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CN116948884A - 高形成生物膜、抗逆性强的德氏乳杆菌乳亚种及其应用 - Google Patents

高形成生物膜、抗逆性强的德氏乳杆菌乳亚种及其应用 Download PDF

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CN116948884A
CN116948884A CN202310802241.7A CN202310802241A CN116948884A CN 116948884 A CN116948884 A CN 116948884A CN 202310802241 A CN202310802241 A CN 202310802241A CN 116948884 A CN116948884 A CN 116948884A
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lactobacillus delbrueckii
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delbrueckii subspecies
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lactobacillus
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Abstract

本发明涉及微生物筛选及发酵技术领域，具体涉及一种高形成生物膜、抗逆性强的德氏乳杆菌乳亚种及其应用，所述菌株为德氏乳杆菌乳亚种DangxiongLBⅧ(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactisDangxiongLBⅧ)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.:M2023396，本申请所述的菌株具有高生物膜形成能力、发酵酸奶有果香风味、抵御不良环境能力极强，在高盐、高糖、高酸等多种高胁迫条件的发酵食品中应用，能够保持较高的活菌数量和发酵活力，赋予发酵食品优良的产品特性。

Description

高形成生物膜、抗逆性强的德氏乳杆菌乳亚种及其应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选及发酵技术领域，具体涉及一种高形成生物膜、抗逆性强的德氏乳杆菌乳亚种及其应用。
背景技术
乳酸菌是革兰氏阳性菌，广泛应用于果蔬、鱼类、肉类和乳制品发酵，其因有利于消化食物，预防腹泻，降低胆固醇水平，创造肠道内健康的环境，延长食品保质期等，已经成为国际上益生菌研究的焦点。特别是德氏乳杆菌乳亚种，被广泛用作乳品工业中的发酵剂，并作为健康产品中的益生菌。但是在发酵过程中乳酸菌往往面临着许多不良环境的胁迫，这限制了乳酸菌的进一步推广应用，也正因为如此高抗逆性乳酸菌的研究意义变得非常重要。目前在国内，乳酸菌的研究还存在一系列问题，如乳酸菌产品的生产技术和与国外先进技术相比有差距，产品质量低；不能保证使用的菌株的特有功效，优良菌株的缺乏；益生菌的存活率不高等。对高抗逆性乳酸菌的机制研究也比较少见。所以高抗逆性乳酸菌的研究具有重要的意义。
生物膜是指依附于有生命或无生命物体表面且被胞外大分子包裹的有组织的细菌群体，也被称为生物被膜。生物膜是大多数细菌普遍存在的一种生存方式，其可能存在于医疗器械、病理组织、食品工业原料、食品机械和管道表面等地方。作为微生物在自然界中的一种广泛存在的生活方式，生物膜是细菌抵御各种环境胁迫的一种有效方式，当细菌遇到极端环境(温度、pH值、渗透压、金属离子、抗生素和其他微生物等)威胁时就会聚集形成生物膜以抵御不良环境。因此生物膜形成能力往往与微生物的抗逆性密切相关。
专利申请CN 109576182A公开了一种强抗逆性鼠李糖乳杆菌A-4及其用途：所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosusA-4)，其保藏编号为CGMCC No.16550。本发明还涉及鼠李糖乳杆菌A-4在制备饮料中的用途。本发明涉及的鼠李糖乳杆菌A-4可耐受75℃高温，经pH 2.0酸处理2h存活率高达96.88％±1.4％；在4.5％NaCl的高渗透压胁迫、8倍培养基稀释的低营养胁迫、pH3.5酸胁迫、以及5～45℃温度胁迫下仍可生长繁殖，在制备常温活菌型乳酸菌饮料方面具有广泛的应用前景。
专利申请CN 110656061 A公开了一株副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38：所述副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38已于2019年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO:M2019322。副干酪乳杆菌副干酪亚种RP38(Lactobacillusparacaseisubsp.ParacaseiRP38)具有以下特性：①可在氮源缺失环境中依赖糖碳源代谢产生挥发性风味物质，适应葡萄、银耳龙眼复合汁等原料物性，代谢产生的发酵香浓郁且与原料香协调，是乳酸发酵果汁产品的理想发酵剂。②可应用于海带产品的生物脱腥处理，将1,3-辛二烯、E,Z-3-亚乙基环己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷等腥味物质生物转化而使其明显减少，产生β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、十二醛、E-2-壬烯-1-醇等具有果香等良好风味的次生代谢产物。③具有较强抗逆特性，诸如可耐受pH2.0高酸和30％葡萄糖浓度高渗透压的环境胁迫。
专利申请CN 111280355 A植物乳杆菌P_17及利用该菌制备发酵苹果汁的方法：以苹果汁为原料，以保藏编号为CGMCC NO.19251的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P_17进行发酵制备而成。植物乳杆菌P_17的耐酸、耐糖、耐低温能力突出，具有较强的耐胃蛋白酶和耐酸能力，可抵御人工肠液胁迫环境，有耐受胆盐能力，可耐受较高渗透压的能力。发酵的苹果汁均色泽均匀一致，组织均匀细腻，有发酵特有的香气和苹果香味。本方法制得的发酵的苹果汁比其他菌活菌数高，γ-氨基丁酸、总酸、抗氧化值比普通苹果汁均明显提高。本方法生产工艺简单，原料丰富易得，对果蔬汁乳酸发酵饮料的工业生产意义深远。
专利申请CN 109777748A一株高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌CD0817：所述短乳杆菌CD0817，已于2018年7月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2018462，本发明的短乳杆菌CD0817具有高产GABA的特性，基因功能更加丰富，可在高渗透压环境下生长。
但是现有技术中并没有德氏乳杆菌乳亚种具有抗逆性的报道。
发明内容
