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CN118909852A - 芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法 - Google Patents

芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法 Download PDF

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CN118909852A
CN118909852A CN202411032314.XA CN202411032314A CN118909852A CN 118909852 A CN118909852 A CN 118909852A CN 202411032314 A CN202411032314 A CN 202411032314A CN 118909852 A CN118909852 A CN 118909852A
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王小兵
王长城
栗浩哲
吕顶明
陈慧颖
张瑞霞
张德瑞
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Inner Mongolia People's Hospital (inner Mongolia Cancer Hospital)
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Abstract

本发明涉及中药复方制剂及其应用技术领域，公开了芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，包括以下步骤：S1、配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英；S2、按照一定重量比例范围配制芪连芩英汤：S3、将各中药饮片切细磨碎，用8‑12倍药材体积的水浸泡1‑2h，进行三次煎煮，分别煎煮25‑35mi n、25‑35mi n和15‑25mi n，滤出药液合并，常压蒸发浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1；S4、测定芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的最低抑菌浓度，采用琼脂稀释法进行测定，最低抑菌浓度为25‑35g/L。通过制备芪连芩英汤，在其中药药理作用下，经过多靶点、多途径协同作用，有效阻止幽门螺旋杆菌的生长和繁殖，减少耐药性产生。

Description

芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法
技术领域
本发明涉及中药复方制剂及其应用技术领域，具体为芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，简称Hp)是一种革兰氏阴性细菌，广泛存在于人类的胃黏膜中，是导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等多种胃肠道疾病的重要病原菌。幽门螺旋杆菌感染的传播途径主要包括口-口传播、粪-口传播等，具有较强的传染性。目前，全球范围内约有一半以上的人口感染幽门螺旋杆菌，尤其在发展中国家，其感染率更高，已成为全球公共卫生的重大问题。
现有的治疗幽门螺旋杆菌感染的主要方法是采用抗生素联合质子泵抑制剂的三联或四联疗法。这些治疗方案虽然在短期内对幽门螺旋杆菌有较好的清除效果，但长期使用会导致一系列问题。首先，抗生素的广泛使用导致了幽门螺旋杆菌的耐药性逐渐增加，使得治疗效果逐年下降。其次，抗生素及质子泵抑制剂的副作用较大，患者在治疗过程中常常出现恶心、呕吐、腹泻等不良反应，严重影响了患者的生活质量。此外，部分患者在完成标准治疗后仍存在复发的风险，需要进行多次治疗，增加了治疗的复杂性和成本。
鉴于现有治疗方法的局限性，研究者们开始探索新的治疗途径，以期能够找到一种既有效又安全的治疗方法，为此本发明提出了芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，解决了现有治疗方案中存在的耐药性增加、药物副作用大以及不适合特殊人群使用的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，包括以下步骤：
S1、配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英；
S2、按照一定重量比例范围配制芪连芩英汤：
S3、将各中药饮片切细磨碎，用8-12倍药材体积的水浸泡1-2h，进行三次煎煮，分别煎煮25-35min、25-35min和15-25min，滤出药液合并，常压蒸发浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1；
S4、测定芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的最低抑菌浓度，采用琼脂稀释法进行测定，最低抑菌浓度为25-35g/L；
S5、将幽门螺旋杆菌稀释至0.4-0.6麦氏比浊单位后按1:5至1:15比例再稀释，制备三种药物浓度培养基，接种培养，35-39℃下分别在0、5-7、23-25小时取样稀释并接种，35-39℃培养22-26小时后计数菌落。
