CN119300816A - 用于改善肌肉耐力或治疗或预防肌肉萎缩或营养不良的柚皮素或其衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良，或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的组合物、化合物和方法。这种组合物包括有效量的具有式(I)的化合物，或其药学上可接受的溶剂化物，或其任何组合，以及药学上可接受的赋形剂。这种化合物是柚皮素或柚皮素衍生物。也提供了制备该化合物或组合物的方法。

Description

用于改善肌肉耐力或治疗或预防肌肉萎缩或营养不良的柚皮 素或其衍生物

优先权和相关申请

本发明要求2022年03月24日提交的美国临时申请62/323,146的优先权，该申请的全部内容通过引用明确并入本文。

技术领域

本发明涉及具有药物或功能性质的组合物。更具体地说，涉及一种包含柚皮素或其衍生物的组合物、制备该组合物的方法，以及使用该组合物的方法，例如作为药物组合物、功能组合物和/或膳食补充剂。

背景技术

骨骼肌是哺乳动物体内最大的器官，在支持运动、产热和代谢调节等方面发挥着极其重要的作用。然而，其功能会因衰老、久坐不动的生活方式以及肌肉相关疾病而受损，导致其耐力或力量下降。骨骼肌萎缩和肌肉功能减退伴随着衰老过程(Porter等人，1995)。研究表明，老年人的快肌纤维横截面积减少、线粒体呼吸链复合物表达降低以及骨骼肌有氧呼吸能力下降(Carter等人，2015；Murgia等人，2017)。相应地，从功能上来看，老年小鼠的绝对握力比成年小鼠低26％，相对握力低15％(McArdle等人，2004)。

此外，不运动的小鼠比定期在跑轮上运动的小鼠有更多与年龄相关的肌肉质量和线粒体功能障碍的损失(Figueiredo等人，2009)。久坐的老年男性会伴随IIa型纤维(氧化型肌纤维)的减少以及所有纤维类型的线粒体含量的减少(St-Jean-Pelletier等人，2017)。此外，各种肌肉疾病会导致肌肉萎缩和功能障碍。例如，杜氏肌营养不良症(DMD)，是儿童中最常见的肌营养不良症，会导致近端肌肉无力和小腿部肥大，最终导致骨骼和心肌的退化(Falzarano等人，2015；Kamdar和Garry，2016)。因此，健康的骨骼肌对生物体至关重要，肌肉损伤会严重影响健康和生活质量。

急需制定策略来对抗肌肉流失和功能衰退。已有研究证明，运动是一种有效的策略，可以在一定程度上改善肌肉功能并逆转肌肉老化。然而，对于长期卧床或存在其他临床并发症的患者来说，运动并不适用。因此，需要药物疗法来减少骨骼肌的流失并恢复肌肉功能。

近年来，肌肉功能障碍所涉及的信号通路已被阐明，不同类型的分子，如促炎细胞因子、生长因子和转化生长因子-β(TGF-β)家族效应物，被发现参与骨骼肌萎缩(Furrer和Handschin，2019；Lynch等人，2007)。有一些研究聚焦于这些分子，研究治疗靶点或药物以改善肌肉损失。例如，已有报道显示环氧酶2(COX2)抑制剂显著降低老年大鼠的白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1(IL-1)的血浆水平并增加肌肉质量(Rieu等人，2009)。肌肉抑制素(MSTN)可以显著减少肌肉质量，因此，MSTN作为治疗目标引起了广泛关注。LY2495655，一种人源化MSTN抗体，在临床试验中增加了老年人的肌肉质量；然而，握力并未受到影响(Becker等人，2015)。尽管一些药物可以改善肌肉质量的减少，但大多数试验未能显示出功能参数的显著改善(Furrer和Handschin，2019)。骨骼肌仍然是最被药理学忽视的器官之一。

除了药物的有效性外，药物的安全性也需要考虑。睾酮已被证明可以防止与年龄相关的肌肉力量损失并改善身体功能(Srinivas-Shankar等人，2010；Storer等人，2017)；然而，其临床使用受到严重副作用的限制(Grech等人，2014)。因此，需要发现比现有药物更安全、更有效的新天然药物，以改善骨骼肌的生理功能或防止肌肉萎缩。

柚皮素(NAR)，一种二氢黄酮类化合物，通常在蔷薇科、芸香科和柑橘科植物中以柚皮素的形式存在。据报道，NAR具有重要的生物活性，并对代谢疾病、心血管疾病、癌症、肺部疾病、神经退行性疾病和胃肠病理学有潜在的积极影响(Rivoira等人，2021)。例如，NAR补充剂可以增加能量消耗，增强胰岛素敏感性，并增加肝脏脂肪酸氧化，从而减少脂肪质量并改善代谢功能(Alam等人，2013；Goldwasser等人，2010；Pu等人，2012；Rebello等人，2019；Sacks等人，2018)。在作用机制方面，NAR主要通过PPAR家族、PGC-1家族和AMPK信号通路影响能量代谢(Goldwasser等人，2011；Mulvihill等人，2009；Yu等人，2019)。

发明内容

本公开提供了一种用于改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良，或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的组合物和方法。

在本发明中，发明人发现柚皮素(NAR)能够通过增加氧化型肌纤维数量和有氧代谢来改善自然衰老小鼠和mdx小鼠的肌肉耐力并缓解肌肉功能障碍。转录因子Sp1已被确定为NAR的直接靶标，这是通过生物素标记免疫共沉淀质谱法鉴定得出的，并且已经进一步验证了其结合位点是GLN-110。NAR通过上调Sp1磷酸化水平，增强了Sp1与Esrrg启动子CCCTGCCCTC序列的结合，从而上调了Esrrg的表达。Sp1-ERRγ转录轴的发现在基础骨骼肌研究中具有重要意义，而NAR的新功能对于预防久坐生活方式相关的有氧运动能力下降以及年龄或疾病相关的肌肉萎缩具有潜在的意义。

基于对柚皮素的研究，本发明得到了不同的化合物，包括其衍生物，这些化合物被用于提高骨骼肌耐力，治疗肌肉萎缩或营养不良，或者预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良。本发明也得到了至少包含一个衍生物的组合物。

一方面，本公开提供了一种用于改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良，或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的组合物。这种组合物包括有效量的具有本文所述的式(I)(也具有代码S1)的化合物，或其药学上可接受的溶剂化物，或其任何组合，以及药学上可接受的赋形剂。

式(I)具有如下的化学结构：

在式(I)中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组。在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。这样的化合物是柚皮素或柚皮素衍生物。

在一些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是除H以外的取代基。例如，在一些实施方式中，R₁或R₂是除H以外的取代基，R₃＝H，且R₄＝H。

所述组合物可以是药物组合物、功能组合物和/或膳食补充剂。例如，该组合物是药物组合物，可以注射或口服。该组合物最好是可注射的。化合物的浓度可能在1mM到50mM的范围内，例如，2mM到15mM，5mM到10mM，或任何其他适当的浓度。

所述赋形剂可以是溶剂、共溶剂、着色剂、防腐剂、抗菌剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、乳化剂、悬浮剂或其任何组合。例如，在一个可注射的组合物中，赋形剂包括由20％DMSO和80％盐水按重量计算的载体。

另一方面，本公开提供了一种具有式(I)的化合物，如本文所述，或其药学上可接受的溶剂化物，或其任何组合。本公开提供了任何如本文所述的化合物属或种。在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组。至少有一个R₁、R₂、R₃和R₄是除H以外的取代基。这样的化合物是一种柚皮素衍生物。在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。

在一些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是H以外的取代基。例如，在一些实施方式中，R₁或R₂是H以外的取代基，R₃＝H，且R₄＝H。

所述化合物可以是一种具有所需溶解性和药理性质的合适的化合物。

另一方面，本公开提供了一种制备本文所述的组合物或化合物的方法。这种方法可能包括制备所述化合物。该方法可能进一步包括混合赋形剂和化合物。

另一方面，本公开提供了一种改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良，或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的方法。该方法包括将适量的本文所述组合物给药至需要此类治疗的受试者。

在某些实施方式中，具有式(I)的化合物中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组。至少有一个R₁、R₂、R₃和R₄是除H以外的取代基。这样的化合物是柚皮素或柚皮素衍生物。在某些实施方式中，每个R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。

在一些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是H以外的取代基。例如，在一些实施方式中，R₁或R₂是H以外的取代基，R₃＝H，且R₄＝H。

在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，最好是人类受试者，可以是健康的人类，或者是有年龄或疾病相关肌肉萎缩的成年人。

在一些实施方式中，所述组合物通过肌肉注射或口服给药。优选的是注射给药。在某些实施方式中，所述组合物以每日一次或每隔一日一次的频率，以有效剂量的化合物在2mg/Kg至20mg/Kg范围内的剂量进行肌肉注射。给药剂量可以是任意适宜的剂量。例如，在某些实施方式中，有效剂量的化合物的剂量范围为3.6mg/Kg至7.6mg/Kg。

附图说明

本公开内容最好通过以下详细描述以及附带的图示来理解。需要强调的是，根据常规做法，图示的各种特征并不一定按比例绘制。相反，为了清晰起见，各种特征的尺寸可能会被任意放大或缩小。在规格和图示中，相同的参考数字表示相同的特征。

图1-3显示了中年小鼠在跑步机上的最大跑步距离(图1)、四肢抓力与体重的比值(图2)以及腓肠肌(GAS)肌肉重量与体重的比值(图3)，这些小鼠接受了腓肠肌内注射溶剂载体或NAR。每组n＝6，10月龄的C57小鼠。

图4-6显示了年轻小鼠在跑步机上的最大跑步距离(图4)、四肢抓力与体重的比值(图5)以及腓肠肌(GAS)肌肉重量与体重的比值(图6)，这些小鼠接受了腓肠肌内注射溶剂载体或NAR。每组n＝9/10，2月龄的C57小鼠。

图7-9显示了C57或mdx小鼠在跑步机上的最大跑步距离(图7)、四肢抓力与体重的比值(图8)以及腓肠肌(GAS)肌肉重量与体重的比值(图9)，这些小鼠都接受了腓肠肌内注射溶剂载体或NAR。每组n＝4-6，年龄为4月龄的C57小鼠或4月龄的mdx小鼠。

图10显示了用溶剂载体或NAR处理的10月龄的C57小鼠腓肠肌中Myh7、Myh2和Myh4的mRNA表达水平。每组n＝6。

图11显示了用免疫荧光染色法对10月龄的C57小鼠腓肠肌中MyHC I型肌纤维的定量统计结果，这些小鼠接受了溶剂载体或NAR的处理。

图12显示了用溶剂载体或NAR处理的10月龄的C57小鼠腓肠肌中与有氧代谢相关基因的mRNA表达水平。每组n＝6。

图13显示了用溶剂载体或NAR处理的2月龄的C57小鼠腓肠肌中Myh7、Myh2和Myh4的mRNA表达水平。每组n＝9/10。

图14显示了用免疫荧光染色法对2月龄的C57小鼠腓肠肌中MyHC I肌纤维的定量统计结果，这些小鼠接受了溶剂载体或NAR的处理。每组n＝9/10。

图15显示了用溶剂载体或NAR处理的2月龄的C57小鼠腓肠肌中与有氧代谢相关基因的mRNA表达水平。每组n＝9/10。

图16显示了通过免疫印迹分析溶剂载体或NAR处理后的2月龄C57小鼠的五种氧化磷酸化复合物水平的定量统计结果。β-肌动蛋白被用作内参对照。每组n＝7。

图17显示了4月龄的C57小鼠或mdx小鼠腓肠肌中与有氧代谢相关基因的mRNA表达水平，这些小鼠经过了溶剂载体或NAR的处理。每组n＝4-6。

图18显示了用DMSO或不同浓度(40、100、200、400、800、1600和2400μM)的NAR处理后的C2C12肌管形态。

图19显示了用DMSO或不同浓度的NAR处理的C2C12肌管中Myh7、Myh2和Myh4的mRNA表达水平。

图20显示了用DMSO或不同浓度的NAR处理的C2C12肌管中的ATP水平；

图21显示了用DMSO或NAR处理的C2C12肌管的耗氧率。添加寡霉素以阻止ATP偶联呼吸，添加FCCP以诱导最大呼吸，并添加抗霉素A/罗滕酮以阻止线粒体电子传递。共四次生物学重复实验。

