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CN118879579A - 一种发酵粘液乳杆菌lz63、利用该菌株获得的试剂及其应用 - Google Patents

一种发酵粘液乳杆菌lz63、利用该菌株获得的试剂及其应用 Download PDF

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CN118879579A CN202411300083.6A CN202411300083A CN118879579A CN 118879579 A CN118879579 A CN 118879579A CN 202411300083 A CN202411300083 A CN 202411300083A CN 118879579 A CN118879579 A CN 118879579A
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史明璇
吴弟艳
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域。本发明提供了一种发酵粘液乳杆菌LZ63，分类学名称为Limosilactobacillusfermentum LZ63，于2024年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20241619；该菌株可用于制备胞外多糖、抗氧化产品。本发明还提供了利用该菌株获得的试剂及其在制备抗氧化产品中的应用。本发明所述菌株具有较强的抗氧化能力以及高产胞外多糖的特点。

Description

一种发酵粘液乳杆菌LZ63、利用该菌株获得的试剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种发酵粘液乳杆菌LZ63、利用该菌株获得的试剂及其应用。
背景技术
浆水是我国西北地区特有的传统发酵食品，在中国已有数千年的制作历史。浆水具有丰富的营养价值和益生功效，其中含有多种有机酸、氨基酸、维生素、类胡萝卜素、类黄酮等物质，以及多种微生物，具有清热解暑、促进消化、调节肠道微生物等功能，有利于人体健康。浆水是利用蔬菜表面及环境中的微生物进行自然发酵，在此过程中淀粉、多糖和蛋白质被微生物分解代谢产生各种小分子物质。有研究表明，乳酸菌(Lactic acidbacteria，LAB)是浆水中最丰富的微生物，具有抗氧化性、降解亚硝酸盐等功能。近年来，浆水已通过体内外研究被证实具有降低血尿酸、降低胆固醇、降低血压的临床效果。它的独特风味和丰富的营养价值，使其成为夏季消暑时的最佳饮品。
微生物，尤其是乳酸菌，在发酵蔬菜中发挥重要的作用。乳酸菌在发酵过程中产生的有机酸可改善食品风味，产生的抑菌物质可改善食品安全，并且具有降低胆固醇、降低血尿酸、抗氧化等促进人体健康的益生作用。中国西北传统发酵食品浆水已有研究表明对人体健康有诸多益处，目前已经有研究从浆水中筛选出2株发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)和1株植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，3株乳酸菌均可降解胆固醇和亚硝酸盐，同时具有良好的耐酸和耐胆盐特性，表现出良好的益生功能。在浆水中分离的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)产生的细菌素，表现出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌良好的抑制作用。从浆水中筛选出一株发酵乳杆菌JL-3(Lactobacillusfermentum JL-3)在体外具有较强尿酸降解能力，此外，该菌株还可在小鼠肠道内定植，通过减少肠道对尿酸的吸收并增加其排泄，有效降低了血液中的尿酸浓度。
乳酸菌除了已被证明具有降解亚硝酸盐、降解胆固醇、降解血尿酸等能力，还被证明可产生胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)。微生物细胞膜由糖类分子组成，这些糖类分子有些为荚膜多糖与细胞表面紧密相连，有些以胞外多糖的形式，松散的附着在细胞表面，或分泌在外环境中。胞外多糖是微生物产生的天然高分子量生物聚合物，用于保护自身免受不适宜环境的影响，如：pH、渗透压、金属离子等。由于乳酸菌被“普遍认为是安全的(Generally recognised as safe，GRAS)”，因此由乳酸菌产生的胞外多糖也被认为是食品用多糖的良好来源。乳酸菌的胞外多糖表现出一定的生物活性和生理功能，广泛的研究表明乳酸菌产生的某些胞外多糖可以促进人体的健康和预防疾病，例如可以起到免疫刺激，免疫调节，抗肿瘤，抗氧化性和降低胆固醇的活性等作用。此外，它们还可以直接用于食品生产中，以实现所需的粘度、质地和口感，特别是其保水能力、形成凝胶的能力以及改善食品流变特性的能力。
