CN119176855B

CN119176855B - 一种提高免疫力的鳄鱼血肽复合物及其制备方法

Info

Publication number: CN119176855B
Application number: CN202411405839.3A
Authority: CN
Inventors: 孙根元; 吴毛展; 张婷婷
Original assignee: Zhencheng Tianjin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhencheng Tianjin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-10-10
Filing date: 2024-10-10
Publication date: 2025-04-25
Anticipated expiration: 2044-10-10
Also published as: CN119176855A

Abstract

本发明提供了一种提高免疫力的鳄鱼血肽复合物及其制备方法。本发明从养殖的暹罗鳄血液中通过酶解、筛选鉴定得了2个具有较好促进免疫细胞增殖及提高免疫活性的多肽，将其制备成为复合物后能够很好的提高小鼠的免疫活力，具有较好的应用价值。

Description

一种提高免疫力的鳄鱼血肽复合物及其制备方法

技术领域

本申请涉及生物领域，涉及一种提高免疫力的鳄鱼血肽复合物及其制备方法。

背景技术

免疫系统是人体抵抗外来病原体，提高生存能力的至关重要的一部分，但它容易受到不良生活方式、病菌、压力等诸多因素的干扰。一旦人体免疫系统出现问题，通常通过他克莫司（FK506）、环孢菌素、雷帕霉素、咪唑立宾等免疫抑制剂调节免疫能力。但大多数免疫抑制剂疗效缓慢且有一定的毒副作用。而近年来研究人员发现天然的生物活性肽可能成为治疗免疫疾病的一大突破点。

海洋蕴藏巨大的生物资源,拥有丰富多样的物种以及独特的化学物质。鱼类、贝类、软体动物、甲壳类动物等海洋生物及其副产物是优质蛋白质的丰富来源。从海洋生物来源的多肽具有抗氧化、调节血压、抗菌、抗癌、增强免疫等功能。例如,从发酵鱼露中获得了具有较强抗氧化活性的两个肽段;大眼金枪鱼鱼头蛋白小于1kDa组分对羟自由基、超氧阴离子等有较好的清除能力和提高免疫能力。

此外，植物蛋白大米蛋白主要含有谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，其主要优点是氨基酸组成合理与低致敏性。目前大米蛋白肽主要集中于抗氧化及降血压活性的研究一，但对大米免疫活性肽的研究也越来越受到重视。最早在1994年Takahashi等就从大米胰酶水解物中分离出一个八肽，并证明其具有增强巨噬细胞吞噬能力、促进肠道收缩和抗吗啡等免疫调节作用，之后也有一些阿片类活性的大米肽相继被分离出来。最近，王璐等圳通过胰酶水解分离纯化出的不同纯度的大米肽能促进巨噬细胞RAW164.7的增殖，分子量≤1000Da的酶解肽具有最佳的促增殖效果。研究发现富硒大米蛋白酶解物可以保护Pb引起的RAW264.7巨噬细胞毒性，表明大米活性肽对免疫细胞具有免疫保护作用。

其他植物来源的免疫活性肽食源性植物种类众多，水果及蔬菜等同样成为免疫活性肽的主要来源。对软枣猕猴桃多肽进行免疫试验，发现软枣猕猴桃多肽能够延长小鼠负重游泳时间、增加小鼠肝糖原储备量、增强动物运动耐力、缓解动物体力疲劳的作用,对小鼠机体具有直接的免疫增强作用。从苋菜中分离得到的蛋白活性肽SSEDIKE可抑制人结肠癌细胞Caco-2的趋化因子CC120的基因表达,具有抑制炎症的免疫特性。从蜜桔中分离出环肽citrusinXl,并利用RAW264.7炎症模型证明其可通过抑制NF-xB通路而降低iNOS和N的产生,具有抗炎作用。此外，来自羽扇豆的抗炎免疫活性肽GPETAFLR可作用于人单核细胞株THP-1分化的巨细胞并明显降低促炎介质TNF、1L-18和CCL2,提高抗炎介质IL-10的基因表达。这些免疫活性肽的研究不仅表明食源性植物的生物活性,同样为食源性植物在生产中的充分利用及临床疾病的改善提供了更多契机。