针对目前许多发酵食品生产过程中，乳酸菌面临着不良环境的胁迫，导致乳酸菌在发酵环境中死亡或者活力不高，最终影响发酵食品质量的技术问题，本申请提供了一种抗逆性强的德氏乳杆菌乳亚种。该菌株具有高生物膜形成能力、发酵酸奶有果香风味、抵御不良环境能力极强，在高盐、高糖、高酸等多种高胁迫条件的发酵食品中应用，能够保持较高的活菌数量和发酵活力，赋予发酵食品优良的产品特性(良好的风味、理化特性、功能性成分等)。
具体来说，本申请提出了如下技术方案。
本申请提供了一种德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述菌株为德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LBⅧ(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis Dangxiong LBⅧ)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.:M2023396。
优选地，对于上述所述的德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述菌株的16s rRNA序列包含如SEQ ID NO:3所示的序列或者由如SEQ ID NO:3所示的序列组成。
优选地，对于上述所述的德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述德氏乳杆菌乳亚种携带有表达生物膜的基因。
优选地，对于上述所述的德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述表达生物膜的基因包含如SEQ ID NOs:4-7所示的序列或者由如SEQ ID NOs:4-7所示的序列组成。
本申请提供了一种菌体制剂，其包含上述所述的德氏乳杆菌乳亚种。
本申请提供了上述所述的德氏乳杆菌乳亚种或者权利要求所述的菌体制剂在发酵领域中的应用，优选在食品发酵领域中的应用。
优选地，对于上述所述的应用，其中，所述食品为乳制品、酱油制品、梨汁制品或食醋制品，进一步优选地，所述乳制品为酸奶或奶酪。
本申请提供了上述所述的德氏乳杆菌乳亚种或者上述所述的菌体制剂在生物防腐或者在制备抗龋齿产品中的应用。
本申请提供了上述所述的德氏乳杆菌乳亚种或者上述所述的菌体制剂在制备动物饲料或者在制备调节肠道菌群产品中的应用。
本申请提供了一种形成德氏乳杆菌乳亚种的生物膜的基因组，其中，所述基因组包括选自SEQ ID NOs:4-7所示的序列中的一种或二种以上基因。
优选地，对于上述所述的基因组，所述基因组对NaCl、糖和/或酸具有耐受性。
本申请提供了一种耐受NaCl、糖或酸的蛋白质，其由如SEQ ID NOs:4-7所示的一种或二种以上编码得到，或者通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种或者上述所述的菌剂得到。
本申请提供了一种食品，其通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种发酵食材得到。
优选地，对于上述所述的食品，其中，所述食品为酱油制品、乳制品、梨汁制品或食醋制品。
优选地，对于上述所述的食品，所述酱油制品为通过将豆粕、面粉、麸皮混合后接种上述所述的德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合株发酵得到，其中，所述德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合的混合比例为1：0.5-1；和/或
所述乳制品为通过上述的德氏乳杆菌乳亚种发酵生牛乳得到；和/或
所述梨汁制品为通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种发酵梨汁得到；和/或
所述食醋制品为通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种与醋酸菌混合发酵食醋得到。
优选地，对于上述所述的食品，所述食品为抗龋齿或者预防龋齿的食品或者调节肠道菌群的食品。
本申请所取得的有益效果：
本申请所述的菌株德氏乳杆菌乳亚种与NCBI数据库中已公开完整基因组的14株德氏乳杆菌乳亚种(Control_14)相比，含有与生物膜形成相关的4个特有基因，具有高生物膜形成能力，该特性使得德氏乳杆菌乳亚种具有很强的耐渗透压、耐酸、耐胃肠消化液等特性，具有很强的抗逆性；所述菌株在乳制品发酵、酱油发酵、食醋发酵、果汁发酵等多种高胁迫的发酵环境使用能够保持较强的发酵活力，赋予发酵食品优良的产品特性(良好的风味、理化特性、功能性成分等)。
本申请所述的菌株是分离自西藏当雄县海拔约4350m的牧民家的奶拉中，属于天然野生型菌株，经过鉴定其属于德氏乳杆菌乳亚种，该种菌收录于《可用于保健食品的益生菌菌种名单》中，具有食品安全属性。
本申请所述的菌株可分别在质量浓度10％的NaCl的、质量浓度为45％的葡萄糖、pH3.0的MRS液体培养基中生长，还可在人工胃液和人工肠液中存活，具有很高的抗逆性，测定其生物膜形成能力发现其具有较强的生物膜形成能力。
本申请所述的菌株可在多种高胁迫的发酵环境中保持较高的活力，可应用于乳制品、酱油、食醋、果汁等多种环境下的食品发酵中，赋予发酵食品优良的产品特性。
菌株保藏信息
本发明所用的菌种德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LBⅧ(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis Dangxiong LBⅧ)，于2023年3月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023396，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮政编码：430072；电话：02768754052。
附图说明
图1是菌株镜检形态特征示意图。
图2是4个基因编码的氨基酸的凝胶电泳示意图。
图3是不同NaCl浓度下两种德氏乳杆菌乳亚种生物膜形成情况示意图。
图4A至图4C是德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LBⅧ(简称DB-8)在不同浓度的NaCl、糖以及不同pH下的生长曲线示意图，其中，图4A是DB-8在不同浓度的NaCl的生长曲线示意图，图4B是DB-8在不同糖浓度下的生长曲线示意图，图4C是DB-8在不同pH下的生长曲线示意图。
图5是DB-8在胁迫情况下生物膜形成基因表达情况示意图。
具体实施方式
如上所述，本申请提供了德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述菌株为德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LBⅧ(简称DB-8)(Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis Dangxiong LBⅧ)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.:M2023396。
本申请所述的菌株是在西藏当雄县海拔约4350m的牧民家的奶拉中分离获得，属于天然野生型菌株，其具有较好的抗逆性性，能够抵御较强的不良环境的能力。
