CN114516906B

CN114516906B - 玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114516906B
Application number: CN202011316982.7A
Authority: CN
Inventors: 陈化榜; 赵丽; 刘洁
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: CN114516906A

Abstract

本发明公开了一种玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1或2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1或2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物与菌根真菌共生相关的蛋白质。本发明的ZmL75基因可调控玉米与菌根真菌共生，即该基因纯合突变或缺失使玉米丧失菌根真菌共生并形成菌根结构的能力；在该基因突变或缺失的材料中表达ZmL75可使玉米恢复上述能力。ZmL75可提高植物耐盐性，恢复突变体atgpat6角果表型。本发明为植物与菌根真菌共生研究提供了新的基因资源，其可在植物耐逆育种等领域应用。

Description

玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

我国人口增长和生活水平持续提高对粮食需求总量不断增加，近年来我国粮食进口也不断增加。玉米是我国种植面积最大、总产最高的作物之一，近五年的玉米产量保持在全国粮食总产的39％以上 (http：//www.stats.gov.cn/，中华人民共和国国家统计局)。然而我国存量耕地多处于高强度利用，且每年还在持续减少，耕地缺口不断加大，提高玉米耐逆能力，挖掘土地产能效益扩增潜力，有助于保障国家粮食安全。

在玉米生长发育过程中，不可避免地会受到干旱、盐碱、营养等多种逆境的影响。例如磷素，是植物生长发育必需的大量营养元素，然而磷在土壤中易被固定和沉淀，低磷胁迫会导致玉米植株生长缓慢、花期延迟、结实率下降并最终导致减产。为适应胁迫环境，植物进化出了与丛枝菌根真菌共生的机制。玉米属于菌根植物，能够与菌根真菌形成互惠互利的菌根。菌根是土壤中的菌根真菌与植物根系形成的共生体。根据形态和解剖学的特征可把菌根分为外生菌根、内生菌根和内外生菌根。丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)是土壤中球囊霉门的菌根真菌与植物根系形成的一种共生体，大约80％的维管显花植物能够与丛枝菌根真菌形成共生关系(Smith et al.，1997)。AM真菌的根外菌丝在土壤中的延伸不仅扩大了植物根系与土壤的接触面积，还增加了植物根系的长度，使得植物根系在更大面积范围内，将更多的养分和水分吸收进根细胞。AM真菌给宿主植物提供的最主要的营养元素是磷，还可为植物提供氮(Liu et al.，2004)等其它营养元素。AM真菌与植物的共生可增加植物的气孔导度、蒸腾速率和净光合作用(Lenoir et al.，2016)，提高植物对病原菌的抗性和对干旱、盐碱、重金属等非生物胁迫的抗性等(Evelin et al.，2009，Feng etal.， 2002，Jankong et al.，2008，Gidda et al.，2009)。植物与AM真菌的互作经历了信号识别、传导、菌丝入侵、共生界面形成、物质交换等一系列过程。这些过程涉及了大量基因的参与，前人的研究从豆科植物起始，逐渐延伸到其它双子叶植物，乃至单子叶植物。在玉米中，仅发现一类新的转运蛋白NOPE1，运输植物来源的N-乙酰氨基葡萄糖基分子，该分子作用于真菌内的启动信号，促进共生(Nadal et al.，2017)。除此之外，玉米中参与植物与 AM真菌共生的基因还知之甚少。

因此，挖掘玉米与菌根真菌共生相关基因，不仅能够在科学理论上丰富对玉米与AM 真菌共生的遗传和机理认识，又能够在生产实践上促进玉米耐逆改良、玉米可种植区域的扩大和玉米产量的提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为ZmL75，来源于玉米属的玉米(Zea mays L.)，是如下 (a)-(c)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将序列1或序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与玉米与菌根真菌共生相关的由序列1或序列2衍生的蛋白质。

序列表序列1和序列2均为ZmL75的氨基酸序列，序列1是玉米材料B73中的ZmL75的氨基酸序列，序列2是玉米材料L75中的ZmL75的氨基酸序列。其中序列1包括511个氨基酸，该蛋白质的分子量为55.50KD，等电点为8.79。序列2包括511个氨基酸，该蛋白质的分子量为 56.17KD，等电点为8.83。