菌类免疫活性肽菌类蛋白是一种特殊的蛋白质,其氨基酸分子呈线性排列,根据菌种的不同,可产生不同的蛋白质。菌类蛋白的粗提取物及从中分离的多肽、多糖肽(PSP)与环肽在体内外均具有免疫调节活性。分别从冬虫夏草与杏鲍菇中分离提取出抗菌肽，这些肽对多种致病菌增殖有明显抑制作用。研究发现云芝PSP可以调节人外周血单核细胞的Toll样受体4、5信号通路,证明云芝糖肽具有体外免疫活性。在大鼠体内研究中发现云芝PSP可以增高LPS诱导的大鼠血清中的TNF-a和IL-6的含量，证明PSP具有体内免疫调节功能。

鳄鱼多肽营养丰富，是一种高蛋白、低糖、低脂的产品，富含钾、钙、镁和锌、铁等多种金属元素。而且氨基酸种类齐全，富含8种人体必需氨基酸，尤其人体需要量最大的赖氨酸和亮氨酸含量显著较多，并且鳄鱼活性多肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值显著高于各种鱼类。研究表明，鳄鱼活性肽能够有效清除对人体有害的自由基，提高机体抗氧化能力，减少氧化产物的产生，保护机体免受各种氧化性损伤，从而预防了各种与自由基损伤相关的疾病，如高血压、糖尿病、阿尔兹海默病、心血管病等。如鳄鱼皮胶原活性肽就能够有效抑制血管紧张素转化酶，从而达到降血压的效果；鳄鱼肉活性肽可以修复受损细胞，提高胰岛细胞功能，促进胰岛素的分泌和胰岛功能的实现，同时提高抗氧化酶的作用，减少氧化作用，减少糖尿病并发症发生。鳄鱼肽富含抗氧化剂，这些成分能够中和自由基，减少细胞损伤，从而加强免疫系统的功能。抗氧化剂不仅可以提升免疫细胞的活力，还可以抑制炎症反应，帮助维持整体健康。

但是目前，一方面，高活性的鳄鱼多肽分离的种类还不够多，另外一方面，鳄鱼数量有限，制备方法复杂，成本高昂，多肽来源受限，不适于直接通过从鳄鱼肉或者鳄鱼血中分离制备获得活性多肽。

发明内容

本发明提供一种提高免疫力的鳄鱼血肽复合物。

进一步的，本发明的鳄鱼血肽复合物是由YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽组成。

进一步的，YZB-II-B-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，YZB-II-B-2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，本发明的多肽还可以被取代。具体的，氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代可以是，例如作为酸性氨基酸的天门冬氨酸-谷氨酸；作为碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为疏水氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸、甲硫氨酸/缬氨酸、丙氨酸/缬氨酸；作为亲水氨基酸的丝氨酸/甘氨酸/丙氨酸/苏氨酸。保守氨基酸取代也包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含有酰胺的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。进行氨基酸取代后，使用本文所述的测定可以评估含有氨基酸取代的多肽的活性。

进一步的，本发明的多肽还可以偶联聚合物以提高生物活性或者半衰期。

具体的，偶联到多肽的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，具有依据本发明所限定的分子量，包括天然的和合成的均聚物，诸如多元醇(即聚-OH)、聚胺(即聚-NH₂)和聚羧酸(即聚-COOH)，以及进一步地，杂聚物，即包括一个或多个不同的偶联基团如羟基基团或胺基团的聚合物。合适的聚合物分子的例子包括选自下列的聚合物分子：聚环氧烷烃(PAO)，诸如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支链聚乙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D，L-氨基酸、聚乙烯顺丁烯二酸酸酐共聚物、聚苯乙烯苹果酸酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，壳聚糖的水解物，淀粉诸如羟乙基-淀粉和羟丙基-淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物，瓜尔豆胶、短醒霉多糖、菊糖、黄原胶、卡拉胶、果胶、海藻酸水解产物和生物多聚物。优选的聚合物分子是无毒性的聚合物分子，诸如(m)聚乙二醇(mPEG)，进一步地，它们需要相对简单的化学过程便能够共价偶联到酶表面上的附着基团。