在一些实施方式中，所述菌株的16s rRNA序列包含如SEQ ID NO:3所示的序列或者由如SEQ ID NO:3所示的序列组成。
SEQ ID NO:3的序列如下：
GATTTGTTGGACGCTAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTAAAGACTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAACACCATGAATCGCATGATTCAAGTTTGAAAGGCGGCGCAAGCTGTCACTTTAGGATGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGCAGTAACTGGTCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAATGATAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAACTGCATCGGAAACTGTCATTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGCGCTAGGTGTTGGGGACTTTCCGGTCCTCAGTGCCGCAGCAAACGCATTAAGCGCTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTGCGCTACACCTAGAGATAGGTGGTTCCCTTCGGGGACGCAAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGTGCAGTACAACGAGAAGCGAACCCGCGAGGGTAAGCGGATCTCTTAAAGCTGCTCTCAGATCGGACTGCGGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAACTGGAATCGCTAGTAATCTCGGATCACCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGCGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTCTGCAATGCCCAAAGTCGGTGAGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGCCTAA
在一些实施方式中，所述DB-8携带有表达生物膜的基因。在一些实施方式中，所述表达生物膜的基因包含如SEQ ID NOs:4-7所示的序列或者由如SEQ ID NOs:4-7所示的序列组成。
在本申请中，所述DB-8与Control_14相比具有4个特有的与生物膜形成相关的基因，从而使所述的菌株具有较强的抗逆性。
在本申请中，Control_14指的是NCBI数据库中已公开完整基因组的14株德氏乳杆菌乳亚种。
在本申请中，SEQ ID NO:4(即DB-8GL000445)的序列为：
ATGAAATCATCCTTAGGAAAAACACTCAGAGAAATCCGTGTAGGAAAACAAGTCAGCATTTGTTCACTTGCTGATCAACACCTGTCCAAATCGCAGATTTCCCGCTTCGAGCGTGGCGAATCTGAAATATCTTGTGCTAATCTCATTAACATATTAGATAAGTTAAACGTTTCTTTAGATGAATTCATGATTATCCATAATGATGTACCTCCAACGAGGACAGAATCTTTTTTCAACCTAATGAGCTACATCAGAAAGGCATATTTTGCTCAAAATACAGCTGAAATCATGAATTTGCTTTCTGCTAATTCCAGTTTTAAACTAAATCCTTTTGAAAAAACGATGATTAAATCAATTGTTCACACACTGGATAGCAATGTCTGTCCAACAAGGGAAGAGATAGCCCAACTAGTCGACTATTTGTTTAAGATAGAAAAGTGGGGCTACTACGAAATAACTTTGTTGGGAAACTGTGTAGAAACAATTCCATACGATTCTTTATTCCTGTTGACAAAGGAAATTTTAAAAAATTCTATTTATTACTCACTAAACAAAAACAACAAGCGGCTAGTGACGCGGCTTGCTATAAATTGCTTAACCATAAGCATTGATGAAAAAGAATTTGCAAATTGCGAGTACTTGATTCAAGAAATAAAAAATCTGTTAAGCAATGAATTAAATTACTACGAACAAACCGTTTTTCTTTACACAACAGGATATTTTGAGTTTATGAAGGGGAAACACGACGGAATTGAAAAAATGACAAAAGCCCTTCAGATTTTCAGTATTTTAGGTGATGAATCTCTTAAAGGCCTATATATCAATCACTTTTCCAAACACGTCGACATTTGA
SEQ ID NO:5(即DB-8GL001087)的序列为：
ATGGCAATTAGCAGCTGGAAAAAAATCCTGTACTGTCTGGCCATCATCTTGTCCGCCATTTACCTAATCTGGCGGATCGGCTGGACCATCCCTTGGGAGCAGCGCTTCTGGGTCCTTTTGTATGCCATCGTTCTTTGGGTCTGTGAAGTTATCTCCAACTTGACGGCATATATCACCATCATTTTCCACATGCTGCCGCCCAAGAAAAAAATACAGATGGACCTCCATCATGTTTTGGACACTTGGCAAGTGCCGGACGTCGATGTTCTGATCGCCACTCATAATGAAGACCGGGAGCTTTTGGAAAAAACGGTCAACGGTGCGACTTACATGAACTACCCCAAGGACAAGCTGCACATCTATATCTGCGATGACGGTAACCGGTCAGAAATCAAGGGCCTGGCTGACCAGTATGGAGTAGGCTATATTGGCCTGGAAAACAATCATGAGGCTAAATCCGGCAACTTAAACCATGCCTTAAGCTTGTTGACCTCTCCTTTGTTTGTTGACTTTGACAGCGACATGATCCCTTATACCAACTTTTTGCAAGAGACCGTGCCGTATTTCCAGCAGAACTGGTTGGATTATAAAAATGACCCAGATAACACCCAGCCACTTGGCTATGTGCAGACCCCGCAGAGTTTTTACGAAAATGATATCTTCCAGTACAATCTTTTCTCTGAAAGAATCGTGGCCAATGAGCAGGACTTTTTCTCAAGAGACGTTAACGTTCTCTATGGCCAGCATGGCTACGCCATCTTTACCGGGTCTAACGCCCTCTTTCTGCGCCAGGCGGTTGACAAAGTTGGTGGTTTTCCAACAAAAACTTTGACTGAAGACTTTGAACTGGGTGCCCGGGTGAACATTGCCGGCTACTCTAGCTTTTCAACGACTGAGCCCCAGTCAGCCGGCACAACGCCGCTGGACTTAACTGAGCCCCAGTCAGCCGGCACAACGCCGCTGGACTTAAAGGGGGTCATCAAGCAGCGTAGCCGGTGGGGGCGGGGGGTGATCCAGTCTTGCCGCAACCTCCACATTTTCCTTAATTCCAAAATTGCCTGGACTCACAAGGTGATTTTGGCCAATGCCTACTTTTACTGGTGGTCCTTCTTCAGACGTTTGATCTATATCGCTGCTCCAATCCTTTTTGCCGTCTGGAAGATCCAAGTGGTCGACACCAACTTCTGGCTTTTGCTGCTGATGTGGGCGCCGGGCTACGCCCTTCTGCACACCGTCTTAGGGGACTCCTCTTCCCGGATTCGGAACGAGCGCTGGGGGGAGGTGCAGGAAACCTTTTTCGCCCCTTATCTGTTCCTGCCAGTCATCCTGCAGACTATGCATATAAAAAAGCACAGCTTCCAGGTGACCCAGAAAAGCTATCAGCGCAACTGGCTGGACCGGGTCTACCTTTTGCCACATTTAGCCATGTGGCTGTTGACCACATATGCCATCATCAAGTTCAATTACGGCAAGTGGGGGTCAGAAATTCTTTACGGGGCCTGGCTCTTGATGCACTGGATCAACCTGTCCTTTGCCGTCTTTATTGCCATGGGCCGGCAGGTTTTCCGCCAGCAGACCCGCTTTCCGCGGAAAATTGCCGGTACGATCAAGGGAGCAGGGGAGATGGAGACTATCGACATCTCAGACACTGGCCTGTCTTTCCAGTTAAGGGATAAAAATGCTCCAGTCCTCTCTGCTGGAGAAAAACTGGCAGGAAAACTACACTTGAGTGATGATTTAATCAAAGAGCGTAACTTCCAGTCCCCGGATCAGACGCTGGACTTTGACTTAACCATCGTCCGTAAAATTGATGACCAGGGCCGCTATGCCGCAACGGTAACGCCGGCTGACAGCAGCCTGCCTGGCTGGCTCCACCTGGTCTATGACCAGCACAACCAGGCAGTTCCAGAAGAGTATGACCGCTGGATGACGACGTTTGACATTCTGGGCATGAATGCCAGGAAGCGGCTGGAAAAAATAGAGTGGCATTTGCGCCGCCGCTTTACCAGACAAAGGGAGGGTTAA
SEQ ID NO:6(即DB-8GL001801)的序列为：
ATGGGTTGCACAGAAGAAATGAAGATAAGTTGTGGAATAGTGTCTTTCAATCCAGACATTGATCTTCTGGAATCAAATATTGATGCCATTAATAACCAGGTAGAGCAAGTCTTTGTGGTTGATAATGGATCCAATAATGTCAATGCAGTAGAGAGATTGGCAGATCAATATTGTTCTGTGCAATTAATCAAGAATACAGAAAATCTCGGAATTGCGGCAGCTTTAAATCAGTGTTGCGAAGCTGCTCGTAAAGCCGGTTATGAATGGATCATCACATTAGATCAGGATTCAATCTGTCCGAAACACTTCGTGGAAGGGCTACTACAGTACATTTATGTAGACTCAAAAGTCGGAATTGTTGCTCCGGTCATTGTGGACCGTTCGGTAGGAGTTATAGGACACCACCCTAATGGATATGCAGAGGTTCGTACTTGCATTACCTCTGGTGCAATGACAAATCTTGCGTTATGGAGCAAATTAAAAGGCTTTGATGAACGGATGTTTATAGATAGTGTAGACTTTGAATATTGTTATCGGGTTCGCAAAGCTGGATATAAAGTAATTCAGACTGATCAAGTGCAGATTAGCCATTCCATCGGTAATGCATCCTTGCGCAGATTTTTATTTTGGAAATTCAAGAATACGGAGCATAGCGCATTCCGAAATTACTATATTGCTCAAAATAATGTGTATTATCCAAGAAAACATAGACTTTGGATTCATTTTATACGCGGAAATGTTCGCAATTTGAAAAGTTTACTAGTAGTTTGCTTTTATGAAGATGAGAAAACAGCAAAATTAAAAGCTATAGTTCGCGGATGGCGCAACGGACTTACAATGAGGAACGATGGATGA
SEQ ID NO:7(DB-8GL001802)的序列为：
GTGAAGGATATAGCAGCAGGAATAGTTATTTATAATCCCGATGACCCAGAACGGTTTAATGAATCTTTGACTAGTGTGCTCGCTCAATTCTCCAGAGTCTATCTTTTTGATAACAGCACACAAAAGGTGAAGCTTCCATCTTTCGGATCTAATGTTACATATATTACAGAGCATAAGAATCAAGGTATTGCATATGCGCTAAATCGTATAATGGAGCAAGCAGAACGGGATGGATTTCAATGGCTTGTAACTATGGATCAGGATTCTATATTACCAGATAACATGGCTGCAGCCTATAGAGAGCACATTCATGATACCAATGTTGCAATCATCTGTCCTCAAGTGATTGATAAGCGTAGGAAGTATATGGCTGTAAAAACTGAGCCGGCGGAGGAGTTTGTAGATGAGTGCATTACTTCCGGAAGTTGTACATCTATTGAAGTTTGGAAAAAGCTGGGAAAGTTTGATGAGTGGCTTTTTATTGATTTGGTTGATAATGAATTCTGCAAGAGAGCTGCTGTATCAGGCTATAAAATCCTTCAACTGAACTCCTTGGTAATGAACCAGGAGTTTGGCAAAATTATTCCAAAGTCAGAGAAGACTATACAGTTTTGGCTTAGGATGGCTAATTTTCTTCACAATAAGAACTTTGCGAAATTTTCGTATAGAAAGACTGTTAGTCCGGCGCGTGTGTATTATACAAACCGGAATATTATTTATGTAAACAGAAAACTTGTGGGTTATGGCCCTGTTGCATATCAAAATTATAACTGTAGGGGATATATTGGGTTTTGGATATCCTTTAACTTTCCGAGCTTCCTACGTGCTCAGGATAAAAAGGCTGTATGGAAAGCTATTTGGAAAGGTAGGAGAGACGGACTTAATAAGCATGTAGAGAAATGGGTTGCACAGAAGAAATGA
在一些实施方式中，SEQ ID NOs：4-7编码的氨基酸序列如SEQ ID NOs：8-11所示。
其中，SEQ ID NO:8的序列为：
MKSSLGKTLREIRVGKQVSICSLADQHLSKSQISRFERGESEISCANLINILDKLNVSLDEFMIIHNDVPPTRTESFFNLMSYIRKAYFAQNTAEIMNLLSANSSFKLNPFEKTMIKSIVHTLDSNVCPTREEIAQLVDYLFKIEKWGYYEITLLGNCVETIPYDSLFLLTKEILKNSIYYSLNKNNKRLVTRLAINCLTISIDEKEFANCEYLIQEIKNLLSNELNYYEQTVFLYTTGYFEFMKGKHDGIEKMTKALQIFSILGDESLKGLYINHFSKHVDI
SEQ ID NO:9的序列为：
