CN118813715A - 一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用。本发明所述细胞内纳米囊泡产量大，粒径小，粒径分布范围窄，作为载体负载药物时具有更高的包封率和载药率，在玻璃体腔注药方式下分布的范围和程度更广，例如在玻璃体腔注射形式下负载的药物可更快被吸收，在医药领域中具有非常好的应用和研究价值。特别是，本发明赋予了细胞内纳米囊泡靶向性，通过对Lamp2b的改造使其携带靶向肽，获得具有靶向性的细胞内纳米囊泡。本发明提供的纳米囊泡，产量大，靶向性强，可更高效地发挥治疗作用或药物载体作用，具有非常好的应用前景和研究价值。

Description

一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用，特别是在眼部疾病中的应用。

背景技术

由细胞释放到细胞外或血浆中而进入血液循环、被称为“细胞外囊泡”（extracellular vesicles， EVs）的细胞分泌物已经得到了广泛的关注和研究。“细胞外囊泡”主要分为外泌体（exosome）、微泡（microvesicle）或微颗粒（microparticle）和凋亡小体（apoptotic body）三类，其中主要成分是外泌体。目前，外泌体被广泛用于多种损伤修复及免疫性疾病的治疗。然而，外泌体其细胞靶向性仍需进一步提高，以减少副作用和提升疗效。其次，细胞分泌外泌体的效率有限，收集一定量的外泌体需要投入大量时间。因此，进一步提升其靶向性、生物安全性和产量是未来需要解决的问题。

细胞纳米囊泡的修饰策略包括基因工程和化学修饰。利用基因工程将目的蛋白或多肽的基因序列与选定的外泌体表面蛋白的基因序列融合，可使目的蛋白或引导肽表达于外泌体表面。溶酶体相关膜蛋白2b（Lysosome associated membrane protein 2b,Lamp2b）是Lamp家族成员，是一种可用于携带靶向蛋白或多肽的膜蛋白。

另外，在细胞内还存在大量纳米囊泡，游离在各种富有膜的细胞器之间，介导细胞内物质运输及细胞的分泌途径。其中构成型分泌囊泡是细胞内囊泡（intracellularvesicle，IVs）的主要类型，由内质网产生，与高尔基体、溶酶体和细胞膜等进行物质交换，介导了细胞内各种分泌蛋白的产生、运输及分泌。其内容物丰富，含有大量的分泌型蛋白、脂质和核酸分子。迄今没有关于如何对细胞内纳米囊泡进行富集和应用的报道。除此之外，我们前期结果中发现相较于EVs，这些细胞内纳米囊泡粒径更小，跨膜蛋白Lamp2b含量更多，具有更高的药物递送效率，更适合用于疾病治疗及其药物递送。

自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis）是一类常见致盲性眼病，主要累及葡萄膜和视网膜，可引起白内障、青光眼、黄斑病变和视神经萎缩等多种眼部并发症，导致视力严重下降。CD4阳性辅助性T细胞（T helper cells, Th cells），特别是分泌IFN-γ的Th1和分泌IL-17A的Th17细胞，是自身免疫葡萄膜炎的主要效应T细胞，它们的异常激活在疾病发生中发挥重要致病作用。CD40L属于TNF超家族，被认为是CD4 + T淋巴细胞的早期激活标记。CD40/CD40L参与触发下游多种免疫信号通路，早期研究已证明CD40/CD40L共刺激信号传导是产生T细胞依赖性抗体应答和记忆B细胞分化所必需。巨噬细胞和DC细胞中CD40/CD40L信号激活后，诱导细胞因子分泌和表面活化分子表达，参与调节CD4 + T细胞和CD8 +T细胞交叉刺激和激活。在各种自身免疫性疾病中也存在CD40/CD40L信号通路表达调控失调，其可能促进致病性自身免疫反应的启动或维持。因此，靶向CD40/CD40L通路有望成为自身免疫性疾病新的治疗策略。

病理性视网膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）是几种常见致盲性视网膜疾病的关键病理变化，包括糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP) 等。目前的临床治疗包括玻璃体内注射anti-VEGF药物、视网膜光凝和玻璃体切割，尽管玻璃体内注射anti-VEGF药物可以抑制视网膜和脉络膜NV的进一步形成，但其治疗效果一直存在争议，大约30%的患者对anti-VEGF药物治疗的反应不佳，并且激光和手术治疗效果有限，仍有相当数量的患者丧失视功能。因此，需要寻找更有效、更安全的替代方法。

既往研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）具有促进创伤修复、神经保护等作用，广泛用于视网膜和神经系统疾病的治疗研究。但由于其具有细胞增殖的劣势限制了其临床转化及应用。MSC衍生的囊泡具有干细胞的生物学特性，无核无遗传物质，具有极大的转化应用前景。对囊泡进行改造，使其具备靶向性可以提高囊泡的生物利用率。因此，对细胞内纳米囊泡进行针对性改造，使其具备靶向性，进行自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病研究，并寻找治疗自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病药物具有重要意义。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用，特别是作为具有靶向功能的药物载体的应用。

在本发明第一方面，提供一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡，其过表达靶向分子-Lamp2b的融合蛋白。

具体地，所述的靶向分子包括但不仅限于多肽、抗体、激活或抑制受体、蛋白配体、生物活性酶、核酸药物、或其组合，特别是，所述的靶向分子为多肽。

在本发明的一些实施例中，所述的靶向分子为A25多肽，所述的细胞内纳米囊泡可靶向T细胞。

在本发明的一些实施例中，所述的靶向分子为RGD多肽，所述的细胞内纳米囊泡可靶向新生血管（例如视网膜新生血管）。

具体地，所述的靶向分子位于Lamp2b的N端。

具体地，所述的融合蛋白结构包括：

1）Lamp2b的N端-靶向分子-Lamp2b的C端；

2）靶向分子-Lamp2b的N端。

具体地，所述囊泡呈圆球形或者杯垫状。

具体地，所述囊泡的平均粒径为50-100nm（例如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100nm），特别是65-85nm。

具体地，所述的细胞来源于哺乳动物，特别是人类。

具体地，所述细胞为真核细胞，特别是干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞（293T）、巨噬细胞、T细胞和肿瘤细胞中的至少一种；更具体地，所述干细胞为间充质干细胞（MSC），包括但不限于：脐带间充质干细胞（UC-MSC）、骨髓间充质干细胞（BM-MSC）、脂肪间充质干细胞（AD-MSC）、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。

在本发明的一些实施例中，所述细胞为间充质干细胞，特别是脐带间充质干细胞（UC-MSC）。

在本发明的一些实施例中，所述细胞为上皮细胞，例如293T细胞。

在本发明的一些实施例中，所述细胞为肿瘤细胞，例如Hela细胞。

具体地，所述囊泡由本发明第二方面所述方法制备得到。

在本发明第二方面，提供一种上述囊泡的制备方法。

具体地，所述的方法包括将过表达靶向分子-Lamp2b的融合蛋白的细胞依次进行超声处理、离心处理、超速离心处理的步骤。

具体地，所述方法包括以下步骤：

（1）将编码靶向分子-Lamp2b的融合蛋白的核苷酸引入细胞；

（2）取步骤（1）所得细胞分散在悬浮溶剂中，进行超声处理；

（3）将步骤（2）所得液体进行一次或多次离心处理，弃去细胞膜及细胞器碎片，取上清液；

（4）将步骤（3）所得上清液进行超速离心处理，取沉淀为细胞内纳米囊泡；

任选地，（5）将步骤（4）所得沉淀重悬。

具体地，步骤（1）中所述将编码靶向分子-Lamp2b的融合蛋白的核苷酸引入细胞的方法可以采用转化、转导、转染、感染等方法，可通过载体将该核苷酸引入细胞，所述载体包括质粒载体和病毒载体，所述病毒载体可以为，例如逆转录载体、慢病毒载体或其他载体（例如腺病毒载体、腺相关病毒载体）。

在本发明的一些实施例中，步骤（1）包括：构建过表达靶向分子-Lamp2b的融合蛋白的质粒，然后将所述质粒包装成慢病毒，将所述慢病毒转染细胞。

在本发明的一个实施例中，所述构建过表达质粒的步骤包括：将编码A25肽和Lamp2b的cDNA片段插入载体质粒中CMV启动子的下游。

具体地，步骤（2）中所述细胞为经过培养、消化、洗涤后所得分离的细胞（其经过弃去细胞培养基、消化、洗涤等步骤，可排除分离获得细胞外囊泡的可能性）。

具体地，所述方法还可以细胞消化、计数步骤；在本发明的一些实施例中，所述细胞消化步骤包括：培养细胞生长至90%融合，弃去细胞培养基，洗涤细胞，加入胰酶消化细胞，然后中和并清洗细胞。

具体地，所述细胞在悬浮溶剂中的细胞密度为1-4×10⁶个/mL，例如1×10⁶个/mL、2×10⁶个/mL、3×10⁶个/mL、4×10⁶个/mL。在本发明的一些实施例中，所述细胞密度为1×10⁶个/mL。

具体地，所述悬浮溶剂为任何适于培养细胞的缓冲液，例如PBS、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液。在本发明的一些实施例中，所述溶剂为PBS。

具体地，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-35%（例如20%、25%、30%、35%），例如20%-30%。

具体地，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-25%（例如20%、22%、24%、25%）；在本发明的一些实施例中，所述超声处理的振幅为20%。

具体地，步骤（2）中所述超声处理的时间为10-60s（例如10、15、20、25、30、60s），例如10-30s。

具体地，步骤（2）中所述超声处理的时间为10-20s（例如10、15、18、20s），优选为15s；在本发明的一些实施例中，所述超声处理的时间为15s，on 2s，off 2s。

在本发明的一些实施例中，步骤（3）中所述离心处理的次数为两次，其各自参数分别为：

1000-3000g（例如1000、1500、2000、2500、3000g），5-20分钟（例如5、8、10、12、15、20分钟）；

10000-30000g（例如10000、15000、20000、25000、30000g），20-40分钟（例如20、25、28、30、32、35、40分钟）。

在本发明的一个实施例中，第一次离心在2000g下进行10分钟。

在本发明的一个实施例中，第二次离心在20000g下进行30分钟。

具体地，步骤（4）中所述超速离心处理的参数包括100000-180000g（例如100000、120000、140000、150000、160000、180000），50-100分钟（例如50、60、65、70、75、80、90、100分钟）。

在本发明的一个实施例中，所述超速离心在150000g下进行70分钟。

具体地，步骤（5）中所述重悬溶剂为任何适于培养细胞的缓冲液，例如PBS、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液。在本发明的一些实施例中，所述重悬溶剂为PBS。

具体地，所述超声处理、离心处理、超速离心处理中的一种或多种在低温下操作，例如0-5℃下；特别是，所述超声处理、离心处理、超速离心处理均在冰上进行。

在本发明的一些实施例中，所述方法包括：取1×10⁶个/mL密度的细胞悬液，将超声探头放入液面中央，超声振幅参数范围是20%，时间参数范围是15s，on 2s，off 2s，进行超声处理；然后将该液体转移至离心管进行离心，离心参数是2000g×10min，20000g×30min，收集上清液；将该上清液转移至超速离心管进行离心，离心参数是150000g×70min。

在本发明第三方面，提供第一方面所述的囊泡作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述疾病为眼部疾病，特别是葡萄膜或视网膜相关疾病，包括，但不限于，葡萄膜炎，例如自身免疫性葡萄膜炎；视网膜血管病，例如视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、早产儿视网膜病变等；黄斑疾病，例如中心性浆液性脉络膜视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、黄斑囊样水肿、黄斑裂孔黄斑前膜等；视网膜脱离疾病，例如孔源性视网膜脱离、牵拉性视网膜脱离、渗出性视网膜脱离等；视网膜色素变性；视网膜肿瘤疾病，例如视网膜母细胞瘤等；以及其他眼部疾病，例如青光眼、干眼症、其他眼部炎性疾病（例如睑缘炎、睑缘角膜结膜炎、结膜炎、角膜炎、视神经炎等）、视神经损伤（例如视神经炎、视神经萎缩、视神经乳头水肿、缺血性视神经病变等）、眼部肿瘤，等。

