CN116819066A - 肝癌微环境检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝癌微环境检测试剂盒，其包括如下成分：用于制备肝癌组织冰冻切片所需的表面活性剂、封闭剂、固定剂、包埋剂；CD68第一抗体，偶联有荧光染料一的荧光抗体一；PPT1第一抗体；偶联有荧光染料二的荧光抗体二，其中，荧光染料一和荧光染料二是不同颜色的荧光染料，荧光抗体一中的抗体与荧光抗体二中的抗体不相同。该试剂盒能够检测肝肿瘤组织内的PPT1表达水平和巨噬细胞浸润水平，反映肝细胞癌微环境免疫特征和术后总体生存风险，在临床实践中有助于指导肝癌患者免疫治疗决策制定，实施肝癌精准治疗。

Description

肝癌微环境检测试剂盒

技术领域

本发明属于临床医学诊断工具领域，涉及一种肝癌微环境检测试剂盒，具体涉及一种检测肿瘤内CD68、PPT1表达水平和巨噬细胞浸润水平的免疫荧光试剂盒。

背景技术

肝癌在各种癌症中发病率排名第六，死亡率排名第三。肝细胞癌是最常见的原发性肝癌组织学类型，占总病例的约80-90％。尽管少数患者符合根治性手术的条件，但大多数术后发生复发和转移的患者需要进一步治疗。多激酶抑制剂作为晚期肝细胞癌的一线治疗方案，仅能略微延长患者的总生存期。免疫检查点阻断剂(PD-1)等免疫疗法的出现已经改变了肝癌的治疗模式，但其客观缓解率仍不足20％。此外，BCLC分期和TNM分期等预后评估系统已经不能满足新的治疗策略提出的对患者精准分层的需求。因此，有必要确定可以预测肝细胞癌预后风险和治疗效果的有效手段。

深入了解肝细胞癌肿瘤免疫微环境的复杂细胞和分子网络有助于开发新的基于免疫反应的抗肿瘤治疗策略。免疫效应细胞和免疫抑制细胞之间的功能平衡，以及肿瘤细胞的免疫逃避能力决定了免疫治疗的反应率。在肝细胞癌中，常驻的Kupffer细胞和从血液循环中迁移的巨噬细胞在肿瘤微环境中大量富集。它们可以发挥抗肿瘤作用，例如吞噬作用和抗原呈递，但也容易被肿瘤细胞诱导为肿瘤相关巨噬细胞。巨噬细胞的高度异质性和可塑性表型可对周围细胞产生显着影响，进而影响肝细胞癌中抗肿瘤免疫和免疫逃避之间的平衡。因此，为了逆转肝细胞癌免疫抑制微环境，提高免疫治疗效果和预测预后，需要更好地表征肝细胞癌微环境中肿瘤相关巨噬细胞的分子景观，并准确识别关键的巨噬细胞亚群。然而，可以作为稳定预后分类器或微环境特征揭示者的巨噬细胞标志物仍然是一个未满足的需求。

棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)是一种催化脱棕榈酰化过程的酶，已被报道在多种癌症中上调并与不良预后相关，包括肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌和食道癌。值得注意的是，PPT1已被确定为DQ661和DC661等抗疟疾药物的分子靶标，这些PPT1抑制剂可通过棕榈酰化蛋白的积累损害细胞溶酶体分解代谢，从而抑制肿瘤生长并使肿瘤细胞对靶向治疗和免疫治疗敏感。然而，之前的研究重点关注PPT1在肿瘤细胞中的生物学效应，其在肝细胞癌复杂免疫微环境中，尤其是巨噬细胞中的表达和主要作用仍有待进一步探索。

发明内容

本课题组在肝癌组织研究中，基于微环境的众多表征信息统计，包括蛋白PPT1、CD45、CD8、CD68、CD4、PD-1(CD279)等等的表达水平变化以及T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、DNT细胞等等的状态/含量变化，发现PPT1等蛋白并不能单独作为生物标志物用于反映肝癌微环境状况。但也意外地发现，蛋白PPT1与CD68的组合、以及进一步与巨噬细胞的组合信息能够准确地表征肝癌微环境状况，进而评估肝癌患者术后总体生存风险。以此研究成果为基础，本发明包含如下技术方案。