图22显示了用DMSO或NAR处理的C2C12肌管中五种氧化磷酸化复合物水平的统计结果。

图23显示了用DMSO和NAR处理的C2C12肌管中与氧化磷酸化、三羧酸循环和β-氧化相关的基因的mRNA表达水平。由于空间有限，没有显著差异的变化未被标记。

图24显示了用DMSO或NAR处理的C2C12肌管中ERRγ水平的qPCR分析统计结果。β-肌动蛋白被用作内参对照。

图25显示了用DMSO或NAR处理的中年小鼠、年轻小鼠和mdx小鼠腓肠肌的ERRγ水平的qPCR分析。

图26显示了用DMSO或NAR处理的C2C12肌管(NC组和Esrrg敲低组)中Esrrg、Myh7、Myh2、Atp5b和Cpt1b的mRNA表达水平。

图27显示了生物素和生物素标记的NAR处理细胞后Sp1水平的免疫印迹分析。

图28显示了在细胞裂解液(体外)中进行细胞热转移实验(CETSA)以评估NAR和Sp1之间相互作用的实验结果。

图29显示了化合物NAR与Sp1结合的结构预测滑移对接模型。化合物NAR以蓝色棒状表示。黄色虚线描绘了预测的NAR与Sp1的ASN-81、SER-83和GLN-110残基结合的三个氢键。

图30-31显示了经过Mit-A预处理后，NAR处理和不处理的中年小鼠的最大跑步机运动距离(图30)和抓力(图31)。

图32显示了经过Mit-A预处理后，NAR处理和不处理的中年小鼠腓肠肌中MyHC I型肌纤维的免疫荧光染色的定量统计结果。

图33显示了经过Mit-A预处理后，NAR处理和不处理的中年小鼠腓肠肌中Myh7、Myh2和Myh4的mRNA表达水平。每组n＝6，10月龄C57小鼠。

图34显示了经过Mit-A预处理后，NAR处理和不处理的中年小鼠腓肠肌中ERRγ水平的qPCR分析。β-肌动蛋白被用作内参。每组n＝6，10月龄C57小鼠。

图35显示了经过Mit-A预处理后，NAR处理和不处理的中年小鼠腓肠肌中能量代谢相关基因的mRNA表达水平。每组n＝6，10月龄C57小鼠。

图36显示了在HEK293T细胞中对Esrrg启动子上潜在转录因子结合位点(Sp1)的删除分析和突变分析。

图37显示了在HEK293T细胞中过表达突变了预测结合位点的Sp1(Sp1-MT-Pocket1-GLN)后，细胞对NAR诱导的反应变化。

图38显示了NAR对Sp1磷酸化水平影响的免疫印迹分析。总Sp1水平被用作对照。

具体实施方式

在本公开中，单数形式“一种(a)”，“一个(an)”和“所述(the)”包括复数参考，对特定数值的引用至少包括该特定值，除非上下文明确指出其他情况。因此，例如，对“一种添加剂”的引用是对已知于本领域技术人员的一种或多种此类化合物及其等效物的引用，等等。当值被表达为近似值时，通过使用前导词“大约”，应理解特定值形成另一个实施方式。在此使用的“大约X”(其中X是数值)优选指的是所述值的±10％，包含在内。例如，短语“大约8”优选指的是7.2至8.8的值，包含在内；作为另一个例子，短语“大约8％”优选(但不总是)指的是7.2％至8.8％的值，包含在内。在存在的地方，所有的范围都是包含性的并且可以组合。例如，当提到“1到5”的范围时，应将提到的范围解释为包括“1到4”、“1到3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”、“2-5”等范围。此外，当正面提供替代列表时，这种列表可以被解释为意味着任何替代项都可能被排除，例如，通过在权利要求中的负面限制。例如，当提到“1到5”的范围时，应将提到的范围解释为包括排除1、2、3、4或5的任何情况；因此，“1到5”的提及可以被解释为“1和3-5，但不包括2”，或者简单地说“其中不包括2”。意图是，无论这些组件、元素、属性或步骤是否被列为替代方案或是否单独提及，只要在这里正面提及的任何组件、元素、属性或步骤都可以在权利要求中明确排除。

在本发明中，“受试者”和“患者”这两个词是可互换使用的。在这里，“患者”一词指的是动物，最好是哺乳动物，如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、鼠等)和灵长类(例如，猴子和人类)，最理想的是人类。在某些实施方式中，受试者是非人类动物，如农场动物(例如，马、猪或牛)或宠物(例如，狗或猫)。在特定的实施方式中，受试者是人类。在另一个实施方式中，受试者是人类成年人。在另一个实施方式中，受试者是人类儿童。在另一个实施方式中，受试者是人类婴儿。

在本发明中，术语“药物”指的是用于预防、治疗、管理和/或诊断疾病或病症的任何分子、化合物、方法和/或物质。在此使用的“有效剂量”一词指的是足以防止疾病或病症的发展、复发或发病，以及其一个或多个症状的疗法剂量，增强或改善另一种疗法的预防效果，减轻疾病或病症的严重程度和持续时间，缓解疾病或病症的一个或多个症状，防止疾病或病症的进展，引起疾病或病症的退化，和/或增强或改善另一种疗法的治疗效果。

在本发明中，短语“药学上可接受的”意味着已经得到联邦或州政府的监管机构批准，或者在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出，用于动物，特别是人类。

在本发明中，术语“治疗剂”指的是用于治疗和/或管理疾病或疾患的任何分子、化合物和/或物质。

在本发明中，术语“疗法”和“治疗”可以指用于预防、治疗和/或管理疾病或病症，或其一个或多个症状的任何方法、组合物和/或药物。在某些实施方式中，术语“治疗”和“疗法”指的是小分子疗法。

在本发明中，术语“治疗”、“疗法”和“治疗法”在对受试者进行疗法管理的背景下，指的是减少或抑制疾病或病况的进展和/或持续时间，减轻疾病或病况(如癌症)的严重程度，和/或由于一种或多种疗法的管理而改善其一个或多个症状。

在本发明中，术语“赋形剂”指的是作为药物或其他活性物质的载体或介质的非活性物质。适合的赋形剂的例子包括但不限于溶剂、共溶剂、着色剂、防腐剂、抗菌剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、乳化剂、悬浮剂或其任何组合。

在本发明中，术语“二氢色酮”和“色酮”是可以互换的，都指的是同一化学结构。除非另有说明，本文中描述的化合物是消旋的或没有手性的。在本次公开中使用的柚皮素(NAR)或NAR衍生物是消旋的。

NAR对骨骼肌的影响研究较少；现有的发现主要与糖尿病肥胖有关。在L6肌管细胞中，NAR激活AMPK并以胰岛素独立的方式直接刺激肌肉葡萄糖的摄取，这表明NAR可能调节骨骼肌葡萄糖稳态(Zygmunt等人，2010)。NAR可以通过增加小鼠骨骼肌中GLUT4的表达来缓解棕榈酸和果糖诱导的胰岛素抵抗(Mutlur Krishnamoorthy和Carani Venkatraman，2017)。在L6骨骼肌细胞中，NAR通过激活AMPK并因此增加GLUT4转位来增加肌细胞的葡萄糖摄取(Bhattacharya等人，2013；Zygmunt等人，2010)。然而，NAR对肌肉耐力和肌肉萎缩的影响仍不清楚。

在这项研究中，本发明的发明人探讨了NAR是否可以改善肌肉功能并保护肌肉免受衰老过程或肌肉疾病的影响。使用年轻成年小鼠、自然衰老的小鼠和mdx小鼠(DMD的临床前模型)作为模型，评估了NAR对运动能力和骨骼肌有氧代谢水平的影响。本发明的发明人发现NAR增加了氧化型肌纤维的数量，增强了体内外的有氧呼吸，并改善了自然衰老和mdx小鼠的肌肉功能障碍。从机制上讲，本发明的发明人发现Sp1是NAR的直接结合目标，NAR通过激活Sp1-雌激素相关受体γ(ERRγ)转录轴来影响骨骼肌。本发明的结果将为改善肌肉功能和治疗肌肉萎缩提供新的策略。

骨骼肌功能可能会因衰老、久坐不动的生活方式或疾病而受损；然而，到目前为止，骨骼肌仍然是药物治疗最不足的器官之一。本研究发现柚皮素(NAR)可以通过增加氧化型肌纤维数量和有氧代谢来改善自然衰老小鼠和mdx小鼠的肌肉耐力并改善肌肉功能障碍。通过生物素标记免疫共沉淀质谱法，确定转录因子Sp1是NAR的直接靶标，并且进一步验证了其结合位点为GLN-110。NAR通过上调Sp1磷酸化水平，增强了Sp1与Esrrg启动子CCCTGCCCTC序列的结合，从而上调了Esrrg表达。Sp1-ERRγ转录轴的发现在基础骨骼肌研究中具有重要意义，而NAR的新功能对于预防久坐生活方式相关的有氧运动能力下降以及年龄或疾病相关的肌肉萎缩具有潜在意义。

本发明的发明人发现了NAR在通过结合转录因子Sp1促进Sp1磷酸化，从而改善自然老化和mdx小鼠的骨骼肌耐力并保护肌肉免于萎缩方面的新功能。磷酸化的Sp1直接上调雌激素相关受体γ(ERRγ)的转录水平，从而调节能量代谢和肌肉重塑。

柚皮素(NAR)改善了自然衰老和mdx小鼠的肌肉功能障碍。NAR增加了氧化型肌纤维的数量并增强了有氧代谢。NAR与Sp1结合以增加其磷酸化和转录因子活性。激活Sp1-ERRγ轴促进能量代谢和肌肉重塑。

本发明的发明人进一步修改了柚皮素，以获得其不同的衍生物，这些衍生物有望提供改进的性能。

本发明还提供了一种包含柚皮素或其衍生物、衍生化合物的组合物，制备该组合物的方法，以及使用该组合物的方法，例如作为药物组合物、功能组合物和/或膳食补充剂。

方法

普通化学

NAR(柚皮素)(批号QY00305-180610，纯度≥98％)购自中国南京的清云生物有限公司。柚皮素探针(NAR-Biotin)的纯度通过带有ELSD、PDA检测器、样品管理器和二元溶剂管理器的Waters ACQUITY UPLC系统确定。制备性HPLC在带有Alltech 2424ELSD和2489PDA的Varian PrepStar系统上运行，使用Waters Sunfire RP C18(5μm，30×150mm)柱。电喷雾离子化(ESI)-MS光谱是在带有2998PDA检测器的Waters 2695仪器上获得的，该检测器与Waters ACQUITY ELSD和Waters 3100SQDMS检测器耦合，使用Waters Sunfire RP C18柱(4.6×150mm，5μm)，流速为1.0mL/min。HRESI-MS是在配备ESI离子源的Waters ACQUITYUPLC系统(Waters Corporation Milford，MA，USA)上进行的。MS检测是用Synapt G2-Si Q-TOF质谱仪(Waters Corporation，Milford，MA，USA)进行的。¹H和¹³C NMR光谱是在BrukerAVANCE III 500MHz仪器上记录的。化学位移以ppm(δ)报告，耦合常数(J值)以赫兹报告。化学位移以Me₄Si作为参考标准以ppm报告。