MAISSWKKILYCLAIILSAIYLIWRIGWTIPWEQRFWVLLYAIVLWVCEVISNLTAYITIIFHMLPPKKKIQMDLHHVLDTWQVPDVDVLIATHNEDRELLEKTVNGATYMNYPKDKLHIYICDDGNRSEIKGLADQYGVGYIGLENNHEAKSGNLNHALSLLTSPLFVDFDSDMIPYTNFLQETVPYFQQNWLDYKNDPDNTQPLGYVQTPQSFYENDIFQYNLFSERIVANEQDFFSRDVNVLYGQHGYAIFTGSNALFLRQAVDKVGGFPTKTLTEDFELGARVNIAGYSSFSTTEPQSAGTTPLDLTEPQSAGTTPLDLKGVIKQRSRWGRGVIQSCRNLHIFLNSKIAWTHKVILANAYFYWWSFFRRLIYIAAPILFAVWKIQVVDTNFWLLLLMWAPGYALLHTVLGDSSSRIRNERWGEVQETFFAPYLFLPVILQTMHIKKHSFQVTQKSYQRNWLDRVYLLPHLAMWLLTTYAIIKFNYGKWGSEILYGAWLLMHWINLSFAVFIAMGRQVFRQQTRFPRKIAGTIKGAGEMETIDISDTGLSFQLRDKNAPVLSAGEKLAGKLHLSDDLIKERNFQSPDQTLDFDLTIVRKIDDQGRYAATVTPADSSLPGWLHLVYDQHNQAVPEEYDRWMTTFDILGMNARKRLEKIEWHLRRRFTRQREG
SEQ ID NO:10的序列为：
MGCTEEMKISCGIVSFNPDIDLLESNIDAINNQVEQVFVVDNGSNNVNAVERLADQYCSVQLIKNTENLGIAAALNQCCEAARKAGYEWIITLDQDSICPKHFVEGLLQYIYVDSKVGIVAPVIVDRSVGVIGHHPNGYAEVRTCITSGAMTNLALWSKLKGFDERMFIDSVDFEYCYRVRKAGYKVIQTDQVQISHSIGNASLRRFLFWKFKNTEHSAFRNYYIAQNNVYYPRKHRLWIHFIRGNVRNLKSLLVVCFYEDEKTAKLKAIVRGWRNGLTMRNDG
SEQ ID NO:11的序列为：
MKDIAAGIVIYNPDDPERFNESLTSVLAQFSRVYLFDNSTQKVKLPSFGSNVTYITEHKNQGIAYALNRIMEQAERDGFQWLVTMDQDSILPDNMAAAYREHIHDTNVAIICPQVIDKRRKYMAVKTEPAEEFVDECITSGSCTSIEVWKKLGKFDEWLFIDLVDNEFCKRAAVSGYKILQLNSLVMNQEFGKIIPKSEKTIQFWLRMANFLHNKNFAKFSYRKTVSPARVYYTNRNIIYVNRKLVGYGPVAYQNYNCRGYIGFWISFNFPSFLRAQDKKAVWKAIWKGRRDGLNKHVEKWVAQKK
本申请所述的菌株由于携带有与生物膜相关的基因的上述特有基因，当细菌遇到极端环境(温度、pH值、渗透压、金属离子、抗生素和其他微生物等)胁迫时就会聚集形成生物膜以抵御不良环境，因此，所述的菌株具有高抗逆能力，例如，其可以在质量浓度为10％的NaCl、质量浓度为45％的葡萄糖、pH3.0的MRS液体培养基中生长，还可在人工胃液和人工肠液中存活。
本申请提供了一种菌体制剂，其包含上述所述的德氏乳杆菌乳亚种。
本申请提供了上述所述的菌株或者上述所述的菌体制剂在发酵领域中的应用，优选在食品发酵领域中的应用，优选地，所述食品为乳制品、酱油制品、梨汁制品或食醋制品，进一步优选地，所述乳制品为酸奶或奶酪。
例如采用上述所述的菌株发酵酸奶时，所得酸奶香气浓郁，有果香味，口感清爽，后酸稳定。
采用上述所述的菌株发酵酱油时，总酸、总酯含量和酒精度明显提高，促进了酱油的风味，使香味更加浓郁。
采用上述所述的菌株发酵梨汁时，所得到的梨汁更加爽口，并且可以缩短发酵时间，梨汁中含有更高的活菌数。
采用上述所述的菌株酿造醋时，其与对照菌株相比，在pH和还原糖上都更低，说明使用本申请所述的菌株能够加快发酵进程，并且所得到的食醋有更高的总黄酮、总多酚和DPPH清除率，有着更好的抗氧化性，使食醋具有更高的品质和保健作用。
本申请提供了上述所述的德氏乳杆菌乳亚种或者上述所述的菌体制剂在生物防腐或者在制备抗龋齿产品中的应用，优选在抑制有害菌增殖的生物防腐或者抗龋齿中的应用，例如可以抑制沙门氏菌，李斯特菌，变形链球菌等有害菌增殖，从而达到生物防腐及抗龋齿的功能。
本申请提供了上述所述的德氏乳杆菌乳亚种或者上述所述的菌体制剂在制备动物饲料或者在制备调节肠道菌群产品中的应用，例如在发酵饲料方面提高饲料的营养价值及吸收率等，抑制饲料和肠道中的有害菌增殖，调节肠道菌群体现在与有害菌在肠道中竞争性定植，从而抑制有害菌，降低肠道pH，产生短链脂肪酸等代谢产物，抑制有害菌，从而调节肠道菌群。
本申请提供了形成德氏乳杆菌乳亚种的生物膜的基因组，其中，所述基因组包括选自SEQ ID NOs:4-7所示的序列中的一种或二种以上的基因。
在本申请中，所述SEQ ID NOs：4-7的核苷酸序列如上所示。
在一些实施方式中，所述基因组对NaCl、糖和/或酸具有耐受性。
本申请提供了一种耐受NaCl、糖或酸的蛋白质，其由如SEQ ID NOs:4-7所示的一种或二种以上编码得到，或者通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种或者上述所述的菌剂得到。
在一些实施方式中，所述耐受NaCl、糖或酸的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NOs：8-11所述的序列中的一种或两种以上。
本申请提供了一种食品，其通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种发酵食材得到。在一些实施方式中，所述食品为乳制品、酱油制品、梨汁制品或食醋制品。
在一些实施方式中，所述发酵乳制品为通过上述的德氏乳杆菌乳亚种发酵生牛乳或其其他乳得到；
其中，所述酱油制品为通过将豆粕、面粉、麸皮混合后接种到上述所述的德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合菌株中发酵得到，其中，所述德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合菌株的混合比例为1：0.5-1；
其中，所述梨汁制品为通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种发酵梨汁得到；
其中，所述食醋制品为通过上述所述的德氏乳杆菌乳亚种与醋酸菌混合发酵食醋得到；
在本申请中，所述德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合菌株的混合比例指的是二者的质量比例，其是基于豆粕、面粉和麸皮的总质量的百分比的比例关系，例如，当豆粕、面粉和麸皮的总质量为100g时，那么德氏乳杆菌乳亚种的质量可以为1g，米曲霉的质量可以为(0.5-1)g。
例如，所述德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合菌株的混合比例可以为1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1等。