一种肝癌微环境检测试剂盒，其为免疫荧光试剂盒，其主要包括如下成分：

用于制备肝癌组织冰冻切片所需的表面活性剂、封闭剂、固定剂；

CD68第一抗体(亦称CD68一抗)；

偶联有荧光染料一的荧光抗体一，所述荧光抗体一能够与CD68第一抗体-CD68结合物相结合，相当于、或者简称CD68二抗；

PPT1第一抗体(亦称PPT1一抗)，

偶联有荧光染料二的荧光抗体二，所述荧光抗体二能够与PPT1第一抗体-PPT1结合物相结合，相当于、或者简称PPT1二抗，

其中荧光染料一和荧光染料二是不同颜色的荧光染料，即荧光波长不同；所述荧光抗体一中的抗体与所述荧光抗体二中的抗体不相同。

例如，上述荧光抗体一中的抗体与所述荧光抗体二中的抗体都是IgG。例如，IgG抗体选自山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG等。

优选地，所述荧光抗体一是Alexa Fluor 488(Cat.ab150113,Abcam)即山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa 488)(ab150113)；所述荧光抗体二是CY3(Cat.ab6939,Abcam)即山羊抗兔IgG H&L预吸附二抗(ab6939)。

狭义上理解，上述肝癌微环境是指肝组织内的CD68、PPT1表达水平和巨噬细胞浸润水平。我们的临床研究显示，PPT1表达水平和巨噬细胞浸润水平能够较为准确地反映肝细胞癌微环境免疫特征，用于预测术后总体生存不良风险。

本领域技术人员容易理解，肝癌组织样本中的CD68和PPT1表达水平是指CD68和PPT1的蛋白含量或浓度。

本发明中，CD68和PPT1双阳性细胞可表示为“PPT1+巨噬细胞”，其中符号“+”代表阳性、表达，这是本领域技术人员容易理解的。类似地，CD8+T细胞代表有CD8表达的阳性T细胞，以此类推。

巨噬细胞浸润水平一般是随机5个视野中CD68+细胞的数量占CD45+免疫细胞的比例，超过50％为高浸润。

进一步，上述肝癌微环境检测试剂盒还包括如下成分：

包埋剂，选自OCT包埋剂或石蜡，其用于浸没肝癌组织样本；

EDTA抗原修复缓冲液，其用于福尔马林固定、石蜡包埋组织切片免疫组织化学染色前的抗原修复，增加免疫组织化学实验的显示效果；

含细胞核染料(亦称DNA染料)的抗荧光淬灭封片剂，用于对使用抗体孵育后的切片进行封片。

在一种实施方式中，上述细胞核染料可以是DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)；上述表面活性剂可以是0.5％ Triton-X100缓冲液；上述封闭剂可以是BSA封闭液，例如是5％BSA封闭缓冲液；上述固定剂是福尔马林，例如是4％多聚甲醛。

上述的肝癌微环境检测试剂盒可以通过下述步骤实施肝癌微环境检测：

i.制备肝癌组织冰冻切片；

ii.将所述冰冻切片用表面活性剂通透和用封闭剂封闭后，与CD68第一抗体(CD68一抗)和PPT1第一抗体(PPT1一抗)孵育过夜，再用相应的荧光抗体一和荧光抗体二孵育并进行封片；

iii.根据CD68和PPT1荧光共定位的结果，确定肝癌组织中PPT1+巨噬细胞浸润水平，并根据浸润水平将患者划分为高PPT1+巨噬细胞浸润组和低PPT1+巨噬细胞浸润组。

在一种实施方式中，步骤i中所述的冰冻切片的制备过程可以为：将新鲜组织用包埋剂比如OCT包埋后置于液氮中冷冻，随后置入恒冷箱切片机中冰冻切片，并用固定剂比如4％多聚甲醛固定。

步骤iii中，细胞浸润情况可以通过流式细胞术结合TSNE降维图确定。

步骤iii中，所述PPT1+巨噬细胞浸润水平的评估方法可以为：将巨噬细胞标志物CD68携带的绿色荧光与PPT1携带的红色荧光重合(merge)的细胞认定为CD68和PPT1双阳性细胞，即PPT1+巨噬细胞，随机选取组织切片中5个视野进行细胞计数，获得PPT1+巨噬细胞的浸润数量。