NAR(柚皮素)探针(NAR-生物素)的合成

将NAR(272mg，1.0mmol)、生物素(244mg，1.1mmol，1.1eq.)和DMAP(12.2mg，0.1mmol，0.1eq.)溶解在20ml的无水DMF中。EDCI(310mg，2.0mmol，2.0eq.)和Et3N(277μL，202mg，2.0eq.)。将该溶液在室温下搅拌过夜。反应用2M HCl溶液猝灭，然后用100ml的水稀释，并用乙酸乙酯提取。合并的有机相用水、盐水洗涤，并用无水MgSO₄干燥。有机溶剂在减压下蒸发，残留物通过制备HPLC(在水中含0.1％HCCOH的MeCN，40-60％，0-35min)纯化，得到产品(300mg，产率60％)。在288nm处的纯度：99.93％；¹HNMR(500MHz，Py-d₅)δ为7.64和7.38(d，J＝8.6Hz，每1H)、7.60和7.47(br.s，每1H)、6.50和6.43(d，J＝2.2Hz，每1H)、5.55(dd，J＝13.1，3.0Hz，1H)、4.58(m，1H)、4.42(m，1H)、3.26(m，1H)、3.19(dd，J＝17.0，13.1Hz，1H)、2.98(dd，J＝12.5，5.0Hz，1H)、2.91(m，1H)、2.89(dd，J＝17.0，3.0Hz，1H)、2.56(t，J＝7.4Hz，2H)，1.85-1.94(m，2H)、1.70-1.76(m，2H)、1.58-1.63(m，2H)；¹³C NMR(125MHz，Py-d₅)δ为196.31、172.51、169.18、165.64、164.82、164.15、152.07、137.40、128.60、128.60、123.05、123.05、103.27、97.94、96.68、79.48、62.97、61.08、56.71、43.85、41.54、34.60、29.54、29.37和25.52；ESI-MSm/z499.24[M+H]⁺，497.24[M-H]⁺；C₂₅H₂₇N₂O₇S[M+H]⁺的HRESI-MS(m/z)值计算为499.1539，发现为499.1544。

小鼠和细胞系

HEK293T细胞(人胚胎肾细胞，雌性)和C2C12细胞(小鼠间充质前体细胞，性别未知)从美国菌种保藏中心(ATCC)获得。这些细胞在37℃、5％CO₂的条件下，用4.5g/L(25mM)葡萄糖Dulbecco’s修饰的Eagle’s培养基进行培养，该培养基添加了10％胎牛血清(Gibco)和青霉素/链霉素(Gibco 15070063)。使用2％马血清(Gibco)诱导C2C12细胞向肌管分化，持续三天。本实验中使用的小鼠包括从Vital River公司购买的10月龄和2月龄的C57BL/6N雄性小鼠，以及从GemPharmatech购买的4月龄的C57BL/10ScSnJGpt-Dmdem3Cd4/Gpt(mdx)雄性小鼠。实验开始前，这些小鼠被饲养在标准笼中，每组2-6只动物，在温度控制室(21-23℃)内以标准化条件饲养，维持12：12小时的光暗周期，提供标准的鼠粮和水供其随意食用。所有动物研究均经过中国科学院动物委员会(IACUC)审查并批准。

小鼠骨骼肌肌肉注射

对小鼠后肢的腓肠肌和胫骨前肌(仅在2月龄的小鼠中)进行了处理，通过肌肉注射的方式，每隔两天进行一次，总共进行了十五次注射。肌肉注射的体积为腓肠肌40μL，胫骨前肌20μL，NAR的浓度为8mM，其中包含20％的DMSO和80％的生理盐水。载体是20％的DMSO和80％的生理盐水。对于10月龄的小鼠，预先注射了50μM的Mit-A(Abcam ab142723)以阻断Sp1的转录活性。

跑步实验

实验前2天，通过在LE8710RTS跑步机检测系统(Panlab/Harvard Apparatus)上以15度倾斜的方式，15cm/s的速度跑步练习5min/day让小鼠适应跑步机。对于运动实验，每5min将速度增加5cm/s，直到达到30cm/s，并让小鼠一直跑到筋疲力尽。然后，计算小鼠跑步的总距离。

抓力实验

使用GT3抓力测试仪器系统(Bioseb，法国Vitrolles)记录肌肉抓力。允许小鼠用四只爪子抓住金属网格，然后轻轻向后拉其尾巴，直到它们无法再握住网格。峰值拉力被记录在数字力传感器上。10次测量的最大值用于代表每只小鼠的抓力。

冷冻切片的免疫荧光染色

腓肠肌被嵌入包埋剂OCT中，然后在液氮中冷冻，并储存在-80℃超低温冰箱中。肌肉的冰冻切片(8μm)在冷丙酮(预冷至-20℃)中固定20min，用PBS洗涤三次，并用0.5％的Triton X-100/PBS(PBST)渗透三次，每次10min。洗涤后，通过在室温下与5％的BSA孵育2h来阻止滑片，然后与以下抗体孵育：BA-F8用于MHC类型1(1：100)，BF-F3用于MHC2b(1：100)，SC-71用于MHC-2a(1：100)(美国爱荷华大学发育研究杂交瘤库)。切片在室温下与AlexaFluor 350-、488-和594-结合的二抗(1：100)(Invitrogen)避光孵育1h。然后在共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss LSM710)下观察拍照。

耗氧量测量

使用Seahorse Bioscience的XF24细胞外通量分析仪测量细胞耗氧量。C2C12肌管在XF24 V28细胞培养微板(Seahorse Bioscience，North Billerica，MA，USA)上用DMSO或400μM NAR处理24h。有关详细的实验程序，请参阅实验指南(Agilent Seahorse XF CellMito Stress Test Kit)。

RNAi干扰和抑制剂处理实验

根据制造商的说明书，针对小鼠Sp1和Esrrg的siRNAs(JST)以最终浓度50nM使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen 11668019)转染到C2C12细胞中。细胞分化3天，然后用或不用400μM NAR处理24h。对于Sp1和ERRγ抑制研究，肌管预先用DMSO、250nM Mit-A或10μM 4-OHT(MCE，HY-16950)处理2h。然后再用或不用400μM NAR处理24h。

质粒制备、细胞转染和荧光素酶报告基因分析

从小鼠腓肠肌组织中提取的总cDNA通过PCR扩增Sp1 cDNA序列，经双酶切后与同样用该内切酶消化的pcDNA3.1载体转化，得到Sp1过表达载体。

根据NCBI数据库提供的小鼠Esrrg基因组序列，利用Primer 5软件设计适用于PCR扩增不同长度Esrrg启动子序列的引物。用KpnI/HindIII(NEB)限制性内切酶双酶切经PCR获得的Esrrg启动子序列，琼脂糖凝胶电泳回收后与同样经过该内切酶消化的pGL3-basic载体连接，用T4连接酶(NEB)获得pSE-1518、pSE-1518DEL、pSE-1080和pSE-129荧光报告质粒。以pSE-129质粒为模板通过环形PCR获得pSE+3和pSE+38荧光报告质粒。以pSE+3质粒为模板通过环形PCR获得pSE+3MT荧光报告质粒。另外，以Sp1过表达质粒为模板通过环形PCR获得突变Sp1质粒载体Sp1-MT-Pocket1-GLN、Sp1-MT-Pocket2-THR、Sp1-MT-Pocket3-Total和Sp1-MT-Pocket4-GLY。

实验前24h，将HEK293T细胞接种到12孔板中。24小时后，当细胞生长至85％密度后，开始转染。含有不同长度Esrrg启动子片段的pGL3-basic质粒、内部参考报告载体质粒pRL-TK以及包含这些突变Sp1载体的pcDNA-3.1-Sp1过表达载体以20：1：20的比例共转染到12孔板中的细胞。

24h后，用DMSO或NAR预处理平板12h，PBS洗涤两次，然后按照Novozymes双荧光素酶检测试剂盒的说明进行双荧光素酶报告基因分析。启动子活性以相对荧光素酶单位表示。计算萤火虫荧光素酶与海洋性萤光素酶的比值作为相应启动子片段的启动效率。pGL3载体作为阴性对照。

基因表达检测

使用TRIzol试剂(Thermo Scientific 15596018)从小鼠骨骼肌或C2C12肌管中提取总RNA。使用HiScript II Reverse Transcriptase(Vazyme R201)合成cDNA。使用SYBRGreen Fast qPCRMix(Genstar A304)进行实时定量PCR。

蛋白质免疫印迹分析

蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime P0012)进行评估，每个SDS-PAGE实验中使用20-30μg的蛋白质。

染色质免疫沉淀法分析

C2C12细胞在100mm的培养皿中生长。在分化形成肌管后，用400μMNAR处理24h。具体的实验步骤按照试剂盒说明(Millipore#17-408)进行。使用超声波破碎器(4417探测器)(每次15s开/30s关，共18次，功率9W)在500μl的超声缓冲液中对细胞核进行超声处理，以剪切DNA，得到长度在300到600bp之间的片段。使用5μg的抗Sp1抗体(Abcam ab227383)、5μg的抗组蛋白H3抗体(Millipore)或5μg的正常兔IgG抗体(Millipore)和40μg的染色质，在4℃下过夜进行免疫沉淀(IP)。通过针对Esrrg启动子Sp1特异性结合区域的实时PCR分析DNA。

NAR相互作用蛋白的获得

两皿100mm的C2C12肌管细胞用PBS洗涤三次，然后在2mL的低渗裂解缓冲液中裂解(20mM HEPES，2mM EDTA，2mM MgCl₂，1％混合物，pH＝7.4)。使用细胞刮刀将细胞刮下并在冰上裂解45min。然后，在4℃下以12000×g离心15分钟。为了减少假阳性，向上清液中加入40μL链霉亲和素磁珠(Thermo Scientific#65001)，并在4℃下反向旋转孵育2h。上清液平均分成两部分：向处理组添加含有1％DMSO的4mM NAR-生物素，向对照组添加含有1％DMSO的4mM生物素。各组在4℃下颠倒孵育过夜，然后向每组添加20μL链霉亲和素磁珠(ThermoScientific#65001)。各组在4℃下颠倒孵育2小时。弃去上清液，用三种缓冲液清洗磁珠三次(缓冲液A：TBS，0.5％Triton X-100，混合物；缓冲液B：TBS，0.1％Triton X-100，混合物；缓冲液C：TBS，混合物)。得到的结合蛋白进行SDS–PAGE、考马斯亮蓝染色和液相色谱(LC)-串联质谱(MS/MS)分析。

LC-MS/MS分析

在SDS-PAGE和Coomassie Brilliant Blue染色后，凝胶条带被脱色并用胰蛋白酶进行了过夜的酶解。然后，使用不同浓度的乙腈通过多步骤提取了肽段。