具体地，眼部肿瘤包括任何眼部组织或任何眼部细胞的肿瘤，包括，但不仅限于，脉络膜肿瘤、结膜肿瘤、眼睑肿瘤、浸润性眼内肿瘤、虹膜肿瘤、转移性眼部肿瘤、视神经肿瘤、眼眶肿瘤及视网膜肿瘤。更具体地，包括，但不仅限于，脉络膜肿瘤，如脉络膜血管瘤、脉络膜黑色素瘤、脉络膜转移瘤、脉络膜痣、脉络膜骨瘤、睫状体黑色素瘤和 Ota痣；结膜肿瘤，如结膜卡波西氏肉瘤、眼球表面皮样囊肿、结膜淋巴瘤、非典型性的黑色素瘤和 PAM、染色结膜肿瘤、睑裂黄斑、翼状胬肉、鳞状细胞癌及结膜上皮内瘤；眼睑肿瘤，如基底细胞癌、毛细血管瘤、汗腺囊瘤、睑缘痣、脂溢性角化病、眼睑恶性黑色素瘤、眼睑皮脂腺癌和眼睑鳞状细胞癌；浸润性眼内肿瘤，如慢性淋巴性白血病、眼睑肿瘤，脉络膜及眼内淋巴瘤；浸润性脉络膜病和眼内淋巴瘤；虹膜肿瘤，如前段葡萄膜转移瘤、虹膜囊肿、虹膜黑色素细胞瘤、虹膜黑色素瘤和虹膜珍珠状囊肿；转移性眼部肿瘤，如转移性脉络膜黑色素瘤 ；视神经肿瘤，如影响视神经的脉络膜黑色素瘤、视神经病变的乳头周围转移瘤、视神经黑色素细胞瘤和视神经鞘脑膜瘤；眼眶肿瘤，如泪腺的腺样囊性癌、眼眶的海绵状血管瘤、眼眶的淋巴管瘤、眼眶黏液囊肿、眼眶炎性假瘤、眼眶横纹肌肉瘤、儿童眼周血管瘤及硬化型炎性假瘤；视网膜肿瘤，如视网膜色素上皮(RPE)增生、视网膜色素上皮(RPE)肿瘤、成视网膜细胞瘤、vonHippel血管瘤。

在本发明的一些实施例中，所述囊泡为A25-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡（sIVs-A25），所述疾病为自身免疫性葡萄膜炎。

在本发明的一些实施例中，所述囊泡为RGD-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡（sIVs-RGD），所述疾病为视网膜新生血管疾病，例如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、视网膜血管阻塞、早产儿视网膜病变。

具体地，所述囊泡作为药物载体负载药物活性成分，例如针对上述眼部疾病的药物活性成分；所述药物活性成分包括化学药物（例如雷帕霉素、甲氨蝶呤）、生物药物（例如蛋白质（如PEDF、Lucentis）、多肽（如KV11、PEDF34mer、PEDF P5-3）、寡核苷酸类药物（如siRNA））、天然药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗和光动力治疗药物中的一种或几种。

具体地，所述多肽和蛋白类药物可以为，例如细胞因子(如白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-11)、集落刺激因子(如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF))、干扰素(如α、β、γ干扰素)、生长因子（例如色素上皮衍生因子）、肿瘤坏死因子(如TNF-α和TNF-β)、转化生长因子-β家族或趋化因子家族等)、人血红蛋白、凝血因子、血管内皮生长因子抗体拮抗剂、蛋白类激素(如胰岛素、胰高血糖素、降钙素、下丘脑激素、垂体激素或胃肠激素等)、抗体(如单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体或抗体片断)、酶及辅酶类药物(苯丙氨酸裂解酶、精氨酸酶、精氨酸脱酰酶、胰核糖核酸酶、超氧化物歧化酶、天冬酰胺酶、葡糖脑苷脂酶或透明质酸酶)、其他多肽类药物（例如KV11、PEDF34mer、PEDF P5-3等）。

在本发明的一些实施例中，所述囊泡为sIVs-A25，所述药物活性成分可以为激素、免疫抑制类药物（雷帕霉素，甲氨蝶呤）、siRNA、蛋白（如IL-10）和多肽。

在本发明的一些实施例中，所述囊泡为sIVs-RGD，所述药物活性成分可以为siRNA、蛋白（如PEDF、Lucentis）、多肽（如KV11、PEDF34mer、PEDF P5-3）。

具体地，所述的载药方法可以为基因工程法、化学合成法、病毒载体法、超声法、电穿孔法、共孵育法中的一种或多种方法的组合。

具体地，所述药物可以采用任何合适的给药方式，特别是眼内给药，例如滴眼液给药、眼膏给药、眼球后注射给药、眼球旁注射给药、结膜下注射给药、玻璃体腔注射给药，特别是玻璃体腔注射给药。

具体地，所述药物可以被配制为任何合适的制剂形式，例如，但不限于，霜、泡沫、膏、软膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、注射剂、粉针剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、眼罩或隐形眼镜等，特别是注射剂。

在本发明第四方面，提供一种载药囊泡的制备方法，其包括以本发明第一方面所述的囊泡作为药物载体进行载药。

具体地，所述的载药方法可以为基因工程法、化学合成法、病毒载体法、超声法、电穿孔法、共孵育法中的一种或多种方法的组合，特别是共孵育法。

具体地，所述载药步骤包括：将所述囊泡与药物活性成分混合，温育；

任选地，（通过例如超滤离心）去除游离的药物活性成分。

具体地，所述温育温度为35-40℃（例如35、36、37、38、39、40℃），特别是37℃。

具体地，所述温育的温育时间为1-2小时（例如1、1.2、1.5、2小时），特别是1小时。

在本发明的一些实施例中，超滤膜参数为100kD。

具体地，所述载药囊泡的制备方法还可以包括本发明第一方面所述制备囊泡的方法步骤。

在本发明第五方面，提供一种载药囊泡，其以本发明第一方面所述的囊泡作为药物载体。

具体地，所述载药囊泡中的药物如本发明第三方面所述。

具体地，所述载药囊泡的载药率可以为40%-90%（例如45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%）。

具体地，所述载药囊泡的包封率可以为40%-90%（例如45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%）。

具体地，所述载药囊泡的制备方法可以如本发明第四方面所述。

在本发明第六方面，提供一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用载药的第一方面所述的囊泡（例如本发明第四方面所述的载药囊泡）的步骤。

特别是，所述疾病优选为眼部疾病，如本发明第三方面所述。

具体地，所述受试者为哺乳动物，特别是人类。

具体地，所述囊泡作为药物载体负载药物活性成分，例如针对上述眼部疾病的药物活性成分；所述药物活性成分包括化学药物、生物药物、天然药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗和光动力治疗药物中的一种或几种。

具体地，所述施用可以采用任何合适的给药方式，特别是眼内给药或静脉注射，所述的眼内给药包括滴眼液给药、眼膏给药、眼球后注射给药、眼球旁注射给药、结膜下注射给药、玻璃体腔注射给药，特别是玻璃体腔注射给药。在本发明的一些实施例中，采用静脉注射治疗自身免疫性葡萄膜炎，采用玻璃体腔给药治疗视网膜新生血管疾病。

本发明提供了一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法和应用。发明人通过制备了Lamp2b-RGD过表达修饰的细胞内纳米囊泡sIVs-RGD和A25-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡sIVs-A25，赋予了原本不具有靶向功能的囊泡分别靶向新生血管和T细胞的作用。进一步利用具有靶向功能的sIVs-RGD和sIVs-A25作为载体将药物运输至治疗靶点，用于治疗自身免疫性葡萄膜炎和视网膜新生血管疾病。本发明所述细胞内纳米囊泡产量大，靶向性强，粒径小，粒径分布范围窄，作为载体负载药物时具有更高的包封率和载药率，在玻璃体腔注药方式下分布的范围和程度更广。本发明获得的改造囊泡既可以增强其本身的治疗作用，又可以作为药物载体，具有非常好的应用前景和研究价值。

附图说明

图1所示为细胞内纳米囊泡的生产方法的流程和步骤示意图。其中A示流程图，B示步骤。

图2所示为对细胞内纳米囊泡的分离参数的优化过程。其中，A-B所示分别为在20%的超声振幅，不同作用时间下所得sIVs的蛋白质产量（A）和囊泡产量（B）；在20%的超声振幅下，作用时间超过低于10秒或高于20秒，囊泡产量骤降。C-D所示分别为在15s的超声作用时间，不同超声振幅下所得sIVs的蛋白质产量（C）和囊泡产量（D）；在15s的超声时间下，超声振幅高于25%，囊泡产量骤降。E所示为在15s的超声作用时间，不同超声振幅下所得sIVs的透射电镜图，比例尺：100nm。F所示为在20%的超声振幅，不同作用时间下所得sIVs的透射电镜图，比例尺：100nm。

图3所示为实验简易流程图。

图4所示为A25-Lamp2b过表达修饰的MSCs的构建与鉴定。其中A为A25-Lamp2b过表达质粒。B所示为利用慢病毒按照转染复数MOI值梯度（3、15、30）转染MSCs 48h后绿色荧光蛋白GFP表达情况。比例尺200μm。C所示为qRT-PCR检测慢病毒转染前后MSCs中Lamp2b mRNA表达情况。D所示为WB检测慢病毒转染前后MSCs中Flag标签蛋白和Lamp2b蛋白表达情况。其中，GFP组代表转染空载病毒MSCs，A25组代表转染A25-Lamp2b过表达病毒MSCs，N代表未转病毒MSCs。

图5所示为sEVs/sIVs-GFP/A25的获取与鉴定。A所示为sEVs/sIVs-GFP/A25的透射电镜图。宽视野比例尺：200nm；特写比例尺：200nm。B-C所示为纳米粒度分析结果，其显示sEVs/sIVs-A25的粒径分布及其统计学分析结果。D所示为sEVs/sIVs-A25装载IL-10后的IL-10的含量。E-F所示为WB检测sEVs/sIVs-A25中Flag标签蛋白和Lamp2b蛋白表达情况及其统计学分析结果。（p＜0.05，p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图6所示为体外T细胞模型和实验性自身免疫性葡萄膜炎动物模型中CD40L表达变化。A、B、C所示为流式检测体外刺激Naive CD4+ T细胞12h后CD40L表达差异及其统计学分析结果。其中Control组为未加入刺激的CD4+T细胞，Pma+iono组为加入PMA和Ionomycin刺激的CD4+T细胞，anti-CD3/CD28组为加入抗CD3和抗CD28抗体刺激的CD4+T细胞。D-E所示为流式检测EAU诱导后13天引流淋巴结和脾脏CD40L表达差异及其统计学分析结果。其中，Normal组为未做任何处理的小鼠，EAU组为EAU诱导后的小鼠。F-G所示为WB检测EAU诱导后13天淋巴结和脾脏CD40L表达差异及其统计学分析结果（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001表示各组间显著性差异）。

图7所示为sEVs/sIVs-A25的体外T细胞靶向性验证。A-B所示为流式检测共培养12h后各组T细胞中CFSE荧光强度及其统计学分析结果（p＜0.05，p＜0.001表示各组间显著性差异）。C所示为共聚焦检测共培养12h后各组T细胞中DiD荧光分布情况。其中，绿色Anti-CD4为细胞膜上表达的CD4，蓝色DAPI为细胞核，红色DID为DID标记的sEVs和sIVs。

图8所示为sEVs/sIVs_A25@IL-10对naive CD4+ T细胞的作用。A、C所示为sEVs及sIVs各组对T细胞增殖的抑制作用及其统计学分析；B、D所示为sEVs及sIVs各组对Treg细胞分化的促进作用及其统计学分析。（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001表示各组间显著性差异）。

图9所示为各组EAU小鼠眼底炎症评价。 A所示为EAU模型诱导第17天各治疗组及空白对照组小鼠眼底照相图。B所示为EAU模型诱导第17天各组小鼠OCT图。C所示为EAU模型诱导第21天各治疗组及空白对照组小鼠视网膜HE染色切片图。D、E所示分别为各治疗组及空白对照组小鼠治疗后临床和病理评分。（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001表示各组间显著性差异）。

图10所示为各组EAU小鼠ERG测量结果。A-B所示为b波振幅及其统计学分析。C-D所示为a波振幅及其统计学分析。（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001表示各组间显著性差异）。

图11所示为各组EAU小鼠脾脏、引流淋巴结细胞亚群比例变化。A所示为各治疗组及空白对照组引流淋巴结和脾脏IL-17A+细胞、IFN-γ+细胞流式检测结果（从左到右依次为PBS、IL-10、sEVs_A25@IL-10、sIVs_GFP@IL-10和sIVs_A25@IL-10）。B所示为所示为各治疗组及空白对照组引流淋巴结和脾脏CD25+FOXP3+细胞流式检测结果（从左到右依次为PBS、IL-10、sEVs_A25@IL-10、sIVs_GFP@IL-10和sIVs_A25@IL-10）。C所示为各治疗组及空白对照组流淋巴结中Th1（IFN-γ+）和Th17（IL-17A+）细胞占比统计学分析结果。D所示为各治疗组及空白对照组脾脏中Th1（IFN-γ+）和Th17（IL-17A+）细胞占比统计学分析结果。E所示为各治疗组及空白对照组流淋巴结中Treg（CD25+FOXP3+）细胞占比统计学分析结果。F所示为各治疗组及空白对照组脾脏中Treg（CD25+FOXP3+）细胞占比统计学分析结果。（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001表示各组间显著性差异）。

