的逆转录酶结构域。因此这些系统的一个共同特点是，HBV DNA聚合酶的引发活性的检测可指示HBV DNA聚合酶的活性。这类系统中的两个利用了鸭的HBV(DHBV)DNA聚合酶，它们均证实了依赖模板并由蛋白质引发的逆转录酶活性。其中一个DHBV系统利用DHBV DNA聚合酶的体外翻译获得了包含功能性DNA聚合酶的裂解物，另一系统将DHBV DNA聚合酶的一种活性融合蛋白从酵母的逆转座子Tyl包装至病毒样颗粒中。活性DNA聚合酶可通过其引发活性测量，如在有引发核苷酸(即DHBV DNA聚合酶的[α-³²P]dGTP)时放射性标记蛋白质所指示的那样。最近有人报道了一种类似的人类HBV DNA聚合酶的活性试验。所报道的所有构建体中均包括带衣壳包装信号的聚合酶3’非编码区一段350碱基对，从而说明它对体外活性试验的重要性。

人HBV DNA聚合酶的体外活性试验的一个直接应用可能是对新型抗病毒试剂的筛选。慢性HBV感染的抗病毒治疗一直是一个问题，因为数项临床试验已显示，参与研究的病人仅有30-40％能维持对干扰素或核苷类似物的应答。在长期HBV携带者和免疫受损的病人中该应答率甚至更低。需要设计消除HBV的新化疗方案，因为大多数病人并未清除病毒感染，并因此是发展为更严重肝脏疾病和肝细胞癌(HCC)的高危人群。同样特别需要评估这类试剂对人HBV表面抗原突变体的抗病毒效应。

但是应用现有的人HBV DNA聚合酶体外活性试验进行抗病毒检测存在限制因素。限制之一是所有现有系统都要求通过克隆将HBV DNA聚合酶的编码区置于质粒(如pGEM-T)上的一种病毒聚合酶启动子(如SP6或T7)的控制之下。此外，某些系统中表达的HBV DNA聚合酶在进行其活性试验前需要进一步纯化(即免疫沉淀)。这些繁琐的操作因HBV突变体的极大数量而无法实施。

发明简述

本发明第一方面提供一种人乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的体外活性试验，其包括利用已掺入了SP6病毒启动子的寡核苷酸作为5’寡核苷酸从样品中经PCR扩增HBV DNA聚合酶，在真核细胞的无细胞裂解物中直接转录和翻译所述PCR产物，并在有放射性标记试剂的情况下测定HBVDNA聚合酶的引发。

上述第一方面的实验，其中所述寡核苷酸和SP6病毒聚合酶启动子形成复合物，该复合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳从所述试验缓冲液中分离。

上述第一方面的实验，其中所述寡核苷酸和SP6病毒聚合酶启动子形成复合物，该复合物通过过滤从所述试验缓冲液中分离。

本发明第二方面提供本发明第一方面的试验在分析各种血清样品的活性和/或筛选HBV DNA聚合酶的抑制剂时的应用。

本发明第三方面提供本发明第一方面的试验在检测和/或筛选潜在抗HBV药物对人类HBV DNA聚合酶的DNA引发活性的抑制能力方面的应用。这类应用优选包括以下步骤：

a)在指定体积的试验缓冲液中制备至少一份样品，每份样品在真核细胞的无细胞裂解物中包含以线性PCR产物为模板经体外翻译成的HBVDNA聚合酶蛋白，以及HBV负链合成所需的含有能形成茎环结构之序列的RNA模板，

b)在等体积试验缓冲液中制备对照样品，所述对照样品包含以线性PCR产物为模板经体外翻译而成的HBV DNA聚合酶蛋白，和HBV负链合成所需的RNA模板，该RNA模板含有能形成茎环结构的序列，为结合和引发人HBV DNA聚合酶所必需，

c)将样品保温，以获得含有DNA聚合酶和放射性标记试剂的复合物，

d)将所述复合物从试验缓冲液中分离出来，以及

e)测定每份分离的复合物中放射性试剂的含量，该含量可以指示人HBV DNA聚合酶的DNA引发活性。

上述步骤c)，d)和e)可替换为：

c)在适于上述人HBV DNA聚合酶的DNA引发活性的指定条件下，使上述每一试验管及上述每一对照管与等量的放射性标记之核苷三磷酸(其包括已插入上述HBV负链DNA中的第一个核苷酸)一起保温，导致形成一种复合物，该复合物中含有上述DNA聚合酶和上述放射性标记的核苷三磷酸；

