CN119086911A - 测定肝癌患者癌旁组织中的cd93蛋白与cd68蛋白水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肝癌疾病预后诊断技术领域，提供了测定肝癌患者癌旁组织中的标志物水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用，所述标志物为CD93蛋白与CD68蛋白。本发明研究表明，只有癌旁间质区域的巨噬细胞才高表达CD93。而巨噬细胞高表达CD93的表型与肝癌患者的预后生存情况高度相关。因此，本发明通过分析肝癌癌旁间质区域中CD93和CD68双阳性细胞的密度，以CD68单阳性密度405.7cells/mm2，CD93和CD68双阳性细胞密度22.1cells/mm2为阈值，来更加高效准确地评估肝癌患者的预后生存情况。本发明能帮助医生选择适合治疗手段进而提高患者的治疗效果，最终实现延长患者生存时间的目的，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于肝癌疾病预后诊断技术领域。更具体地，涉及测定肝癌患者癌旁组织中的CD93蛋白与CD68蛋白水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位于第四位和第二位。目前临床针对肝癌的治疗仍以手术切除和放化疗为主要手段，然而，由于肝癌在确诊时大多已处于中晚期，加上手术切除后的高复发率，使得肝癌患者的总体生存率仍维持着较低的水平。因此，通过找寻能够有效预测肝癌患者预后的相关标记物，将为患者更好地实现临床预后评估以及精准治疗提供重要的参考意义。
目前临床上可依据肝癌病理诊断以及单个分子标记物对患者术后生存情况进行预测，包括：(1)肝癌分期；(2)血清肿瘤标记物(甲胎蛋白)；(3)肝功能指标；(4)免疫学指标，如淋巴细胞或者髓系细胞的数量等。以上指标虽然在一定程度上能够帮助评估肝癌患者的预后情况，但仍存在预测精度和有效性均较差的问题。例如，免疫细胞如髓系细胞在肝癌肿瘤的浸润水平这单一指标无法准确反映髓系细胞在肿瘤进展中发挥的实际功能，进而影响肝癌患者术后预后评估的准确性。
CD68是一种细胞质蛋白，与溶酶体颗粒有关，常被用于特异性标记单核巨噬细胞，且有研究表明肿瘤相关单核巨噬细胞主要扮演促肿瘤的角色。CD93是一种C型凝集素14家族蛋白，主要由内皮细胞以及单核巨噬细胞表达，在体内发挥着促进血管生成和调节免疫反应的功能。CD93已被报道在肿瘤相关内皮细胞上高表达能够促进肿瘤血管生成进而调控肿瘤的进展。
目前，有关单核巨噬细胞表达的CD93水平在肝癌患者预后生存中的研究还尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供测定肝癌患者癌旁组织中的CD93蛋白与CD68蛋白水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用。
本发明的另一目的是提供一种用于肝癌切除术后预后预测的免疫组化染色检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发明，只有癌旁间质区域的巨噬细胞才高表达CD93。而巨噬细胞高表达CD93的表型与肝癌患者的预后生存情况高度相关。因此本发明提供以下应用方案：
测定肝癌患者癌旁组织中的标志物水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用，所述标志物为CD93蛋白与CD68蛋白。
测定肝癌患者癌旁组织中的巨噬细胞CD93水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用。
测定肝癌患者癌旁组织中的标志物水平的抗体在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用，所述标志物为CD93蛋白与CD68蛋白。
测定肝癌患者癌旁组织中的标志物水平的抗体在制备肝癌切除术后预后的免疫组化检测试剂盒的应用，所述标志物为CD93蛋白与CD68蛋白。
具体地，所述肝癌预后预测为肝癌切除术后患者生存期预测。