优选地，上述PPT1+巨噬细胞浸润水平高低的判定公式(数学模型)为：F＝5个视野中CD68+PPT1+巨噬细胞数量之和÷5个视野中CD68+细胞数之和，其中F为浸润水平，F＜0.5视为低PPT1+巨噬细胞浸润，F≥0.5视为高PPT1+巨噬细胞浸润。

在一种实施方式中，当肝癌组织具有高PPT1+巨噬细胞浸润时，肿瘤组织具有较多的耗竭型PD-1+CD8+T细胞浸润，并提示术后总体生存不良，预后不良。即，高PPT1+巨噬细胞浸润与耗竭型CD8+T细胞高浸润呈正相关。

显然，上述肝癌微环境检测试剂盒的检测结果可用于评估肝癌患者术后总体生存不良风险(预后风险)，肿瘤组织高PPT1+巨噬细胞浸润的肝癌患者总体生存时间显著短于低PPT1+巨噬细胞浸润患者。

在一种优选的实施方式中，上述肝癌微环境检测试剂盒还包括使用说明书，所述说明书记载有实施肝癌微环境检测的步骤和判定公式(数学模型)。

例如，上述说明书可以写在瓶子、试管和类似物、板子上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频APP下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如CD、U盘、网盘等。

本发明首次发现CD68和PPT1的表达水平及巨噬细胞浸润水平能够较为准确地反映肝癌组织微环境免疫特征和肝癌患者术后总体生存不良风险高低，CD68+PPT1+巨噬细胞是肝癌预后的有效生物标志物。以此为基础提供了一种用于检测肝癌微环境的免疫荧光试剂盒，实现肝癌微环境检测标准化，简化肝癌检测流程，对推动肝癌精准治疗和改善患者预后具有重要临床价值。

附图说明

图1显示了实施例肝癌组织中CD68与PPT1的代表性免疫荧光共定位图像。其中，图像merge显示了CD68携带的绿色荧光与PPT1携带的红色荧光重合的细胞。

图2显示了实施例中根据肿瘤组织中PPT1+巨噬细胞浸润水平进行肿瘤微环境免疫细胞浸润的分析清凉。其中，A图是TSNE降维图像和多种细胞在CD45+细胞中的比例统计曲线，该比例反映了高PPT1+巨噬细胞浸润组和低PPT1+巨噬细胞浸润组中各种免疫细胞类型的浸润比例，图中CD8+T细胞在高PPT1+巨噬细胞浸润组中富集外，其他免疫细胞包括B细胞、巨噬细胞、NK细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和DNT细胞在高低PPT1+巨噬细胞浸润组间的浸润比例没有统计学差异；B图是高PPT1+巨噬细胞浸润组和低PPT1+巨噬细胞浸润组在CD8+T细胞上的PD-1表达水平比较曲线。

图3显示了实施例中高PPT1+巨噬细胞浸润组和低PPT1+巨噬细胞浸润组总体生存时间的预后分析曲线。

具体实施方式

本发明的免疫荧光试剂盒通过对肝癌组织样本的切片的CD68和PPT1共同表达水平进行检测，结合流式细胞术分析技术，测定肿瘤内CD68+PPT1+巨噬细胞浸润水平，获得的肿瘤微环境内的免疫细胞浸润情况和功能特征能够预测肝癌患者术后总体生存不良风险，在临床实践中有助于指导肝癌患者免疫治疗决策制定，推动肝癌精准治疗。

近些年来，临床上针对肿瘤的免疫治疗已经取得了突破性进展，而肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)的复杂组成也制约了对于肿瘤的精准诊疗。TME是由肿瘤细胞、免疫细胞、血管及内皮细胞、纤维细胞及多种基质共同构成，并且其持续处于动态变化过程中，因此对于肿瘤治疗带来严峻挑战。对于复杂肿瘤微环境(及其他生物学微环境)的准确描绘，无法通过传统的IHC(免疫组化检测)实现，有赖于多色、甚至超多色的成像解决方案。

针对这一挑战，人们已经推出了多套解决方案，例如Akoya Biosciences推出了快速的9色成像、40色深度成像分析等，为肿瘤学及其他生物学分析研究提供可靠的技术支持，三位一体全面解析组织免疫微环境从而为肿瘤学及生物研究提供精准方案。