d)通过硝酸纤维素膜过滤将上述复合物从上述每一试验管和上述每一对照管的试验缓冲液中分离出来；

e)测定上述每份分离的复合物中放射性标记的核苷三磷酸的含量，该含量可以指示上述人HBV DNA聚合酶的DNA引发活性；

f)比较上述每一试验管和上述每一对照管中仍结合在硝酸纤维素膜上的上述分离的复合物中放射性标记的核苷三磷酸的各自含量，试验管中分离的复合物中的放射性标记之核苷三磷酸的含量低于对照管，则说明上述人HBV DNA聚合酶的DNA引发活性被上述潜在的抗HBV药物抑制。

本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的一项简化的活性试验，其很可能比以前的试验更快。该方法涉及将SP6病毒聚合酶启动子引入一寡核苷酸，该寡核苷酸随后作为5’寡核苷酸用于经PCR从血清样品中扩增HBV DNA聚合酶。这种含有完整编码区和一段3’非编码区(300bp，带衣壳包装信号)的PCR产物可直接在小麦生殖细胞的无细胞提取物中转录和翻译。在有放射性标记的[α-³²P]dTTP存在时，测量HBV DNA聚合酶向RNA中间体模板的引发，所述模板是其酶活性的关键指示物。本发明的应用包括对各种血清样品(包括有HBV主要表面抗原突变的那些)的活性试验，以及对HBV DNA聚合酶抑制剂的筛选。

本发明提供一种简化方法，用于直接在扩增自血清样品的线性DNA模板中体外分析人HBV DNA聚合酶活性。该活性试验所涉及的蛋白质一般在小麦生殖细胞的无细胞系统中通过线性DNA模板(其5’末端含有一个SP6病毒聚合酶启动子)的转录加翻译而产生。

为达到此目的和其它目的，本发明提供直接从扩增自血清样品的线性DNA片段产生HBV DNA聚合酶的方法。在有放射性标记试剂如[α-³²P]dTTP存在时，可分析所得蛋白质的引发活性，这是乙型肝炎病毒复制的关键步骤。

发明详述

本发明提供一种简单、敏感、快速的特别针对HBV DNA聚合酶活性的试验。本发明包括一种检测血清样品中HBV DNA聚合酶活性的方法，该方法包括：

-用酚/氯仿从血清中经一步法提取HBV病毒DNA；

-通过PCR扩增HBV DNA聚合酶的编码区(2400碱基对)及其3’非编码区(310碱基对)。其5’寡核苷酸包括5’近端SP6病毒聚合酶启动子；

-以PCR扩增产物为模板体外翻译HBV DNA聚合酶；

-在有放射性标记的引发核苷酸时对含有翻译的HBV DNA聚合酶的提取物进行活性分析；

本发明的其它主题还包括实施所述方法的试剂、测定物质对聚合酶活性的抑制效应的方法、以及对表面抗原突变的HBV变体之聚合酶活性的应用。

根据本发明，血清样品可能含有一种HBV变体，其DNA聚合酶活性不确定。本发明可以对它进行定性测定。当需要对所述DNA聚合酶活性进行定量测定时，可对本发明的活性试验进行进一步开发(即在硝酸纤维素膜上测定引发的DNA聚合酶)。当需要测定一种分子对所述DNA聚合酶的抑制效应时，可以将引发的DNA聚合酶的量与对照样品的产生量比较，所述对照样品不含抑制分子。本发明血清样品包含人HBV野生型或称为表面突变体的新菌株，其是由于对乙型肝炎接种耐受而出现，或出现于正常症状人群中，以及有乙型肝炎病毒肝病的个体中。

以下将以实施例的形式并配以附图提供参考，以便更好地理解本发明。

图1显示人HBV基因组的线性化结构。人HBV DNA聚合酶的编码区(方框)及其3’非编码区(红线)均包含在本发明的PCR扩增中。下面的数字表示野生型HBV adw亚型基因组中的位置，如GenBank中所定义：箭头表示位置和PCR扩增中所使用的寡核苷酸的方向，它们的序列展示于箭头之上(5’)或之下(3’)。除了与该HBV DNA聚合酶的起始部分配对的序列(编码区的头27个碱基)，病毒SP6启动子( ATTTAGGTGACACTATAGAACTC)也已参入5’端。5’有义寡核苷酸的位置是2309至2335位(箭头)，而3’反义寡核苷酸覆盖了1917至1940位的区段(箭头)。