为了便于上述(a)或(b)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1或序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述 (c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列3或序列4或序列7的第21-1553位所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因(命名为ZmL75)，所述基因具体可为如下1)-5)中任一的DNA分子：

所述基因为如下1)-5)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)序列表中序列4所示的DNA分子；

3)序列表中序列7的第21-1553位所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)-3)中任一限定的DNA分子杂交且编码玉米与菌根真菌共生相关的由序列1或序列2衍生的蛋白质的DNA分子；

5)与1)-4)中任一限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码玉米与菌根真菌共生相关的由序列1或序列2衍生的蛋白质的DNA分子。

其中，序列3为ZmL75基因在玉米材料B73中的基因组序列，序列4为ZmL75基因在玉米材料L75中的基因组序列，序列7的第21-1553位为ZmL75基因在玉米材料L75中的cDNA序列。上述严格条件为可用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中 65℃下杂交并洗膜。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因 Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述转基因细胞系为转入所述基因的非繁殖材料。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)植物育种和/或制种；

(b)调控植物与菌根真菌共生并形成菌根结构的能力；

(c)调控植物抗逆能力。

本发明还提供了培育转基因植物的方法。

本发明所提供培育转基因植物的方法，可为如下(A)或(B)或(C)或(D)：

(A)培育能够形成菌根结构的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(a1)向不能形成菌根结构的受体植物中导入ZmL75蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；所述受体植物的不能形成菌根结构的性状是由于所述受体植物表达有功能的所述ZmL75蛋白的能力丧失或降低引起的；

(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到能够形成菌根结构的转基因植物；

(B)培育不能形成菌根结构的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(b1)抑制可形成菌根结构的受体植物中ZmL75蛋白的表达，得到转基因植物；所述受体植物不能形成菌根结构的性状是由于所述受体植物所述ZmL75蛋白功能的丧失或降低引起的；

(b2)从步骤(b1)所得转基因植物中得到不能形成菌根结构的转基因植物。

在所述方法步骤(b1)中，是通过如下实现抑制所述受体植物中所述编码基因的表达的：采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码ZmL75蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切，使所述受体植物丧失或降低表达有功能的ZmL75蛋白的能力。

其中，所述CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码ZmL75蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切时的靶标片段为所述受体植物中编码ZmL75蛋白的基因组DNA序列中符合 5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种， 14≤X≤30，且X为整数(如X为20)，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，所述靶标片段为所述受体植物中编码ZmL75蛋白的基因组DNA序列中的“5’-GCTCATCTTCGCGTCCATGG-3’(即序列3的第294-313位)”；

(C)培育耐盐能力增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(c1)向受体植物中导入ZmL75蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

(c2)从步骤(c1)所得转基因植物中得到耐盐能力增强的转基因植物；

(D)培育角果正常生长的转基因植物的方法，包括如下步骤：

(d1)向角果不能正常生长的受体植物中导入ZmL75蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；所述受体植物的角果不能正常生长的性状是由于所述受体植物表达有功能的所述ZmL75蛋白的同源蛋白AtGPAT6的能力丧失或降低引起的；

(d2)从步骤(d1)所得转基因植物中得到能够形成正常角果的转基因植物。

在本发明中，所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物。其中，所述单子叶植物如禾本科植物，具体如玉米。所述双子叶植物如十字花科植物，具体如拟南芥。

在本发明的一个实施例中，培育能够形成菌根结构的转基因植物时，可将玉米突变体S75 作为所述受体植物，获得相应的能够形成菌根结构的转基因玉米；当然也可以像本发明的一个实施例一样，将含有所述ZmL75蛋白的编码基因的载体转化到玉米材料B104中，然后再将转基因阳性植株与玉米突变体S75杂交后自交，选择定位区间内基因组背景为S75且转基因为阳性的植株，即为相应的能够形成菌根结构的转基因玉米。