图12所示为实验简易流程图。

图13所示为western blot实验结果，其显示三种细胞（MSC细胞、293细胞和Hela细胞）的蛋白、sIVs和sEVs中Lamp2b的蛋白表达情况。

图14所示为western blot实验结果，其显示Lmap2b和Flag的蛋白表达情况（A）和Lmap2b表达的统计学分析结果（B），GAPDH为内参，NOR示为转染病毒组，Ctrl示空载慢病毒转染组，10/30/50示慢病毒转染组（其中10/30/50示转染复数MOI）。

图15所示为western blot实验结果，其显示Lmap2b和Flag的蛋白表达情况（A）和统计学分析结果（B、C），GAPDH为内参，NOR示未转染病毒组，Ctrl示空载慢病毒转染组，10/30/50示慢病毒转染组，10/30/50示转染复数MOI（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图16所示为ELISA检测结果，sEVs_RGD@PEDF示sEVs装载PEDF制备的复合制剂，sIVs_RGD@PEDF示sIVs装载PEDF制备的复合制剂（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图17所示为western blot实验结果，其显示RGD结合整合素αV和β3在正常内皮细胞和VEGF诱导的增殖的内皮细胞中的表达情况（A）和统计学分析结果（B和C）（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图18所示为PCR实验结果，其显示RGD结合整合素αV（A）和β3在正常小鼠和OIR小鼠视网膜中的表达情况（B）（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图19所示为western blot实验结果，其显示RGD结合整合素αV和β3在正常小鼠和OIR小鼠视网膜中的表达情况（A）和统计学分析结果（B和C）（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图20所示为内皮细胞摄取囊泡的实验结果，其显示12h的sEVs-GFP、sEVs-RGD、sIVs-GFP和sIVs-RGD在正常内皮细胞以及增殖的内皮细胞模型中的摄取情况（A）和统计学分析结果（B），红色示DID染色的囊泡，蓝色示DAPI染色的细胞核，比例尺：50um（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图21所示为内皮细胞摄取囊泡的实验结果，其显示24h的sEVs-GFP、sEVs-RGD、sIVs-GFP和sIVs-RGD在正常内皮细胞以及增殖的内皮细胞模型中的摄取情况（A）和统计学分析结果（B），红色示DID染色的囊泡，蓝色示DAPI染色的细胞核，比例尺：50um（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图22所示为OIR小鼠视网膜摄取囊泡的实验结果，其显示玻腔注射后8h（A和B）、24h（C和D）和5天（E和F）的sEVs-GFP、sEVs-RGD、sIVs-GFP和sIVs-RGD在正常内皮细胞以及增殖的内皮细胞模型中的摄取情况和统计学分析结果，红色示DID染色的囊泡，蓝色示DAPI染色的细胞核，比例尺：50um（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图23所示为体外CCK实验结果，其显示sIVs_RGD@PEDF在体外对VEGF诱导的新生血管模型细胞增殖的治疗作用（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图24所示为体外Transwell实验结果，其显示sIVs_RGD@PEDF在体外对VEGF诱导的新生血管模型细胞迁移的治疗作用的镜检结果（A）和具体迁移细胞个数统计结果（B），比例尺：100um；（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图25所示为western blot实验结果，其显示炎性因子ICAM-1在HRECs中的表达情况（A）和统计学分析结果（B）（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图26所示为OIR小鼠视网膜铺片染色实验结果，其显示OIR小鼠视网膜的无灌注区面积和新生血管面积的情况（A）、无灌注区面积的统计学分析结果（B）和新生血管面积的统计学分析结果（C），L代表低浓度（0.5mg/ml），M代表中浓度（1mg/ml），H代表高浓度（2mg/ml），（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图27所示为OIR小鼠视网膜铺片染色实验结果，其显示OIR小鼠视网膜的无灌注区面积和新生血管面积的情况（A）、无灌注区面积的统计学分析结果（B）和新生血管面积的统计学分析结果（C）（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

图28所示为各组OIR小鼠的ERG测量结果，其显示b波振幅的整体情况（A）和b波振幅在最高刺激（2.2 cd•s/m²）的统计学分析（B），a波振幅的整体情况（C）和a波振幅在最高刺激（2.2 cd•s/m²）的统计学分析（D）（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001表示各组间显著性差异）。

图29所示为western blot实验结果，其显示GFAP和VEGF在小鼠视网膜中的表达情况（A）、GFAP的统计学分析结果（B）和VEGF的统计学分析结果（C）（p＜0.01、p＜0.001和p＜0.0001表示各组间显著性差异）。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

术语“患者”或“受试者”等等在本文中可交换使用，是指根据本文所述的方法治疗的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。具体地，前述动物包括哺乳动物，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴子、人类，特别是人类。

术语“治疗”是指在疾病发作之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病的一种或多种临床症状。

术语“预防”指在疾病发作之前，通过治疗以避免、最小化或令疾病难于发作或发展。

本发明中A25-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡以“sIVs-A25” 或“sIVs_A25”表示。

本发明中A25-Lamp2b过表达修饰的细胞外囊泡以 “sEVs-A25”或“sEVs_A25”表示。

本发明中RGD-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡以“sIVs-RGD” 或“sIVs_RGD”表示。

本发明中RGD-Lamp2b过表达修饰的细胞外囊泡以“sEVs-RGD”或“sEVs_RGD”表示。

本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：细胞的提取及培养

1、间充质干细胞（MSC）的提取及培养

人脐带由中国北京贝来生物科技有限公司提供，从剖宫产后没有并发症的正常妊娠中获得的脐带立即放入含有青霉素（100U/mL）和链霉素（100mg/mL）的盐水中，然后在4小时内运送到实验室。在去除残余血液和血管后，将获得的脐带切成1-3mm的块，并用0.1%的Ⅱ型胶原酶在37℃下消化1小时。然后通过100目筛网过滤悬浮液以去除未消化的组织。将来自过滤的上清液离心并用PBS洗涤三次。将细胞沉淀重悬于Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F12完全培养基中。培养基含有10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。将细胞接种在T175培养瓶中，并在37℃的5% CO₂培养箱中培养。培养基每3天更换一次。当细胞融合达到80%时，以1:2的继代比例进行传代，并使用P3至P5的细胞进行实验。

2、293T细胞的培养

使用DMEM完全培养基（DMEM，Invitrogen，USA）与5%胎牛血清（FBS），1%青霉素-链霉素（ScienCell，Carlsbad，CA）培养细胞，细胞在37℃和5%二氧化碳下孵育。培养基每2-3天更换一次。细胞在第三代至第六代，70-80%汇合时用于各种实验。

3、Hela细胞的培养

使用DMEM完全培养基（DMEM，Invitrogen，USA）与5%胎牛血清（FBS），1%青霉素-链霉素（ScienCell，Carlsbad，CA）培养细胞，细胞在37℃和5%二氧化碳下孵育。培养基每2-3天更换一次。细胞在第三代至第六代，70-80%融合时用于各种实验。

同时以上细胞培养可参考申请号为202410605857.X的专利申请。

实施例2：细胞来源的纳米囊泡的制备

细胞内纳米囊泡的生产方法流程如图1所示。

1、细胞消化与计数

以MSC细胞为例，细胞生长到90%融合，吸净细胞上清，加入PBS清洗细胞2次，加入胰酶消化细胞，消化后使用PBS中和并清洗细胞3次。随后进行细胞计数，使用PBS将细胞数量调整至1×10⁶个/mL。

2、超声处理细胞

取1×10⁶个/mL密度的细胞悬液2 mL，加至50 mL离心管的底部，将超声探头放入液面中央，超声振幅参数为20%，时间参数为15s，on 2s，off 2s，离心管置于冰上。随后将该液体转移至2mL离心管进行离心。

3、小细胞内纳米囊泡的收集

离心参数是2000g×10min，20000g×30min。随后收集上清转移至超速离心管，离心参数是150000g×70min，以上操作均在冰上进行。获得的沉淀使用PBS重悬，为小细胞内纳米囊泡（small Intracellular Nanovesicles, sIVs）。

4、小细胞外囊泡的收集

FBS是体外培养细胞的必需条件，但是其内含有大量牛来源的细胞外囊泡，也会存在于含FBS的细胞完全培养基中。为了去除牛细胞外囊泡，将FBS在4℃下以110000×g离心过夜（约12小时）。当细胞融合达到60%时，将细胞在含有10%去除外泌体的FBS的完全培养基中培养48小时。然后，收集上清液，并通过在4℃下超速离心分离细胞外囊泡。具体步骤包括300g×10min、2000g×10min、10000g×30min和110000g×70min两次。获得的沉淀使用PBS重悬，为以外泌体为主的小细胞外囊泡（small Extracellular Vesicles, sEVs）。

实施例3：对细胞内纳米囊泡的分离参数的优化

参照实施例2的步骤，对细胞内纳米囊泡的分离参数的优化过程如图2所示。

1、纳米粒度分析仪检测sIVs的产量差异

取PBS重悬的sIVs，用PBS稀释至1ml，使用纳米颗粒跟踪分析软件（NanoparticleTracking Analysis，NTA）NTA 3.3 Dev Build 3.3.104进行检测，设置温度为25℃，激光设置为Blue488，流速设置为50，模式为自动检测，进样三次，分析三次，取峰值平均值为Mode粒径结果。相机模式为sCMOS。激光类型为Blue488，粘滞度为0.9cP。

2、透射电镜观察不同细胞sIVs的形态

取离心后的sIVs，重悬于200μL PBS液中混匀，取10μL的sIVs溶液和4%PFA按体积比1：1混合，滴在干净的塑料薄膜上形成液滴，然后将电镜碳网的正面扣在液滴上，放置20min，10μL磷钨酸负染90s，烤干碳网，使用HitacW-7500透射电子显微镜进行观察。

图2中A和图2中B分别显示在20%的超声振幅下，选择5s、10s、15s、20s、25s、30s和60s的作用时间，按照本实施步骤所得sIVs的蛋白质产量和囊泡产量。结果显示作用时间低于10秒或超过20秒，所得囊泡的数量和蛋白质产量骤降。图2中C和图2中D分别显示在15s的超声作用时间下，选择20%、25%、30%、35%和40%的振幅，按照本实施步骤所得sIVs的蛋白质产量和囊泡产量。结果显示在15s的超声时间下，超声振幅高于25%，囊泡产量骤降。图2中E示在15s的超声时间下，选择20%、25%、30%、35%和40%的超声振幅，按照本实施步骤所得sIVs的透射电镜图。图2中F示在20%的超声振幅下，选择5s、10s、15s、20s、25s、30s和60s的超声时间，按照本实施步骤所得sIVs的透射电镜图。

本优化过程表明，在20%的超声振幅下，作用时间超过低于10秒或20秒，囊泡产量骤降。在15s的超声时间下，超声振幅高于25%，囊泡产量骤降。20%的振幅以及15s的超声时间是最佳的收集细胞内纳米囊泡的参数。

关于细胞囊泡的制备可同步参考申请号为202410605857.X的专利申请。

实施例3：A25-Lamp2b过表达修饰的纳米囊泡sEVs/sIVs_A25@IL-10复合体的制备

构建A25-Lamp2b过表达修饰的纳米囊泡sEVs/sIVs_A25@IL-10复合体的制备复合体并进行体外以及小鼠体内实验的步骤如图3所示。

1、实验仪器和材料

1.1实验试剂

DMEM-F12 培养基（美国 Gibco 公司）；胶原蛋白酶 II（美国 Gibco 公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（美国 Gibco 公司）；胎牛血清（FBS）（美国 Gibco 公司）；胰岛素-转铁蛋白-硒(Insulin-Transferrin-Selenium)（美国 Gibco 公司）；双抗（Penicillin-Streptomycin）（美国 Gibco 公司）；胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）（美国 Gibco 公司）；谷氨酰胺（Glutamine）（美国 Gibco 公司）；聚凝胺（Polybrene）（中国索莱宝公司）；BCA（中国索莱宝公司）；曲拉通 X-100(Triton X-100)（中国索莱宝公司）；逆 转 录 试 剂 盒 （RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）（美国 Thermo 公司）；GAPDH、Lamp2b引物（中国苏州金唯智生物科技有限公司）；Flag-tag、GAPDH、Lamp2b 抗体（美国 Abcam 公司）；75cm2 、175cm2细胞培养瓶（美国 Corning 公司）；-80℃超低温冰箱（美国 ThermoFisher Scientific 公司）；10ml、25ml 移液管（中国天津钧尧公司）。

1.2实验仪器

水浴锅（中国天津欧诺仪器有限公司）；移液枪（德国 Eppendorf 公司）；台式离心机（德国 Eppendorf 公司）；倒置相差显微镜（日本 OLYMPUS 公司）；高压蒸汽消毒器（日本SAKURA 公司）；电子天平（德国赛多利公司）。

2、实验方法：

2.1、A25-Lamp2b过表达修饰的细胞的构建

2.1.1、过表达A25-Lamp2b融合蛋白质粒的构建

将编码A25肽和Lamp2b的cDNA片段（atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcaGAGAGCGAGGAGGAGGACttggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagtacgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcaccattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctg（SEQ IDNO：1））插入载体质粒中CMV启动子的下游，组装成A25-Lamp2b-Flag过表达质粒，质粒结构如图4中A所示。