在nanoLC-Q Exactive系统上进行了LC-MS/MS分析。简单来说，通过柱子的流速设定为0.3μL/min，施加的远端喷雾电压设定为2.0kV。数据收集是通过进行一次全扫描(MW300–1,600)后，对全MS1扫描后的20个最丰富的离子进行依赖数据的MS2扫描来完成的。

通过酶消化得到的肽段混合物首先通过液相色谱-串联质谱(LC–MS/MS)进行分析。然后，使用Thermo Proteome Discoverer(2.2.0.388)的SEQUEST HT搜索引擎在UniProt-proteome-mouse(update-20171001)数据库中进行蛋白质搜索。搜索参数如下：胰蛋白酶消化，有2个缺失的切割位点，前体离子质量误差小于10ppm，碎片离子质量误差小于20mDa，半胱氨酸的烷基化作为固定修饰，甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。搜索结果的过滤参数如下：Percolator用于光谱的过滤，Delta Cn小于0.1，FDR设置为1％，选择高肽置信度，并将蛋白质水平的FDR也设置为1％。使用Consensus节点和以下参数进行无标记定量(LFQ)：唯一+剃刀；基于强度的前体丰度；归一化模式，无或总肽量；比率计算，基于成对比率的比率计算，最大允许FC，高(100)。只有在所有三个重复实验中平均比率(处理组/对照组)超过2的蛋白质被选中进行进一步的GO分析，使用的是R语言。

RNA-Seq转录组分析

通过使用TRIzol试剂(Thermo Scientific 15596018)提取了DMSO和NAR处理的C2C12肌管的总RNA。样本被送往Biomarker Technologies(北京，中国)进行测序。mRNA的每千碱基的外显子模型每百万映射读数(FPKM)值用于进一步分析。使用DESeq2对两组进行了差异表达分析。由DESeq2发现的调整后P值<0.05的基因被认为是差异表达的。设定FDR<0.05和FC≥1.5作为显著差异表达的阈值。使用GOseq R包和KOBAS软件对DEGs中的上调基因和下调基因进行了GO富集分析和KEGG通路富集分析。

Sp1磷酸化检测

C2C12肌管在有或无NAR的情况下处理24h，然后在含有1％蛋白酶抑制剂混合物(MCE HY-K0010)和1％磷酸酶抑制剂混合物(MCE HY-K0023)的RIPA裂解缓冲液(GenStarE123-01)中裂解。使用细胞刮刀将细胞刮下并在冰上裂解45min。蛋白质先用Protein A/G磁珠(Thermo Scientific 88803)在4℃下预清除1h。预清除后的上清液与Sp1抗体(Abcamab227383)在4℃下温和摇动孵育过夜。孵育后，加入Protein A/G磁珠(ThermoScientific88803)，并在4℃下孵育1h。蛋白质-抗体-珠子复合物用裂解缓冲液洗涤三次，每次5分钟，温度为4℃。该复合物在上样缓冲液(Thermo Scientific 39000)中重悬，煮沸10min后进行Westernblot分析。

细胞热转移实验CETSA

C2C12肌管在含有DMSO或400μM NAR的培养基中培养48h。然后，用PBS洗去培养基，并收集细胞。添加含有1％蛋白酶抑制剂(MCE HY-K0010)的RIPA裂解缓冲液(GenStar#E121-01)。细胞在液氮中反复冻融3次，然后在4℃下以12000×g离心15min。将DMSO组的上清液平均分成两部分。一部分用4mM NAR处理30min。另一部分DMSO处理组和400μM NAR处理组用DMSO处理30min。对于每个组，分离出50μL(1mg/mL)，并在S1000^TM热循环仪(Bio–Rad)的不同温度梯度下加热5min。然后将样品在12000×g离心15min。去除上清液以准备电泳样品。

Sp1蛋白结构及配体结合位点的预测

转录因子Sp1由Sp1基因编码，属于Sp/KLF家族(Vellingiri等人，2020)。已经使用了几种方法来预测Sp1蛋白结构，但尚未确定整个结构。

第一种方法是同源建模。同源建模，也被称为比较建模，是一种常用的结构预测方法(Muhammed和Aki-Yalcin，2019)。同源建模的目标是根据与已知序列(模板)的比对，从目标蛋白质的主要氨基酸序列构建其三维结构(Bordoli等人，2009)。首先，使用了SWISS-MODEL工作空间来构建Sp1蛋白的三维结构。SWISS-MODEL是由SIB瑞士生物信息学研究所和巴塞尔大学生物中心的计算结构生物学组开发的。

I-TASSER服务器，由密歇根大学医学院的杨张研究组提供，是另一个用于自动化蛋白质结构预测的工具。I-TASSER(Iterative Threading ASSEMbly Refinement，迭代线程组装细化)是一种层次化的蛋白质结构预测和基于结构的功能注释方法。I-TASSER也是一种基于模板的方法，它采用多线程方法来识别与目标蛋白质在有限数量的蛋白质折叠基础上具有结构相似性的已知结构(Deng等人，2016；Roy等人，2010)。

一旦确定了Sp1蛋白的3D结构，下一步就是预测配体结合位点以进行蛋白质-配体对接。Roll是一种新的用于预测结合位点的算法，并已在名为POCASA(Yu等人，2010)的程序中实现。在本研究中，使用了日本北海道大学提供的POCASA 1.1的网络服务器来预测Sp1蛋白的配体结合位点。POCASA的参数设置默认；例如，探针球体的半径被设置为单位网格的大小被设置为

分子对接

本研究使用分子对接来探索小分子NAR与蛋白质Sp1之间的相互作用。首先，使用蛋白质准备向导模块对Sp1蛋白的结构进行预处理，包括添加氢、去除水、结构限制最小化等操作。然后，将预测的Sp1结合位点导入程序作为下一步程序的对接网格框。之后，通过LigPrep模块在目标pH值7.0±1.0下生成小分子NAR的可能离子化状态和立体异构体(每个配体最多10个)。最后，这些预处理的配体通过配体对接模块对接入SP1蛋白的预测结合位点。所有这些模块都包含在Maestro 11.2软件中(Schrodinger，LLC：New York，NY，2010)。

统计学分析

所有实验至少进行了三次。每个动物实验的重复次数(n)在图例中显示。当比较三个或更多组时，以处理作为独立因素进行单因素方差分析。两组测量值使用双尾Student’st检验。数据以均值±SEM表示。ns被认为是无显著差异，*P<0.05被认为是具有统计学意义，**P<0.01被认为是具有显著统计学意义。所有的统计分析都使用了Excel和GraphPad。

实验结果：

1、NAR提高肌肉耐力并保护免受与年龄或疾病相关的肌肉萎缩。

为了研究NAR对抵抗年龄相关肌肉萎缩的保护效果，首先使用10月龄的雄性小鼠作为实验模型。这些小鼠被随机分为对照组和NAR组，进行腓肠肌的肌肉内注射。结果显示，NAR显著增加了小鼠的跑步距离(图1)，这表明它增强了肌肉的运动耐力。此外，NAR还增加了抓力(图2)和腓肠肌相对重量(图3)。因此，在10月龄的中年小鼠中，NAR不仅防止了肌肉退化，而且增强了肌肉功能。

本发明的发明人接下来试图确定在正常生理条件下，NAR是否能改善年轻小鼠的肌肉功能。使用了2月龄的小鼠，发现NAR再次增加了有氧耐力能力(跑步距离)(图4)，但对抓力(图5)和腓肠肌的相对重量(图6)没有显著影响。因此，在正常生理条件下的年轻小鼠中，NAR也显著增加了跑步距离。

除了与年龄相关的肌肉萎缩外，还使用mdx小鼠进一步研究了NAR对疾病相关肌肉萎缩的影响，mdx小鼠是杜氏肌营养不良DMD的动物模型。与文献报道一致(Ryu等人，2016)，mdx小鼠显示出典型的耐力降低的表型以及肌肉假性肥大)。NAR增加了mdx小鼠的跑步距离(图7)和抓力(图8)，但并未影响体重或腓肠肌相对重量(图9)。

总的来说，NAR可以提高肌肉耐力并保护免受与年龄或疾病相关的肌肉萎缩的影响。

2、NAR通过增加氧化型肌纤维的数量并增强有氧代谢，从而提高肌肉耐力。

增加的肌肉耐力和颜色更红的肌肉表型表明NAR可能影响肌纤维类型和能量代谢。因此，进一步检查了NAR对10月龄小鼠的腓肠肌、2月龄小鼠的前胫骨肌和腓肠肌以及4月龄的mdx小鼠的腓肠肌中不同类型肌纤维的影响。结果显示，NAR上调了10月龄小鼠腓肠肌中氧化型肌纤维对应的MHC1基因Myh7和酵解型肌纤维对应的MHC2b基因Myh4的表达，但并未上调氧化型肌纤维对应的MHC2a基因Myh2(图10)。

此外，免疫荧光(IF)显示NAR增加了腓肠肌中I型氧化型肌纤维的含量(图11)。为了进一步探索NAR对骨骼肌能量代谢的影响，检查了几个与能量代谢相关的基因的表达水平。有氧代谢相关基因(Mb、Atp5b、Cycs、Cox5b和Cox2)、β-氧化相关基因(Cpt1b和Ucp3)以及葡萄糖代谢相关基因(Pdk4)被NAR上调(图12)，这与氧化型肌纤维含量的增加一致。因此，NAR不仅增加了肌纤维的含量以抵抗衰老引起的肌肉萎缩，还通过增加小鼠中的氧化型肌纤维含量来提高肌肉耐力。

同样，在2月龄的小鼠中，NAR增加了腓肠肌中Myh7(对应MHC1)和Myh2(对应MHC2a)的表达，而没有显著改变Myh4(对应MHC2b)的水平(图13)。这些发现与NAR对年轻小鼠抓力无影响的结果一致。因此，IF染色显示，NAR组中的I型氧化型肌纤维比对照组更多(图14)。在能量代谢方面，NAR上调了年轻小鼠腓肠肌中与有氧代谢相关基因(Mb、Atp5b、Cycs、Cox5b和Cox2)、β-氧化相关基因(Cpt1b和Ucp3)以及葡萄糖代谢相关基因(Pdk4)的表达(图15)。此外，NAR上调了线粒体中五种氧化磷酸化(OXPHOS)复合物的相对水平，包括复合物I亚基NDUFB8、复合物II亚基30kDa、复合物III亚基Core2、复合物IV和ATP合酶α亚基(图16)。总的来说，结果表明，NAR通过增加氧化型肌纤维的数量和增强有氧代谢，而不影响酵解型肌纤维，从而提高了年轻小鼠的肌肉耐力。

在4月龄的mdx小鼠中，NAR处理组的Mb、Atp5b、Cox2、Ucp3和Pdk4表达水平上调(图17)，这表明有氧代谢增加，这可能有助于NAR处理后mdx小鼠肌肉功能的改善。

总结来说，NAR通过增加氧化型肌纤维的数量和增强有氧代谢来提高肌肉耐力。

3、NAR增加了C2C12肌管中氧化型肌纤维的含量，并增强了有氧代谢。

为了进一步探索NAR调控骨骼肌功能的细胞机制，使用了C2C12成肌细胞。C2C12细胞可以分化并融合形成肌管。用不同浓度的NAR(0、40、100、200、400、800、1600和2400μM)处理C2C12肌管24h。当NAR浓度超过800μM时，许多细胞死亡(图18)。因此，选择低于400μM的NAR浓度来处理细胞。氧化型肌纤维相关基因Myh7和Myh2的表达被NAR以剂量依赖性方式上调，而酵解型肌纤维相关基因Myh4的表达则没有(图19)，这表明氧化型肌纤维的含量增加。