本发明的肝癌微环境检测试剂盒通过多色免疫荧光法检测肝癌组织样本，借助于冰冻切片的成像分析和流式细胞术，确定肿瘤微环境。

本文中，术语“肝癌微环境检测试剂盒”也是指“免疫荧光试剂盒”，可简称“试剂盒”，它们表示相同的意义，可以互换使用。

该试剂盒针对每一种待检测抗原都包含两种不同的抗体，其中一种是用于捕获抗原的捕获抗体、也称“第一抗体”简称“一抗”，另一种是用于检测被捕获抗原的检测抗体、也称“结合抗体”或“第二抗体”简称“二抗”。这两种抗体先后与抗原蛋白的不同抗原表位(抗原决定簇)相结合，先形成第一抗体-抗原结合物，然后该第一抗体-抗原结合物再与第二抗体相结合，产生第一抗体-抗原-第二抗体的“夹心”结构来实施“双抗体夹心法”检测抗原蛋白。可以使用IgG抗体作为二抗，在本发明的实施方案中，具体使用偶联有荧光染料的IgG抗体作为二抗。

针对不同的抗原蛋白PPT1、CD45、CD8、CD68、CD4、PD-1(CD279)中两种以上的检测，可以使用不同颜色的荧光染料进行免疫法检测，即它们的第二抗体上偶联不同的荧光染料，从而实现两种以上颜色荧光的多色深度成像分析。

CD68第一抗体可以是任何能够结合CD68蛋白的抗体或抗体片段，并且可以是重组体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源性抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体，优选使用商品化的市售抗体，其例子比如包括Cat.ab283654,Abcam；Cat.29176(Cell Signaling Technology)。

PPT1第一抗体可以是任何能够结合PPT1蛋白的抗体或抗体片段，并且可以是重组体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源性抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体，优选使用商品化的市售PPT1抗体，其例子比如包括Cat.ab89022,Abcam。

荧光抗体一和荧光抗体二中的IgG抗体上分别偶联的荧光染料一和荧光染料二不相同，各自选自下组：包括但不限于荧光素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、Cy3TM、Cy5TM、别藻蓝素、德克萨斯红、香槟叶绿素(peridenin chlorophyll)、花菁、串联偶联物，例如藻红蛋白-Cy5TM、绿色荧光蛋白、罗丹明、异硫氰酸荧光素(FITC)和OregonGreenTM、罗丹明及其衍生物(如德克萨斯红和四罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))、生物素、藻红蛋白、AMCA、CyDyesTM、6-羧甲基荧光素(已知通常缩写为FAM和F)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N’,N’-四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-所及-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)，和罗丹明110；花菁染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如，Hoechst33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，如Cy3、Cy5等花菁染料；BODIPY染料和喹啉染料。

该试剂盒中还包含用于制作肝癌组织样本切片的必要试剂，例如表面活性剂、封闭剂、固定剂、包埋剂、EDTA抗原修复缓冲液、含细胞核染料(亦称DNA染料)的抗荧光淬灭封片剂等，这些试剂都可以采用市售商品。

包埋剂用于浸没组织样本，一般选自OCT包埋剂或石蜡。OCT包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。利用OCT预先浸润组织，然后再进行恒冷箱切片，使切片质量得到改善。

福尔马林是常用的固定剂，其通过对组织标本切片的固定，方便进行后续的染色、免疫组化等操作，例如福尔马林可以是4％多聚甲醛。

表面活性剂是细胞通透剂，可以为0.5％ Triton-X100缓冲液。

封闭剂用于免疫荧光时切片或细胞样品的封闭。封闭后，可以减小后续的一抗或二抗和样品的非特异性结合，降低背景，增强信噪比。可以采用生物学领域常用的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)溶液作为封闭剂。

EDTA抗原修复缓冲液，其用于福尔马林固定、包埋组织切片免疫组织化学染色前的抗原修复，增加免疫组织化学实验的显示效果；

含细胞核染料的抗荧光淬灭封片剂可用于对使用抗体孵育后的切片进行封片。有效的封片对免疫荧光成像观察至关重要。荧光基团对荧光成像中的激发光和保存期间的光漂白和光淬灭等十分敏感，使用封片剂可以对样品实现更长时间的保存。