2.1.2、过表达A25-Lamp2b-Flag融合蛋白慢病毒的分离纯化

将所述2.1.1中过表达质粒交付公司，包装出相应高滴度的A25-Lamp2b-Flag慢病毒。其中，Flag是一种常见的融合标签蛋白，由八个氨基酸组成（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（SEQ ID NO：4）），其融合表达目的蛋白后，可被抗Flag的抗体有效识别，这样就方便通过Western Blot方法对含有Flag的融合蛋白A25-Lamp2b进行检测、鉴定。

2.1.3、慢病毒感染MSCs

当 P2代MSCs或293T细胞长至60%融合，按照MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）加入慢病毒和5μg/ml Polybrene半量换液，感染 8h 后更换新鲜完全培养基，48h后荧光显微镜观察荧光表达情况（图4中B）。

2.1.4、RT-PCR 法检测目的基因Lamp2b表达情况

取 P5代MSCs或293T细胞，未感染慢病毒的正常细胞做对照组。总RNA用Trizol 试剂（Invitrogen，美国）提取。cDNA用逆转录试剂盒（Thermo，美国）按照试剂盒说明书合成。将反转引物、cDNA 和 SYBR Green Master（Roche，瑞士）依次加入到 384 孔板中，进行RT-PCR，用 GAPDH 表达作为内参。相关 mRNA 表达水平通过△△Ct 方法计算（图4中C）。Lamp2b扩增引物根据NCBI基因序列库自行设计：F：TGGCTCCGTTTTCAGCATTG（SEQ ID NO：2）R：TGGTGTCATCATCCAGCGAA（SEQ ID NO：3）。

2.1.5 Western Blot法检测目的蛋白Lamp2b和Flag标签蛋白表达情况

吸取样品20μl，加入蛋白上样缓冲液，95℃金属浴10分钟使之变性；SDS-PAGE胶电泳；转膜；5%脱脂奶粉封闭2小时；一抗4℃孵育过夜；TBST溶液洗膜3次，每次10分钟；二抗室温孵育2小时；TBST溶液洗膜3次，每次10分钟；ECL显色，观察目标条带（图4中D）。

2.2.1、sIVs/sEVs的分离和储存

以MSCs为例，采用完全培养基培养2天后，更换为含有10% exosome-free血清的培养基。细胞密度为70-80%时用胰酶消化细胞，PBS洗涤2次，制备浓度为1x10⁶/ml的细胞悬液。对细胞悬液进行超声处理破碎细胞膜（2ml功率：20%-30%，2s/2s，15s-120s）。收集超声后混悬液，梯度离心2000g 10min后接着20000g 30min去除细胞碎片后使用超速离心（150,000×g for 70min）获得sIVs。根据实施例2及步骤1-4类似的方法获得sEVs。过表达A25-Lamp2b的sIVs/sEVs为靶向改造后的sIVs/sEVs，空载病毒转染的sIVs/sEVs为未改造的sIVs/sEVs，以下简称sIVs-A25、sEVs-A25、sIVs-GFP、sEVs-GFP。

2.3、sIVs_A25@IL-10复合体的制备与鉴定

2.3.1 sIVs_A25@IL-10复合体的制备

取sIVs-A25，按照质量比梯度（1:20、1:10、1:5、1:1）依次加入IL-10药物溶液，混匀后37℃温箱中静置1h，将液体加入100kDa超滤管离心除去游离的药物。先用PBS润湿超滤管后，加入液体14000g离心20min，再加入PBS 300ul进行离心14000g 20min重复2次，然后倒置离心4000g 2min回收，获得sIVs_A25@IL-10，暂时存放在4℃。同时利用类似的方法获得sIVs_GFP@IL-10、sEVs_A25@IL-10、sEVs_GFP@IL-10。其中，sIVs_A25@IL-10和sEVs_A25@IL-10代表装载IL-10的靶向改造后的sIVs和sEVs，sIVs_GFP@IL-10和sEVs_GFP@IL-10代表装载IL-10的未改造的sIVs和sEVs。

2.3.2 sIVs_A25@IL-10复合体的鉴定

2.3.2.1电镜：使用 2%多聚甲醛固定后采用透射电镜鉴定其形态和大小。具体方法：吸取小细胞内纳米囊泡和小细胞外囊泡悬液10μl滴加于铜网上沉淀5-10min；吸取2%的醋酸双氧铀10μl滴加于铜网上染色1-2min，滤纸吸去浮液；常温干燥数分钟。上机，80kv成像，观察形态。

2.3.2.2 Nanosight激光粒度仪：取PBS重悬的小细胞内纳米囊泡和小细胞外囊泡，用PBS稀释至1ml，使用NTA 3.3 Dev Build 3.3.104进行检测，设置温度为25℃，激光设置为Blue488，流速设置为50，模式为自动检测，进样三次，分析三次，取峰值平均值为Mode粒径结果。

2.3.2.3 Western Blot：步骤同2.1.5。

2.3.3 sIVsA25@IL-10复合体的IL-10含量测定

采用ELISA技术对sIVs_A25@IL-10、sEVs_A25@IL-10、sIVs_GFP@IL-10和sEVs_GFP@IL-10内药物载药量进行测定：分别取各组纳米囊泡，加入ELISA试剂盒孔板中，并加入相应的标准品对照组，室温孵育1 h后。加入相应体积的一抗，室温孵育1 h后洗板三次。加入相应体积的二抗，室温孵育1 h后洗板三次。加入相应体积的底物显色，室温孵育20min后，加入相应体积的终止液终止显色。酶标仪562nm激发检测吸光度值。

2.4 统计学分析

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果：

3.1过表达A25-Lamp2b的MSCs的构建与鉴定

由于T细胞的非吞噬性，将药物靶向递送至T细胞仍面临技术挑战。在T细胞靶向研究中，最常选择的修饰受体是T细胞标志物，包括CD3、CD4、CD7和CD8。然而这种针对所有T细胞亚群的靶向治疗可能会导致剂量限制性毒性，因此，应尽量选择特定细胞亚群的标记物或疾病状态下过度表达的标记物。CD40配体（CD40L, CD154）是一种39KD的II型跨膜蛋白，属于TNF超家族，被认为是CD4 + T淋巴细胞的早期激活标记。CD40/CD40L参与触发下游多种免疫信号通路，早期研究已证明CD40/CD40L共刺激信号传导是产生T细胞依赖性抗体应答和记忆B细胞分化所必需。巨噬细胞和DC细胞中CD40/CD40L信号激活后，诱导细胞因子分泌和表面活化分子表达，参与调节CD4 + T细胞和CD8 + T细胞交叉刺激和激活。组织炎症时，上皮或内皮细胞中CD40/CD40L活化诱导细胞因子和趋化因子分泌，可能触发额外的白细胞浸润。在各种自身免疫性疾病中也存在CD40/CD40L信号通路表达调控失调。例如，CD40L在系统性红斑狼疮（SLE）患者的各种细胞亚群，包括B细胞、T细胞和单核细胞，以及银屑病关节炎（PsA）和类风湿性关节炎（RA）患者的循环T细胞中表达明显升高。另外，RA患者T细胞中CD40L过度表达与其不良预后相关。此外，有研究发现可溶性的CD40L也在几种自身免疫性疾病中增加。以上结果说明CD40/CD40L信号通路失调可能促进致病性自身免疫反应的启动或维持。

因此，靶向CD40/CD40L通路有望成为自身免疫性疾病新的治疗策略。目前，抗CD40L治疗已经在SLE、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）和EAU小鼠模型中显示有效。抗CD40L治疗也开展了临床实验，早期结果表明虽然药物具有临床疗效，但均因出现血栓栓塞而终止。血栓形成可能与CD40L 单抗 Fc结构域与人类血小板表面FcγRIIa（CD32a）结合有关，因此，目前正在进行的临床实验均采用不含Fc段的抗CD40L单抗或特异性配体。有研究设计了CD40L特异性肽配体-A25，修饰负载甲氨蝶呤的脂质体，用于治疗EAE，显著降低了EAE小鼠的CD40L+T细胞比例，有效抑制疾病进展。因此，采用A25作为CD40L特异性肽配体，可有效靶向CD40L+T细胞，从而增强药物疗效。

A25-Lamp2b 慢病毒及空载慢病毒(如图4中A所示)均购自和元生物。通过采用不同的MOI转染复数值( 3、15、30)来感染MSCs，48小时之后荧光显微镜可检测到绿色荧光蛋白GFP的表达（图 4中B）。qPCR结果显示，与未转病毒组和空载病毒转染组相比，A25-Lamp2b病毒转染组MSCs中目的基因Lamp2b的表达增加，差异具有统计学意义（图 4中C）。另外，Western blot 结果发现，过表达A25-Lamp2b病毒转染组MSCs中Lamp2b和Flag标签蛋白的表达显著优于空载病毒转染组MSCs，差异具有统计学意义(图 4中D)。

3.2 sIVs_A25@IL-10的制备与鉴定

透射电镜结果显示利用超速离心技术获取的sIVs和sEVs体现出相对均匀的大小，其呈现为直径范围处在70-150nm之间的圆球形或者杯垫状（图5中A）。通过Nanosight技术，对提取出的sEVs的直径进行了分析。统计数据表明sEVs-GFP、sEVs-A25、sIVs-GFP、sIVs-A25的平均直径分别约为154.8±1.3 nm、154.0±1.3 nm、128.7.3±0.8、119.1±2.2 nm；并且 D50值依序为146.9 nm、146.1 nm、113.2 nm、100.7nm；D90值依序为215.4 nm、209.4nm、194.2 nm、175.2nm（图5中B-C）。ELISA结果显示，与sEVs组相比，sIVs组内IL-10蛋白浓度更高（图5中D），说明sIVs载药能力优于sEVs。WB结果显示在正常和过表达状态下，sIVs中的Lamp2b表达水平均高于sEVs；在过表达状态下，sIVs-A25中的Flag标签蛋白表达水平高于sEVs-A25（图5中E-F）。

4、小结

应用过表达A25-Lamp2b慢病毒来成功转染MSCs并获得靶向改造的sIVs和sEVs。sIVs-N中的Lamp2b表达水平高于sEVs-N，说明sIVs更适合进行靶向改造；sIVs-A25中的Lamp2b和Flag标签蛋白表达水平均高于sEVs-A25。此外，sIVs载药效果优于sEVs，说明sIVs作为药物载体的性能优于sEVs。

实施例4：体外T细胞模型和实验性自身免疫性葡萄膜炎动物模型中CD40L表达变化

1、实验动物

使用集萃药康公司提供的七周大的雌性C57BL/6J小鼠构建EAU动物模型，所有实验小鼠在使用前已经排除了眼部和全身的病变。小鼠在天津医科大学眼科医院的研究所动物房（SPF 级）中饲养，其环境条件设定为：稳定的温度（23±2）℃，湿度（55%±10%），以及昼夜各 12 小时的光照。提前对各组别小鼠进行编号，根据生成的随机数字表进行分组。实验过程中，我们严格按照天津医科大学动物保护和使用委员会的标准步骤进行。

2、实验方法

2.1、体外T细胞模型中CD40L表达差异

2.1.1小鼠Naïve CD4+ T细胞分离

取小鼠脾脏和引流淋巴结，置于铜网上，用注射器芯研磨。裂解红细胞后，离心得到单细胞，重悬所得细胞于15ml离心管中：冷MACS缓冲液 90μL/10⁷个细胞，抗CD4磁珠10μL/10⁷个细胞。在15ml离心管中孵育15-30min。将冷MACS缓冲液加入15ml离心管至15ml，离心后使用5ml冷MACS缓冲液重悬细胞。将细胞缓慢加入置于磁力架上的使用MACS缓冲液冲洗过的磁柱，并使用5ml MACS缓冲液冲洗3次。从磁力架上取下磁柱，置于15ml离心管上，向磁柱内加入5ml MACS缓冲液，然后用针栓将磁柱内所有液体快速推入离心管中所得即Naïve CD4+ T细胞，用于进行体外激活、增殖和分化等试验。

2.1.2 体外T细胞活化刺激模型

在自身免疫性葡萄膜炎发病过程中，Naïve T细胞在体内遇到视网膜抗原后被激活为抗原特异性T细胞（Th1和/或Th17细胞），发生分化和增殖，通过引流淋巴结和/或脾脏进入眼内，识别眼内抗原，被再度活化，通过分泌的粘附分子、趋化因子等进一步募集T细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞等聚集于眼内，放大炎症反应，导致眼内实质细胞损害。激活后T细胞的CD40L的表达上调是本实施例靶向设计的基础。