在本发明的一个实施例中，培育不能形成菌根结构的转基因植物时采用的所述受体植物具体为玉米材料综31。

在本发明的一个实施例中，培育耐盐能力增强的转基因植物时采用的所述受体植物具体为拟南芥野生型Col-0，培育角果正常生长的转基因植物时采用的所述受体植物为拟南芥突变体atgpat6。

本发明利用图位克隆的策略，用玉米不能形成菌根结构、在轻微胁迫土壤中生长受抑制的突变体S75与玉米自交系M66和/或自交系Mo17组配BC₁F₁群体，将控制这一突变性状的基因定位到玉米一号染色体的标记M77和M124之间，以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离约为358kb，共包括10个基因。其中基因号为Zm00001d033915的序列在突变体S75与玉米自交系M66/Mo17之间存在差异，S75有一个1.3kb的缺失，M66和Mo17没有这一缺失，基因编码蛋白可以正确翻译，将此基因命名为ZmL75。用转基因技术将ZmL75基因在上述玉米突变体中互补表达，可以恢复其形成菌根结构的能力。用CRISPR-Cas9基因编辑技术将能够形成菌根结构的玉米材料综31的ZmL75基因敲除，可以使综31的形成菌根结构的能力丧失。在拟南芥野生型中过量表达ZmL75基因，能够提高拟南芥的耐盐能力。在拟南芥突变体atgpat6中过量表达ZmL75基因，能够恢复角果表型。

本发明的ZmL75基因在玉米中能够调控植物与菌根真菌的共生及形成菌根结构的能力，以及在轻微胁迫下正常生长的能力。即该基因的纯合突变或缺失能够使玉米丧失菌根真菌定殖能力，不能形成菌根结构，在轻微胁迫下生长受到抑制；在该基因突变或缺失的材料中正常表达ZmL75基因能够恢复玉米与菌根真菌的共生，能够形成菌根结构并在轻微胁迫下正常生长。ZmL75基因在拟南芥中能够提高植物的耐盐能力，能够恢复拟南芥突变体atgpat6的角果表型。

本发明为玉米与菌根真菌共生研究提供了新的基因资源，其在玉米耐逆育种制种等领域的应用中将发挥重要作用。

附图说明

图1为河北南皮实验站玉米自交系L75与突变体S75的表型比较图。

图2为北京昌平试验田土壤培养玉米自交系L75和突变体S75的表型比较图。其中A为成株期，B为苗期，C为成株期株高统计分析，D为叶绿素相对含量统计分析。数值展示的是平均值±标准误，**为P＜0.01，Bars＝25cm。

图3为玉米自交系L75(左)与突变体S75(右)在低磷土池中的表型比较图。

图4为玉米自交系L75和突变体S75水培胁迫处理的表型比较图。其中A为正常营养液，B 为180mM NaCl处理，C为50mM Na₂CO₃处理，D为5μM KH₂PO₃处理。

图5为玉米自交系L75和突变体S75的菌根侵染实验及基因表达量测定图。其中A为昌平大田播种6周L75台盼蓝染色观察，B为昌平大田播种6周S75台盼蓝染色观察，C为温室无R. irregularis处理的6周L75台盼蓝染色观察，D为温室无R.irregularis处理的6周S75台盼蓝染色观察，E为温室有R.irregularis处理的6周L75台盼蓝染色观察，F为温室有R.irregularis处理的6 周S75台盼蓝染色观察，G为昌平大田播种6周L75和S75根系菌根真菌侵染率，H为ZmL75基因在玉米根系中的相对表达量。ZmGADPH(Zm00001d049641)作为管家基因，数值展示的是平均值±标准误，**为P＜0.01，Bars＝100μm。

图6为L75和S75混合种植实验图。其中A为培养箱混合种植表型图，B为大田混合种植表型图，C为培养箱混合种植下L75根系台盼蓝染色，D为培养箱混合种植下S75根系台盼蓝染色， E为混合种植与单独种植下的侵染率，其中L75/L75为单独种植下L75的侵染率，L75/S75为混合种植下L75的侵染率，S75/L75为混合种植下S75的侵染率，S75/S75为单独种植下S75的侵染率，F为基因ZmL75的相对表达量。ZmGADPH(Zm00001d049641)作为管家基因，数值展示的是平均值±标准误，**为P＜0.01，ns为没有显著性差异，Bars＝100μm。