优选的，所述S2步骤中配制芪连芩英汤按以下重量比例配制：黄芪10-20g、黄连10-20g、黄芩10-20g、半夏5-15g、厚朴5-15g、蒲公英10-30g。
优选的，所述S3步骤具体包括以下步骤：
S3.1、浸泡：将各中药饮片切细磨碎，用8-12倍药材体积的水浸泡1-2h；
S3.2、第一次煎煮：将浸泡后的药材煎煮25-35min，滤出药液；
S3.3、第二次煎煮：加水浸没药材3-4cm，煎煮25-35min，滤出药液；
S3.4、第三次煎煮：再加水浸没药材1-1.5cm，煎煮15-25min，滤出药液；
S3.5、合并与浓缩：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
优选的，所述S4步骤具体包括以下步骤：
S4.1、制备药物琼脂培养基；
S4.2、接种菌液：
将受试菌稀释成浓度为106-108CFU/ml的菌悬液；
用微量移液器吸取0.5-1.5μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含103-105个菌；
S4.3、培养与观察：
将平板倒置于35℃培养箱内培养16-20h；
观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度。
优选的，所述S4.1步骤中制备药物琼脂培养基具体包括以下步骤：
S4.11、准备培养基：
准备若干三角烧瓶，每个烧瓶加入20-30ml融化的肉汤琼脂培养基；
S4.12、稀释药液：
在第一个烧瓶中加入20-30ml100％中药水煎液，使其浓度为0.4-0.6g/ml；
混匀后取出20-30ml，加入第二个烧瓶，依次进行倍比稀释，直至达到所需浓度范围25-35g/L。
优选的，所述S5步骤具体包括以下步骤：
S5.1、制备菌悬液：
取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.4-0.6麦氏比浊单位，含菌量为1.0-2.0×108CFU/ml；
再按1:5至1:15的比例稀释，使其含菌量为1.0-2.0×107CFU/ml备用；
S5.2、制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.3、菌悬液接种与培养：
在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
置于35-39℃培养箱中培养；
S5.4、取样与稀释：
分别在0小时、5-7小时、23-25小时取样；
对取样进行1:5至1:15的比例稀释；
S5.5、稀释后的菌液接种与培养：
将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
涂匀，35-39℃培养22-26h；
S5.6、菌落计数：
培养22-26小时后进行菌落计数。
优选的，所述S5.2步骤中三种不同含药浓度的培养基为制备含药浓度为0.4×MIC-0.6×MIC、0.8×MIC-1.2×MIC和1.8×MIC-2.2×MIC的肉汤培养基。
本发明提供了芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法。具备以下有益效果：
1、本发明芪连芩英汤由黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英组成，各药材具有不同的药理作用，通过多靶点、多途径协同作用，有效阻止幽门螺旋杆菌的生长和繁殖，减少耐药性产生。
2、本发明芪连芩英汤属于中药复方，适用于不同年龄段和体质的患者，尤其适合老年人、孕妇及哺乳期妇女等不适合抗生素治疗的特殊群体，具备较低的副作用风险，并且在长时间使用中未见显著耐药性，有效解决了传统的三联或四联抗生素治疗方案常伴有副作用和耐药性问题。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明各组胃黏膜的代表性免疫组化图片；
图3为本发明各组胃黏膜NF-kB的表达图；
图4为本发明芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的杀菌曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
请参阅附图1，本发明实施例提供芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，包括以下步骤：
S1、配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英；
S2、按照一定重量比例范围配制芪连芩英汤：
S3、将各中药饮片切细磨碎，用8-12倍药材体积的水浸泡1-2h，进行三次煎煮，分别煎煮25-35min、25-35min和15-25min，滤出药液合并，常压蒸发浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1；
S4、测定芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的最低抑菌浓度，采用琼脂稀释法进行测定，最低抑菌浓度为25-35g/L；
S5、将幽门螺旋杆菌稀释至0.4-0.6麦氏比浊单位后按1:5至1:15比例再稀释，制备三种药物浓度培养基，接种培养，35-39℃下分别在0、5-7、23-25小时取样稀释并接种，35-39℃培养22-26小时后计数菌落。
S2步骤中配制芪连芩英汤按以下重量比例配制：黄芪10-20g、黄连10-20g、黄芩10-20g、半夏5-15g、厚朴5-15g、蒲公英10-30g。