图2是一张照片，显示PCR产物的电泳模式，其扩增自携带野生型HBV的血清分离的病毒DNA。具有预期的2800碱基对大小的片段用箭头指示。‘M’泳道上还显示了分子量标记的移动位置(1kb DNA梯度，MBIFermentas)。

图3是一张放射性自显影照片，显示小麦生殖细胞裂解物在有[³⁵S]甲硫氨酸存在时直接从PCR扩增产物体外翻译的野生型HBV DNA聚合酶。[³⁵S]标记的人HBV DNA聚合酶如所预期为90千道尔顿(kD)，用箭头表示。图左外侧为分子量标志(Rainbow蛋白质迁移标志，Amersham)的位置。

图4是一张放射性自显影照片，显示野生型HBV DNA聚合酶(在小麦生殖细胞裂解物中合成)在有[α-³²P]dTTP存在时的体外引发活性。[α-³²P]dTTP标记的人HBV DNA聚合酶如所预期为90千道尔顿(kD)，用箭头表示。图左外侧为分子量标志(Rainbow蛋白质迁移标志，Amersham)的位置。

图5是一张放射性自显影照片，显示野生型HBV DNA聚合酶(第一泳道)、表面抗原突变体‘s’145(第二泳道)和‘s’126(第三泳道)在有[α-³²P]dTTP存在时的体外引发活性。三种病毒株的[α-³²P]dTTP标记的人HBVDNA聚合酶如所预期均为90千道尔顿(kD)，用箭头表示。图左外侧为分子量标志(Rainbow蛋白质迁移标志，Amersham)的位置。

图6概述了核苷酸类似物对人野生型HBV DNA聚合酶的抗引发效应。柱表示保留在硝酸纤维素膜上的放射性标记的人HBV DNA聚合酶，由cpm测定。对照指示人HBV聚合酶在没有核苷酸类似物的情况下的体外引发活性。有特定核苷酸类似物时的活性分析结果有相应表示(即+ddTTP表示有ddTTP时的活性分析)。有ddTTP或ddATP存在时保温，相对于对照均无明显的抗引发效应。相反，有ddGTP，ddCTP时观察到抑制效应。与我们的结果一致的是，加入拉米夫定(lamivudine)也观察到抗引发效应，拉米夫定是3’硫胺胞嘧啶核苷的负链enontiomer，一种临床上广泛用于治疗由活跃HBV复制的HBV携带者的胞嘧啶二脱氧核苷酸类似物。

总述

野生型HBV病毒DNA可以用酚/氯仿从血清样品中提取。在本发明第一步中用特异性寡核苷酸(图1)实施PCR扩增。5’有义寡核苷酸与HBVDNA聚合酶编码区的头27个核苷酸配对，并在其近端插入SP6启动子。3’反义寡核苷酸与HBV DNA聚合酶终止密码子下游的300碱基对区域配对。所得线性DNA扩增产物为2800碱基对(图2)，直接将其用于在小麦生殖细胞的无细胞系统中进行体外转录/翻译，方法按说明书(Promega，U.S.A.)。

在有[³⁵S]甲硫氨酸存在时，体外翻译产生约90kD的蛋白质产物，与843氨基酸的聚合酶多肽的预计大小一致，见图3。该结果与以前对DHBVDNA聚合酶活性试验的报道一致，这再次强烈表明已经用上述线性PCR扩增产物作模板适当转录了人HBV DNA聚合酶。

为了分析人HBV DNA聚合酶活性，将体外翻译反应的混合物在包含dATP、dCTP、dGTP以及放射性标记的[α-³²P]dTTP的溶液中保温，所述反应混合物含有在缺乏任何放射性标记氨基酸(即[³⁵S]甲硫氨酸)的情况下新合成的聚合酶。核苷酸分析领域常规使用的任何标记形式都可以用于对将被掺入引发的聚合酶中的核苷酸进行标记，如荧光标记或吸附标记，但优选使用放射性标记。本发明选用[α-³²P]dTTP是因为它相较于其它三种核苷酸具有较高的引发特异性。

根据所使用的标记类型，对引发产生的放射性标记的聚合酶产物可通过任何适当的方法检测。这通常包括从引发产生的放射性标记的聚合酶产物中分离所标记的单核苷酸(即[α-³²P]dTTP)的步骤。在本发明中，引发反应的产物优选用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。图4显示人野生型HBVDNA聚合酶在[α-³²P]dTTP，这种人源HBV DNA聚合酶的特异性引发核苷酸存在时的引发活性分析结果。通过放射性自显影检测具有预期大小的蛋白质条带可以指示HBV DNA聚合酶的引发活性。