抗CD3&CD28和PMA&Ionomycin均为常用的体外T细胞活化的刺激因子。研究表明，诱导T细胞的活化与增殖需要两种信号：一种是TCR/CD3与抗原提呈细胞（APCs）表面特异的MHCⅡ抗原肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号；另一种是非特异性协同刺激信号，由APCs表面的协同刺激分子和T细胞的相应受体相互作用后产生，其中CD28/B7是最为重要的协同刺激分子，能增加IL-2的产生，加速T细胞增殖，阻止细胞进入无反应状态或死亡。在体外联合使用CD3、CD28的抗体刺激T细胞，模拟T细胞活化的双信号作用，是目前进行T细胞激活与扩增应用最广泛的方法。另外，在细胞内，Protein kinase C (PKC)的激活可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致多种蛋白的表达，进而引起细胞的活化。PKC可以在DAG(二脂酰甘油)和Calcium（Ca2+）的共同作用下而激活。PMA（豆蔻酰佛波醇乙酯）是一种DAG的模拟物，而Ionomycin是Ca2+的转运剂，可将细胞器内的Ca2+转运到胞浆，所以PMA和Ionomycin的共同作用可以激活PKC，从而引起一系列的下游反应。

因此，在上述分选的Naïve CD4+T细胞培养体系中加入6ng/ml PMA和1ug/ml ION或者10μg/ml anti-CD3和5μg/ml anti-CD28刺激6-12h。分别收集细胞，PBS清洗2遍后用相应抗CD40L抗体染色后流式上机检测CD40L+T细胞的比例变化。

2.2 实验性自身免疫性葡萄膜炎动物模型中CD40L表达变化

2.2.1 实验性自身免疫性葡萄膜炎动物模型（EAU）诱导

EAU是T细胞介导的自身免疫性疾病动物模型，CD4+ T细胞是EAU发病后CD40L表达上调的主要免疫细胞类型。选用雌性C57BL/6小鼠，周龄6-8周。将抗原多肽IRBP _651-670与完全弗氏佐剂按1：1的比例加入接有三通管的两个注射器，每只小鼠终体积为200μL，每只小鼠抗原使用量为300 μg，冰上充分混合后，在每只小鼠侧腹部和尾根部分6个点皮下注射200 μL乳化液。皮下注射乳化液前30 min，给予腹腔注射PTX，每只小鼠1μg。

2.2.2 CD40L表达变化检测

流式：取第13天EAU小鼠和同周龄Naïve小鼠脾脏和淋巴结组织制备单细胞悬液，用相应抗CD40L抗体染色后流式上机检测CD40L+T细胞的比例变化。

Western Blot：取第13天EAU小鼠和同周龄Naïve小鼠脾脏和淋巴结组织进行蛋白提取，再加入蛋白上样缓冲液，95℃金属浴变性后进行Western Blot检测。Western Blot实验步骤同前。

2.3统计学分析

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计。

3、实验结果

3.1 CD40L在体外T细胞活化刺激模型中表达上调

如图6中A-C所示，体外刺激后，CD4+T细胞中CD40L+细胞比例较未刺激组明显增加。

3.2 CD40L在EAU小鼠模型脾脏和淋巴结中表达上调

如图6中D-E流式结果显示，EAU诱导后小鼠脾脏和引流淋巴结CD4+T细胞中CD40L+细胞比例较未造模组明显增加；如图6中F-G的Western Blot结果显示EAU诱导后小鼠脾脏中CD40L蛋白表达较未造模组上调。

4、小结

结果说明T细胞活化后CD40L表达明显上调。因此，靶向CD40/CD40L通路有望成为自身免疫性疾病新的治疗策略。

实施例5：sIVs-A25和sEVs-A25靶向T细胞功能评价

1、实验仪器和材料

1.1实验试剂

CFSE（美国 Invitrogen 公司）；RPMI 1640 培养基（美国 Gibco 公司）；谷氨酰胺（Glutamine）（美国 Gibco 公司）；FBS 胎牛血清（美国 Gibco 公司）；磁珠阳选小鼠 NavieCD4 试剂盒（美国 ebioscience 公司）；磁珠阳选小鼠 Total CD4 试剂盒（美国ebioscience 公司）；IL-10 蛋白（美国 MCE 公司）；BSA（中国碧云天公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（美国 Gibco 公司）；DID（中国碧云天公司）；DAPI（美国 Sigma 公司）；抗荧光淬灭封片剂（中国索莱宝公司）；粘附载玻片（中国世泰公司）；聚凝胺（Polybrene）（美国 Gibco 公司）；CD3 抗体（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；CD28 抗体（美国 Thermo FisherScientific公司）；15ml/50ml 离心管（美国 Corning 公司）；48 孔板、96 孔板（美国Corning 公司）；LS- column（德国 Miltenyi 公司）；1ml、50ml 注射器（中国赣发公司）；1.5mlEP 管（美国 Axygen 公司）；细胞计数板（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；0.45μm、0.22μm 过滤器（美国 Sigma 公司）。

1.2实验仪器

水浴锅（中国天津欧诺仪器有限公司）；移液枪（德国 Eppendorf 公司）；台式离心机（德国 Eppendorf 公司）；共聚焦显微镜（美国 Ceiss 公司）；倒置相差显微镜（日本OLYMPUS 公司）；高压蒸汽消毒器（日本 SAKURA 公司）；电子天平（德国赛多利公司）；流式细胞仪（美国 BD 公司）。

2、实验方法

2.1 sIVs-A25体外靶向性验证

2.1.1 CFSE标记sIVs和sEVs

使用PBS稀释 sIVs和sEVs重悬液至400ul, 加入CFSE于和sEVs稀释液中，使得CFSE终浓度为5μM。室温下共孵育10min，多余染料用大体积PBS中和，11000g离心70min洗一遍，适量PBS重悬，0.22μm滤器过滤。所述的sIVs和sEVs来自于实施例3中2.2.1获得的sIVs和sEVs。

2.1.2 DID标记sIVs和sEVs

使用PBS稀释 sIVs重悬液至400ul, 加入 DID于sIVs稀释液中，使得DID终浓度为5ug/ml。37℃避光孵育 30min以上，将DID悬液加入100kd超滤管，离心14000g 15min。向超滤管内加入400ul PBS重悬沉淀，离心14000g 15min。加入50ul PBS重悬沉淀，倒置超滤管，换新收集管，离心1000g 2min。转入新的1.5ml EP管，离心14000g 3min，取上清。

2.1.3 T细胞共培养

磁珠阴选试剂盒分离Naïve CD4+T细胞，2x10⁵/孔铺板于预孵育CD3抗体的96孔板中，细胞培养箱培养24h后，加入20μg/ml的各组纳米囊泡继续培养，分别孵育1h、6h、12h、24h后，收集细胞进行流式和共聚焦检测。

3、实验结果

3.1 sIVs较sEVs更易被T细胞内化

如图7所示，当sEVs-GFP、sEVs-A25、sIVs-GFP、sIVs-A25与CD4+T细胞共孵育后，流式和共聚焦结果显示T细胞摄取A25修饰后的sEVs和sIVs的比例均高于其对应的未修饰组，并且sIVs-A25的T细胞摄取比例明显高于sEVs-A25。

4、小结

上述实验结果说明sIVs较sEVs更易被T细胞内化；并且A25修饰的明显增加了sIVs和sEVs被T细胞摄取的数量，相较于sEVs，对sIVs的改造更显著的提高了T细胞的靶向性。

实施例6：sIVs_A25@IL-10对体外CD4+T细胞增殖抑制作用和体外Treg细胞分化促进作用

1、实验仪器和材料

1.1实验试剂

CFSE（美国 Invitrogen 公司）；RPMI 1640 培养基（美国 Gibco 公司）；谷氨酰胺（Glutamine）（美国 Gibco 公司）；FBS 胎牛血清（美国 Gibco 公司）；磁珠阳选小鼠 NavieCD4 试剂盒（美国 ebioscience 公司）；磁珠阳选小鼠 Total CD4 试剂盒（美国ebioscience 公司）；IL-10 蛋白（美国 MCE 公司）；BSA（中国碧云天公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（美国 Gibco 公司）；CD3 抗体（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；CD28 抗体（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；15ml/50ml 离心管（美国 Corning 公司）；48 孔板、96 孔板（美国 Corning 公司）；LS- column（德国 Miltenyi 公司）；1ml、50ml 注射器（中国赣发公司）；1.5mlEP 管（美国 Axygen 公司）；细胞计数板（美国 Thermo FisherScientific 公司）；0.45μm、0.22μm 过滤器（美国 Sigma 公司）。

1.2实验仪器

水浴锅（中国天津欧诺仪器有限公司）；台式离心机（德国 Eppendorf 公司）；倒置相差显微镜（日本 OLYMPUS 公司）；高压蒸汽消毒器（日本 SAKURA 公司）；电子天平（德国赛多利公司）；流式细胞仪（美国 BD 公司）。

2、实验方法

2.1 T细胞体外增殖实验（CFSE法）

96孔板预处理（铺板）：稀释CD3抗体于PBS中，浓度为10μg/ml，96孔板每孔加入100μl，96孔板外圈孔加入100μl PBS防止过量蒸发，4℃过夜或置于细胞孵箱中37℃孵育2h，吸出抗体，PBS洗孔两遍后备用。

磁珠分选小鼠脾脏Naïve CD4+T细胞。调整Naïve CD4+T细胞至5ml置于离心管中，加入1μl CFSE储存液（5mmol/L），迅速混匀，室温避光孵育10min，加入同体积含10% FBS的RPMI1640培养基终止染色，离心后完全培养基（配置：90%1640基础培养基+10%FBS+2μg/mlCD28抗体+100U/ml双抗+50μMβ-巯基乙醇）重悬，以3x10⁵/孔细胞铺板于预处理的96孔板中，设置空白对照组及各纳米囊泡处理组，每组三个副孔。培养72h后，收集细胞加入CD4抗体染色，流式上机检测CFSE荧光表达情况。

2.2 Treg体外分化实验

2.2.1 Treg体外分化

Naive CD4+T细胞的分离按照磁珠阴性分选试剂盒说明书进行。分离完成后，取2x10⁵/孔细胞铺板于预孵育CD3抗体的96孔板中，按照以下分化条件细胞孵箱中培养：X-VIVO 15培养基+2μg/ml CD28抗体+5ng/ml TGF-β+20ng/ml IL-2，培养5d。设置空白对照组及各纳米囊泡处理组，每组三个副孔。5天后进行流式细胞检测。

2.2.2 流式细胞术检测Treg细胞比例

取待测的细胞放入流式管中，加入PBS后400g 离心5min，100μl PBS 重悬，加入CD4-BV711抗体1μl染色，避光孵育30min，加入 PBS 后400g离心5min，依次加入固定液/破膜液进行固定和破膜处理，加入 1μl FOXP3-PE 抗体染色，避光孵育 30min，400g 离心5min，500μl PBS 重悬，流式细胞仪上机检测 FOXP3+CD4+细胞比例。

实验中用到的sEVs_A25@IL-10、sIVs_GFP@IL-10、和sIVs_A25@IL-10参照实施例3获得。

2.3统计学分析

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1 体外T细胞增殖实验

当使用浓度为10μg/ml的sEVs_A25@IL-10、sIVs_GFP@IL-10、和sIVs_A25@IL-10时，结果它们能够在一定程度上抑制CD3/CD28抗体刺激下T细胞的增殖（图8中A、C）。其中sIVs_GFP@IL-10组对于T细胞体外增殖的抑制程度要明显优于sIVs_GFP@IL-10组和sEVs_A25@IL-10组，差异具有统计学意义。说明对sIVs的靶向改造增加了装载药物IL-10的靶向递送效率，提高了IL-10对CD3/CD28抗体刺激的T细胞增殖的抑制作用。

3.2 Treg细胞分化实验

Treg细胞是体内主要的抑制性细胞群，在移植物耐受、抑制自身免疫反应和维持机体免疫平衡等方面发挥重要作用。在自身免疫性疾病中，Treg细胞可抑制致病性T细胞，促进疾病消退，其功能和调节异常可以导致自身免疫性疾病。

图8中B、D结果显示sIVs_GFP@IL-10组对Treg分化无明显促进作用，但是sIVs_A25@IL-10组、sEVs_A25@IL-10组在T细胞向Treg细胞分化过程中表现出明显的促进效果，且这一差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明对sIVs的靶向改造增加了装载药物IL-10的靶向递送效率，提高了IL-10对TGF-β诱导的Treg细胞分化的促进作用。

4、小结

通过在sIVs和sEVs中包载IL-10旨在增强MSCs来源的sIVs和sEVs对T细胞体外增殖的抑制能力，并促进 Treg 细胞在体外的发育，从而达成更为显著的免疫抑制效果。上述实验结果表明sIVs_A25@IL-10不仅能够有效地抑制由CD3/CD28抗体刺激引发的体外增殖，而且还能够促进Naïve CD4+T细胞向Treg细胞分化。另外，靶向改造后sIVs比未改造的效果明显，并且经过靶向改造后的sIVs与sEVs表现出相当的免疫抑制效力。