S3步骤具体包括以下步骤：
S3.1、浸泡：将各中药饮片切细磨碎，用8-12倍药材体积的水浸泡1-2h；
S3.2、第一次煎煮：将浸泡后的药材煎煮25-35min，滤出药液；
S3.3、第二次煎煮：加水浸没药材3-4cm，煎煮25-35min，滤出药液；
S3.4、第三次煎煮：再加水浸没药材1-1.5cm，煎煮15-25min，滤出药液；
S3.5、合并与浓缩：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
S4步骤具体包括以下步骤：
S4.1、制备药物琼脂培养基；
S4.2、接种菌液：
将受试菌稀释成浓度为106-108CFU/ml的菌悬液；
用微量移液器吸取0.5-1.5μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含103-105个菌；
S4.3、培养与观察：
将平板倒置于35℃培养箱内培养16-20h；
观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度。
S4.1步骤中制备药物琼脂培养基具体包括以下步骤：
S4.11、准备培养基：
准备若干三角烧瓶，每个烧瓶加入20-30ml融化的肉汤琼脂培养基；
S4.12、稀释药液：
在第一个烧瓶中加入20-30ml100％中药水煎液，使其浓度为0.4-0.6g/ml；
混匀后取出20-30ml，加入第二个烧瓶，依次进行倍比稀释，直至达到所需浓度范围25-35g/L。
S5步骤具体包括以下步骤：
S5.1、制备菌悬液：
取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.4-0.6麦氏比浊单位，含菌量为1.0-2.0×108CFU/ml；
再按1:5至1:15的比例稀释，使其含菌量为1.0-2.0×107CFU/ml备用；
S5.2、制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.3、菌悬液接种与培养：
在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
置于35-39℃培养箱中培养；
S5.4、取样与稀释：
分别在0小时、5-7小时、23-25小时取样；
对取样进行1:5至1:15的比例稀释；
S5.5、稀释后的菌液接种与培养：
将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
涂匀，35-39℃培养22-26h；
S5.6、菌落计数：
培养22-26小时后进行菌落计数。
S5.2步骤中三种不同含药浓度的培养基为制备含药浓度为0.4×MIC-0.6×MIC、0.8×MIC-1.2×MIC和1.8×MIC-2.2×MIC的肉汤培养基。
实施例1
步骤：
S1：配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英。
S2：按以下重量比例配制芪连芩英汤：黄芪10g、黄连10g、黄芩10g、半夏5g、厚朴5g、蒲公英10g。
S3：
S3.1：将各中药饮片切细磨碎，用8倍药材体积的水浸泡1h；
S3.2：将浸泡后的药材煎煮25min，滤出药液；
S3.3：加水浸没药材3cm，煎煮25min，滤出药液；
S3.4：再加水浸没药材1cm，煎煮15min，滤出药液；
S3.5：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
S4：
S4.1：制备药物琼脂培养基；
S4.2：将受试菌稀释成浓度为1.0×108CFU/ml的菌悬液；
S4.3：用微量移液器吸取1.0μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含10^4个菌；
S4.4：将平板倒置于35℃培养箱内培养16h；
S4.5：观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度，范围为25g/L。
S5：
S5.1：取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.4麦氏比浊单位，含菌量为1.0×108CFU/ml；
S5.2：再按1:5的比例稀释，使其含菌量为1.0×107CFU/ml备用；
S5.3：制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.4：在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
S5.5：置于35℃培养箱中培养；
S5.6：分别在0小时、5小时、23小时取样；
S5.7：对取样进行1:5的比例稀释；
S5.8：将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
S5.9：涂匀，35℃培养22小时；
S5.10：培养22小时后进行菌落计数。
总结：本实施例通过具体参数设定验证了芪连芩英汤在最低浓度25g/L时对幽门螺旋杆菌的有效抑制效果。
实施例2
步骤：
S1：配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英。
S2：按以下重量比例配制芪连芩英汤：黄芪15g、黄连15g、黄芩15g、半夏10g、厚朴10g、蒲公英15g。
S3：
S3.1：将各中药饮片切细磨碎，用10倍药材体积的水浸泡1.5h；
S3.2：将浸泡后的药材煎煮30min，滤出药液；
S3.3：加水浸没药材3.5cm，煎煮30min，滤出药液；