进一步的，本发明还提供了YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽组成的鳄鱼血肽复合物在制备用于提高免疫力的药物中用途。

具体的，所述的药物中含有合适的载体或者赋形剂或者合适的药用辅料。

进一步的，药物可以含有：稀释剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸氢钙或羧甲基纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；和粘合剂，诸如淀粉、天然胶，例如阿拉伯胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷、纤维素和其衍生物，聚维酮、交聚维酮和其他这样的粘合剂，如本领域技术人员所知道的。液体的药学上可施用的组合物可以通过例如将上面定义的活性化合物和可任选的药物佐剂溶解、分散或混合在载体中，从而形成溶液或悬浮液来制备，所述的载体例如水、盐水、含水右旋糖、丙三醇、乙二醇、乙醇和类似物。如果需要的话，待施用的药物组合物也可以含有很小量的无毒辅助物质诸如润湿剂、乳化剂或增溶剂、pH缓冲剂和类似物，例如醋酸盐、柠檬酸钠、环状糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺醋酸钠、三乙醇胺油酸盐和其他这样的试剂。制备这样的剂型的方法是已知的，或对于本领域技术人员是显而易见的。待施用的组合物或制剂含有一定数量的活性化合物，该数量足以改善接受治疗的对象的症状。此外，抗细菌或抗真菌试剂—包括但不限于硫柳汞可以存在于制剂中。本文中提供的另一制剂是于EDTA、NaCl和CaCl₂中的稳定化溶液，其中含有有效活性数量的多肽，并加入了乳糖。本文也提供了含有处于EDTA、NaCl和CaCl₂中的稳定化溶液或冻干形式的多肽制剂。本文中提供的另一制剂，或者是冻干的或者是作为稳定溶液，含有有效数量的多肽，它们处于EDTA、NaCl和CaCl₂中。

进一步的，所述的药物可以是口服制剂或者注射制剂。

更进一步的，用于肠胃外施用的制剂可以包括普通的赋形剂、无菌水、盐水、诸如聚乙二醇的聚烷撑二醇、植物源油、氢化萘和其组合。在一些实例中，生物相容的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯(polyoxethylene)-聚氧丙烯共聚物或其组合可以被用作体内多肽控释的赋形剂。可以使用的其他合适的肠胃外给药系统包括但不限于乙烯醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可移植输注系统、脂质体和其组合。用于吸入施用的制剂可以包括诸如乳糖的赋形剂。吸入制剂可以是含有诸如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘胆酸盐、脱氧胆酸盐或其组合的水溶液，或者它们可以是以滴鼻剂形式施用的油溶液。如果需要，含有本文提供的多肽的组合物可以配制成凝胶以在鼻内应用。用于肠胃外施用的制剂可以包括口腔施用的甘胆酸盐。为了口服施用，可以使用合适的方法和药学可接受赋形剂制备片剂或胶囊剂，所述赋形剂如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠(sodiumstarch glycolate))；或润湿剂(例如月桂硫酸钠(sodium lauryl sulfate))。使用合适的方法可以包衣片剂。可以配制口服施用的制品以提供多肽的控释。

进一步的，本发明的还提供了一种用于提高免疫力的保健品，所述保健品中含有提高免疫力的鳄鱼血肽复合物。本发明的鳄鱼血肽复合物是由YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽组成。

进一步的，本发明还提供了鳄鱼血肽复合物在制备用于提高免疫力的保健品中的用途，具体的所述的鳄鱼血肽复合物是由YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽组成。