然后评估了NAR对细胞能量代谢的影响。研究发现，NAR增加了总ATP水平(图20)，这表明NAR促进了能量产生。此外，使用Seahorse细胞能量代谢仪测量了用或不用NAR处理的C2C12肌管的细胞生物能量特征。用200μM NAR处理肌管能增加氧消耗率(OCR)(图21)。这些结果证实了NAR促进了C2C12细胞的有氧呼吸。

此外，NAR增强了氧化磷酸化(OXPHOS)过程、三羧酸循环(TCA)和β-氧化过程中关键酶的表达(图22和23)。因此，NAR通过改善骨骼肌中的线粒体活性，增加了氧化型肌纤维的含量并增强了有氧呼吸。

4、ERRγ介导NAR诱导的氧化型肌纤维数量和有氧代谢的增强

对用NAR处理和未用NAR处理过的C2C12肌管之间的差异表达基因(DEGs)进行了分析。结果发现，核转录因子ERRγ(由Esrrg编码)的表达被NAR上调的程度比其他核转录因子更为显著。先前的研究已经显示，ERRγ在氧化型肌纤维中高度表达，并且它可以调控许多与新陈代谢相关的基因(Misra等人，2017)。因此，检查了用NAR处理过的C2C12肌管中的ERRγmRNA水平。结果发现，NAR以剂量依赖的方式增加了ERRγ的水平(图24)。此外，NAR在体内增加了10月龄的小鼠、2月龄的小鼠和mdx小鼠的ERRγ转录水平(图25)。体外和体内的数据表明，ERRγ可能参与NAR的功能。随后，为了验证这个假设，使用siRNA在细胞水平上敲低了ERRγ。ERRγ的缺乏抑制了NAR介导的氧化型肌纤维相关Myh7和Myh2以及有氧代谢相关Atp5b和Cpt1b的上调(图26)，这表明ERRγ介导了NAR诱导的氧化型肌纤维数量和有氧代谢的增加。

总结来说，ERRγ介导了NAR诱导的氧化型肌纤维数量和有氧代谢的增加，从而提高了小鼠的耐力运动能力。

5、Sp1是C2C12细胞中NAR的直接结合蛋白

为了进一步阐明NAR上调ERRγ表达的原因，本发明的发明人对NAR进行了生物素化标记。分化的C2C12细胞被裂解，裂解物用生物素和生物素标记的NAR进行免疫沉淀。接下来，使用亲和性磁珠来富集与生物素结合的非特异性蛋白以及与NAR-生物素结合的特异性蛋白。通过SDS-PAGE分离得到的两组蛋白，并通过质谱(MS)进行分析，将与NAR-生物素免疫沉淀的蛋白与阴性对照(NC)生物素免疫沉淀的蛋白进行比较，以识别变化超过两倍的差异蛋白。结果显示，共有492种蛋白在NAR-生物素组中上调超过两倍，其中207种蛋白仅存在于NAR-生物素组而非NC组。因此，只存在于生物素化NAR组中的转录过程相关蛋白的分子得到了富集(图27)。转录因子Sp1仅存在于生物素化的NAR组中。因此，SP1最有可能是NAR的结合蛋白。

为了验证NAR与Sp1的直接相互作用，首先使用免疫印迹法证明Sp1在生物素化的NAR结合蛋白中显著富集(图27)。然后，使用细胞热转移测定法(CETSA)进一步分析NAR对Sp1的结合亲和力，该方法检测小分子化合物和目标蛋白的结合亲和力。结果显示，用4mMNAR处理30分钟的C2C12肌管细胞裂解液中Sp1的溶解度曲线明显偏移。在对照组中，50％的Sp1蛋白在63℃时降解，而在用4mM NAR处理30分钟的细胞裂解液样品中，温度增加到69℃。NAR处理样品中Sp1蛋白的稳定性增加表明NAR直接与Sp1蛋白结合。因此，上述结果表明，NAR可能通过直接结合转录因子Sp1在骨骼肌中发挥调控作用(图28)。

为了更好地展示NAR与Sp1的相互作用，预测了Sp1的3D结构以及NAR/Sp1可能的交互位点。小分子NAR主要通过氢(H-)键与Sp1蛋白进行交互；更具体地说，NAR分子中的两个羟基与Sp1的ASN-81、SER-83和GLN-110残基发生作用(图29)。具有最高对接分数(-6.584)的NAR构象最有可能是NAR/Sp1结合的组合。

6、Sp1参与NAR介导的ERRγ上调和肌肉功能改善

为了确定Sp1是否参与骨骼肌中NAR的功能，首先在动物水平上使用Sp1抑制剂检查了NAR对骨骼肌功能和代谢的影响。当使用mithramycin A(Mit-A)，一种特异性的Sp1抑制剂，来抑制中年小鼠腓肠肌中Sp1的转录活性时，本发明的发明人发现NAR对有氧运动距离和抓力的增强效果被抑制(图30和31)。由NAR诱导的氧化型肌纤维数量的增加(图32)以及氧化型肌纤维相关基因Myh7和Myh2的上调(图33)也被抑制。此外，NAR介导的ERRγ上调在RNA水平上被Mit-A抑制(图34)。此外，与氧化型肌纤维数量或有氧代谢相关的ERRγ下游基因，包括肌红蛋白、Atp5b、Cycs、Cox5b、Cpt1b和Ucp3的上调也被抑制(图35)。这些结果表明，NAR诱导的10月龄小鼠耐力和抓力的增加是通过体内转录因子Sp1实现的。

7、NAR通过增加Sp1的磷酸化来增强Sp1与Esrrg启动子的相互作用

上述结果显示Sp1介导NAR诱导的ERRγ上调，因此接下来寻求确定NAR如何通过Sp1调控ERRγ表达。通过序列比较和预测，发明人发现Esrrg启动子该区域含有一个可能被Sp1结合的序列(CCCTGCCCTC)。为了确定Sp1与Esrrg启动子的结合是否对NAR诱导有反应，测量了NAR对对照载体、含有Esrrg启动子+3到+100区域的荧光报告载体以及突变报告载体的不同效应。结果显示，荧光报告载体pSE+3对NAR的反应是4.5倍，远高于对照的1.7倍和突变体的2.5倍(图36)。

本发明的发明人获得了NAR与Sp1可能的结合位点。因此，使用了一个含有Esrrg启动子+3至+100区域和Sp1载体结合位点的突变氨基酸的荧光报告载体来验证NAR与Sp1的真实结合位点。结果显示，荧光报告载体pSE+3对未突变的Sp1载体的NAR反应是4.5倍，远高于Sp1-MT-Pocket1-GLN载体的1.7倍反应(图37)。在Sp1的口袋1中GLN-110的突变破坏了NAR的结合，表明NAR通过与口袋1中的Sp1的GLN-110形成氢键与Sp1蛋白相互作用。Sp1直接与NAR结合增加Sp1转录活性的机制尚不清楚。最近的数据表明，Sp1的磷酸化状态在调控多个基因中起着重要作用(Chu，2012；Tan and Khachigian，2009)。使用免疫沉淀(IP)测定了NAR处理后Sp1的翻译后磷酸化水平。结果显示，Sp1的磷酸化在NAR结合后增加(图38)，这导致了Sp1转录活性的增加。

8、NAR结构的重构与合成：通过结构改造提高NAR的水溶性、活性和药用性质

基于对NAR的研究结果，进一步修改了NAR的结构以获得不同的衍生物。这些修改的目标包括提高水溶性，增强生物或治疗活性，以及药用性质。这些衍生物将用于改善骨骼肌耐力，治疗肌肉萎缩或营养不良，或者预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良。获得了至少包含一种衍生物的组合物。在本发明中，新化合物包括一系列如本文所述的衍生物。

肌肉萎缩和功能障碍是生命和健康的主要问题，寻找解决方案一直是研究的追求。在本次研究中，发现了NAR的新功能。包括其衍生物在内的NAR通过增加氧化型肌纤维数量并增强有氧呼吸，改善了自然衰老过程和mdx小鼠的肌肉耐力，并保护它们免受肌肉萎缩的影响。重要的是，转录因子Sp1被确定为NAR的直接结合目标。NAR的结合增加了Sp1的磷酸化和转录因子活性。此外，发现Sp1是Esrrg的新转录因子，并且发现Sp1-ERRγ转录轴参与了NAR介导的能量代谢和肌肉重塑。这些发现对于预防久坐生活方式和与年龄相关的有氧运动能力和肌肉萎缩的减少，以及治疗DMD相关肌肉无力具有重要的意义。

在三种动物模型中，NAR在骨骼肌中的新功能和意义：

随着年龄的增长，肌肉质量和力量的减少是一个不容忽视的问题，一些研究报告称，30岁以后每10年肌肉质量会减少3～8％(Volpi等人，2004)。骨骼肌萎缩和运动耐受力下降是衰老的主要表现，主要表现为肌肉质量和线粒体有氧呼吸的减少(Brunner等人，2007；Carter等人，2015；Klitgaard等人，1990；Lanza等人，2005；Murgia等人，2017；Short等人，2005)。发明人以自然衰老的10月龄的小鼠为模型，证明了NAR可以通过增加氧化型肌纤维的数量和整体有氧代谢能力来提高耐力和抓力并在一定程度上逆转肌肉萎缩。由于自然衰老导致的肌肉萎缩是最常见的肌肉损失类型，因此发明人首先使用自然衰老的小鼠模型来证明NAR在改善肌肉功能方面的作用。在全球老龄化问题日益严重的背景下，NAR对于广泛地应用于改善或治疗肌肉萎缩具有很大的前景。即使在年轻的成年小鼠模型中，NAR也显著增加了跑步距离、氧化型肌纤维的形成以及骨骼肌OXPHOS过程关键酶的表达。这表明NAR可以在正常生理条件下增强肌肉的有氧能力，暗示了其可能被应用于长跑运动员等耐力运动员的可能性。

此外，NAR的这种新功能对于现代青年具有潜在的应用价值，其中缺乏运动或久坐不动的生活方式导致骨骼肌代谢减少和肥胖症、糖尿病等代谢疾病的风险增加。值得注意的是，NAR还改善了mdx肌肉营养不良小鼠的耐力和握力。尽管它并未显著影响肌纤维的类型或含量，但NAR对有氧代谢的促进作用在一定程度上解释了这一现象。总之，尽管机制尚未完全理解，但NAR通过改善mdx表型也扩大了NAR在治疗肌肉疾病中的潜在应用。总的来说，这些发现表明，NAR在改善肌肉功能方面的作用将使多个人群受益。

Sp1，被确定为NAR的新的直接目标，介导骨骼肌中的NAR功能：

尽管NAR在不同疾病中的多种生物活性已被广泛研究，但关于其直接作用目标的研究却非常缺乏，这大大限制了NAR的应用。迄今为止，只有两项研究探讨了NAR的直接作用目标。已确定Collapsin反应介质蛋白2(CRMP2)是与NAR直接结合以解释NAR在阿尔茨海默病(AD)中保护效应的候选者(Yang等人，2017)。另一项研究表明，NAR直接绑定到PPARα配体结合域(LBD)区域并通过双荧光素酶报告系统激活PPARα，从而降低极低密度脂蛋白(VLDL)水平并减少肝脏中的脂质积累(Goldwasser等人，2011)。然而，是否Pparα是NAR的直接目标尚未通过额外的证据得到证实。