S3.4：再加水浸没药材1.2cm，煎煮20min，滤出药液；
S3.5：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
S4：
S4.1：制备药物琼脂培养基；
S4.2：将受试菌稀释成浓度为1.5×108CFU/ml的菌悬液；
S4.3：用微量移液器吸取1.0μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含104个菌；
S4.4：将平板倒置于37℃培养箱内培养18h；
S4.5：观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度，范围为30g/L。
S5：
S5.1：取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.5麦氏比浊单位，含菌量为1.5×108CFU/ml；
S5.2：再按1:10的比例稀释，使其含菌量为1.5×107CFU/ml备用；
S5.3：制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.4：在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
S5.5：置于37℃培养箱中培养；
S5.6：分别在0小时、6小时、24小时取样；
S5.7：对取样进行1:10的比例稀释；
S5.8：将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
S5.9：涂匀，37℃培养24小时；
S5.10：培养24小时后进行菌落计数。
总结：本实施例通过设定中等浓度范围的参数验证了芪连芩英汤在浓度30g/L时对幽门螺旋杆菌的有效抑制效果。
实施例3
步骤：
S1：配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英。
S2：按以下重量比例配制芪连芩英汤：黄芪20g、黄连20g、黄芩20g、半夏15g、厚朴15g、蒲公英30g。
S3：
S3.1：将各中药饮片切细磨碎，用12倍药材体积的水浸泡2h；
S3.2：将浸泡后的药材煎煮35min，滤出药液；
S3.3：加水浸没药材4cm，煎煮35min，滤出药液；
S3.4：再加水浸没药材1.5cm，煎煮25min，滤出药液；
S3.5：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
S4：
S4.1：制备药物琼脂培养基；
S4.2：将受试菌稀释成浓度为2.0×108CFU/ml的菌悬液；
S4.3：用微量移液器吸取1.5μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含105个菌；
S4.4：将平板倒置于39℃培养箱内培养20h；
S4.5：观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度，范围为35g/L。
S5：
S5.1：取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.6麦氏比浊单位，含菌量为2.0×108CFU/ml；
S5.2：再按1:15的比例稀释，使其含菌量为2.0×107CFU/ml备用；
S5.3：制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.4：在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
S5.5：置于39℃培养箱中培养；
S5.6：分别在0小时、7小时、25小时取样；
S5.7：对取样进行1:15的比例稀释；
S5.8：将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
S5.9：涂匀，39℃培养26小时；
S5.10：培养26小时后进行菌落计数。
总结：本实施例通过设定最高浓度范围的参数验证了芪连芩英汤在浓度35g/L时对幽门螺旋杆菌的有效抑制效果。
实施例4
步骤：
S1：配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英。
S2：按以下重量比例配制芪连芩英汤：黄芪12g、黄连12g、黄芩12g、半夏8g、厚朴8g、蒲公英12g。
S3：
S3.1：将各中药饮片切细磨碎，用9倍药材体积的水浸泡1.2h；
S3.2：将浸泡后的药材煎煮28min，滤出药液；
S3.3：加水浸没药材3.2cm，煎煮28min，滤出药液；
S3.4：再加水浸没药材1.3cm，煎煮18min，滤出药液；
S3.5：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
S4：
S4.1：制备药物琼脂培养基；
S4.2：将受试菌稀释成浓度为1.2×108CFU/ml的菌悬液；
S4.3：用微量移液器吸取0.8μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含104个菌；
S4.4：将平板倒置于36℃培养箱内培养17h；
S4.5：观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度，范围为27g/L。
S5：
S5.1：取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.45麦氏比浊单位，含菌量为1.2×108CFU/ml；