图7为ZmL75基因的图位克隆图。其中M77-M124为群体亲本之间的多态性分子标记，标记下方的数字为相应标记下交换单株的个数，CG1-CG10为358kb区间内的10个候选基因。

图8为ZmL75基因遗传互补验证图。其中A为遗传互补流程图，AA为正常的ZmL75基因的基因型，aa为突变的ZmL75基因的基因型，Bb为转基因杂合植株的基因型，bb为转基因阴性植株的基因型，B为转基因阴性植株和转基因阳性植株的表型图，aabb为定位区间内ZmL75 基因为纯合突变且转基因为阴性的植株，CM1和CM2为分别由两个不同的转基因株系与S75 杂交自交而来的定位区间内ZmL75基因为纯合突变且转基因为阳性的植株，C为转基因阴性植株(aabb)和转基因阳性植株(aaB_)株高比较，D为转基因阴性植株(aabb)台盼蓝染色观察，E为转基因阳性植株(aaB_)台盼蓝染色观察，F为转基因阴性植株(aabb)与转基因阳性植株(CM1、 CM2)侵染率比较，数值展示的是平均值±标准误，**为P＜0.01，Bars＝100μm。

图9为PCR产物Nco I酶切后经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测图。

图10为ZmL75基因敲除验证图。其中A为敲除株系靶点序列测序比对，B为野生型综31 和敲除株系苗期表型，C为野生型综31和敲除株系CC2，CC4根系ZmL75相对表达量分析。数值展示的是平均值±标准误，**为P＜0.01。

图11为敲除株系的根系菌根真菌侵染观察图。其中A为玉米综31根系台盼蓝染色观察， B为ZmL75基因敲除株系根系台盼蓝染色观察，C为综31与敲除株系侵染率比较。数值展示的是平均值±标准误，**为P＜0.01，Bars＝100μm。

图12为拟南芥野生型Col-0中过量表达ZmL75基因在NaCl处理下的植株表型图。其中 Col-0为拟南芥野生型，Col-0-ZmL75为在拟南芥野生型中过量表达ZmL75基因的转基因植株。

图13为拟南芥突变体atgpat6中过量表达ZmL75基因的植株表型图。其中A为AtGPAT6基因结构与拟南芥突变体atgpat6的T-DNA插入示意图，B为野生型Col-0角果表型，C为突变体 atgpat6角果表型，D为在突变体atgpat6中过量表达ZmL75基因的植株的角果表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米材料L75、S75、M66、Mo17、B104、综31为本实验室收集和保存。

拟南芥突变体gpat6：由The European Arabidopsis Stock Centre保存，NASCID：N646013； Donor Number：SALK_146013。该突变体在该保藏中心的具体网页链接如下：http：//arabidopsis.info/StockInfo？NASC_id＝646013。

pBUN411载体：在文献“Hui-Li Xing，Li Dong，Zhi-Ping Wang，Hai-Yan Zhang，Chun-Yan Han，Bing Liu，Xue-Chen Wang，Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14：327-338(2014)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验。该质粒可同时用于转录向导RNA和表达Cas9蛋白。

实施例1、玉米与菌根真菌共生基因ZmL75的图位克隆

一、玉米突变体S75的表型

在河北南皮实验站的盐碱地上，我们在玉米骨干自交系L75的穗行中分离出了生长严重受阻的突变体，命名为S75，该突变体从三叶一心开始，叶尖逐渐失绿，发黄，叶片边缘变为紫红色，然后逐渐向基部扩展，后期叶尖变褐枯死，最终整株死亡(图1)。在北京昌平试验田大田土壤(轻度盐碱)也观察到了这一表型，和南皮实验站相比，S75生长后期植株不会死亡，但是生长严重受阻(图2中A和B)，成株期株高和叶绿素含量与L75相比均极显著性降低(图2中 C和D)。在北京昌平试验田的低磷土池中，L75能够正常生长，而S75的生长受到严重抑制，叶片发黄，长势极差(图3)。