在一些实施方式中，所述食品为抗龋齿或者预防龋齿的食品或者调节肠道菌群的食品。
实施例
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。
实施例1菌株的筛选
(1)菌株富集：取5g西藏当雄县(海拔4350m)牧民家自制的奶拉样品粉碎后加入45ml无菌生理盐水分散均匀，取2ml上述分散液加入到20ml灭菌的石蕊牛乳培养基中，置于37℃培养箱静置培养，待培养基酸化凝固并呈现粉红色时取出。
(2)培养单菌落：将石蕊牛乳培养基菌液稀释到10-5倍，吸取100μl涂布于BL固体培养基平板上，置于37℃培养箱培养，待菌落形成。在BL平板上，菌落呈光滑微微凸起，湿润，边缘不光滑，无色到微白色，直径1-3mm，菌落背面为淡黄色。
(3)筛选产酸菌种：将初筛得到的单菌落，在含0.2％CaCO3的BL固体培养基平板上划线培养，37℃培养箱培养36h，结束培养后观察菌落周围有无透明圈产生，选择透明圈直径大为3-3.5cm的单菌落做进一步分离纯化。
(4)革兰氏染色初步鉴定：对步骤(3)的菌株进行革兰氏染色，如果菌体染色呈紫色，则为革兰氏阳性菌，留下来进行后续研究，如果染色呈现红色，该菌株是革兰氏阴性菌直接淘汰。鉴定结果显示：所得菌株为革兰氏阳性菌，不运动，无芽孢，无鞭毛，无荚膜，菌体呈细杆状，呈现单杆或成链，此菌株即为目标菌株，菌株镜检形态特征如图1所示。
(5)分子生物学鉴定16S rDNA：使用高保真酶对待鉴定菌株进行16S rDNA测序及菌种鉴定，采用的引物信息及PCR扩增反应体系和条件如表1和表2所示。
表1.引物信息
表2.PCR扩增反应体系和条件
PCR产物检测合格后送测序公司进行测序，得到16s rRNA序列如SEQ ID NO:3所示，并将测序结果进行NCBI-BLAST比对，鉴定该菌株为德氏乳杆菌，命名为德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LBⅧ(简称DB-8)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2023396。
实施例2DB-8全基因组测序分析
将实施例1所得到的菌株DB-8委托给深圳华大基因股份有限公司进行全基因组测序和比较基因组学分析，结果显示，该菌株含有4个与生物膜形成相关的特有基因，基因ID分别为：DB-8GL000445(SEQ ID NO:4)、DB-8GL001087(SEQ ID NO:5)、DB-8GL001801(SEQID NO:6)、DB-8GL001802(SEQ ID NO:7)。四个相关的基因在KEGG中ID号分别为K20374、K00694、K12990、K12990。这4个特有基因使得该菌株具有高生物膜形成能力，提高了菌株的抗逆性。这4个基因编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8-11所示，将这4个基因编码的氨基酸进行凝胶电泳，其结果如图2所示。
实施例3DB-8生物膜形成能力测定
将在MRS液体培养基活化后的实施例1中所述的DB-8和对照菌株德氏乳杆菌乳亚种CICC 6047(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)分别用NaCl浓度为0％，2％，4％，6％，8％，10％的MRS培养基稀释至OD600＝0.15，然后以每孔200μl的体积加入96孔板中，37℃培养24h以形成生物膜，每组3个重复。生物膜的测定方法为：除去各孔中的液体，孔中用200μL的0.85％生理盐水洗三次，加入200μL的99％甲醇，孵育15min固定细胞，室温风干5min，0.1％的结晶紫染色20min，用200μl生理盐水洗涤三次，去除多余的结晶紫，每孔加入200μL 33％的醋酸20min，释放结合的结晶紫，用酶标仪在OD590nm处测定吸光度，测定结果如图3所示。
从图3可以看出，DB-8生物膜形成远高于对照菌，且在高NaCl浓度下，DB-8有着更高的生物膜形成，说明生物膜的形成提高了DB-8抗逆性。
实施例4DB-8对NaCl、糖和pH耐受能力的测定
(1)DB-8对NaCl耐受能力的测定
将活化后的DB-8分别接种到NaCl质量浓度为2％、4％、6％、8％、10％、12％的MRS液体培养基中，使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪于42℃条件下培养，测定其生长曲线，600nm波长下每30min取样测定吸光度值(OD600 nm值)，以MRS液体培养基作对照，测得的数据用于生长曲线的绘制，各培养基中DB-8的生长曲线如图4A所示。
从图4A可以看出，随着NaCl浓度的增加，DB-8的生长逐渐受到抑制，在10％NaCl浓度下还能生长，在12％浓度下可以略微生长。说明DB-8有较强的耐盐能力。
(2)DB-8对糖耐受能力的测定
将活化后的DB-8分别接种到葡萄糖质量浓度为25％、30％、35％、40％、45％、50％的MRS液体培养基中，使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪于42℃条件下培养，600nm波长下每30min取样测定吸光度值(OD600 nm值)，以MRS液体培养基作对照，测得的数据用于生长曲线的绘制，各培养基中DB-8的生长曲线如图4B所示。
由图4B可以看出，随着葡萄糖浓度的增加，菌株生长逐渐受到抑制，DB-8能在45％的葡萄糖浓度下生长，当葡萄糖浓度为50％时菌株生长受到显著抑制，表明DB-8有较强的耐高糖能力。
(3)DB-8对pH耐受能力的测定
用盐酸调节MRS液体培养基至不同的pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)。将活化后的DB-8分别接种到上述培养基中，使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪于42℃条件下培养，600nm波长下每30min取样测定吸光度值(OD600 nm值)，测得的数据用于生长曲线的绘制，结果如图4C所示。
由图4C可以看出，DB-8能在pH3.0的培养基中生长，表明DB-8有较强的耐酸能力。
实施例5 DB-8对人工消化液的耐性
(1)人工消化液的配制
人工胃液：NaCl 0.20g/100mL，胃蛋白酶0.35g/mL，用1mol/L的HCl调整pH值为2.5后，过滤除菌备用。
人工肠液：将下述A液和B液以2:1混合即为人工肠液。A.胰腺液：重碳酸钠1.1g/100mL，NaCl 0.2g/100mL，胰蛋白酶0.1g/100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。B.胆汁液：胆汁酸盐1.8g/100mL，调整pH值为6.8，过滤除菌备用。
(2)人工消化液耐性测定
挑取DB-8的单菌落在MRS液体培养基中培养过夜后，取培养液1mL分别接种于9mL的人工胃液或人工肠液中，37℃培养2小时，接种于9mL MRS液体培养基的CICC 6047对照菌作为阳性对照，测定其活菌数，并计算存活率，存活率按下述公式计算，其结果如表3所示。
存活率(％)＝(人工消化液中活菌数量/对照中活菌数量)*100％
表3 DB-8经人工胃液和人工肠液处理后存活率
菌株编号 人工胃液存活率％ 人工肠液存活率％
DB-8 94.79％ 93.75％
CICC6047 69.54％ 46.37％