S5.2：再按1:7的比例稀释，使其含菌量为1.2×107CFU/ml备用；
S5.3：制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.4：在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
S5.5：置于36℃培养箱中培养；
S5.6：分别在0小时、6小时、24小时取样；
S5.7：对取样进行1:7的比例稀释；
S5.8：将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
S5.9：涂匀，36℃培养24小时；
S5.10：培养24小时后进行菌落计数。
总结：本实施例通过设定较低浓度范围的参数验证了芪连芩英汤在浓度27g/L时对幽门螺旋杆菌的有效抑制效果。
实施例5
步骤：
S1：配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英。
S2：按以下重量比例配制芪连芩英汤：黄芪18g、黄连18g、黄芩18g、半夏12g、厚朴12g、蒲公英25g。
S3：
S3.1：将各中药饮片切细磨碎，用11倍药材体积的水浸泡1.8h；
S3.2：将浸泡后的药材煎煮32min，滤出药液；
S3.3：加水浸没药材3.8cm，煎煮32min，滤出药液；
S3.4：再加水浸没药材1.4cm，煎煮22min，滤出药液；
S3.5：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
S4：
S4.1：制备药物琼脂培养基；
S4.2：将受试菌稀释成浓度为1.8×108CFU/ml的菌悬液；
S4.3：用微量移液器吸取1.2μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含105个菌；
S4.4：将平板倒置于38℃培养箱内培养19h；
S4.5：观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度，范围为32g/L。
S5：
S5.1：取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.55麦氏比浊单位，含菌量为1.8×108CFU/ml；
S5.2：再按1:12的比例稀释，使其含菌量为1.8×107CFU/ml备用；
S5.3：制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.4：在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
S5.5：置于38℃培养箱中培养；
S5.6：分别在0小时、6小时、24小时取样；
S5.7：对取样进行1:12的比例稀释；
S5.8：将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
S5.9：涂匀，38℃培养24小时；
S5.10：培养24小时后进行菌落计数。
总结：本实施例通过设定中高浓度范围的参数验证了芪连芩英汤在浓度32g/L时对幽门螺旋杆菌的有效抑制效果。
汇总总结
通过上述五个实施例，验证了芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的显著抑制效果，并且在不同浓度范围和参数设置下均表现出良好的抑菌性能。具体来说：
实施例1至实施例5覆盖了芪连芩英汤不同重量比例和制备参数范围，从较低到较高的浓度设定，均展示了对幽门螺旋杆菌的有效抑制作用。
各实施例中，通过不同的浸泡时间、煎煮时间和温度参数，展示了芪连芩英汤在不同制备条件下的稳定性和有效性。
最低抑菌浓度在25g/L至35g/L范围内，芪连芩英汤均表现出良好的抑菌效果，证明了该中药复方在多种条件下的有效性。
综合五个实施例，本发明的芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，具有显著的抑菌效果，适用范围广，能够为临床治疗提供一种有效、安全的中药方案。
请参阅附图2-附图4，为验证本发明所制备的芪连芩英汤具备抑制幽门螺旋杆菌的作用，设计了以下两个实验：
实验一：芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的体内抑菌实验
实验目的：验证芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌感染小鼠的体内抑菌效果，评估其抗炎和根除幽门螺旋杆菌的潜力。
实验步骤：
制备芪连芩英汤：
配方：黄芪15g、黄连15g、黄芩15g、半夏9g、厚朴10g、蒲公英20g。
实验用具：实验小鼠、电子天平、饮片粉碎机、蒸发设备、培养箱、微量移液器、无菌生理盐水、尿素酶试剂盒、免疫组化试剂盒、显微镜。
方法：
将各中药饮片切细磨碎，用10倍药材体积的水浸泡1-2小时。
将浸泡后的药材煎煮30分钟，滤出药液。
加水浸没药材3-4厘米，煎煮30分钟，滤出药液。
再加水浸没药材1-1.5厘米，煎煮20分钟，滤出药液。
将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1，浓度为100g/100ml，进行消毒灭菌，置于4℃冰箱中保存。
实验动物处理：
动物：SPF级C57BL/6小鼠44只，4-6周龄，体重16-18g左右，雄性。
分组：将小鼠随机分成四组，每组11只，分别为正常组、模型组、中药组和西药组。
造模：
除正常组外，其余三组小鼠禁食12小时，灌胃0.5ml的5％NaHCO3溶液。