有益效果

附图说明

图1 各组分对RAW264.7细胞增殖的影响

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1 鳄鱼血肽的制备

取养殖的暹罗鳄血液，加入4倍量的蒸馏水，调节至适宜的pH，加入优化后的酶解条件：反应温度为50℃，pH之为7.0，酶与底物浓度比为6%，底物浓度为7.5%，反应为85min。将反应后的产物放入95℃水浴15min,对酶灭活,灭活液在4℃、4500r/min离心30min,取上清液真空浓缩后冷冻干燥,得酶解物。采用D101大孔吸附树脂对暹罗鳄血液酶解物进行脱盐，用截留分子量为3kDa和1kDa的超滤膜超滤分级,得三个组分:YZB-I(MW>3kDa)、YZB-II(3kDa>MW>1kDa)和YZB-III(MW<1kDa)。

RAW264.7细胞系（货号：HTX1760，豪地华拓生物）培养于含有10%灭活胎牛血清的高糖DMEM 培养基中，置于 37℃、饱和湿度5%CO₂恒温培养箱中进行培养，每2-3d传代一次。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，以100μL孔接种于96孔培养板中，于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养2h，待细胞贴壁，去掉上清液，每孔加入100μL三个超滤分级组分，使其终浓度为1μg/mL(含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基配制)，空白对照组加入不含多肽组分的培养液，以1μg/mL LPS作为阳性对照组，每组设置3个复孔。在37℃、5%CO₂恒温培养箱中继续培养24h后，加入10μL 5mg/mL的MTT工作液，继续培养4h,弃去培养基，小心用PBS冲3遍后，每孔加入150μL DMSO溶解液，避光振荡20min，使甲瓒彻底溶解利用酶标仪测570nm处的OD值，计算RAW264.7细胞增殖率，增殖率（%）=（样品OD570nm/空白对照组OD570nm）×100。

从图1可以看出，YZB-II(3kDa>MW>1kDa)组分的促进细胞增殖能力最强，相比空白对照组，增殖率达到了（165.4±3.7）%，因此，选择该组分进行进一步的分离和纯化。

取超滤后的 YZB-II溶于双蒸水中,保持浓度为1mg/mL，加入到预先平衡的Sephadex G-25 凝胶柱(2.6× 80cm)上,用蒸馏水以1mL/min的速度洗脱,每5min收集一管, 并于220nm检测吸光度,按峰合并,得5个组分(YZB-II-A~E)。采用前述相同的RAW264.7细胞增殖率（%）检测方法，检测五个组分对RAW264.7细胞增殖的影响，结果显示，YZB-II-B组分显示出最强的增殖效果。

将YZB-II-B组分进行RP-HPLC。RP-HPLC条件为:色谱柱Zorbax SB C-18(4.6×250mm,5μm,Agilent,USA)；流速1mL/min；检测波长220nm；流动相:乙腈/水梯度洗脱；柱温25℃。YZB-II-B经RP-HPLC分析为2个峰，分别命名为YZB-II-B-1和YZB-II-B-2。利用Edman降解法经蛋白质序列分析仪测定YZB-II-B-1的序列为SEQ ID NO：1所示，YZB-II-B-2的序列为SEQ ID NO：2所示。

实施例2 鳄鱼血肽对免疫细胞吞噬活性的影响

RAW264.7细胞系（货号：HTX1760，豪地华拓生物）培养于含有10%灭活胎牛血清的高糖DMEM 培养基中，置于 37℃、饱和湿度5%CO₂恒温培养箱中进行培养，每2-3d传代一次。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，设置空白对照组（只有培养基）、阳性对照组（1μg/mL LPS）和YZB-II-B-1和YZB-II-B-2 分别2个质量浓度的实验组（10μg/mL、100μg/mL），每组设置4 个复孔，在 37℃、5%CO₂条件下培养 24h后弃掉上清液，加入0.075%中性红溶液100uL，于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养1h，弃去中性红溶液，小心用PBS 洗2遍后，加入醋酸-乙醇(1:1，V/V)细胞溶解液100μL/孔，室温静置过夜，利用酶标仪，于波长540 nm处测定 OD值，按照下面公式计算 RAW264.7细胞的吞噬指数。吞噬指数（%）=（样品OD540nm/空白对照组OD540nm）×100。结果如表1所示。