实施例7：sIVs_A25 @IL-10对实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

1、实验对象

1.1实验动物

使用集萃药康公司提供的七周大的雌性C57BL/6小鼠构建 EAU 动物模型，所有实验小鼠在使用前已经排除了眼部和全身的病变。小鼠在天津医科大学眼科医院的研究所动物房（SPF 级）中饲养，其环境条件设定为：稳定的温度（23±2）℃，湿度（55%±10%），以及昼夜各12小时的光照。提前对各组别小鼠进行编号，根据生成的随机数字表进行分组。实验过程中，我们严格按照天津医科大学动物保护和使用委员会的标准步骤进行。

2、实验方法

2.1 EAU诱导

选用雌性C57BL/6小鼠，周龄6-8周。将抗原多肽IRBP _651-670与完全弗氏佐剂按1：1的比例加入接有三通管的两个注射器，每只小鼠终体积为200μL，每只小鼠抗原使用量为300 μg，冰上充分混合后，在每只小鼠侧腹部和尾根部分6个点皮下注射200 μL乳化液。皮下注射乳化液前30 min，给予腹腔注射PTX，每只小鼠1μg。

2.2 sIVs_A25@IL-10体内疗效验证

2.2.1 EAU 模型鼠的治疗及分组

在造模完成后的第11天，将EAU模型小鼠随机分组，确保每组包含 6 只小鼠，对各组小鼠进行了尾静脉注射，分别注射了1ug IL-10、30ug sIVs_A25@IL-10、30ug sIVs_GFP@IL-10和30ug sEVs_A25@IL-10。同样地，在空白对照组中，小鼠注射了等体积的磷酸盐缓冲液（PBS），以确保实验条件的一致性。实验中用到的sEVs_A25@IL-10、sIVs_GFP@IL-10、和sIVs_A25@IL-10参照实施例3获得。

2.2.2 实验性自身免疫性葡萄膜炎的临床/病理炎症评分

于模型诱导后第9天开始，每隔2天用间接眼底镜观察各组小鼠疾病发病严重程度。在发病的不同时期摘取小鼠眼球，固定并制备石蜡切片，进行常规HE染色。在光学显微镜下记录小鼠视网膜组织结构损伤程度。参照Caspi分级记录眼底临床和组织病理学评分。

2.2.3 小鼠OCT和眼底像检查

于模型诱导后第10天开始，每隔4天用德国海德堡SPECTRALIS-OCT观察小鼠眼底结构改变情况。使用托吡卡胺以及肾上腺素滴眼液对小鼠双眼进行散瞳，然后使用阿佛丁对小鼠进行腹腔注射麻醉，待小鼠进入麻醉平稳期后，在小鼠眼部涂抹玻璃酸钠凝胶，进行视网膜扫描。扫描图像以小鼠视盘为中心，水平和垂直切面各拍一张。

2.2.4 视网膜电图（ERG）

各组EAU小鼠造模后25天于暗房中进行12小时以上的暗适应。采用检测暗适应下各组小鼠视网膜的电生理反应，小鼠暗适应12小时，腹腔麻醉后充分散瞳，麻醉眼表后将小鼠置于37℃恒温操作台，将红色电极针插入小鼠颈部皮，并且下针头朝向头部，将绿色电极针插入小鼠尾部，使用胶带将电极固定。加替沙星眼用凝胶涂于角膜保持角膜湿润，并预防仪器划损角膜导致感染，调整角度将角膜对准角膜电极，根据国际临床视觉电生理协会（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV）标准化方案，由低至高给予小鼠刺激并记录视网膜电图。刺激强度范围为-1.7至 3.1 log（cd•s/m2）根据低（-1.7~0.4）、中（0.7~2.2）、高刺激强度（2.5~3.1）予以刺激，分别重复 7、5、3 次并记录单闪光平均值，刺激间隔分别为 15、30、60 秒。

2.2.5 引流淋巴结和脾脏组织细胞分离及流式细胞术测定T细胞亚群

EAU小鼠模型诱导后第17天，取各组EAU小鼠引流淋巴结和脾脏组织，研磨处理后分离得到单细胞悬液。将单细胞悬液分成两部分。

一部分进行胞内染色。在PMA，ION和BFA的共刺激下，于CO2孵箱培养6 h。收集细胞，用PBS漂洗干净。分别加入Live/Dead抗体和CD4抗体进行染色，4℃避光孵育30 min。漂洗后加入固定剂室温固定30min。离心后加入透膜剂漂洗两遍，然后在样本中分别加入透膜剂与IFN-γ、IL-4、IL-17A抗体进行胞内染色，4℃避光孵育30 min。染色结束彻底漂洗透膜剂，PBS重选后BD FacsCelesta上机，检测 Th1、Th2和Th17细胞亚群变化情况。

另一部分未刺激细胞进行FOXP3+CD25+ CD4+T 细胞核染色。细胞样本中分别加入Live/Dead抗体和CD4+抗体进行染色，4℃避光孵育30 min。漂洗后加入透核膜固定剂，室温固定30min。离心后加入透核膜剂漂洗两遍，然后在样本中分别加入透膜剂与FOXP3+CD25+抗体进行细胞核内染色。4℃避光孵育30 min。染色结束彻底漂洗透膜剂，PBS重选后BDFacsCelesta上机，检测Treg细胞亚群变化情况。

2.4 统计学分析

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1 sIVs_A25@IL-10与sEVs_A25@IL-10相似，均能明显缓解EAU小鼠眼底炎症

结果显示，三组治疗组的眼底炎症评分和病理评分相较于对照组均降低（P＜0.05）（图9）。其中，sEVs_A25@IL-10与sIVs_A25@IL-10治疗组的治疗效果相当，眼底炎症情况明显改善、视盘水肿减轻、血管白鞘消失、玻璃体炎症细胞减少；HE切片显示视网膜结构恢复平坦，视网膜各层结构，均优于sIVs_GFP@IL-10治疗组，差异具有统计学意义。OCT结果与之一致。

3.2 sIVs_A25@IL-10对EAU小鼠神经保护作用更强

如图10结果显示，未经改造的sIVs_GFP@IL-10组较于PBS和IL-10组在高刺激下的均可以显著提高a 波、b 波振幅。经过改造的sIVs 相较于改造的sEVs可以显著提高a 波、b波振幅。这说明改造后的sIVs具有更好的神经保护作用。

3.3 sIVs_A25@IL-10与sEVs_A25@IL-10相似，能提高引流淋巴结中Treg细胞的比例并且均能降低引流淋巴结和脾脏中的Th1细胞比例

如图11结果显示，经过改造的sIVs_A25@IL-10和sEVs_A25@IL-10治疗组小鼠引流淋巴结中Treg（CD4+CD25+FOXP3+）细胞比例较PBS、IL-10和sIVs_GFP@IL-10组明显提高；并且经过改造的sIVs_A25@IL-10和sEVs_A25@IL-10治疗组小鼠引流淋巴结和脾脏中Th1（CD4+IFN-γ+）细胞比例较PBS、IL-10和sIVs_GFP@IL-10组明显降低，说明改造后的sIVs提高了IL-10的组织靶向递送效率，提高了IL-10对EAU小鼠引流淋巴结中Treg细胞分化的促进作用，同时增强了IL-10对EAU小鼠引流淋巴结和脾脏中Th1细胞增殖的抑制作用。

4、小结

EAU小鼠经尾静脉注射sIVs_A25@IL-10后，其发病严重程度有了明显改善，HE染色切片也表现出视网膜结构恢复正常、炎症细胞浸润减轻的现象。证明尾静脉注射sIVs_A25@IL-10可有效抑制 EAU小鼠炎症的进展。观察ERG电生理结果表明 sIVs_A25@IL-10具有明显的视网膜神经保护功能。流式结果提示sIVs_A25@IL-10可能通过促进EAU小鼠引流淋巴结和脾脏中Treg细胞分化进而达到抑制 EAU小鼠炎症的进展的作用。

实施例8：细胞的sIVs的Lamp2b表达量比sEVs高

1、实验方法

具体实验流程如图12所示。

1.1 细胞培养

细胞的提取及培养同实施例1。

1.2 sIVs的提取

细胞生长到90%融合，吸净细胞上清，加入PBS清洗细胞2次，加入胰酶消化细胞，消化后使用PBS中和并清洗细胞3次。随后进行细胞计数，使用PBS将细胞数量调整至1×10⁶个/mL。取1×10⁶个/mL密度的细胞悬液2 mL，加至50 mL离心管的底部，将超声探头放入液面中央，超声振幅参数为20%，时间参数为15s，on 2s，off 2s，离心管置于冰上。随后将该液体转移至2mL离心管进行离心。

使用50ml注射器和0.45μm 滤头对上清进行过滤（先用PBS润湿滤膜），利用差速离心法来提取和分离 IVs，转速RCF 150000，时间70min，温度4℃，每管用干净60ul PBS 重悬沉淀，收集在EP管内，用BCA法进行蛋白定量，进而进行蛋白变性进行western blot实验。

1.3 sEVs的收集

FBS是体外培养细胞的必需条件，但是其内含有大量牛来源的细胞外囊泡，也会存在于含FBS的细胞完全培养基中。为了去除牛细胞外囊泡，将FBS在4℃下以110000×g离心过夜（约12小时）。当细胞融合达到60%时，将细胞在含有10%去除外泌体的FBS的完全培养基中培养48小时。然后，收集上清液，并通过在4℃下超速离心分离细胞外囊泡。具体步骤包括300g×10min、2000g×10min、10000g×30min和110000g×70min两次。获得的沉淀使用PBS重悬，为以外泌体为主的sEVs，收集在EP管内，用BCA法进行蛋白定量，进而进行蛋白变性进行western blot实验。

293T细胞和Hela细胞的细胞内小囊泡收集及western blot实验步骤同上。

2、统计学处理

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1 MSC细胞、293细胞和Hela细胞中sIVs的Lamp2b表达量比sEVs高

本实验采用了三种细胞（MSC细胞、293细胞和Hela细胞）的细胞蛋白、sIVs蛋白和sEVs蛋白进行了western blot实验，来检测Lamp2b的蛋白表达量（图13），结果显示Lamp2b在sIVs中的蛋白表达量远远高于sEVs。

4、小结

本实施例证明了Lamp2b在MSCs细胞、293T细胞和Hela细胞的sIVs中的表达高于sEVs，说明了细胞的sIVs的Lamp2b表达量比sEVs高。

实施例9：sIVs_RGD@PEDF的制备

1、实验方法

1.1 MSC的分离培养和慢病毒感染

从人的脐带中通过消化离心提取MSC，经差速贴壁法获取和纯化 MSC。通过慢病毒转染MSC构建MSC-RGD，取状态良好的 P3 代 UMSCs 细胞，12h后待细胞融合度达 50%-70%时进行慢病毒转染。配制慢病毒转染液：取 6 个 50ml 离心管，分别向其内加入正常培养体系一半量的完全培养基，加入 polybrene 助转染试剂使其终浓度达 6ug/ml，实验组依次加入以 MOI 值为 10、30、50计算得出的相应体积 Lamp2b-RGD 慢病毒，对照组依次加入相同 MOI 值梯度的对照慢病毒，吹打以将液体混匀。吸出原细胞培养基，分别加入上述病毒转染液，轻轻晃动使液体均匀覆盖于细胞表面，将细胞轻放至细胞培养箱孵育。6 小时后向细胞添加完全培养基至正常培养体系足量，加入慢病毒转染液 24 小时后行对细胞换液处理。293T细胞的感染步骤同上。

1.2 sIVs的收集和储存

当UMSCs培养达到 90%的融合度后，首先将培养基抽吸以去除细胞上清液，然后用温的 PBS 洗涤细胞后，加入3ml胰酶对细胞进行消化3 min，使用 6ml PBS 中和后1000g5min进行离心，再次用 PBS 进行重悬后离心洗涤重复2次。用PBS重悬后使用自动细胞计数仪进行计数，用 PBS 将细胞重选液体稀释调整至1*10^6/ml的密度。随后用超声机器破碎细胞的方法获取IVs，每次取2ml进行在冰上进行超声（2ml功率：20%-30%，2s/2s，15s-120s），超声后的液体收集在2ml的EP管内进行离心先2000g 10min后接着20000g 30min，然后收集上清液，最后转移至新的15ml离心管中，标记日期存于-80℃。

293T细胞的细胞内小囊泡收集步骤同上。

1.3 sIVs的提取

使用50ml注射器和0.45μm 滤头对上清进行过滤（先用PBS润湿滤膜），利用差速离心法来提取和分离 IVs，转速RCF 150000，时间70min，温度4℃，每管用干净60ul PBS 重悬沉淀，收集在EP管内，用BCA法进行蛋白定量。

根据1.1-1.3以及实施例8类似的方法获得sEVs。过表达Lamp2b-RGD的sIVs/sEVs为靶向改造后的sIVs/sEVs，空载病毒转染的sIVs/sEVs为未改造的sIVs/sEVs，以下简称sIVs- RGD、sEVs- RGD、sIVs-GFP、sEVs-GFP。