从表3可以看出，DB-8菌在人工胃液以及人工肠液的存活率高，说明具有较高的耐性。
实施例6 RT-PCR测定DB-8生物膜形成基因在胁迫环境下的表达情况
将活化后的DB-8分别接种到含8％NaCl、40％葡萄糖、3.5pH的MRS液体培养基中，以接种到MRS培养基的组作为对照。培养24h后根据制造商的方案，使用MaxTM细菌RNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)进行RNA提取。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TAKARA)进行逆转录合成cDNA。使用PikoReal 96系统(Thermo Fisher Scientific)中的SYBR Green PCRMaster Mix进行RT-PCR。反应混合物含有SYBR Green预混液、引物、cDNA和无RNase水。此外，将20μL的混合物扩增如下：95℃10min作为初始变性，随后进行40个循环，95℃15s作为变性，60℃45秒作为退火和延伸。使用熔解曲线分析方法进行分析以确定反应。使用16SrDNA作为内参基因，2-ΔΔCt计算基因表达量,结果如图5所示,使用的引物如表4所示。
表4.RT-PCR引物信息
引物ID 引物序列
DB-8GL000445_1_F AGAAAAGTGGGGCTACTACGA(SEQ ID NO:12)
DB-8GL000445_1_R GCGTCACTAGCCGCTTGT(SEQ ID NO:13)
DB-8GL001087_1_F GCAGACCCCGCAGAGTTT(SEQ ID NO:14)
DB-8GL001087_1_R CCTGCTCATTGGCCACGA(SEQ ID NO:15)
DB-8GL001801_1_F CGGGTTCGCAAAGCTGGA(SEQ ID NO:16)
DB-8GL001801_1_R GGAATGCGCTATGCTCCG(SEQ ID NO:17)
DB-8GL001802_1_F GTCCGGCGCGTGTGTATT(SEQ ID NO:18)
DB-8GL001802_1_R GCACGTAGGAAGCTCGGA(SEQ ID NO:19)
由图5可知，DB-8的4个特有基因在高盐、高糖、低pH的胁迫下均表达上调(Foldchange＞1)。结合DB-8在高胁迫条件下生物膜形成提高，说明这4个特有基因的表达上调是DB-8生物膜形成提高的原因，且使得DB-8具有抗逆性强的特点。
实施例7 DB-8菌粉的制备
(1)DB-8菌株的活化：取-80℃冷冻甘油管保藏的DB-8菌株于MRS液体培养基中，37℃培养12h，连续转接2次完成菌株活化；
(2)DB-8菌株的扩培：将活化菌种按2％接种至70mlMRS液体培养基，37℃培养12h；
(3)DB-8菌株的培养：将扩培菌种按2％接种至3500mlMRS液体培养基，37℃培养12h；
(4)DB-8菌体分离：将培养液采用5000rpm离心10min，倒掉上清，保留沉淀；
(5)冻干液配备：10g脱脂奶粉，5g麦芽糊精，5g海藻糖，3g甘油，12g菌体沉淀，65g纯水，混匀制备成菌体冻干液，转入冻干瓶，-40℃预冻2h。
(6)DB-8菌粉冻干：采用Labconco真空冷冻干燥机进行冻干，冻干程序如表5所示。
表5
步骤 温度(℃) 时间(h) 真空度(Pa)
1 -10 10 0
2 -8 10 0
3 -6 8 0
4 -3 6 0
5 0 4 0
6 3 4 0
7 6 4 0
实施例8 DB-8发酵酸奶
取新鲜牛乳，加入重量比为6.5％的食用蔗糖，混匀后预热，均质和杀菌；冷却至40-50℃后加入发酵罐中，分别将实施例7中制备的DB-8菌粉以及常规的市售酸奶发酵剂1和2(天猫网购酸奶发酵剂)按50mg/L接种，37℃发酵12h；发酵结束置于4℃冷藏24h后即得酸奶。酸奶的感官评价参照《中国乳制品工业行业规范RHB 103-2004酸牛乳感官质量评鉴细则》，邀请7人对不同菌株发酵的酸奶样品品尝后进行评分，最终结果取平均值。其感官评定结果如表6所示。
表6不同发酵剂发酵酸奶感官得分
DB-8 市售酸奶发酵剂1 市售酸奶发酵剂2
色泽、状态是否洁白细腻 9.71 10.00 9.43
酸甜是否合适 10.00 9.57 8.86
风味有无天然果香 39.29 34.71 34.00
口感是否清爽 39.00 38.71 37.86
综合得分 98 92.99 90.15
如表6实验结果显示：采用本申请提供的DB-8菌株发酵的酸奶综合评分最高，尤其在风味方面本申请所述的DB-8菌株得分远高于对照菌株。
对应用DB-8菌株发酵制作的酸奶进行了7人小组感官评价，反馈其具有天然果香风味，并且具有酸奶清爽可口的特征，采用本申请所述的DB-8菌株发酵的酸奶综合评分最高，尤其在风味方面本申请所述的DB-8菌株得分远高于对照菌株(市售酸奶发酵剂)。
实施例9 DB-8与米曲霉混菌酿造酱油
采用豆粕、面粉、麸皮混合后接种米曲霉和实施例7制备得到DB-8菌粉制曲，称取一定量的豆粕，按照质量比1:1.2加水润湿浸泡两小时，于115℃高压蒸汽灭菌20min，按豆粕、面粉、麸皮比例为7:2.5:0.5(干比)称取面粉和麸皮，米曲霉和DB-8菌粉分别按三种原料总量的0.5％和0.5‰接种(以单米曲霉为对照)，混合均匀后装入制曲框于培养箱中，保持温度为35℃制曲，在第12h和第17h分别进行翻曲，控制水分，在第36h结束制曲。称取120g成曲，加入两倍质量的10％的盐水于玻璃瓶中，摇晃均匀，放入30℃恒温培养箱中发酵培养四个月，发酵结束后，采用国标GB/T18186—2000的方法测定氨基酸态氮和总酸，GB/T5009.7—2008的方法测定还原糖，用重铬酸比色法测定乙醇含量，连续电位滴定法测定总酯含量，其结果如表7所示。
表7.混菌酿造酱油理化指标对比
总酸(g/L) 总酯(g/L) 酒精度(％/ovl) 氨基酸态氮(g/L) 还原糖(g/L)
米曲霉 14.26 64.57 0.09 7.45 16.7
米曲霉+DB-8 20.21 93.66 2.01 7.56 16.4
由表7可知，添加DB-8菌粉后总酸、总酯含量和酒精度明显提高，说明添加DB-8菌粉后有机酸类，醇类、脂类物质明显增加，促进了酱油的风味，使香味更加浓郁。
实施例10 DB-8菌粉发酵梨汁
将购买的新鲜水晶梨经盐水浸泡后清洗，并于无菌条件下进行榨汁，加入冰片糖调节梨汁糖度为35％后分装于无菌锥形瓶中密封，经巴氏灭菌后按照0.5‰的比例将DB-8菌粉接种于梨汁中，以CICC6047菌为对照，30℃条件下发酵144h，发酵结束后按照GB12456-2021使用酸碱指示剂滴定法测定总酸，稀释涂布平板法测定活菌数，pH计测定其pH值，按照GB 5009.7-2016使用直接滴定法测定还原糖，其结果如表8所示。
表8.发酵梨汁各项理化指标
总酸(μmol/L) 活菌数(log(CFU/mL)) pH 还原糖(g/L)
DB-8 23.63 6.37 3.42 21.84
CICC6047 18.74 4.86 3.85 27.46
由表8可知，发酵144h后DB-8菌粉发酵的梨汁，在pH和还原糖上都更低，总酸更高，这些都使的DB-8菌粉发酵的梨汁更加爽口，且在以相同指标作为终点时可以缩短发酵时间。同时DB-8发酵的梨汁有着更高的活菌数，这些都说明DB-8有着优良的发酵特性。
实施例11DB-8与醋酸菌混合发酵食醋
按以下工艺流程酿造食醋：