表1 各组的吞噬指数结果

#表示与空白对照组相比，差异显著（P<0.05）。

从表1可以看出，本发明的YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽对RAW264.7细胞刺激后，对细胞吞噬能力有明显的促进作用，并且具有一定的剂量依赖性，与空白对照组相比，差异显著（P<0.05）。

实施例3 鳄血多肽对小鼠免疫力的影响

将BALB/c小鼠，每组10只随机分为6个组：对照组、模型组、阳性对照组（鱼鳞胶原蛋白多肽400mg/kg）组（货号XCSW2022，香草生物）、YZB-II-B-1和YZB-II-B-2（1:1）多肽共计200、400、800mg/kg组。造模同时开始灌胃给药，每天1次，连续15d。对照组给予饮用水0.2mL/10g体重。造模方法除对照组外，其余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺，0.6mg/次，每日1次，共3次，对照组腹腔注射等量生理盐水0.2mL/10g体重。连续对小鼠灌胃15d，将其颈椎脱臼处死，无菌条件下获取其脾脏，用镊子将脾在盛有适量无菌Hanks液的小平皿中轻轻撕碎，200目筛网过滤制成单细胞悬液，悬液分为2部分，用于转化实验备用。细胞悬液用Hanks液洗涤2次，每次进行10min（1000r/min）离心，然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，台盼兰染色计数活细胞数（在95%以上），将细胞浓度调整为3×10⁶个/mL。每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液作为实验，另一孔作为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。以实验孔与对照孔OD的差值代表淋巴细胞增殖能力。结果如表2所示。

表2 各组对免疫功能损伤小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响

*表示与模型组相比，P<0.05。

从表2的结果表明给药组小鼠T淋巴细胞的增殖功能较模型组小鼠的功能有明显上升，并且具有计量依赖性，在800mg/kg给药条件下，增殖能力最强。

进一步的，将各组小鼠脾细胞悬液（5×10⁶/L）加入96孔细胞培养板内，100μL/孔。将体外传代培养的YAC-1靶细胞（⁵¹Cr标记靶细胞）离心，并调整细胞密度按照效靶比为10:1，加于96孔培养板中，置37℃、CO₂培养箱中培养4h。1000rpm离心培养板10min，吸取100μl上清液至检测管中，采用液闪计数仪检测每分钟放射性活性(cpm值)，计算NK细胞对靶细胞的杀伤率。结果如表3所示。

表3 各组对免疫功能损伤小鼠NK细胞杀伤活性的影响

*表示与模型组相比，P<0.05。

从表3的不同组别的NK细胞杀伤结果显示，阳性对照组以及本发明的多肽组，而且具有正向免疫调节作用，可提高小鼠的免疫功能，且呈一定的剂量依赖性。基于以上结果可以发现，本发明的YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽制备的组合物药物可以有效的提高机体的免疫力，具有极好的治疗效果和应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种提高免疫力的鳄鱼多肽，其特征在于其命名为YZB-II-B-1多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种提高免疫力的鳄鱼多肽，其特征在于其命名为YZB-II-B-2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种提高免疫力的鳄鱼血肽复合物，其特征在于所述的复合物是由YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽按照1:1配制组成，其中，YZB-II-B-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，YZB-II-B-2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.鳄鱼血肽复合物在制备提高免疫力的药物中的用途，其中，所述的复合物是是由YZB-II-B-1和YZB-II-B-2多肽按照1:1配制组成，其中，YZB-II-B-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，YZB-II-B-2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。