也可以通过硝酸纤维素膜的过滤监控所述聚合酶活性试验。在适当条件下硝酸纤维素膜上只保留非显著量的未掺入的[α-³²P]dTTP，故可以观察引发产生的放射性标记聚合酶的定量结合。

本发明可以用以下实施例进一步说明，但在任何意义上本发明都不受限制于这些实施例。

实施例

总的试验方法

携带野生型HBV的血清中病毒DNA的分离如下：将200μl血清样品加入400μl裂解液(Tris-HCl 10mM，pH7.4，EDTA 1mM，和2％十二烷基硫酸钠)和25μl蛋白酶K(20mg/ml)，在65℃保温3小时。然后将病毒DNA用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。用以下寡核苷酸进行PCR扩增。5’寡核苷酸为有义寡核苷酸( AAATTTAGGTGACACTATAGAATATGCCCCTATCTTATCAACACTTCC)，在其近端(下划线序列)包含一个SP6启动子，并在HBV DNA聚合酶编码区的起始区具有其配对区(野生型HBV基因组中2309至2340位)。3’寡核苷酸为反义寡核苷酸(ACAGTAGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCA)，HBV DNA聚合酶的终止密码子下游300个碱基对处具有其配对区(野生型HBV基因组中1940至1911位)。所得PCR产物因此比已公开的(50个碱基对)短。[α-³²P]dTTP(3000Ci/mmole)和[³⁵S]甲硫氨酸(1000Ci/mmole)来自Amersham。非标记的dATP，dCTP和dGTP来自Promega。

除非另有说明，所述聚合酶活性试验在以下溶液中进行，所述溶液含有100mM Tris HCl(pH7.5)，10mM MgCl₂，3mM NaCl，10％甘油，4mM二硫苏糖醇，未标记的脱氧核糖核苷三磷酸(dATP，dCTP和dGTP)各100μM和5μCi[α-³²P]dTTP。反应在30℃保温30分钟，然后取5μl等分试样加入85μl tricine十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)样品缓冲液(Novex，U.S.A.)，取10μl在10％SDS-PAGE上分析。电泳后，将凝胶浸泡在加了10％醋酸的10％甲醇中固定，并真空干燥。使干胶接触X-线胶片，信号用激光密度测定法定量。

实施例1

HBV表面抗原突变株的聚合酶活性试验

本发明所报道的人HBV DNA聚合酶的简易活性试验，它的一个直接应用是评估有主要表面抗原突变的HBV变体，尤其以下疫苗接种(即‘S’145)所诱导的变体的相关活性。如上述从含有这类HBV变体的血清样品中提取病毒DNA。本发明涉及的突变株包括‘S’145(甘氨酸到精氨酸的突变)和‘S’146(苏氨酸到丙氨酸的突变)，它们能逃避现有免疫检测系统并能独立复制。用所述病毒DNA为模板，以相同的寡核苷酸引物，在DNA热循环仪(Perkin-Elmer，Cetus)上使用Taq聚合酶(Promega，U.S.A.)进行35个循环的PCR，每个循环包括在变性温度(94℃)1.5分钟，在退火温度(53℃)2分钟和在延伸温度(72℃)4分钟。

将含有SP6启动子并从每一HBV突变株中扩增的PCR产物加入小麦生殖细胞的无细胞系统。根据说明书(Promega，U.S.A.)进行体外的联合转录/翻译。简短说，将10μl PCR产物加入25μl小麦生殖细胞提取物，该提取物中添加了SP6 RNA聚合酶、氨基酸混合物(在缺乏[³⁵S]甲硫氨酸的情况下)、RNA酶抑制剂和反应缓冲液。将反应混合物在30℃保温60分钟。所得提取物含有翻译的HBV DNA聚合酶，将其加入总的试验方法一节所述溶液中，并如上述分析聚合酶活性。这类分析的结果示于图5，其说明突变株‘S’145(泳道2)或‘S’146(泳道3)的HBV DNA聚合酶与野生型酶的(泳道1)相比显示相似的引发活性。或者，可用激光密度测定法进行定量测定，其可比较所引发的放射性标记聚合酶的强度。