在本发明中，本发明的发明人通过IP-MS确定了Sp1是NAR的直接结合蛋白，并通过在肌肉细胞中进行CETSA验证了NAR对Sp1的结合亲和力。Sp1的活性受到翻译后修饰的调控，如磷酸化、糖基化和乙酰化等，其中磷酸化研究最为深入。研究发现，NAR通过促进Sp1的磷酸化激活Sp1转录因子活性，揭示了NAR调控Sp1的机制。这是首次确定NAR在骨骼肌纤维类型和能量代谢调控中的直接靶标。

Sp1是ERRγ的新的转录因子：

ERRγ是一种孤核雌激素受体，具有配体独立的转录活性，在胰岛素抵抗、酒精性肝损伤和心肌肥大等病理条件下起着重要作用，并调节心脏、骨骼肌和胰岛β细胞的能量代谢(Misra等人，2017)。基于ERRγ在代谢稳态中的重要性，ERRγ是治疗代谢性疾病的良好靶点。通过膜受体或细胞内转录因子，各种细胞应激可以诱导ERRγ的表达。

此外，ERRγ表达可以通过转录因子c-Jun、Stat3、CREB、HIF1a和ATF6a在外部刺激下进行调节(Misra等人，2017)。在研究中，确定了Sp1作为ERRγ的新的转录因子，为ERRγ表达的调控提供了新的机制。NAR与Sp1的结合进一步促进了Sp1与ERRγ启动子的结合。Sp1-ERRγ轴的建立不仅揭示了NAR调控肌肉功能的机制，也为优化改善肌肉功能的策略提供了新的信号通路。

在本研究中，本发明发现NAR通过促进Sp1的磷酸化来增强Sp1的转录因子活性。然而，具体的磷酸化位点尚未得到验证，NAR如何影响Sp1的磷酸化仍然不清楚。此外，NAR相对较低的溶解度可能会限制其在动物中的有效性。提高NAR的水溶性将有助于促进NAR的应用。

如本文所述，本发明首次证明了NAR能够提高年轻小鼠骨骼肌的耐力和有氧代谢能力，保护中年小鼠免受肌肉萎缩的影响，并缓解DMD。此外，它确定了Sp1是NAR的新的直接靶标，并在Sp1和目标基因ERR之间建立了新的关系，从而阐明了NAR如何通过结合Sp1来增强Sp1与ERR启动子之间的相互作用，从而上调ERR表达的分子机制。因此，这项研究为NAR的应用开辟了新的途径，并为改善肌肉功能和保护衰老和疾病引起的肌肉萎缩提供了一种新的、更安全的策略。NAR衍生物被合成出来，目的是模仿NAR或进一步提高其性能。

一方面，本公开提供了一种用于改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良，或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的组合物。这种组合物包含有效量的具有本文所述的式(I)的化合物，或者其药学上可接受的溶剂化物，或者它们的任何组合，以及药学上可接受的赋形剂，

式(I)的化学结构如下：

在式(I)中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组。在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂的组。这样的化合物是柚皮素(NAR)或柚皮素衍生物。

在本文提供的柚皮素衍生物中，与二氢色酮相连的苯环被至少一个取代基团和最多四个取代基团R₁、R₂、R₃和R₄修饰。在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是除H以外的取代基团。例如，在某些实施方式中，R₁或R₂是除H以外的取代基团，R₃＝H，且R₄＝H。当柚皮素衍生物在柚皮素基础结构的苯环上只含有一个取代基团(由R₁表示)时，这种化合物具有式(II)的化学结构：

唯一的取代基团(由R₁代表)可能位于羟基的邻位或间位。该化合物可能具有式(III)或(IV)的化学结构：

在本文提供的组成中，适宜的化合物的例子包括但不限于以下化合物：

在上述化合物中，样品编号包括化合物编号和括号中的实验室化合物代码。

该组合物可以是药物组合物、功能组合物和/或膳食补充剂。例如，该组合物是一种可以注射或口服药物组合物。该组合物最好是可注射的。化合物的浓度可以在1-50mM范围内，例如2-15mM，5-10mM，或任何其他适当的浓度。适当浓度的例子包括但不限于1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM以及这些值中任两个值之间的任何其他值。

该赋形剂可以是溶剂、共溶剂、着色剂、防腐剂、抗菌剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、乳化剂、悬浮剂或其任何组合。例如，在一个可注射的组合物中，赋形剂包括含20％的DMSO和80％的盐水按重量计算组成的载体。在某些实施方式中，这些组合物可以与饮料、食物或相关成分一起给药。

另一方面，本公开提供了一种具有本文所述的式(I)的化合物，或其药学上可接受的溶剂化物，或其任何组合。这样的化合物是除了柚皮素(NAR)之外的柚皮素衍生物。

该化合物可以是一种具有所需溶解性和药理性质的适宜化合物。在某些实施方式中，该化合物是具有式(I)的化合物或其药学上可接受的溶剂化物。

本发明提供了任何如本文所述的化合物属或种，例如具有式(II)、(III)或(IV)。在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组。至少有一个R₁、R₂、R₃和R₄是除H以外的取代基。这样的化合物是一种柚皮素衍生物。在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。

在某些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是H以外的取代基。例如，在某些实施方式中，R₁或R₂是H以外的取代基，R₃＝H，且R₄＝H。

适合作为柚皮素衍生物的化合物示例包括但不限于本文所述的化合物示例，例如化合物编号1-13。

另一方面，本公开提供了一种制备本文所述的组合物或化合物的方法。这种方法可能包括准备化合物。该方法可能进一步包括混合赋形剂和化合物。

另一方面，本公开提供了一种制备所述化合物的方法，该化合物是本文所述的柚皮素衍生物。在某些实施方式中，该方法包括以下步骤：将1-(2-羟基-4,6-双(甲氧基甲氧基)苯基)乙酮与取代的对-双(甲氧基甲氧基)苯甲醛反应，如下所述。

另一方面，本公开提供了一种改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良，或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的方法。该方法包括将适量的本文所述的组合物给予需要此类治疗的受试者。该组合物包含有效量的具有式(I)的化合物。本公开还提供了使用具有式(I)的化合物如NAR和NAR衍生物制造用于治疗任何这些医疗条件的药物。

在一些实施方式中，具有式(I)的化合物中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组。至少有一个R₁、R₂、R₃和R₄是除H以外的取代基。这样的化合物是柚皮素或柚皮素衍生物。在某些实施方式中，每个R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。

在一些实施方式中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是H以外的取代基。例如，在某些实施方式中，R₁或R₂是H以外的取代基，R₃＝H，且R₄＝H。

在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，最好是人类受试者，可以是健康的人类，或者是有年龄或疾病相关肌肉萎缩的成年人。

在一些实施方式中，该组合物通过肌肉注射或口服给药。优选的是肌肉注射。在某些实施方式中，该组合物以有效剂量的化合物进行肌肉注射，剂量范围为2mg/Kg至20mg/Kg，频率为每日一次或每隔一天一次。给药可以采用任何适当的剂量。例如，在某些实施方式中，有效剂量的化合物的剂量范围为3.6mg/Kg至7.6mg/Kg。有效剂量的化合物的适当剂量的例子包括但不限于2mg/Kg、3mg/Kg、3.5mg/Kg、4mg/Kg、4.5mg/Kg、5mg/Kg、5.5mg/Kg、6mg/Kg、6.5mg/Kg、7mg/Kg、7.5mg/Kg、8mg/Kg、9mg/Kg、10mg/Kg、11mg/Kg、12mg/Kg、13mg/Kg、14mg/Kg、15mg/Kg、16mg/Kg、17mg/Kg、18mg/Kg、19mg/Kg和20mg/Kg。这些剂量是根据迄今为止获得的数据计算得出的。

化合物的实施例：

以下实施例包括合成过程，仅用于说明，并不限制本公开提供的化合物的范围。

化合物1-13已被制备并进行了评估。表1总结了它们与柚皮素(简称为NAR，实验室化合物代码为S12)的结构比较。化合物1-13的标签化合物代码也在表1中显示。

表1

合成2'-羟基苯乙酮的通用步骤：

根据方案(A)和以下描述的步骤合成2'-羟基苯乙酮：

将2'，4'，6'-三羟基苯乙酮(14.74g，87.68mmol，1.0eq.)悬浮在二氯甲烷(180mL)中，并在氩气氛围下搅拌。在0℃下加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，46.05mL，263.05mmol，3.0eq.)，然后在0℃下滴加溴甲基甲醚(MOMBr，15.75mL，192.91mmol，2.2eq.)至反应混合物中。在0℃下搅拌反应混合物4小时。用200mL水淬灭反应混合物，然后用二氯甲烷(3×120mL)提取水溶液。合并有机溶液后干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩。残渣通过硅胶柱色谱法(PE/EtOAc＝15/1-10/1)纯化，得到1-(2-羟基-4，6-双(甲氧基甲氧基)苯基)-1-乙酮(8.4g，37.39％)。¹HNMR(400MHz，氯仿-d)δ为13.71(s，1H)、6.26-6.20(m，2H)、5.24(s，2H)，5.15(s，2H)、3.50(s，3H)、3.45(s，3H)和2.63(s，3H)。其他酚羟基需要通过MOM保护基团进行保护，并可以通过此方法合成。

合成6-羟基-[1，1'-联苯]-3-甲醛的通用步骤：

根据方案(B)和以下步骤合成了6-羟基-[1，1'-联苯]-3-甲醛：

通过常规的MOM保护基方法添加3-溴-4-羟基苯甲醛(1.0g，5mmol，1.0eq.)，并通过硅胶柱色谱法(PE/EtOAc＝30：1-20：1)进行纯化，得到400mg的3-溴-4-(甲氧基甲氧基)苯甲醛，产率为32.79％。在搅拌的溶液中加入3-溴-4-(甲氧基甲氧基)苯甲醛(400mg，1.63mmol，1.0eq.)、苯硼酸(298.52mg，2.45mmol，1.5eq.)和PdCl₂(dppf)(59.71mg，0.081mmol，5mol％)在1，4-二噁烷(5.0mL)中，在氩气氛围下于60℃反应24小时。然后在真空中去除溶剂。残渣通过硅胶柱色谱法(PE/EtOAc＝40：1-30：1)进行纯化，得到6-(甲氧基甲氧基)-[1，1'-联苯]-3-甲醛(231mg，58.42％)。结构生成由LC-ESIMS确认，发现为m/z243.2[M+H]⁺。

合成柚皮素衍生物(即所述化合物)的通用步骤：

根据方案(C)合成了作为柚皮素衍生物的化合物，其中条件(a)和(b)是可替代的：

以化合物1(实验室化合物代码：NAR-27)为例，合成方法中条件(a)为2-(3-氟-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮。

化合物1(NAR-27)通过如下方案(D)合成：

将3-氟-4-羟基苯甲醛(154mg，1.0mmol，1.0eq.)加入到一个装有搅拌棒的50mL的茄子形烧瓶中，该烧瓶中含有丙酮(10mL)、碳酸钾(276.4mg，2.0mmol，2.0eq.)和溴甲基甲醚(90μL，1.1mmol，1.1eq.)。将混合物加热回流3小时。反应完成后，加入甲醇以猝灭反应，并通过旋转蒸发去除大量的有机相，然后加入20mL的水，再用乙酸乙酯(20mL)提取三次。合并有机相，用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后在真空中浓缩，得到一种棕褐色油状液体。直接进行下一步操作，无需处理。