实施例中，细胞浸润情况可以用TSNE降维图来描述，该TSNE降维图可用FlowJo软件生成。该软件可以安装于全自动免疫荧光显微图像分析仪、流式细胞仪等。

上述试剂盒通过在肿瘤组织中进行免疫荧光检测，能够反映肿瘤微环境的免疫特征，确定可有效判断肝癌患者预后不良风险的标志物或标志事件，并对患者的预后风险进行有效评估，为肝癌免疫治疗决策制定提供指导，延长肝癌患者生存时间。

以下结合具体实施例及附图，对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中，如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(10-40℃)。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指重量百分含量。

实施例

1.研究对象纳入

研究对象为复旦大学附属中山医院提供的169例肝细胞癌患者肿瘤组织，纳入及排除标准为：

(1)接受根治性切除术且病理明确诊断为肝细胞癌；

(2)术前未曾接受过其他癌症相关治疗；

(3)无其他恶性肿瘤病史；

(4)具有完善的临床病理资料和随访信息。

2.研究方法：

(1)收集169例肝细胞癌患者的手术切除肿瘤组织标本并进行冰冻切片，同时收集新鲜组织，采用流式细胞仪(FACSCalibur III,BD公司)进行流式检测。患者术后随访内容包括血常规、肝功能检查、血清肿瘤标志物检测、腹部超声和胸片等。术后总体生存时间定义为从手术日期到死亡或最后一次随访的时间间隔。

(2)肿瘤组织免疫荧光染色

将切片浸入EDTA修复缓冲液加热至沸腾，室温自然冷却后，滴加0.5％ Triton-X100封闭液室温30min，随后用1％BSA室温封闭2h。按照供应商的产品说明书，分别滴加适当稀释的CD68第一抗体Cat.ab283654,Abcam和PPT1第一抗体Cat.ab89022,Abcam，4℃过夜后，用PBS洗涤3次，加入对应的荧光抗体一Alexa Fluor 488(Cat.ab150113,Abcam)和荧光抗体二CY3(Cat.ab6939,Abcam)，室温孵育2h，最后加入含DAPI的抗荧光淬灭封片剂进行封片。

采用全自动免疫荧光显微图像分析仪(BX53,Oympus公司)对封片进行分析，结果如图1所示。图中绿色荧光显示CD68的表达，红色荧光显示PPT1的表达，Merge显示的是共表达CD68和PPT1的巨噬细胞，简称为CD68+PPT1+巨噬细胞或者PPT1+巨噬细胞。

(3)肿瘤PPT1+巨噬细胞浸润水平与肝细胞癌微环境免疫特征及患者预后的关系分析

根据图1中免疫荧光显微图像进行PPT1+巨噬细胞浸润高低分组，在组织切片中随机选择5个视野进行PPT1+CD68+细胞计数，将新鲜组织获得的流式数据可视化为TSNE二维图像，经统计，PPT1+巨噬细胞浸润水平高低的判定公式为：F＝5个视野中CD68+PPT1+巨噬细胞数量之和÷5个视野中CD68+细胞数之和，其中F为浸润水平，F＜0.5视为低PPT1+巨噬细胞浸润，F≥0.5视为高PPT1+巨噬细胞浸润，比较两组患者肿瘤中免疫细胞浸润比例的差异，结果如图2中A所示。

图中还显示，除了CD8+T细胞在高PPT1+巨噬细胞浸润组中富集外，其他免疫细胞包括B细胞、巨噬细胞、NK细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和DNT细胞等在高低PPT1+巨噬细胞浸润组间的浸润比例没有统计学差异。

(4)绘制术后总体生存时间曲线并进行Kaplan–Meier生存分析，结果如图3所示。

3.实验结果：

肝癌组织的免疫荧光结果显示，PPT1在肝癌组织中主要在CD68+巨噬细胞中表达，即肝癌组织中PPT1和CD68在巨噬细胞中表达(如图1所示)。该细胞称为CD68+PPT1+巨噬细胞或者PPT1+巨噬细胞。