实施例2

检测人类HBV DNA聚合酶的抑制剂

筛选人HBV DNA聚合酶的抑制剂将提供HBV感染的新治疗试剂，因为对聚合酶活性的有效抑制将导致对HBV病毒复制的抑制。本发明所报道的简化活性试验能更快速分析新发现的分子对携有主要表面抗原突变之HBV变体的DNA聚合酶的抑制效应。简言之，先使候选抑制剂与如本发明的报道经PCR扩增和体外翻译的野生型人HBV DNA聚合酶一起保温。保温时有[α-³²P]dTTP以及上述其它条件存在。其抑制效应可通过激光密度测定法和随后的SDS-PAGE分析测定，或通过测定过滤后结合于硝酸纤维素膜上的放射性标记HBV DNA聚合酶的量而测定。显然，对这类抗病毒试剂的抑制效应的分析可方便地应用于HBV变体，包括本发明中也涉及到的疫苗诱导的‘S’145突变体(图5)。衍生自上述试验的进一步潜在抑制效应试验可再扩展至其它系统如产生HBV的细胞系以及转基因动物模型。

根据所使用的标记类型，标记的HBV DNA聚合酶杂交产物可通过任何适当的方法检测。这通常包括从标记的人HBV DNA聚合酶中分离所标记的单核苷酸的步骤。在一个优选实施方案中，通过使样品混合物(此时在所述试验方法中，包含标记的人HBV DNA聚合酶和过量标记的单核苷酸)滤过硝酸纤维素膜而进行检测。未掺入的过量标记的单核苷酸流过滤膜，而标记的聚合酶杂交反应产物则被结合在硝酸纤维素膜上。在本发明报道的简化试验中，当标记为放射性标记时，结合在滤膜上的放射活性的量可用平板闪烁读数仪(plate reading scintillation counter)测定。这类测量与本发明所述前一个方法相比，明显的优势在于其不含电泳步骤。

在本发明中，可分析以下能抑制HBV DNA聚合酶活性的核苷酸类似物的抗引发活性。这些包括ddTTP，ddGTP，ddCTP，ddATP和拉米夫定。试验条件与总的试验方法一节中所述相同。简言之，在特定核苷酸类似物的抗引发活性检测中，试验混合物中的核苷酸以相应的核苷酸类似物取代(即检测ddGTP的抗引发活性时，以ddGTP代替dGTP)。相反，当检测ddTTP以及拉米夫定的抗引发活性时无需核苷酸取代(因为本发明中放射性标记的核苷酸是dTTP)。保温结束时，将反应混合物通过常规印迹转移至一张硝酸纤维素膜(2×2cm)上。然后通过将硝酸纤维素膜在400ml Tris HCl(pH7.5)，100mM NaCl，20mM MgCl₂，和0.5％牛血清白蛋白中洗涤而分离出未掺入的放射性标记dTTP。结合在硝酸纤维素膜上的放射性标记的人HBV DNA聚合酶然后用平板闪烁读数仪测定。示于图6的结果说明，在有ddCTP和ddGTP存在时[³²P]标记的人HBV DNA聚合酶的量明显低于对照试验(缺乏任何核苷酸类似物)的，从而说明它们的抗引发活性。与之对比，未发现ddTTP或ddATP的抗引发活性。

本发明的基础是对人HBV DNA聚合酶的简化的活性试验。该发明使得有可能对血清样品中人HBV DNA聚合酶的活性进行直接快速测定，而无需目前所要求的克隆。因此它可快速评估并监控主要表面抗原有突变的HBV变体的数量增长。该发明还使得有可能对抗病毒试剂之抑制效应进行简易分析，这些试剂针对上述HBV变体，尤其经疫苗接种后诱导的相关于肝脏疾病的那些(即‘S’145)以及将逐渐导致肝脏疾病的无症状个体中发现的那些。

序列表

<110>新加坡共和政府

<120>人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶的体外活性试验，及其在HBVDNA聚合酶抑制剂的筛选中的应用

<130>JAS/TW/PSC/A.2911/980

<140>PCT/SG99/00017

<141>1999-03-13

<150>PCT/SG98/00077

<151>1998-09-29

<160>3

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>鼠伤寒沙门菌噬菌体SP6

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(23)

<400>1

atttaggtga cactatagaa ctc 23

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(23)

<220>

<223>人工序列的描述：核苷酸1-23为SP6启动子；核苷酸23-48来自乙型肝炎病毒

<400>2

aaatttaggt gacactatag aatatgcccc tatcttatca acacttcc 48

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>3

acagtagctc caaattcttt ataagggtca 30

Claims

1.一种人乙型肝炎病毒HBV DNA聚合酶的体外活性的测试方法，其包括用一种已掺入SP6病毒聚合酶启动子的寡核苷酸作为5’寡核苷酸在样品中进行HBV DNA聚合酶的PCR扩增，直接在真核细胞的无细胞裂解物中转录和翻译该PCR产物，并测定HBV DNA聚合酶在有放射性标记试剂存在时的引发。