本发明利用数字切片扫描仪和QuPath等专业图像处理软件分析肝癌癌旁间质中CD68分子单阳性细胞、CD93与CD68分子双阳性细胞的密度，分别采用中位值法将肝癌患者分为高低两组。在本发明中，通过中位值法分别确定CD68分子单阳性细胞密度大于等于405.7cells/mm2为高表达组，低于该值的样本为低表达组；CD93与CD68分子双阳性细胞密度大于等于22.1cells/mm2为高表达组，低于该值的样本为低表达组。高表达组则提示肝癌患者预后生存期较差，低表达组则提示肝癌患者预后生存期较好，且与CD68分子单阳性细胞密度指标相比，以CD93与CD68分子双阳性细胞密度作为预测指标能更精准地评估肝癌患者的预后生存情况。因此，本发明提供以下优选方案：
作为可实施的优选方案，通过分析肝癌癌旁间质区域中CD93和CD68双阳性细胞的密度，以CD68单阳性密度405.7cells/mm2，CD93和CD68双阳性细胞密度22.1cells/mm2为阈值，若高于阈值则预测患者预后生存期差，若低于阈值则预测患者预后生存期好。
另外，本发明还提供一种用于肝癌切除术后预后预测的免疫组化染色检测试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为CD93与CD68的抗体的组合。
作为可选择的实施方案，所述第二抗体是辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
作为可选择的实施方案，所述免疫组化染色检测试剂盒还包含AEC显色试剂。
作为可选择的实施方案，所述AEC显色试剂为3-氨基-9-乙基卡唑。
作为可选择的实施方案，所述免疫组化染色检测试剂盒还包含免疫组化检测所需试剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究表明，只有癌旁间质区域的巨噬细胞才高表达CD93。而巨噬细胞高表达CD93的表型与肝癌患者的预后生存情况高度相关。因此，本发明通过分析肝癌癌旁间质区域中CD93和CD68双阳性细胞的密度，以CD68单阳性密度405.7cells/mm2，CD93和CD68双阳性细胞密度22.1cells/mm2为阈值，来更加高效准确地评估肝癌患者的预后生存情况。
另外，本发明还提供一种用于肝癌切除术后预后预测的双抗体检测试剂盒，该试剂盒可通过多重免疫组化染色方法检测癌旁间质区域表达CD93巨噬细胞的密度，相比于巨噬细胞密度指标，具有更高效准确的优势，更能有效预测肝癌患者手术切除后的生存情况，并能帮助医生选择适合治疗手段进而提高患者的治疗效果，最终实现延长患者生存时间的目的，具有很好的应用价值。
附图说明
图1为多重免疫组化染色检测肝癌正常肝组织、癌旁间质区域以及肿瘤组织CD93和CD68双阳性细胞占CD68单阳性细胞的比例结果(绿色为CD68分子，红色代表CD93分子，蓝色为细胞核，合并图像显示CD68与CD93分子的共定位情况)。
图2为多重免疫组化染色检测肝癌癌旁间质区域中CD68的表达情况(绿色为CD68分子，蓝色为细胞核)。
图3为生存曲线分析肝癌患者癌旁间质区域巨噬细胞密度高低与患者总体生存情况的关系。
图4为多重免疫组化染色检测肝癌癌旁间质区域中CD68和CD93的表达情况(绿色为CD68分子，红色代表CD93分子，蓝色为细胞核，合并图像显示CD68与CD93分子的共定位情况)。
图5为生存曲线分析肝癌患者癌旁间质区域表达CD93分子的巨噬细胞密度高低与患者总体生存情况的关系。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
CD93抗体购自Atlas antibodies公司，货号为HPA009300。
CD68抗体购自Dako公司，货号为M087629-2。
AEC显色试剂盒购自索莱宝(solarbio)公司，货号A2010。
N-Histofine Simple Stain MAX PO(R)(荧光素)购自Nichirei公司，货号414144F。
N-Histofine Simple Stain MAX PO(M)(荧光素)购自Nichirei公司，货号414134F。
实施例1
一种用于肝癌切除术后预后预测的免疫组化染色检测试剂盒，其中包括两个第一抗体和第二抗体，两个第一抗体所检测的蛋白分子分别为：CD93和CD68。试剂盒还含有辣根过氧化物酶标记的第二抗体，AEC显色试剂盒(solarbio)。
实施例2
选取10例肝癌患者包含正常肝组织、肿瘤癌旁间质区域以及肿瘤组织的4μm肝癌石蜡切片。
一、标本检测
对标本进行多重免疫组化染色检测，检测方法如下：