在一个50mL的茄子形烧瓶中，加入KOH(1.0g，17.8mmol)、前一步得到的未纯化粗产品以及2-羟基-4，6-双(甲氧基甲氧基)-1-乙酰苯酮(256mg，1.0mmol，1.0eq.)。然后加入20mL的乙醇和2mL的水，在室温下搅拌18h。加入2M HCl溶液以将pH值调整到约7.5-8弱碱性。用乙酸乙酯(50mL)进行三次提取。合并有机相，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后在真空下干燥并去除溶剂。通过硅胶柱色谱法(PE/EtOAc＝15：1-10：1)纯化粗产品，得到3-(3-氟-4-(甲氧基甲氧基)苯基)-1-(2-羟基-4，6-双(甲氧基甲氧基)苯基)丙-2-烯-1-酮，黄色固体，质量为100.0mg，两步总收率为26.45％。

将前一步得到的查尔酮放入一个50mL的茄子形烧瓶中。加入3.0mL的2M HCl溶液和10.0mL的甲醇，然后加热回流24h。通过TLC和UpLC监测(环闭合产物UV在330-360nm处有特征吸收峰，环开启产物UV在280nm处有特征吸收峰)。反应后，用适量的饱和NaHCO₃中和过量的HCl，并用乙酸乙酯(20mL×3)提取三次。合并有机相，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后在真空中去除溶剂。粗制品经硅胶柱层析纯化(PE/EtOAc＝5：1)，得到2-(3-氟-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(NAR-27)，淡黄白色固体14.19mg，收率为21.54％。MF是C₁₅H₁₁FO₅，MW是290.06。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ为12.13(s，1H)、10.81(s，1H)、10.06(s，1H)、7.33(dd，J＝12.3，2.1Hz，1H)、7.13(dd，J＝8.2，2.1Hz，1H)、6.97(t，J＝8.7Hz，1H)、5.92-5.86(m，2H)、5.46(dd，J＝12.8，3.0Hz，1H)，3.27(dd，J＝17.1，12.9Hz，1H)和2.70(dd，J＝17.1，3.0Hz，1H)；¹³C NMR(200MHz，丙酮-d₆)δ为196.8、167.5、165.0、164.1、152.7、151.5、146.1、131.8、123.9、118.5、103.0、96.8、95.9、79.2和43.4。C₁₅H₁₂FO₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为291.0663，发现为291.0667。

2-(3，5-二氟-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(化合物2，NAR-28)

化合物2(NAR-28)通过如下方案(E)合成：

合成方法与上述条件(a)的方法相同。产物是化合物2(NAR-28)，为淡黄色固体(38.66mg，12.54％)；¹H NMR(500MHz，丙酮-d₆)δ为11.71(s，2H)、9.23(s，1H)、7.34-7.23(m，4H)、5.93(s，2H)、3.39(dd，J＝8.3，7.1Hz，2H)和3.01-2.94(m，2H)。¹³C NMR(150MHz，丙酮-d₆)δ为196.44、167.55、164.93、163.80、154.01(d，J＝7.0Hz)、152.41(d，J＝7.0Hz)、134.83(t，J＝17.1Hz)、131.04(t，J＝6.1Hz)、110.88(dd，J＝17.1，6.1Hz)、102.97、96.97、95.96、78.63和43.29。C₁₅H₁₁F₂O₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为293.0575，发现为293.0577。

2-(3-氯-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(化合物3，NAR-29)化合物3(NAR-29)通过如下方案(F)合成：

合成方法与上述条件(a)的方法相同。得到的化合物2(NAR-29)为淡黄色固体(13.98mg，4.56％)；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ为12.13(s，1H)、10.83(s，1H)、10.39(s，1H)、7.50(d，J＝2.1Hz、1H)、7.29(dd，J＝8.5，2.2Hz、1H)、6.99(d，J＝8.4Hz，1H)、5.92-5.86(m，2H)、5.46(dd，J＝13.0，3.0Hz、1H)、3.31-3.23(m，1H)和2.70(dd，J＝17.2，3.1Hz，1H)；¹³CNMR(200MHz，丙酮-d₆)δ为196.8、167.5、164.9、164.1、154.2、132.2、129.2、127.3、121.1、117.4、103.0、96.8、95.8、79.1和43.4。C₁₅H₁₂ClO₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为307.0368，发现为307.0367。

2-(3，5-二氯-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(化合物4，NAR-30)

化合物4(NAR-30)通过如下方案(G)合成：

NAR-30的合成方法是使用上述条件(b)的方法的通用步骤。

向干燥的乙烯(10mL)中的3，5-二氯-4-羟基苯甲醛(191mg，1.0mmol)和DIPEA(522μL，3.0mmol，3.0eq.)溶液中，在氩气下于0℃加入MOMBr(183μL，2.2mmol，2.2eq.)。反应混合物在0℃下搅拌4h。通过添加100mL的水来终止反应，然后用乙烯(50mL)提取三次。合并有机相，用盐水洗涤，用无水MgSO₄干燥，然后在减压下蒸发以得到粗制的双-MOM保护中间体。

向干燥的THF(10mL)中的2-羟基-4，6-双(甲氧基甲氧基)-1-乙酰苯酮溶液(256mg，1.0mmol，1.0eq.)中，分批加入NaH(60％分散在石蜡油中)(80.0mg，2.0mmol，2.0eq.)，在氮气氛围下和剧烈搅拌下于0℃进行。当H₂停止生成时，将上述二MOM保护中间体在干燥的THF(5.0mL)中的溶液滴加到反应混合物中，持续15min，然后在室温下搅拌反应混合物2h，除非另有说明。反应完成后，用冰水慢慢淬灭反应，用乙酸乙酯(20mL)提取三次，用饱和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并在真空中去除溶剂。粗制品通过硅胶柱色谱法(PE/EtOAc＝15：1-10：1)纯化，得到378mg黄色固体作为3-(4-三氟甲基苯基)-1-(2-羟基-4，6-双(甲氧基甲氧基)苯基)丙-2-烯1-酮，产率为88.30％。

将上步得到的查尔酮全部放入50mL茄子瓶中，加入10.0mL甲醇和3.0mL的2M HCl溶液，加热回流反应24h。TLC和UpLC监测(环合产物UV在330-360nm处有特征吸收峰，开环产物UV在280nm处有特征吸收峰)。反应完成后，用适量饱和NaHCO₃中和过量的HCl，并用乙酸乙酯(20mL×3)提取三次，合并有机相，用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂。

粗制品通过硅胶柱色谱法(PE/EtOAc＝8：1-5：1)进行纯化，得到2-(3，5-二氯-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(NAR-30)为A型淡黄色固体(56.78mg，16.67％)；¹HNMR(500MHz，丙酮-d₆)δ为7.55(s，2H)、6.01(d，J＝2.2Hz，1H)、5.97(d，J＝2.2Hz，1H)、5.50(dd，J＝12.9，3.1Hz，1H)、3.18(dd，J＝17.1，12.9Hz，1H)和2.82(dd，J＝17.1，3.1Hz，1H)。¹³C NMR(125MHz，丙酮-d₆)δ为196.4、167.7、165.0、163.8、150.3、132.9、127.7、122.8、102.9、97.0、96.0、78.5和43.3。C₁₅H₁₁Cl₂O₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为340.9978，发现为340.9981。

2-(3-溴-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(化合物5，NAR-31)

化合物5(NAR-31)通过如下方案(H)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。产物是化合物5(NAR-31)，为淡黄色固体(63.78mg，18.16％)；¹H NMR(400MHz，丙酮-d₆)δ为12.16(s，1H)、9.37(s，2H)、7.73(d，J＝2.1Hz、1H)、7.41(dd，J＝8.4、2.2Hz，1H)、7.07(d，J＝8.4Hz，1H)、6.01-5.94(m，2H)、5.49(dd，J＝12.9，3.0Hz，1H)、3.20(dd，J＝17.1，12.9Hz，1H)和2.78(dd，J＝17.1，3.0Hz，1H)；¹³C NMR(125MHz，丙酮-d₆)δ为196.9、167.4、165.2、164.1、155.2、132.8、132.4、128.1、117.2、110.3、103.1、96.9、95.9、79.1和43.4。C₁₅H₁₂BrO₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为350.9863，发现为350.9861。

2-(3，5-二溴-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(化合物6，NAR-32)

化合物6(NAR-32)通过如下方案(I)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。得到的化合物6(NAR-32)为淡黄色固体(90.21mg，20.98％)；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ为12.12(s，H)、10.87(s，1H)、10.17(s，1H)、7.73(s，2H)、5.96-5.89(m，2H)、5.50(dd，J＝13.0，2.9Hz，1H)、3.33(dd，J＝17.1，13.0Hz，1H)和2.75(dd，J＝17.1，3.0Hz，1H)；¹³C NMR(125MHz，丙酮-d₆)δ为196.4、167.4、165.2、164.9、163.8、151.8、134.3、131.5、111.5、103.0、97.0、96.9、78.2和43.3。C₁₅H₁₁Br₂O₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为428.8968，发现为428.8972。

5，7-二羟基-2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-二氢色酮(化合物7，NAR-33)

化合物(NAR-33)通过如下方案(J)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。得到的化合物7(NAR-33)为淡白色固体(102.6mg，34.47％)；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ为12.15(s，1H)、10.78(s，1H)、9.13(s，1H)、7.09(d，J＝2.0Hz、1H)、6.90(dd，J＝8.2，2.0Hz，1H)、6.79(d，J＝8.2Hz、1H)、5.89(q，J＝2.1Hz、2H)、5.43(dd，J＝12.8，2.9Hz，1H)、3.78(s，3H)和2.68(dd，J＝17.1，3.0Hz，1H)；¹³CNMR(125MHz，丙酮)δ为197.2、167.5、165.0、164.3、148.4、147.9、131.2、120.5、115.7、111.2、103.0、96.7、95.8、80.2、56.3和43.6。C₁₆H₁₅O₆ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为303.0863，发现为303.0873。

5，7-二羟基-2-(4-羟基-3-硝基苯基)-4-二氢色酮(化合物8，NAR-34)

化合物8(NAR-34)通过如下方案(K)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。得到的化合物8(NAR-34)为淡白色固体(8.47mg、1.89％)；¹H NMR(400MHz、DMSO-d₆)δ为12.11(s，1H)、8.03(s，1H)、7.69(d，J＝8.9Hz，1H)、7.17(d，J＝8.6Hz，1H)、5.91(d，J＝7.9Hz，2H)、5.58(dd，J＝12.9，2.9Hz，1H)和2.76(dd，J＝17.1，3.1Hz，1H)；¹³C NMR(125MHz，丙酮-d₆)δ为195.9、166.8、163.5、162.6、152.6、136.6、133.5、129.5、123.7、119.5、101.7、96.1、95.1、77.3和41.8。LC-ESIMS发现为m/z318.2[M+H]⁺和m/z316.2[M-H]^-。

5，7-二羟基-2-(6-羟基-[1，1-联苯]-3-基)-4-二氢色酮(化合物9，NAR-35)