从浆水中筛选具有特殊生物学功能菌株已有研究，而从浆水中筛选具有抗氧化能力且高产胞外多糖的乳酸菌仍有待研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵粘液乳杆菌LZ63及其应用，该菌株具有较强的抗氧化能力以及高产胞外多糖的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种发酵粘液乳杆菌LZ63，分类学名称为Limosilactobacillusfermentum LZ63，于2024年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20241619。
本发明提供了一种具有抗氧化功能的试剂，该试剂利用所述发酵粘液乳杆菌LZ63获得。
作为优选，所述试剂包括发酵液、无细胞上清液或菌悬液中的一种或几种。
作为优选，所述发酵液中有效活菌数为(0.8-1.3)×l09CFU/mL。
本发明还提供了所述发酵粘液乳杆菌LZ63在制备胞外多糖中的应用。
作为优选，将所述发酵粘液乳杆菌LZ63划线接种至MRS培养基中，培养42-50h后获得胞外多糖。
本发明还提供了所述发酵粘液乳杆菌LZ63、或利用所述发酵粘液乳杆菌LZ63获得的试剂在制备抗氧化产品中的应用。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明从浆水中筛选出的发酵粘液乳杆菌LZ63具有较强的抗氧化能力，以及可以高产胞外多糖。利用该菌株发酵粘液乳杆菌LZ63获得的发酵液、无细胞上清液、菌悬液等试剂也具有较强的抗氧化能力。试验证明了发酵粘液乳杆菌LZ63的发酵液、无细胞上清液以及菌悬液的DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率明显高于标准菌株CICC6001的相应试剂，对不同过氧化氢浓度的耐受性也明显高于标准菌株CICC6001的相应试剂。
生物保藏说明
本发明涉及发酵粘液乳杆菌LZ63，分类学名称为Limosilactobacillusfermentum LZ63，于2024年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20241619。
具体实施方式
本发明提供了一种发酵粘液乳杆菌LZ63，分类学名称为Limosilactobacillusfermentum LZ63，于2024年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20241619。
本发明提供了一种具有抗氧化功能的试剂，该试剂利用所述发酵粘液乳杆菌LZ63获得。
在本发明中，所述试剂包括发酵液(Fermentationbroth)、无细胞上清液(Cell-free supernatant,CFS)或菌悬液(Bacterial suspension)中的一种或几种。
在本发明中，所述发酵液中有效活菌数优选为(0.8-1.3)×l09CFU/mL，进一步的优选为(0.9-1.1)×l09CFU/mL，更进一步的优选为1×l09CFU/mL。本发明中所述菌悬液中活菌的有效浓度优选为(0.8-1.3)×l09CFU/mL，进一步的优选为(0.9-1.1)×l09CFU/mL，更进一步的优选为1×l09CFU/mL。
本发明中还提供了所述发酵粘液乳杆菌LZ63在制备胞外多糖中的应用。
在本发明中，将筛选出的发酵粘液乳杆菌LZ63分离纯化后，接种至MRS培养基中培养，然后在用MRS平板上划线，无菌接种环接触单菌落缓缓向外拉，菌落表面拉丝且粘滑则表明产生了胞外多糖。
在本发明中，所述MRS培养基以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分8-12g/L蛋白胨、3-7g/L牛肉膏、3-7g/L酵母粉、18-22g/L葡萄糖、0.8-1.2ml/L吐温80、1.5-2.3g/L磷酸氢二钾、4-6.5g/L乙酸钠、1.8-2.2g/L柠檬酸氢二铵、0.18-0.22g/L硫酸镁、0.04-0.06g/L硫酸锰；进一步优选的包括以下浓度的组分9-11g/L蛋白陈、4-6g/L牛肉膏、4.5-6g/L酵母粉、19-21g/L葡萄糖、0.9-1.1ml/L吐温80、1.7-2.1g/L磷酸氢二钾、4.8-5.5g/L乙酸钠、1.9-2.1g/L柠檬酸氢二铵、0.19-0.21g/L硫酸镁、0.045-0.055g/L硫酸锰；更进一步优选的包括以下浓度的组分10g/L蛋白胨、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、1ml/L吐温80、2g/L磷酸氢二钾、5g/L乙酸钠、2g/L柠檬酸氢二铵、0.2g/L硫酸镁、0.05g/L硫酸锰。
在本发明中，所述培养的温度优选为35-38℃，进一步的优选为37℃；所述培养的时间优选为42-50h，进一步的优选为45-49h，更进一步的优选为48h。
本发明中还提供了所述发酵粘液乳杆菌LZ63、或利用权利要求1所述发酵粘液乳杆菌LZ63获得的试剂在制备抗氧化产品中的应用。本发明中所述抗氧化产品包括具有抗氧化效果的功能性食品。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种具有抗氧化功能的试剂，利用发酵粘液乳杆菌LZ63获得的发酵液：