2.权利要求1的测试方法，其中所述放射性标记试剂是放射性标记的核苷三磷酸。

3.权利要求2的测试方法，其中所述放射性标记的核苷三磷酸是dTTP或其一种类似物，所述的类似物指的是ddTTP，ddGTP，ddCTP，ddATP和拉米夫定。

4.权利要求1，2或3的测试方法，其中所述放射性标记试剂存在于一种试验缓冲液中。

5.权利要求4的测试方法，其中所述寡核苷酸和SP6病毒聚合酶启动子形成复合物，该复合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳从所述试验缓冲液中分离。

6.权利要求4的测试方法，其中所述寡核苷酸和SP6病毒聚合酶启动子形成复合物，该复合物通过过滤从所述试验缓冲液中分离。

7.权利要求4的测试方法，其中所述样品是一种血清样品。

8.权利要求7的测试方法，其中所述血清样品包含人HBV野生型或称为表面突变体的新菌株，其是由于对乙型肝炎接种耐受而出现，或出现于正常症状人群中，以及有乙型肝炎病毒肝病的个体中。

9.权利要求1的测试方法在各种乙型肝炎血清样品的活性试验中的应用。

10.权利要求1的测试方法在筛选HBV DNA聚合酶抑制剂中的应用。

11.权利要求1的测试方法的应用，其用于检验和/或筛选潜在的抗HBV药物对人HBV DNA聚合酶之DNA引发活性的抑制能力。

12.权利要求11的应用，包括以下步骤

a)在指定体积的试验缓冲液中制备至少一份样品，每份样品包含在真核细胞的无细胞裂解物中用线性PCR产物为模板体外翻译的人HBV DNA聚合酶蛋白，以及含有能形成茎环结构之序列的HBV负链合成所需的RNA模板，

b)在等体积试验缓冲液中制备对照样品，该对照样品包含用线性PCR产物为模板体外翻译的人HBV DNA聚合酶蛋白和HBV负链合成所需的包括能形成茎环结构之序列的RNA模板，所述茎环结构为人HBV DNA聚合酶的结合和引发所必需，

c)保温所述样品以获得含有DNA聚合酶和放射性标记试剂的复合物，

d)从所述试验缓冲液中分离所述复合物，和

e)测量每份分离的复合物中放射性标记试剂的量，此量可指示人HBVDNA聚合酶的DNA引发活性。

13.权利要求12的应用，其包括比较各复合物中放射性标记试剂的量。

14.权利要求11的应用，其包括以下步骤：

c)在适于所述人HBV DNA聚合酶的DNA引发活性的指定条件下，使所述每一样品及所述每一对照样品与等量的放射性标记之核苷三磷酸一起保温，导致形成一种复合物，其中所述核苷三磷酸包括已插入所述HBV负链DNA中的第一个核苷酸，所述复合物含有所述DNA聚合酶和所述放射性标记的核苷三磷酸；

d)通过硝酸纤维素膜过滤将所述复合物从所述每一样品和所述每一对照样品的试验缓冲液中分离出来；

e)测定所述每份分离的复合物中放射性标记的核苷三磷酸的量，该量可以指示所述人HBV DNA聚合酶的DNA引发活性；

f)比较所述每一样品和所述每一对照样品中仍结合在硝酸纤维素膜上的所述分离的复合物中放射性标记的核苷三磷酸的各自含量，样品中分离的复合物中的放射性标记之核苷三磷酸的含量低于对照样品，则说明所述人HBV DNA聚合酶的DNA引发活性被所述潜在的抗HBV药物抑制。

15.一种方法，其用线性PCR产物为模板直接从线性DNA片段产生HBVDNA聚合酶。

16.权利要求15的方法，其中所述方法包括将SP6病毒聚合酶启动子掺入5’有义寡核苷酸。

17.权利要求16的方法，其中所述5’有义寡核苷酸包括人HBV DNA聚合酶基因编码区的头27个核苷酸，SP6启动子位于所述寡核苷酸中HBV序列的上游。

18.权利要求15的方法，其中该方法包括3’反义寡核苷酸的合成，所述3’反义寡核苷酸位于人HBV DNA聚合酶基因终止密码子下游300碱基对处。