流式结果表明，高PPT1+巨噬细胞浸润组相比于低PPT1+巨噬细胞浸润组肿瘤具有更多的CD8+T细胞浸润(如图2中A所示)，但CD8+T细胞的功能耗竭标志物PD-1分子表达水平显著增高(如图2B所示)，提示高PPT1+巨噬细胞浸润的肝癌组织中具有更多耗竭型CD8+T细胞，对免疫治疗可能更加敏感。

Kaplan-Meier生存分析表明，高PPT1+巨噬细胞浸润组的肝癌患者具有较短的术后总体生存时间(如图3所示)，提示PPT1+巨噬细胞是肝癌预后的有效生物标志。

总之，在肝癌组织中PPT1主要表达于巨噬细胞且与耗竭型CD8+T细胞高浸润呈正相关。PPT1+巨噬细胞作为有效的预后预测指标，有助于评估肝细胞癌的免疫特征和预后风险，在临床实践中可用于指导肝癌患者免疫治疗管理并预测肝细胞癌患者术后生存时间。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，包括如下成分：

用于制备肝癌组织冰冻切片所需的表面活性剂、封闭剂、固定剂；

CD68第一抗体；

偶联有荧光染料一的荧光抗体一，所述荧光抗体一能够与CD68第一抗体-CD68结合物相结合；

PPT1第一抗体；

偶联有荧光染料二的荧光抗体二，所述荧光抗体二能够与PPT1第一抗体-PPT1结合物相结合，

其中，荧光染料一和荧光染料二是不同颜色的荧光染料，所述荧光抗体一中的抗体与所述荧光抗体二中的抗体不相同。

2.根据权利要求1所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，所述荧光抗体一中的抗体与所述荧光抗体二中的抗体都是IgG。

3.根据权利要求1或2所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，还包括如下成分：

包埋剂，选自OCT包埋剂或石蜡；

EDTA抗原修复缓冲液；

含细胞核染料的抗荧光淬灭封片剂。

4.根据权利要求1或2所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，所述荧光抗体一是Alexa Fluor 488(Cat.ab150113,Abcam)；所述荧光抗体二是CY3(Cat.ab6939,Abcam)；所述细胞核染料是DAPI；所述表面活性剂是0.5％Triton-X100缓冲液；所述封闭剂是BSA封闭液；所述固定剂是福尔马林。

5.根据权利要求1或2所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，通过下述步骤实施肝癌微环境检测：

i.制备肝癌组织冰冻切片；

ii.将所述冰冻切片用表面活性剂通透和用封闭剂封闭后，与CD68第一抗体和PPT1第一抗体孵育过夜，再用荧光抗体一和荧光抗体二孵育并进行封片；

iii.根据CD68和PPT1荧光共定位的结果，确定肝癌组织中CD68和PPT1双阳性细胞为PPT1+巨噬细胞，并根据其浸润水平将患者划分为高PPT1+巨噬细胞浸润组和低PPT1+巨噬细胞浸润组。

6.根据权利要求5所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，步骤i中，所述冰冻切片的制备过程为：将新鲜组织用包埋剂包埋后置于液氮中冷冻，随后置入恒冷箱切片机中冰冻切片，并用固定剂固定。

7.根据权利要求5所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，步骤iii中，细胞浸润情况通过流式细胞术结合TSNE降维图确定。

8.根据权利要求5所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，步骤iii中，所述PPT1+巨噬细胞浸润水平的评估方法为：将巨噬细胞标志物CD68携带的绿色荧光与PPT1携带的红色荧光重合的细胞认定为PPT1+巨噬细胞，随机选取组织切片中5个视野进行细胞计数，获得PPT1+巨噬细胞的浸润数量。

9.根据权利要求8所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，PPT1+巨噬细胞浸润水平的判定公式为：F＝5个视野中CD68+PPT1+巨噬细胞数量之和÷5个视野中CD68+细胞数之和，其中F为浸润水平，F＜0.5视为低PPT1+巨噬细胞浸润，F≥0.5视为高PPT1+巨噬细胞浸润。

10.根据权利要求9所述的肝癌微环境检测试剂盒，其特征在于，当肝癌组织具有高PPT1+巨噬细胞浸润时，肿瘤组织具有耗竭型PD-1+CD8+T细胞高浸润，并提示术后总体生存不良。