1.4 sIVs_RGD@PEDF的制备

取sIVs-RGD，加入PEDF药物溶液，混匀后37℃温箱中静置1h，将液体加入100kDa超滤管离心除去游离的药物。先用PBS润湿超滤管后，加入液体14000g离心20min，再加入PBS300ul进行离心14000g 20min重复2次，然后倒置离心4000g 2min回收，获得sIVs_RGD@PEDF，暂时存放在4℃。同时利用类似的方法获得sIVs_GFP@PEDF和sEVs_RGD@PEDF。其中，sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF代表装载PEDF的靶向改造后的sIVs和sEVs，sIVs_GFP@PEDF和sEVs_GFP@PEDF代表装载PEDF的未改造的sIVs和sEVs。

1.5 ELISA定量sIVs_RGD@PEDF的载药量

采用ELISA检测sIVs_RGD@PEDF中装载药物的浓度，由一系列0~6ng/mL浓度的药物生成标准曲线，将100ul的标准溶液和样品溶液加入ELISA板子进行检测，以药物浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。以此来计算载药率及包封率。

2、统计学处理

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1 Lamp2b-RGD慢病毒成功在MSC中高表达

RGD为大家所熟知可以特异性地靶向整合素，在静息内皮细胞和大多数正常组织中的表达较弱，在增殖的内皮细胞上强烈高表达，尤其是整合素αv和整合素β3，因此我们选择在MSC中过表达RGD，从而收集高表达RGD的sIVs和sEVs，旨在可以靶向视网膜新生血管模型的病灶位置进行治疗。Lamp2b是溶酶体膜蛋白，是外泌体膜表面的一个跨膜蛋白，并且在实施例8中我们发现细胞的sIVs的Lamp2b表达量比sEVs高，因此构建了Lamp2b-RGD慢病毒来转染MSC。Flag是常见的慢病毒标签蛋白，检测到Flag的成功表达也可以用来证明慢病毒的成功转染。

预实验向MSC转染慢病毒的转染复数 MOI 值为 10、30、50，通过收取正常对照组、空载组和转病毒组的MSC细胞进行蛋白变性及Western Blot实验，结果发现目的慢病毒Lamp2b-RGD在MSC成功过表达，western blot 结果显示当MOI为30时，Lamp2b的过表达倍数已达到最大值（图14），并且Flag作为常见的慢病毒标签蛋白也成功高表达，表明Lamp2b-RGD慢病毒在MSC成功过表达，当MOI为30时Flag标签蛋白的过表达倍数已达到最大值，后续实验采用MOI=30进行。

3.2 在高表达Lamp2b-RGD的MSC组中，Lamp2b在sIVs中的表达高于sEVs

通过对正常组MSC、空载组MSC以及高表达Lamp2b-RGD的MSC组sIVs及sEVs的收取，蛋白变性及Western Blot实验，我们发现正常组及空载组的MSC， Lamp2b-RGD在sIVs中的表达高于sEVs（图15）。值得注意的是在高表达Lamp2b的MSC组中，Lamp2b在sIVs中的表达依旧高于sEVs（图15）。

3.3 sIVs的载药能力优于sEVs

sEVs_RGD装载PEDF制备的复合制剂用sEVs_RGD@PEDF表示，sIVs_RGD装载PEDF制备的复合制剂用sIVs_RGD@PEDF表示。通过ELISA的实验检测sEVs_RGD@PEDF和sIVs_RGD@PEDF中的PEDF含量，结果发现sIVs中包载的PEDF的浓度高于sEVs，证明了sIVs的载药能力优于sEVs（图16）。

4、小结

本实施例证明了Lamp2b-RGD慢病毒成功在MSC中高表达，且在高表达Lamp2b-RGD的MSC组中，Lamp2b在sIVs中的表达依旧高于sEVs。sIVs的载药能力优于sEVs。

实施例10：RGD结合整合素在新生血管体内外模型中高表达

1、实验方法

1.1细胞培养

人HRECs购买自美国Angioproteomie公司。完整细胞培养基制备：向93ml ECM基本培养基中加入5ml的胎牛血清、1ml 生长因子和1ml青霉素-链霉素，得到含5%血清的完全培养基。使用低倍数显微镜查看细胞生长密度，采用高倍数显微镜观察细胞呈圆形、椭圆形或多边形扁平细胞，胞质中含有丰富成分，细胞内有很小的空泡。将细胞接种在培养瓶中，并在37℃的5% CO₂培养箱中培养。培养基每3天更换一次。当细胞融合达到80%时，以1:2的继代比例进行传代，并使用P3至P5的细胞进行实验。

1.2实验动物

健康雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体重 21-22g，SPF级，购于斯贝福公司（动物生产许可证：SCXK（京）2019-0010）。所有实验动物在室温下正常饮食，光照和黑暗时间分别12 h。动物饲养环境及实验操作内容均符合国家科学技术委员会有关《实验动物管理条例》的规定，并获得本院动物伦理委员会许可（伦理编号：TJYY2023120297）。将小鼠按照随机数字表法分组进行玻璃体腔注射。

1.3 VEGF诱导的增殖的内皮细胞模型

将HRECs细胞以半培（FBS 2.5%/ECG 0.05%）接种到12孔培养板中，孵育12小时后半培换液并分为两组：正常组和VEGF组（10ng/ml），37℃孵育24小时。除去培养基后，使用PBS清洗细胞，分别收取细胞的RNA及蛋白，并采用PCR和Western bolt的方法来检测RGD靶向整合素αV和β3在VEGF诱导的HRECs中的表达水平。

1.4 氧诱导视网膜病变模型（OIR小鼠）

新生C57BL/6J小鼠和哺乳期母亲在出生后第7天（P7）暴露于高氧（75%O2）环境中5天，并在P12恢复到室内空气中，分配给每个哺乳母亲的新生小鼠数量是相同的，鼠妈每24h在氧舱和常氧中交换一次。给小鼠提供标准饮食和水，并随机分配到每个治疗组。在第12天、第14天和第17天收取小鼠的视网膜组织提取RNA和蛋白，并采用PCR和Western bolt的方法来检测RGD靶向整合素αV和β3在OIR小鼠小鼠中的表达水平。

2、统计学处理

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1 RGD结合整合素在VEGF诱导的内皮细胞中高表达

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，VEGF诱导的内皮细胞增殖模型是最常见的视网膜新生血管体外模型。RGD为大家所熟知可以特异性地靶向整合素，在静息内皮细胞和大多数正常组织中的表达较弱，在增殖的内皮细胞上强烈高表达，尤其是整合素αv和整合素β3，因此我们首先检测了整合素αv和整合素β3在VEGF诱导的内皮细胞中的表达情况。

通过收取VEGF诱导的HRECs的蛋白进行Western bolt实验，结果显示RGD结合整合素αV和β3在VEGF诱导的增殖的内皮细胞中高表达（图17）。

3.2 RGD结合整合素在OIR小鼠视网膜中高表达

氧诱导的视网膜新生血管(oxygen induced retinopathy, OIR)小鼠模型是利用高氧造成视网膜无灌注区，诱发促血管生成因子显著上调，从而形成新生血管，多用于验证针对视网膜新生血管的药物或治疗靶点的作用。

通过收取P12、P14和P17的小鼠视网膜的RNA进行PCP，结果显示RGD结合整合素αV在P12、P14和P17的OIR小鼠视网膜中高表达，整合素β3在P14和P17的OIR小鼠视网膜中高表达（图18）。通过收取P12、P14和P17的小鼠视网膜的蛋白进行Western bolt实验，结果显示RGD结合整合素αV在P12、P14和P17的OIR小鼠视网膜中高表达，整合素β3在P17的OIR小鼠视网膜中高表达（图19）。

4、小结

本实施例证明了RGD结合整合素αV和整合素β3在VEGF诱导的内皮细胞和OIR小鼠中高表达，说明可以利用高表达RGD的sIVs和sEVs进行治疗效果的研究。

实施例11：sIVs-RGD靶向新生血管内皮细胞的能力比sEVs-RGD强

1、实验方法

1.1细胞培养

人HRECs购买自美国Angioproteomie公司。完整细胞培养基制备：向93ml ECM基本培养基中加入5ml的胎牛血清、1ml 生长因子和1ml青霉素-链霉素，得到含5%血清的完全培养基。使用低倍数显微镜查看细胞生长密度，采用高倍数显微镜观察细胞呈圆形、椭圆形或多边形扁平细胞，胞质中含有丰富成分，细胞内有很小的空泡。将细胞接种在培养瓶中，并在37℃的5% CO₂培养箱中培养。培养基每3天更换一次。当细胞融合达到80%时，以1:2的继代比例进行传代，并使用P3至P5的细胞进行实验。

1.2实验动物

健康雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体重 21-22g，SPF级，购于斯贝福公司（动物生产许可证：SCXK（京）2019-0010）。所有实验动物在室温下正常饮食，光照和黑暗时间分别12 h。动物饲养环境及实验操作内容均符合国家科学技术委员会有关《实验动物管理条例》的规定，并获得本院动物伦理委员会许可（伦理编号：TJYY2023120297）。将小鼠按照随机数字表法分组进行玻璃体腔注射。

1.3 DiD标记sIVs和sEVs与细胞共培养

在37℃下囊泡与脂溶性示踪剂DiD溶液共孵育30分钟。通过Amicon® Ultra离心过滤器去除多余的DiD。将细胞接种到24孔培养板上预先放置的圆形片中，孵育24小时。将DiD标记的囊泡加入细胞的培养基中，分组为：空载组和Lamp2b-RGD高表达组的UMSC收取的sIVs和sEVs（sEVs-GFP、sEVs-RGD、sIVs-GFP和sIVs-RGD等囊泡参照实施例9的1.3中的描述获得）,于37℃孵育不同时间：12小时或24小时。除去培养基后，使用PBS清洗细胞，在室温下。使用4% PFA固定细胞10分钟，然后使用0.1% Triton X-100在室温下孵育5分钟以使细胞渗透。随后，细胞在室温下用CoraLite® Plus 488共轭的Phalloidin抗体染色30分钟。利用DAPI标记细胞核。最后，利用共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像，通过Image J分析细胞内吞的囊泡量。

1.4 OIR小鼠玻璃体腔注射DiD标记的囊泡

OIR小鼠造模如前述，囊泡用DiD染色如前述。将DiD标记的囊泡以1μg的质量注射到OIR小鼠的结膜下。分别在注射后8小时、24小时和5天，收集眼球进行观察评估。

1.5视网膜切片

冷冻视网膜切片（8μm厚）用于免疫荧光分析。使用PFA在常温下对视网膜切片进行固定15分钟，随后用PBS洗涤载玻片，并使用DAPI对细胞核进行染色。最后，用抗荧光衰减封片剂封片，并使用共聚焦激光扫描显微镜观察。

2、统计学处理

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1细胞内吞sIVs-RGD能力优于sEVs-RGD

为了评估细胞对两种类型囊泡的吞噬能力，选取HRECs与上述4组囊泡（sEVs-GFP、sEVs-RGD、sIVs-GFP和sIVs-RGD）共同培养12h（图20）和24h（图21）。简言之，将DiD标记的等量的囊泡与正常状态的细胞以及VEGF诱导的HRECs一起孵育，在不同的时间点，使用共聚焦显微镜观察DiD的分布，以观察细胞对囊泡的摄取量。结果显示，在HRECs中，细胞对sIVs的内化率始终超过sEVs，值得注意的是细胞对RGD靶向修饰的sIVs-RGD的内化率始终比sEVs-RGD高。

3.2 sIVs-RGD比sEVs-RGD渗透到视网膜的速度更快，且滞留时间更长

为了评估视网膜对4组囊泡（sEVs-GFP、sEVs-RGD、sIVs-GFP和sIVs-RGD）的吞噬能力，通过玻璃体腔注射的方法，向视网膜新生血管模型小鼠--OIR小鼠眼睛施用等量的DiD标记的囊泡。在不同的时间点收集眼球样本，然后制备冷冻切片，并使用共聚焦显微镜观察视网膜内的囊泡摄取。

玻璃体内注射DiD标记的囊泡后，囊泡从玻璃体腔向视网膜扩散。结果显示，注射后8小时，sEVs分布在玻璃体腔内，尚未到达视网膜，而sIVs已经到达整个视网膜层，并被神经节细胞层和内核层的细胞内化，其中sIVs-RGD的内化率超过sIVs-GFP和sEVs-RGD（图22中的A和B）。玻璃体内注射24小时后，4组类型的囊泡在整个视网膜中呈弥漫分布，且sIVs-RGD的内化率始终超过sIVs-GFP和sEVs-RGD（图22C和D），随后在5天观察4种囊泡在视网膜的分布逐渐减少，但分布趋势仍与之前观察的结果相同（图22E和F）。值得注意的是，sIVs-RGD比sEVs渗透到视网膜的速度更快、滞留时间更长，且高表达RDG的sIVs在OIR小鼠视网膜中的内化率始终超过sIVs。