24小时后接种0.5ml活力幽门螺旋杆菌菌液(1×10^9CFU/ml)，连续接种5天。
药物干预：
中药组：每日灌胃0.5ml芪连芩英汤，连续14天。
西药组：每日灌胃0.5ml三联药物(奥美拉唑20mg、克拉霉素500mg、阿莫西林1000mg)，连续14天。
正常组和模型组：每日灌胃0.5ml生理盐水，连续14天。
取样与分析：
根除评估：处死小鼠，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，4℃的生理盐水冲洗，取部分胃窦进行尿素酶实验(RUT)，剩余部分选择胃窦-胃体组织以多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后进行HE及Warthin-Starry染色。采用双重标准，尿素酶实验及病理染色均为阴性才判定为Hp根除。
抗炎分析：利用免疫组化法测定胃黏膜中NF-κB的阳性表达，评估药物的抗炎效果。石蜡切片脱蜡并水化，高压抗原修复，稍甩干后用免疫组化笔圈定玻片的待测组织区域，滴加过氧化物酶阻断溶液，室温孵育30分钟，PBS冲洗3×5min，加封闭液，室温孵育1小时。除去封闭液，加一抗(按照1:100比例配制IFN-y抗体，200μL/样本滴加)，4℃过夜。PBS冲洗3×5min，加二抗(生物素标记的羊抗兔IgG复合物，按照1:100比例配制生物素标记的羊抗兔IgG聚合物，200μL/样本滴加)，室温孵育1小时，PBS冲洗3×5min，加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育30分钟，PBS冲洗3×5min，甩去PBS液，每张切片加200μL/样本新鲜配制的DAB显色液，室温孵育2min，显微镜下观察3～10min，反应到变棕黄色为止，自来水冲洗中和，苏木素复染，自来水大量冲洗返蓝10min。将切片放于60℃烘箱中，烘片1分钟。中性树胶封固。400倍视野进行采集。
结果：
HP根除率
各组均有10只小鼠进入数据分析，各组的快速尿素酶试验阴性数分别是：正常组10只、模型组0只、中药组6只、西药组8只；各组的组织病理染色阴性数分别是：正常组10只、模型组0只、中药组6只、西药组7只。综合两种检测方法，幽门螺杆菌根除率结果分别为：正常组100％，模型组0％，中药组60％，西药组70％。中药组和西药组经卡方检验Fisher精确概率法比较，P＝1，差异无统计学意义(见表1)
表1各组HP根除率
胃黏膜NF-kB的表达
棕黄色细胞颗粒即为阳性细胞表达部位，如图2所见，正常组小鼠胃黏膜可见少量NF-kB阳性表达，模型组阳性细胞数量显著增多，中药组和西药组的阳性表达量介于正常组和模型组之间。应用Image-ProPlus6.0软件(MediaCybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)进一步精确分析：选取相同的棕色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析，得出每张照片的阳性面积、积分光密度值(IOD)，计算平均蛋白表达强度、阳性率(备注：平均蛋白表达强度＝积分光密度值/总面积；阳性率＝阳性面积/总面积)。结果见表2及图3。胃黏膜NF-kB的阳性表达率：正常组(2.525±0.394)＜中药组(4.609±0.858)＜西药组(6.869±0.243)＜模型组(11.365±1.152)，各个组间均有统计学差异(正常组VS中药组P＜0.05；正常组VS西药组P＜0.001；正常组VS模型组P＜0.0001；模型组VS中药组P＜0.0001；模型组VS西药组P＜0.001；中药组VS西药组P＜0.05)。说明造模成功，且药物起到了抑制NF-kB阳性表达的作用，中药优于西药。
表2各组小鼠胃黏膜NF-kB的表达(均数±标准差；n＝10)
(备注：△＝正常组VS中药组P＜0.05；○＝正常组VS西药组P＜0.001；☆＝正常组VS模型组P＜0.0001；*＝模型组VS中药组P＜0.0001；#＝模型组VS西药组P＜0.001；□＝中药组VS西药组P＜0.05)
实验分析：
本研究通过建立幽门螺旋杆菌(HP)感染小鼠动物模型，用快速尿素酶试验和组织病理染色两种方法综合评价芪连芩英汤对HP的体内清除作用，结果显示：正常组的HP根除率为100％，模型组为0％，表明组间未发生交叉感染，造模成功。中药组的HP根除率是60％，西药组是70％，两组无统计学差异，说明芪连芩英汤和西药三联均能有效根除幽门螺旋杆菌，芪连芩英汤的效果与西药三联接近。
本研究采用免疫组化法来测定胃黏膜NF-kB的阳性表达，结果显示：正常组＜中药组＜西药组＜模型组，各个组间均有统计学差异。模型组表达最高，说明幽门螺杆菌感染后NF-κB处于活化状态；中药组和西药组的NF-kB表达量介于正常组和模型组之间，说明经过药物治疗，NF-κB受到了抑制，胃黏膜炎症反应得到减轻。中药组的NF-κB表达低于西药组，且有统计学差异，说明芪连芩英汤的抗炎效果优于西药三联。
综上所述：
实验总结：实验结果显示，芪连芩英汤在体内对幽门螺旋杆菌具有显著的抑制作用，且抗炎效果优于西药组。中药组的幽门螺旋杆菌根除率为60％，与西药组(70％)接近，NF-κB表达显著降低，表明芪连芩英汤在根除幽门螺旋杆菌和减少胃黏膜炎症反应方面具有良好潜力。
实验二：芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的体外抑菌实验
实验目的：测定芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的体外最低抑菌浓度(MIC)，评估其体外抑菌效果。
实验步骤：