将筛选出的发酵粘液乳杆菌LZ63的各分离株活化后，按照2％的接种量接种至MRS液体培养基中，培养24h后，调整其浓度为1×109CFU/mL，即获得发酵液。
实施例2
一种具有抗氧化功能的试剂，利用发酵粘液乳杆菌LZ63获得的无细胞上清液：
将筛选出的发酵粘液乳杆菌LZ63的各分离株活化后，按照2％的接种量接种至MRS液体培养基中，培养24h后，调整其浓度为1×109CFU/mL，获得发酵液。然后将发酵液在10000r/min、4℃条件下离心5min，收集上清液，即获得无细胞上清液。
实施例3
一种具有抗氧化功能的试剂，利用发酵粘液乳杆菌LZ63获得的菌悬液：
将筛选出的发酵粘液乳杆菌LZ63的各分离株活化后，按照2％的接种量接种至MRS液体培养基中，培养24h后，调整其浓度为1×109CFU/mL，获得发酵液。然后将发酵液在10000r/min、4℃条件下离心5min，收集菌体，并经无菌PBS溶液重悬后，调整其浓度为1×109CFU/mL，即得菌悬液。
试验例1获得发酵粘液乳杆菌LZ63
从兰州大学丹桂苑食堂收集1份刚制备的浆水样品(以包菜为原料，经焯水之后放入面汤中，随后加入“引子”(老浆水)作为发酵剂，在室温下自然发酵而成)，将其分装在18个(6个时间点，每个时间点3个重复)经过高温灭菌后的密封罐中，在室温(25℃)下发酵10天，分别于0、2、4、6、8、10天收集浆水样品，将浆水样品在MRS琼脂平板上进行涂布培养。取25mL浆水，加入225mL的无菌生理盐水(0.9％)，在25℃下以60rpm的转速摇35min，使浆水中存在的微生物完全溶解在生理盐水中，得到浆水微生物菌液。取1mL 10-1CFU/mL的菌液加入到9mL无菌生理盐水中，振荡混匀，得到10-2CFU/mL的菌悬液，逐级稀释到适宜梯度。分别吸取3个不同稀释度100μL的稀释菌液均匀的涂布于MRS平板培养基上，在37℃培养36-48h。及时观察并记录菌落的大小、生长状况、颜色、表面、边缘、溶钙圈、透明度、色泽、湿润度等，随后根据革兰氏染色镜检观察细胞形态，挑选典型菌落，进行多次纯化后加甘油保存在-80℃的超低温冰箱中。将分离纯化后的菌株基于16S rDNA测序进行鉴定。
针对目标菌种的基因序列，设计/选择相应的引物，所用引物为细菌16SrDNAV4-V5可变区引物515R和907R，其中引物515R序列如SEQ ID NO.1，具体序列为5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’，引物907R序列如SEQ ID NO.2，具体序列为5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’。
利用提取的乳酸菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应体系总体积为25μL，1.0μL基因组DNA，2.5μL的10×Buffer，2μL dNTP，正、反向引物各0.5μL，0.2μL ExTaq聚合酶(TAKARA)，18.3μL的ddH2O。采用ddH2O替代基因组DNA作为PCR阴性对照。PCR扩增反应程序：95℃预变性4min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸10min。
随后对扩增产物进行测序，并将测序得到的DNA序列与国际已有核酸序列数据库(如Genbank、EMBL、DDBJ等)中参考序列进行同源性搜索比对，得到菌株的种/属信息，确定益生菌的分类。
本试验分别从浆水发酵的0、2、4、6、8、10天采集发酵样品，将挑取的LAB接种至MRS培养基(10g/L蛋白胨、5g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、1ml/L吐温80、2g/L磷酸氢二钾、5g/L乙酸钠、2g/L柠檬酸氢二铵、0.2g/L硫酸镁、0.05g/L硫酸锰)中，37℃下培养48h，然后在MRS平板上划线，根据菌落在平板表面的产粘、拉丝情况，挑选疑似产EPS的菌株进行划线分离纯化。
EPS产量的测定：将上述挑选的产粘菌落接种到灭菌后的培养基中，活化3次，将活化后的菌液按2％的接种量接种于MRS肉汤，并在37℃培养24h。收集发酵液，以10000r/min、4℃离心10min除去菌体和杂质，收集上清液，添加80％三氯乙酸溶液，使溶液中三氯乙酸的终浓度为4％(m/v)，在4℃冰箱中放置6h后，以10000r/min、4℃离心15min除出蛋白质沉淀，取上清液，再加入3倍体积的95％乙醇，在4℃冰箱中放置12h后，再以10000r/min、4℃离心15min，取沉淀，再加入2mL热的超纯水溶解，并装入8000-14000透析袋中，放置于4℃冰箱中透析24h，每8h换一次水，定容测定多糖含量。
表1乳酸菌分离株的16S rDNA基因测序鉴定结果及EPS产量
结果如表1所示，其中乳酸菌分离株经16S rDNA鉴定为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)，命名为发酵粘液乳杆菌LZ63，其EPS产量在250mg/L以上。