大米打粉过筛后加入两倍质量的水加热糊化，之后加α-淀粉酶液化，冷却之后加糖化酶糖化，装瓶之后按糖化液的8‰分别加入本领域常用的酿酒酵母菌粉和实施例7制备得到的DB-8菌粉，酒精发酵7天后将发酵液稀释至酒精度4.5，接入发酵液体积2％的醋酸菌菌液，以不加DB-8为对照，发酵7天，发酵结束后按照实施例9测定食醋中的总酸、还原糖方法测定总酸和还原糖，按以下方法测定食醋中的总黄酮、总多酚和DPPH自由基清除率：
总多酚的测定采用福林酚方法测定：准确吸取没食子酸标品溶液(1000mg/mL)0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置于10mL比色管中，加入5mL福林酚试剂混合均匀，静置3min，然后加入15％Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10mL，摇匀静置1h，在波长760nm条件下测定吸光度，以没食子酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取0.5mL离心上清发酵液样品，按标准曲线操作步骤，在波长760nm下测定吸光度。总多酚含量用没食子酸当量GRE/g表示。
总黄酮的测定方法：准确吸取芦丁标准溶液(200μg/mL)0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL分别加入10mL比色管中，加入30％乙醇溶液稀释至5mL，然后加入5％的NaNO2溶液0.3mL，摇匀静止5min后加入10％Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀静止6min，继续添加1mol/L NaOH2mL，然后用30％的乙醇溶液定容到10mL，摇匀，静置15min，在波长510nm下测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取1mL离心上清发酵液，按标准曲线操作步骤，于波长510nm处测定吸光度，空白对照为未添加样品的溶液和水混合体系。总黄酮含量用芦丁当量RE/g表示。
DPPH自由基清除能力的测定方法为：将2.5mL离心上清发酵液与2.5mL0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液混合，避光静置30min，在波长517nm下测定吸光度Ai。以2.5mL乙醇加2.5mLDPPH为对照，2.5mL乙醇加2.5mL样品为空白，分别在517nm下测定吸光度Aj和Ak。
自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Ak)/Aj]×100％
其结果如表9所示。
表9.发酵食醋中各项理化指标测定
pH 还原糖(g/L) 总黄酮(RE/g) 总多酚(GRE/g) DPPH清除率
DB-8 3.13 0.054 15.23 0.34 90.42％
对照 3.78 0.126 7.14 0.22 78.27％
由表9可知，添加DB-8发酵的食醋在pH和还原糖上都更低，说明添加DB-8之后能加快发酵进程。同时添加DB-8发酵的食醋有着更高的总黄酮、总多酚和DPPH清除率，有着更好的抗氧化性，使得食醋有着更高的品质和保健作用。
表10序列表
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述菌株为德氏乳杆菌乳亚种Dangxiong LBⅧ(Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis Dangxiong LBⅧ)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.:M2023396。
2.根据权利要求1所述的德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述菌株的16srRNA序列包含如SEQID NO:3所示的序列或者由如SEQ ID NO:3所示的序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述德氏乳杆菌乳亚种携带有表达生物膜的基因。
4.根据权利要求3所述的德氏乳杆菌乳亚种，其中，所述表达生物膜的基因包含如SEQID NOs:4-7所示的序列或者由如SEQ ID NOs:4-7所示的序列组成。
5.一种菌体制剂，其包含权利要求1-4中任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种。
6.权利要求1-4中任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种或者权利要求5所述的菌体制剂在发酵领域中的应用，优选在食品发酵领域中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述食品为乳制品、酱油制品、梨汁制品或食醋制品，进一步优选地，所述乳制品为酸奶或奶酪。
8.权利要求1-4中任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种或者权利要求5所述的菌体制剂在生物防腐或者在制备抗龋齿产品中的应用。
9.权利要求1-4中任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种或者权利要求5所述的菌体制剂在制备动物饲料或者在制备调节肠道菌群产品中的应用。
10.一种形成德氏乳杆菌乳亚种的生物膜的基因组，其中，所述基因组包括选自SEQ IDNOs:4-7所示的序列中的一种或二种以上基因。
11.根据权利要求10所述的基因组，所述基因组对NaCl、糖和/或酸具有耐受性。
12.一种耐受NaCl、糖或酸的蛋白质，其由如SEQ ID NOs:4-7所示的一种或二种以上编码得到，或者通过权利要求权利要求1-4任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种或者权利要求5所述的菌剂得到。
13.一种食品，其通过权利要求1-4任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种发酵食材得到。
14.根据权利要求13所述的食品，其中，所述食品为乳制品、酱油制品、梨汁制品或食醋制品。
15.根据权利要求14所述的食品，所述酱油制品为通过将豆粕、面粉、麸皮混合后接种权利要求1-4任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合株发酵得到，其中，所述德氏乳杆菌乳亚种与米曲霉混合的混合比例为1：0.5-1；和/或
所述乳制品为通过权利要求1-4任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种发酵生牛乳得到；和/或
所述梨汁制品为通过权利要求1-4任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种发酵梨汁得到；和/或
所述酱油制品为通过权利要求1-4任一项所述的德氏乳杆菌乳亚种与醋酸菌混合发酵食醋得到。
16.根据权利要求13-15任一项所述的食品，所述食品为抗龋齿或者预防龋齿的食品或者调节肠道菌群的食品。
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