化合物9(NAR-35)通过如下方案(L)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。得到的化合物9(NAR-35)为黄色固体(68mg，20.50％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ为12.16(s，1H)、10.80(s，1H)、9.77(s，1H)、7.56(d，J＝7.5Hz，2H)、7.44-7.36(m，3H)、7.35-7.26(m，2H)、6.97(d，J＝8.3Hz，1H)、5.92-5.85(m，2H)、5.49(dd，J＝12.8，3.0Hz，1H)、2.72(dd，J＝17.1，3.1Hz，1H)；¹³C NMR(125MHz，丙酮-d₆)δ为196.5、166.7、163.5、163.0、154.7、138.2、129.5、129.3、129.1、128.0、127.6、127.2、125.7、116.0、101.8、95.8、95.0、78.5和42.0。C₂₁H₁₇O₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为349.1071，发现为349.1074。

5，7-二羟基-2-(2-氟-4-羟基苯基)-4-二氢色酮(化合物10，NAR-37)化合物10(NAR-37)通过如下方案(M)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。得到的化合物10(NAR-37)为淡白色固体(96mg，23.09％)。¹H NMR(500MHz，丙酮-d₆)δ为7.46(t，J＝8.6Hz，1H)、6.76(dd，J＝8.6，2.4Hz，1H)、6.66(dd，J＝12.3，2.4Hz，1H)、5.95(t，J＝1.7Hz，2H)、5.67(dd，J＝13.2，3.0Hz，1H)、3.26(dd，J＝17.1，13.2Hz，1H)、2.71(dd，J＝17.1，3.0Hz，1H)；¹³C NMR(125MHz，丙酮-d₆)δ为196.9、167.5、165.0、164.2、162.9、130.0、117.2、112.5、103.7、103.5、102.9、96.9、95.8、74.2和42.2。C₁₅H₁₂FO₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为291.0663，发现为291.0680。

5，7-二羟基-2-(2，6-二氟-4-羟基苯基)-4-二氢色酮(化合物11，NAR-38)

化合物11(NAR-38)通过如下方案(N)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。得到的化合物11(NAR-38)为淡黄白色固体(102mg，32.11％)。¹H NMR(800MHz，丙酮-d₆)δ为6.55(d，J＝10.7Hz，2H)、5.96(d，J＝2.2Hz，1H)、5.94(d，J＝2.2Hz，1H)、5.75(dd，J＝13.9，3.0Hz，1H)、3.48(dd，J＝17.1，13.8Hz，1H)和2.72(dd，J＝17.1，3.1Hz，1H)。¹³C NMR(200MHz，丙酮-d₆)δ为196.7、167.4、165.1、164.2、163.7(d，J＝11.3Hz)、162.4(d，J＝11.3Hz)、161.3、105.6、102.9、100.5、100.4、97.0、95.7、71.1和41.0。C₁₅H₁₁F₂O₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为309.0569，发现为309.0573。

5，7-二羟基-2-(2-氯-4-羟基苯基)-4-二氢色酮(化合物12，NAR-39)

化合物12(NAR-39)通过如下方案(O)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。得到的化合物12(NAR-39)为白色固体(84mg，27.45％)。¹H NMR(500MHz，丙酮-d₆)δ为7.57(d，J＝8.5Hz，1H)、6.95(d，J＝2.5Hz，1H)、6.92(dd，J＝8.5，2.5Hz，1H)，5.98(q，J＝2.2Hz，2H)、5.76(dd，J＝13.2，2.9Hz，1H)、3.15(dd，J＝17.1，13.3Hz，1H)和2.75(dd，J＝17.1，2.9Hz，1H)。¹³C NMR(125MHz，丙酮-d₆)δ为196.7、167.6、165.0、164.2、159.4、133.6、129.8、127.7、116.9、115.6、102.9、96.9、95.9、76.6和42.4。C₁₅H₁₂ClO₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为307.0368，发现为307.0368。

2-(2-溴-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-4-二氢色酮(化合物13，NAR-40)

化合物13(NAR-40)通过如下方案(P)合成：

合成方法与上述条件(b)的方法相同。所得产物化合物13(NAR-40)，为淡白色固体(79mg，22.57％)。¹H NMR(800MHz，丙酮-d₆)δ为7.57(d，J＝8.5Hz，1H)、7.14(d，J＝2.5Hz，1H)、6.97(dd，J＝8.5，2.5Hz，1H)、6.00-5.96(m，2H)、5.71(dd，J＝13.4，2.9Hz，1H)、3.12(dd，J＝17.0，13.3Hz，1H)和2.77(dd，J＝17.0，2.9Hz，1H)。¹³C NMR(200MHz，丙酮-d₆)δ为196.6、167.6、165.0、164.2、159.4、129.9、129.3、123.3、120.2、116.2、103.0、97.0、95.9、78.8和42.5。C₁₅H₁₂BrO₅ ⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI)m/z计算为350.9863，发现为350.9867。

如本文所述，本发明的发明人发现NAR通过上调相对Esrrg表达来促进氧化型肌纤维数量和有氧代谢的增加。因此，相对Esrrg表达的上调是评估NAR类似物是否具有相似功能的关键指标。

化合物1-13被用于测试相对Esrrg表达。每种化合物都溶解在DSMO中，并加入水形成水溶液后进行测试。本文中使用的“相对Esrrg表达”一词指的是使用化合物处理组中的Esrrg表达相对于仅用DMSO处理的对照组的表达。在实验测试过程中，C2C12肌管分别用DMSO或NAR(100μM、200μM和400μM)或其他一种化合物进行处理。使用TRIzol试剂提取C2C12肌管的总RNA。使用寡-dT引物和HiScript II逆转录酶对总RNA中的mRNAj进行逆转录，合成cDNA。使用SYBR Green Fast qPCR Mix进行定量实时PCR。SYBR Green染料加入样品后，会立即与样品中的cDNA结合。在PCR过程中，DNA聚合酶会扩增目标序列，产生称为“扩增子”的PCR产物。然后，SYBR Green染料会与每个新生成的cDNA分子结合。随着PCR的进行，会产生越来越多的扩增子。当SYBR Green染料与所有cDNA结合时，荧光强度会随着PCR产物的增加而增加。获得每种化合物的Ct值(对于无模板对照样本，当荧光信号超过固定阈值时的循环次数)。最后，采用相对定量法分析经NAR或其他化合物处理的样品相对于经DMSO处理的样品中Esrrg基因表达量的变化，用算术公式2^-△△Ct得出不同样品中Esrrg的相对表达量。

化合物1-13和NAR的相对Esrrg表达结果如表2所示。当化合物显示接近或高于2的相对Esrrg表达时，期望该化合物具有所需的生物活性，例如，改善骨骼肌耐力，治疗肌肉萎缩或营养不良，或预防需要其的受试者的肌肉萎缩或营养不良。相对Esrrg表达测量是评估这些期望活性的模型。在本公开中提供的柚皮素及其衍生物已被证明具有较高的相对Esrrg表达和所需的生物或药物活性。

表2

在一些实施方式中，唯一的取代基团(由R₁或R代表)可能位于与二氢色酮连接的苯基的羟基的邻位或间位。该化合物分别具有如式(III)或(IV)所示的结构。

对于具有式(III)化学结构的化合物，上述和表2中描述的例子包括NAR-27(R＝F)、NAR-29(R＝Cl)、NAR-31(R＝Br)、NAR-33(R＝OMe)、NAR-34(R＝NO₂)和NAR-35(R＝苯基)。如表2所示，相对Esrrg表达结果按照取代基的顺序呈现趋势：Cl>Br>OMe>F。当R是NO₂或苯基时，这些化合物在水中的溶解度低，没有获得相对Esrrg表达的结果。需要进一步的研究以提高溶解度。

对于具有式(IIV)化学结构且R位于羟基间位的化合物，上述及表2中的例子包括NAR-37(R＝F)、NAR-39(R＝Cl)和NAR-40(R＝Br)。如表2所示，相对Esrrg表达结果按照取代基顺序呈现趋势：F和Cl>Br。

上述和表2中描述的一些例子包括两个取代基团，除了与二氢色酮环结构相连的苯基上的羟基外。例如，NAR-28和NAR-38包含两个F取代基，NAR-30包含两个Cl取代基，而NAR-32包含两个Br取代基。具有两个卤素取代基的化合物可能比具有一个卤素取代基的相应对应物具有较低的相对Esrrg表达值。然而，除NAR-30外，所有其他具有两个卤素取代基的化合物的相对Esrrg表达值接近或高于2，这表明这些化合物具有所需的生物或药理活性。

基于这些结果，当使用至少一个如本文所述的取代基团(除了羟基)来修饰与二氢色酮连接的苯基时，可以获得具有所需生物或药物活性的化合物。

以下列出了与背景相关的参考文献，其中一些在本公开中有所提及：

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尽管本文已经以示例性实施方式的形式描述了主题内容，但这并不仅限于此。相反，附加的权利要求应被广泛解释，包括其他可能由本领域技术人员进行的变体和实施方式。

Claims (24)

1.一种用于改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的组合物，其特征在于，该组合物包括：

有效量的具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受的溶剂化物或其任何组合；以及

药学上可接受的赋形剂，

其中，式(I)具有以下化学结构：

其中，

R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是除H以外的取代基。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，R₁或R₂是H以外的取代基，R₃＝H，且R₄＝H。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物选自由以下组成的组中：

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述赋形剂选自溶剂、共溶剂、着色剂、防腐剂、抗菌剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、乳化剂、悬浮剂或其任意组合。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述赋形剂包括含20％DMSO和80％盐水的载体。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物为药物组合物、功能组合物和/或膳食补充剂。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物为可注射或口服的药物组合物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述化合物的浓度为1-50mM。

11.一种具有式(I)的化合物、其药学上可接受的溶剂化物或其任何组合，

其中，式(I)具有以下化学结构：

其中，

R₁、R₂、R₃和R₄中的各自选自H、F、Cl、Br、OH、NH₂、NO₂、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和苯基组成的组，并且R₁、R₂、R₃和R₄中至少有一个不是H的取代基。

12.根据权利要求11的化合物，其中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是除H以外的取代基。

13.根据权利要求1的化合物，其中，R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。

14.根据权利要求1所述的化合物，其中，该化合物选自由以下组成的组中：

15.一种制备权利要求11所述的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1-(2-羟基-4，6-双(甲氧基甲氧基)苯基)乙酮与取代的对-双(甲氧基甲氧基)苯甲醛反应。

16.一种制备权利要求1所述的组合物的方法，其特征在于，该方法包括制备所述化合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，该方法还包括混合所述赋形剂和所述化合物。

18.一种改善骨骼肌耐力、治疗肌肉萎缩或营养不良或预防需要此类治疗的受试者的肌肉萎缩或营养不良的方法，其特征在于，该方法包括：

将权利要求1所述的组合物施用给有需要的受试者，其中，所述组合物含有有效量的具有式(I)的化合物、其药学上可接受的溶剂化物或其任何组合的成分。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。

20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述受试者为人类受试者。

21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述组合物通过肌肉注射或口服给药。

22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述组合物以每日一次或每隔一日一次的频率，通过肌肉注射给药有效量范围在2-20mg/Kg的化合物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述化合物的有效剂量为3.6-7.6mg/Kg。

24.根据权利要求18所述的方法，其中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或两个是除H以外的取代基，并且R₁、R₂、R₃和R₄各自选自H、F、Cl、Br、OH和NH₂组成的组。