4、小结

本实施例表明体外培养的细胞对sIVs的内吞能力优于sEVs，且与sIVs和高表达RDG的sEVs相比，高表达RDG的sIVs在增殖的内皮细胞中的摄取率会更高。通过对小鼠进行玻璃体腔注射观察到视网膜对sIVs的内吞能力优于sEVs，sIVs-RGD比sEVs渗透到视网膜的速度更快、滞留时间更长，且高表达RDG的sIVs在OIR小鼠视网膜中的内化率始终超过sIVs。这一发现充分展示了sIVs具有良好组织相容性，且sIVs-RGD靶向新生血管内皮细胞的能力更强。

实施例12：sIVs_RGD@PEDF在体外对新生血管模型的治疗作用

1、实验方法

1.1增殖实验

将HRECs以 4500/孔 细胞密度，种植于96孔板。在培养基中加入VEGF 溶液（10ng/ml）。设计不同组别，只添加 VEGF 溶液为阳性对照组，以分组包括sIVs-GFP、PEDF、sIVs_GFP@PEDF、sIVs_RGD@PEDF、sEVs_RGD@PEDF，各囊泡来源参照实施例9。

为实验组培养 24h 后，通过 CCK 的方法，测试各组细胞的增殖情况。

1.2 Transwell迁移实验

将HRECs按照8000/孔种植在24孔板的Transwell 小室的半透膜上层。该半透膜经细胞外基质包被处理后，可允许细胞粘附和迁移。将培养基加入到半透膜下层小室中。按上述分组，继续孵育 24h 后，染色并计数透过半透膜的HRECs，记录数据并分析其对HRECs迁移能力的抑制作用。

1.3 炎性因子和新生血管相关因子的蛋白表达水平

利用 BCA 的方法对以上各实验组处理24h后的HRECs中提取的蛋白进行定量。将等量的蛋白质与 loading buffer 充分混合变性后，分别采用 7.5-12.5%的 SDS-PAGE 胶进行电泳、转膜、封闭、孵抗体及显色等步骤，检测目标蛋白的表达量，评价其对炎性因子和新生血管相关因子的蛋白表达水平的影响。

2、统计学处理

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1 sIVs_RGD@PEDF抑制了VEGF诱导的内皮细胞的增殖--CCK实验

CCK实验是常用的检测细胞增殖的方法，结果证明单纯的sIVs不能明显地抑制内皮细胞的增殖，而 sIVs_RGD@PEDF可以显著抑制内皮细胞的增殖，虽与sEVs_RGD-PEDF相比没有明显的统计学差异，但是较sIVs_GFP@PEDF有显著的抑制HRECs增殖的效果（图23）。

3.2 sIVs_RGD@PEDF抑制了VEGF诱导的内皮细胞的迁移--Transwell实验

Transwell实验是常用的检测细胞迁移的方法，结果证明单纯的sIVs不能明显地抑制内皮细胞的迁移，而 sIVs_RGD@PEDF可以显著抑制内皮细胞的迁移，虽与sEVs_RGD-PEDF相比没有明显的统计学差异，但是较sIVs_GFP@PEDF有显著的抑制HRECs迁移的效果（图24）。

3.3 sIVs_RGD@PEDF抑制了VEGF诱导的内皮细胞的炎性因子的释放

ICAM-1（intercellular cell adhesion molecule-1 即细胞间黏附分子-1），属于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成员，是介导黏附反应重要的一个黏附分子。ICAM-1在静息的内皮细胞上呈低水平表达，在VEGF诱导的内皮细胞中会高表达。

通过收集内皮细胞的蛋白检测ICAM-1的表达水平，结果显示sIVs_RGD@PEDF显著降低了ICAM-1的表达水平，与单纯的PEDF和sIVs_RGD相比有更显著的治疗效果，并且sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF抑制ICAM-1的能力相同（图25），说明在体外实验中sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF具有相同的抑制炎症的作用。

4、小结

sIVs_RGD@PEDF抑制了VEGF诱导的内皮细胞的增殖和迁移，较sIVs-GFP、PEDF和sIVs_GFP@PEDF有显著的抑制HRECs增殖的效果，与sEVs_RGD@PEDF的作用效果无明显的统计学差异。

实施例13：sIVs_RGD@PEDF复合制剂的体外实验

1、实验方法

1.1 玻璃体腔注射OIR小鼠

OIR小鼠造模如前述，在P12进行玻腔注射，每只眼睛注射1ul液体，分组包括PBS、sIVs-GFP、PEDF、sIVs_GFP@PEDF、sIVs_RGD@PEDF、sEVs_RGD@PEDF，各囊泡来源参照实施例9，随后进行观察评估。

1.2视网膜铺片染色及新生血管面积和无灌注区面积的分析

在p17进行视网膜铺片，取下小鼠眼球在常温多聚甲醛中固定15min，在冷PBS中放置5-10min，将眼球转移至纱布上，在操作显微镜下于角巩膜缘剪开一个切口，用两个有齿镊轻轻撕开巩膜剥离，取出晶状体，用小剪刀将视网膜剪成四瓣，并剪去明显的血管簇，在视网膜上方轻轻滴加冷的无水甲醇固定，视网膜变白后转移至2ml的平底EP管中。将EP管中的无水甲醇吸出，用PBS在4℃摇床清洗2遍，加入1ml封闭液在4℃摇床2h，PBS再次清洗2遍，再加入200ul的IB4避光4℃摇床过夜，PBS清洗5次，每次1h，清洗结束后封片。染色后的视网膜在共聚焦显微镜下进行拍照，并用photoshop软件对视网膜新生血管及无灌注区的面积进行标注和统计，分析各组之间有无明显统计学差异。

1.3视网膜电图（ERG）

使用视网膜电图仪器对P25（±1 d）和P42（±1天）的小鼠进行视网膜神经功能的检测，以评估OIR小鼠的视网膜功能。对小鼠进行过夜的黑暗适应，并在ERG之前进行麻醉。角膜用0.5%丙氧他卡因麻醉，并在眼表面涂抹加替沙星眼凝胶以防止组织干燥，将参考电极插入头皮下方，靠近耳朵之间的中线，将另一个电极插入小鼠尾部。设置−1.1、0.1、1.0和3.0 log（cd•s/m²）的光强度刺激参数范围，对每只小鼠进行三次测试以获得平均值。从基线到a波的波谷测量a波振幅，从a波的波峰到b波的波峰测量b波振幅，使用ERG软件自动量化。

1.4 炎性因子和新生血管相关因子的蛋白表达水平

利用 BCA 的方法对以上各实验组处理P17的小鼠视网膜中提取的蛋白进行定量。将等量的蛋白质与 loading buffer 充分混合变性后，分别采用 7.5-12.5%的 SDS-PAGE胶进行电泳、转膜、封闭、孵抗体及显色等步骤，检测目标蛋白的表达量，评价其对炎性因子和新生血管相关因子的蛋白表达水平的影响。

2、统计学处理

实验数据以均数±标准差（）表示。实验数据均进行正态检验。使用SPSS 22.0分析所有定量数据。方差分析采取One-way ANOVA进行，使用最小显着性差异（LSD）分析进行事后检验。对于非正态分布数据和方差不均的数据，使用了非参数检验，P值<0.05为统计学显著差异。

3、实验结果

3.1 sIVs_RGD@PEDF显著降低了OIR小鼠视网膜无灌注区的面积并抑制了新生血管的生成

通过对OIR小鼠进行不同浓度的sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF的玻腔注射，在P17进行视网膜铺片，并对视网膜无灌注区面积和新生血管面积进行统计，结果发现sIVs_RGD@PEDF在低浓度（0.5mg/ml）、中浓度（1mg/ml）和高浓度（2mg/ml）均抑制了视网膜无灌注区和新生血管的形成，中浓度较低浓度的治疗效果更明显，而和高浓度的治疗效果无明显的统计学差异，因此选择中浓度的sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF进行后续实验（图26）。

通过对各治疗组的小鼠进行视网膜铺片进行视网膜无灌注区面积和新生血管面积的统计，结果发现sIVs_RGD@PEDF显著地抑制了视网膜无灌注区和新生血管的形成，与sEVs_RGD@PEDF具有相同的治疗效果，并且和不靶向的sIVs_GFP@PEDF相比具有更好的治疗效果（图27）。

3.2 sIVs_RGD@PEDF神经保护的作用比sEVs_RGD@PEDF强

我们使用ERG评估OIR小鼠在P42的视网膜电生理功能，结果发现未经治疗的OIR小鼠ERG的a波和b波形的振幅降低（图28中A和C），代表双极细胞和光感受器细胞功能的降低。从统计数据来看，在所有测试的闪光强度下，OIR小鼠的光反应显著减少，sIVs、sIVs_GFP@PEDF、sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF治疗显著挽救了视网膜的光反应（图28）。此外，sIVs_RGD@PEDF在最高刺激下的a波振幅和b波振幅的改善显著优于sEVs_RGD@PEDF和sIVs_GFP@PEDF（图28中B和D）。总之，我们的研究结果表明sIVs_RGD@PEDF神经保护的作用比sEVs_RGD@PEDF和sIVs_GFP@PEDF强。

3.3 sIVs_RGD@PEDF抑制炎症的能力比sEVs_RGD@PEDF强

GFAP是胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）的是星形胶质细胞活化的标志物，是一种重要的视网膜炎症相关因子。通过收集P17的OIR小鼠视网膜蛋白检测GFAP的表达水平，结果显示sIVs_RGD@PEDF显著降低了GFAP的表达水平，并且比不靶向的sIVs_GFP@PEDF相比有更显著的治疗效果，且sIVs_RGD@PEDF抑制GFAP表达的能力比sEVs_RGD@PEDF更强，说明sIVs_RGD@PEDF较不靶向的治疗效果更好，且sIVs_RGD@PEDF抑制炎症的能力比sEVs_RGD@PEDF更强（图29中A和B）。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，是一种重要的新生血管相关因子。通过收集P17的OIR小鼠视网膜蛋白检测VEGF的表达水平，结果显示sIVs_RGD@PEDF显著降低了VEGF的表达水平，并且比不靶向的sIVs_GFP@PEDF相比有更显著的治疗效果，且sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF抑制VEGF的能力相同，说明在具有新生血管靶向作用的sIVs_RGD@PEDF较不靶向的治疗效果更好，且sIVs_RGD@PEDF和sEVs_RGD@PEDF具有相同的抑制VEGF的作用（图29中A和C）。

4、小结

sIVs_RGD@PEDF对OIR小鼠的治疗效果呈剂量依赖性，在1mg/ml的计量中显著降低了OIR小鼠视网膜无灌注区的面积并抑制了新生血管的生成、抑制了视网膜的炎症、保护了视网膜的结构和功能，并且比具有新生血管靶向能力的sIVs_GFP@PEDF作用效果更强。值得注意的是，sIVs_RGD@PEDF抑制炎症的能力和神经保护的能力比sEVs_RGD@PEDF强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims (18)

1.一种来源于细胞内的靶向纳米囊泡的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将编码靶向分子-Lamp2b的融合蛋白的核苷酸引入细胞；

（2）取步骤（1）所得细胞分散在悬浮溶剂中，进行超声处理；

（3）将步骤（2）所得液体进行一次或多次离心处理，弃去细胞膜及细胞器碎片，取上清液；

（4）将步骤（3）所得上清液进行超速离心处理，取沉淀为细胞内纳米囊泡。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）包括：构建过表达靶向分子-Lamp2b的融合蛋白的质粒，然后将所述质粒包装成慢病毒，将所述慢病毒转染细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自：多肽、抗体、激活或抑制受体、蛋白配体、生物活性酶、核酸药物、或其组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子为多肽。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子选自A25多肽或RGD多肽。

6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的靶向分子位于Lamp2b的N端。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%-25%，和/或，所述超声处理的时间为10-20s。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述超声处理的振幅为20%；和/或，所述超声处理的时间为15s，on 2s，off 2s。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述离心处理的次数为两次，

其各自参数分别为：

1000-3000g，5-20分钟；

10000-30000g，20-40分钟；

步骤（4）中所述超速离心处理的参数包括100000-180000g，50-100分钟。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为干细胞、心肌细胞、人胚肾细胞、巨噬细胞、T细胞和肿瘤细胞中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，所述间充质干细胞包括：脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞。

12.根据权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡。

13.根据权利要求12所述的囊泡，其特征在于，所述囊泡为A25-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡或RGD-Lamp2b过表达修饰的细胞内纳米囊泡。

14.根据权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述疾病为眼部疾病。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述疾病为自身免疫性葡萄膜炎或视网膜新生血管疾病。

17.一种载药囊泡的制备方法，其包括以权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体进行载药。

18.一种载药囊泡，其以权利要求1-11任一项所述方法制备的囊泡作为药物载体。