(1)室温下用二甲苯脱蜡两次，每次10分钟；
(2)在100％乙醇中洗去二甲苯，再依次经过95％酒精、80％酒精、70％酒精，每次5分钟；
(3)双蒸水洗5分钟；
(4)使用0.3％H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟；
(5)双蒸水洗4次，每次5分钟；
(6)抗原修复：10mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)，微波热修复高火7分钟中低火25分钟；
(7)室温自然冷却30分钟；
(8)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(9)用5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液室温封闭30分钟；
(10)将第一抗体CD93滴加在组织切片上，4℃孵育12小时；
(11)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(12)滴加带过氧化物辣根酶的第二抗体(N-Histofine Simple Stain MAX PO(R))，室温孵育30分钟；
(13)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(14)滴加AEC底物进行显色，时间7分钟；
(15)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(16)滴加Mayer苏木素细胞核染料，染核10分钟；
(17)双蒸水终止染色，PBS缓冲液洗3分钟；
(18)双蒸水洗4次，每次4分钟；
(19)对石蜡切片进行封片，使用数字切片扫描仪(Aperio VERSA明场，荧光&FISH数字病理扫描仪，Leica)进行扫片后，揭掉盖玻片对AEC底物进行脱色处理；
(20)一抗打断：10mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)，微波高火7分钟，中低火20分钟；
(21)室温自然冷却30分钟；
(22)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(23)用5％BSA的PBS缓冲液室温封闭30分钟；
(24)将第二个第一抗体CD68滴加在组织切片上，4℃孵育12小时；
(25)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(26)滴加带过氧化物辣根酶的第二抗体(N-Histofine Simple Stain MAX PO(M))，室温孵育30分钟；
(27)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(28)滴加AEC底物进行显色，时间30分钟；
(29)PBS缓冲液中洗4次，每次4分钟；
(30)滴加Mayer苏木素细胞核染料，染核时间20分钟；
(31)双蒸水终止染色，PBS缓冲液洗3分钟；
(32)对石蜡切片进行封片，使用数字切片扫描仪进行扫片。
实施例3
选取包含癌旁间质区域的肝癌石蜡切片，确保切片无大片坏死区域。获取99例肝癌患者4μm的石蜡切片，在55℃烤片2小时，取出，等待切片恢复至室温。使用实施例2的检测方法对切片标本进行多重免疫组化染色检测。
实施例4
一、图像处理
对切片扫描图像进行处理，具体处理方法为：
(1)从数字切片扫描仪扫描采集包含实施例2标本的正常肝组织区域、肝癌癌旁间质区域以及肝癌肿瘤区域的图片5张；实施例3标本的肝癌癌旁间质区域的图片5张；
(2)采用QuPath、Image J和Photoshop等专业图像处理软件分别识别各信号并将其转换成荧光信号，其中CD93的荧光信号为红色，CD68荧光信号为绿色，细胞核信号为蓝色(处理后的信号图像如图1、图2、图4所展示)；
(3)对实施例2标本的多重免疫组化染色结果进行CD68单阳性、CD93和CD68双阳性细胞数量的分析，计算正常肝组织、肝癌癌旁间质区域以及肿瘤区域CD93和CD68双阳性细胞占CD68单阳性细胞的比例；
对实施例3标本的多重免疫组化染色结果进行CD68单阳性、CD93和CD68双阳性细胞数量以及截取区域的面积大小的分析，计算肝癌癌旁间质区域中CD68单阳性、CD93和CD68双阳性细胞的密度(即表达CD93的巨噬细胞的密度)；