制备芪连芩英汤：
配方：黄芪15g、黄连15g、黄芩15g、半夏9g、厚朴10g、蒲公英20g。
实验用具：三角烧瓶、肉汤琼脂培养基、中药饮片、培养箱、微量移液器、无菌生理盐水、平板、乳糖酶、砂糖、恒温培养箱
方法：
将各中药饮片切细磨碎，用10倍药材体积的水浸泡1-2小时。
将浸泡后的药材煎煮30分钟，滤出药液。
加水浸没药材3-4厘米，煎煮30分钟，滤出药液。
再加水浸没药材1-1.5厘米，煎煮20分钟，滤出药液。
将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1，浓度为100g/100ml，进行消毒灭菌，置于4℃冰箱中保存。
菌液制备：
将幽门螺旋杆菌培养72小时后，调整菌液浓度至3×10^9CFU/ml。
取10％全脂乳90ml，加入5g乳糖酶，在37℃水解1小时，加入10g砂糖，置90-95℃杀菌灭酶脱脂，待冷却至37℃时，加入10ml菌液(终浓度为1×10^9CFU/ml)，在37℃恒温培养16小时。
最低抑菌浓度(MIC)的测定：
采用倍比稀释法制备含药平板：取三角烧瓶10只，分别加入25ml融化的肉汤琼脂培养基，在第一只加入25ml100％中药水煎液，使其浓度为0.5g/ml，混匀后取出25ml，依次稀释至1.95g/L。
将受试菌稀释至浓度为1.5×10^7CFU/ml，用微量移液器吸取1μl接种于含药平板，培养16-20小时，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为MIC。
时间-杀菌曲线图绘制：
通过倍比稀释获得药物浓度为1×MIC及2×MIC的肉汤培养基，用微量移液器吸取1μl制备好的菌悬液，分别于0小时、6小时、24小时取样并稀释，接种营养琼脂培养基，培养24小时后进行菌落计数，以时间对活菌数(CFU/ml)绘制时间-杀菌曲线图。
实验结果：
药物最低抑菌浓度(MIC)
按表3配制药物琼脂培养基试验并涂布相应浓度的菌液，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为MIC。芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌具有体外抑制作用，最低抑菌浓度MIC值为31.25g/L。
表3：
时间-杀菌曲线图
0h时药物还未作用时活菌数最高，6h和24h时1×MIC药物浓度比2×MIC的活菌数量高，24h时2×MIC药物浓度活菌数为0，细菌全部死亡(图4)。6h时1×MIC药物浓度的杀菌率为44.44％，2×MIC药物浓度的杀菌率为62.5％；24h时1×MIC药物浓度的杀菌率为77.78％，2×MIC药物浓度的杀菌率为100％(表4)。说明：芪连芩英汤对HP有杀灭作用，其作用随时间逐渐增强，各个时间点的杀菌率与药物浓度成正比。
表4：
实验总结：实验结果显示，芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌具有体外抑制作用，最低抑菌浓度(MIC)为31.25g/L。时间-杀菌曲线显示，芪连芩英汤的抑菌效果随时间逐渐增强，2×MIC药物浓度24小时内细菌全部死亡，表明芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌具有显著的杀菌作用。
为验证本发明中的五个实施例对幽门螺旋杆菌的抑制效果，设计了以下测试实验：
实验目的：
验证芪连芩英汤在不同浓度和不同制备条件下对幽门螺旋杆菌的抑制效果，评估其抑菌性能和应用潜力。
实验步骤
制备芪连芩英汤：
配方：
实施例1：黄芪10g、黄连10g、黄芩10g、半夏5g、厚朴5g、蒲公英10g。
实施例2：黄芪15g、黄连15g、黄芩15g、半夏10g、厚朴10g、蒲公英15g。
实施例3：黄芪20g、黄连20g、黄芩20g、半夏15g、厚朴15g、蒲公英30g。
实施例4：黄芪12g、黄连12g、黄芩12g、半夏8g、厚朴8g、蒲公英12g。
实施例5：黄芪18g、黄连18g、黄芩18g、半夏12g、厚朴12g、蒲公英25g。
实验用具：三角烧瓶、肉汤琼脂培养基、中药饮片、培养箱、微量移液器、无菌生理盐水、平板、乳糖酶、砂糖、恒温培养箱。
方法：
将各中药饮片切细磨碎，用相应倍数的水浸泡。
按照实施例中的时间和体积进行三次煎煮，合并滤液。
常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1，浓度为100g/100ml，进行消毒灭菌，置于4℃冰箱中保存。
制备药物琼脂培养基：
准备若干三角烧瓶，每个烧瓶加入25ml融化的肉汤琼脂培养基。
在第一个烧瓶中加入25ml100％中药水煎液，使其浓度为0.5g/ml。
混匀后取出25ml，加入第二个烧瓶，依次进行倍比稀释，直至达到所需浓度范围(实施例1：25g/L，实施例2：30g/L，实施例3：35g/L，实施例4：27g/L，实施例5：32g/L)。
接种菌液：
将幽门螺旋杆菌标准菌株稀释至不同浓度(实施例1：1.0×10^8CFU/ml，实施例2：1.5×10^8CFU/ml，实施例3：2.0×10^8CFU/ml，实施例4：1.2×10^8CFU/ml，实施例5：1.8×10^8CFU/ml)。
按相应比例再稀释菌液备用。
最低抑菌浓度(MIC)的测定：
用微量移液器吸取相应浓度的菌液接种于含药平板。
将平板倒置于相应温度下培养。
观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度。
时间-杀菌曲线图绘制：
制备含药浓度为0.5×MIC、1×MIC和2×MIC的肉汤培养基。