试验例2发酵粘液乳杆菌LZ63抗氧化能力的测定
(一)对不同过氧化氢(H2O2)浓度的耐受性
在MRS液体培养基中加入30％的H2O2溶液，调整其浓度为0、1、2、3mmol/L，将筛选出的高产EPS的发酵粘液乳杆菌LZ63分离株活化后按2％的接种量接种到含不同浓度H2O2的液体培养基中，在37℃培养48h后，测定菌液在波长600nm的光密度值。以鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)CICC6001作为阳性对照菌株，CICC6001购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
表2发酵粘液乳杆菌LZ63对H2O2的耐受能力
结果如表2所示，发酵粘液乳杆菌LZ63在H2O2浓度为0mmol/L时，标准菌株CICC6001生长能力略高于LZ63，当H2O2浓度为1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L时，生长能力均优于标准菌株CICC6001。
(二)DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率
将筛选出的高产EPS的发酵粘液乳杆菌LZ63分离株活化后，按2％的接种量接种到MRS液体培养基中，培养24h后，调整其浓度为1×109CFU/mL，即获得发酵液。将发酵液在10000r/min、5min、4℃离心后获得的上清液为无细胞上清液，将离心后获得的菌体经无菌PBS溶液重悬后即得菌悬液，制备发酵粘液乳杆菌LZ63分离株的三种样液进行DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率测定。
DPPH自由基清除率活性：1mL的样品或1mL去离子水加入到相同体积的乙醇DPPH自由基溶液(0.2mmol/L)中，混合均匀后，室温下避光反应30min，波长517nm处测定吸光度。
ABTS+自由基清除率活性：10mL 7mmol/L的ABTS+溶液与10mL 2.45mmol/L的硫代硫酸钾溶液混匀，室温黑暗条件下，静置12h，以制备ABTS+储备液。将ABTS+储备液用80％的乙醇稀释，至732nm处的吸光度为0.700±0.050，即为ABTS+溶液。0.6mL的样品溶液或0.6mL的蒸馏水(空白对照)与2.4mL的ABTS+溶液混匀，常温黑暗条件下，静置8min，测定溶液在734nm处的吸光度。以鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)CICC6001作为阳性对照菌株，CICC6001购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
表3利用发酵粘液乳杆菌LZ63制备的三种样液的DPPH自由基清除率(％)
表4利用发酵粘液乳杆菌LZ63制备的三种样液的ABTS自由基清除率(％)
测定结果如表3和表4所示，利用发酵粘液乳杆菌LZ63制备的发酵液、无细胞上清液、菌悬液的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率均高于标准菌株CICC6001。
综上可以看出，本发明中筛选出的发酵粘液乳杆菌LZ63相对于标准菌株CICC6001具有较强的抗氧化能力，也具有较高的胞外多糖产量；此外，利用该发酵粘液乳杆菌LZ63制备的发酵液、无细胞上清液、菌悬液的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率均高于标准菌株CICC6001。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种发酵粘液乳杆菌LZ63，其特征在于，分类学名称为Limosilactobacillusfermentum LZ63，于2024年7月22日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20241619。
2.一种具有抗氧化功能的试剂，其特征在于，所述试剂利用权利要求1所述发酵粘液乳杆菌LZ63获得。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括发酵液、无细胞上清液或菌悬液中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述发酵液中有效活菌数为(0.8-1.3)×l09CFU/mL。
5.权利要求1所述发酵粘液乳杆菌LZ63在制备胞外多糖中的应用。
6.根据权利要求5中的应用，其特征在于，将所述发酵粘液乳杆菌LZ63划线接种至MRS培养基中，培养42-50h后获得胞外多糖。
7.权利要求1所述发酵粘液乳杆菌LZ63、或权利要求2-4任一项所述利用权利要求1所述发酵粘液乳杆菌LZ63获得的试剂在制备抗氧化产品中的应用。
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