(4)最终结果取5张截取图片中所得数据的平均值。
二、结果分析
(1)实施例2标本检测结果
多重免疫组化染色检测肝癌正常肝组织、癌旁间质区域以及肿瘤组织CD93和CD68双阳性细胞占CD68单阳性细胞的比例结果如图1所示，结果表明，肿瘤组织的巨噬细胞表达CD93水平与正常组织相当，甚至低于正常组织。相比于正常肝组织以及肿瘤组织，位于癌旁组织区域的巨噬细胞表达CD93的比例显著高于正常肝组织以及肿瘤组织，说明只有癌旁间质区域的巨噬细胞才高表达CD93。
(2)实施例3标本检测结果
多重免疫组化染色检测肝癌癌旁间质区域中CD68的表达情况如图2所示，检测肝癌癌旁间质区域中CD68和CD93的表达情况如图4所示。将实施例3标本检测结果以中位值法确定分组依据，分别以CD68单阳性密度405.7cells/mm2，CD93和CD68双阳性细胞密度22.1cells/mm2为中位值将99例样本分为巨噬细胞密度和CD93+巨噬细胞密度的高低两组，用于后续肝癌患者的预后统计(CD68分子单阳性细胞密度大于等于405.7cells/mm2为高表达组，低于该值的样本为低表达组；CD93与CD68分子双阳性细胞密度大于等于22.1cells/mm2为高表达组，低于该值的样本为低表达组)。
肝癌患者癌旁间质区域巨噬细胞密度高低与患者总体生存情况的关系的生存曲线分析结果如图3所示，肝癌患者癌旁间质区域表达CD93分子的巨噬细胞密度高低与患者总体生存情况的关系的生存曲线分析结果如图5所示，结果表明：
巨噬细胞密度高低两组的肝癌患者总体生存有差异(P＝0.0425，如图3)，而CD93+巨噬细胞密度高低两组的肝癌患者总体生存有极显著差异(P＝0.006，如图5)。以上结果说明二者相比，肝癌癌旁间质区域表达CD93的巨噬细胞细胞密度可作为更准确、更有效预测肝癌患者预后情况的临床指征。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.测定肝癌患者癌旁组织中的标志物水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用，所述标志物为CD93蛋白与CD68蛋白。
2.测定肝癌患者癌旁组织中的巨噬细胞CD93水平的试剂在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用。
3.测定肝癌患者癌旁组织中的标志物水平的抗体在制备肝癌预后预测试剂盒中的应用，所述标志物为CD93蛋白与CD68蛋白。
4.测定肝癌患者癌旁组织中的标志物水平的抗体在制备肝癌切除术后预后的免疫组化检测试剂盒的应用，所述标志物为CD93蛋白与CD68蛋白。
5.根据权利要求1-4任一所述应用，其特征在于，所述肝癌预后预测为肝癌切除术后患者生存期预测。
6.根据权利要求1-4任一所述应用，其特征在于，通过分析肝癌癌旁间质区域中CD93和CD68双阳性细胞的密度，以CD68单阳性密度405.7cells/mm2，CD93和CD68双阳性细胞密度22.1cells/mm2为阈值，若高于阈值则预测患者预后生存期差，若低于阈值则预测患者预后生存期好。
7.一种用于肝癌切除术后预后预测的免疫组化染色检测试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，其特征在于，所述第一抗体为CD93与CD68的抗体的组合。
8.根据权利要求7所述免疫组化染色检测试剂盒，其特征在于，所述第二抗体是辣根过氧化物酶标记的第二抗体。
9.根据权利要求7所述免疫组化染色检测试剂盒，其特征在于，还包含AEC显色试剂。
10.根据权利要求7～9任一所述免疫组化染色检测试剂盒，其特征在于，还包含免疫组化检测所需试剂。
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| CN116042791A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-05-02 | 安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院) | 一种用于预测肝癌患者免疫治疗疗效的三联标志物及用途 |
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