将受试菌稀释至相应浓度，分别于0小时、6小时、24小时取样并稀释，接种营养琼脂培养基。
培养24小时后进行菌落计数，以时间对活菌数(CFU/ml)绘制时间-杀菌曲线图。
实验结果：
MIC测定结果：
时间-杀菌曲线：
实验总结：
通过上述实验，验证了芪连芩英汤在不同浓度和不同制备条件下对幽门螺旋杆菌的显著抑制效果。具体结果如下：
实施例1的最低抑菌浓度(MIC)为25g/L。
实施例2的最低抑菌浓度(MIC)为30g/L。
实施例3的最低抑菌浓度(MIC)为35g/L。
实施例4的最低抑菌浓度(MIC)为27g/L。
实施例5的最低抑菌浓度(MIC)为32g/L。
时间-杀菌曲线显示，芪连芩英汤的抑菌效果随时间逐渐增强，2×MIC药物浓度在24小时内可完全杀灭幽门螺旋杆菌。实验结果表明，芪连芩英汤在体外对幽门螺旋杆菌具有显著的抑菌作用，证明了其作为一种有效的中药复方在抗幽门螺旋杆菌治疗中的潜力。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制芪连芩英汤，芪连芩英汤包括黄芪、黄连、黄芩、半夏、厚朴和蒲公英；
S2、按照一定重量比例范围配制芪连芩英汤：
S3、将各中药饮片切细磨碎，用8-12倍药材体积的水浸泡1-2h，进行三次煎煮，分别煎煮25-35min、25-35min和15-25min，滤出药液合并，常压蒸发浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1；
S4、测定芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的最低抑菌浓度，采用琼脂稀释法进行测定，最低抑菌浓度为25-35g/L；
S5、将幽门螺旋杆菌稀释至0.4-0.6麦氏比浊单位后按1:5至1:15比例再稀释，制备三种药物浓度培养基，接种培养，35-39℃下分别在0、5-7、23-25小时取样稀释并接种，35-39℃培养22-26小时后计数菌落。
2.根据权利要求1所述的芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，其特征在于，所述S2步骤中配制芪连芩英汤按以下重量比例配制：黄芪10-20g、黄连10-20g、黄芩10-20g、半夏5-15g、厚朴5-15g、蒲公英10-30g。
3.根据权利要求1所述的芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，其特征在于，所述S3步骤具体包括以下步骤：
S3.1、浸泡：将各中药饮片切细磨碎，用8-12倍药材体积的水浸泡1-2h；
S3.2、第一次煎煮：将浸泡后的药材煎煮25-35min，滤出药液；
S3.3、第二次煎煮：加水浸没药材3-4cm，煎煮25-35min，滤出药液；
S3.4、第三次煎煮：再加水浸没药材1-1.5cm，煎煮15-25min，滤出药液；
S3.5、合并与浓缩：将三次滤液合并，常压蒸发，浓缩至原药材质量与煎液体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，其特征在于，所述S4步骤具体包括以下步骤：
S4.1、制备药物琼脂培养基；
S4.2、接种菌液：
将受试菌稀释成浓度为106-108CFU/ml的菌悬液；
用微量移液器吸取0.5-1.5μl接种于含药平板，最终接种菌量约每个接种点含103-105个菌；
S4.3、培养与观察：
将平板倒置于35℃培养箱内培养16-20h；
观察结果，以肉眼未见细菌明显生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度。
5.根据权利要求4所述的芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，其特征在于，所述S4.1步骤中制备药物琼脂培养基具体包括以下步骤：
S4.11、准备培养基：
准备若干三角烧瓶，每个烧瓶加入20-30ml融化的肉汤琼脂培养基；
S4.12、稀释药液：
在第一个烧瓶中加入20-30ml 100％中药水煎液，使其浓度为0.4-0.6g/ml；
混匀后取出20-30ml，加入第二个烧瓶，依次进行倍比稀释，直至达到所需浓度范围25-35g/L。
6.根据权利要求1所述的芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，其特征在于，所述S5步骤具体包括以下步骤：
S5.1、制备菌悬液：
取适量的幽门螺旋杆菌标准菌株，使用无菌生理盐水将其稀释至0.4-0.6麦氏比浊单位，含菌量为1.0-2.0×108CFU/ml；
再按1:5至1:15的比例稀释，使其含菌量为1.0-2.0×107CFU/ml备用；
S5.2、制备三种不同含药浓度的培养基；
S5.3、菌悬液接种与培养：
在每个浓度的培养基中加入等量的菌悬液；
置于35-39℃培养箱中培养；
S5.4、取样与稀释：
分别在0小时、5-7小时、23-25小时取样；
对取样进行1:5至1:15的比例稀释；
S5.5、稀释后的菌液接种与培养：
将稀释后的菌液接种于营养琼脂培养基；
涂匀，35-39℃培养22-26h；
S5.6、菌落计数：
培养22-26小时后进行菌落计数。
7.根据权利要求6所述的芪连芩英汤对幽门螺旋杆菌的抑制方法，其特征在于，所述S5.2步骤中三种不同含药浓度的培养基为制备含药浓度为0.4×MIC-0.6×MIC、0.8×MIC-1.2×MIC和1.8×MIC-2.2×MIC的肉汤培养基。
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