然而在温室中用水培模拟盐碱胁迫和低磷胁迫，经过多次重复实验发现：将培养到三叶一心的植株，去掉胚乳后，若转移至正常霍格兰德培养液培养情况下，L75和S75长势一致，长势较好(图4中A)；若转移到含有180mM NaCl或50mM Na₂CO₃的霍格兰德培养液中进行盐碱胁迫，L75和S75仍然长势一致，但均表现出发黄，叶尖枯萎，长势弱的胁迫表型(图4中B 和C)；若转移到含有5μM KH₂PO₃的霍格兰德培养液中进行低磷胁迫，L75和S75均显示出缺磷表现，表型一致(图4中D)。

因此，突变体S75与野生型L75在逆境下的表型差异只能在土壤种植条件下观察到，而在水培条件下则没有明显差异。

于是，对大田种植的L75和S75的根系进行台盼蓝染色。结果表明，L75的根系中有大量的丛枝菌根真菌侵染，能够形成菌根结构(图5中A)，S75的根系中基本找不到带有丛枝结构的细胞，没有形成菌根结构(图5中B)。统计结果表明，L75的根系菌根真菌侵染率极显著水平高于S75的(图5中G)。

在温室中，用三次高温高压灭菌土单独种植L75和S75，作为对照。同时，用上述灭菌土加丛枝菌根真菌R.irregularis的孢子(每小盆约500个孢子)单独种植L75和S75，作为处理。在对照中，L75和S75根系内均无丛枝菌根真菌侵染(图5中C和D)；在处理下，L75根系内有丛枝菌根真菌侵染，能够形成菌根结构(图5中E)，而S75的根系丛枝菌根真菌侵染较少，不能形成菌根结构(图5中F)。

而后，分别在培养箱(图6中A)和北京昌平大田中(图6中B)将L75和S75混合种植，S75在北京昌平大田依然表现出生长受抑制的表型。对混合种植的L75和S75的根系进行台盼蓝染色观察，L75根系内有丛枝菌根真菌侵染，形成菌根结构(图6中C)，S75的根系内没有菌根结构(图 6中D)。

对温室单独种植和混合种植下L75和S75的根系的菌根真菌侵染率进行统计分析，L75的侵染率在单独种植下显著性低于在混合种植下，S75的侵染率在单独种植下和在混合种植下没有显著性差异，不论在单独种植下还是在混合种植下，L75的侵染率都极显著性高于S75的侵染率(图6中E)。

因此，在丛枝菌根真菌存在的条件下，L75根系有明显的丛枝菌根真菌侵染，能够形成菌根结构，S75的根系几乎没有丛枝菌根真菌侵染，不能形成菌根结构，L75根系的菌根真菌侵染率明显高于S75的。L75与S75的混合种植，不能恢复S75根系的低侵染率、无法形成菌根结构、在轻微胁迫下生长受抑制的表型。

二、遗传定位群体的构建

以玉米突变体S75为父本，以玉米自交系M66或Mo17为母本组配F₁，F₁在北京昌平田间表型均为正常生长。而后将F₁自交获得F₂群体，或以突变体S75为父本，以F₁为母本构建回交群体(BC₁F₁)。F₂群体和BC₁F₁群体在田间均可观察到长势良好个体和生长明显受抑制个体两种类型，且F₂群体两种类型的比例经卡方检验符合3∶1，BC₁F₁群体两种类型的比例经卡方检验符合1∶1(表1)。由此推测玉米突变体S75的表型由隐性单基因控制，并将BC₁F₁群体做为遗传定位群体。

表1 S75与Mo17或M66的F₂群体和BC₁F₁群体植株表型分离比统计

X_0.05 ²(1)＝3.84

三、ZmL75基因的定位

首先，以玉米突变体S75和玉米自交系M66、Mo17的基因组DNA为模板，用玉米全基因组标记筛选在突变体和自交系之间有多态性的标记。然后，从BC₁F₁群体中选取两种表型单株各10株，验证多态性标记是否与表型连锁。筛选出连锁标记，用于对BC₁F₁群体的229个单株测定基因型，从而结合表型筛选出表型与基因型不符的为交换单株，并根据不同标记筛选出的交换单株个数的不同，依照减少趋势确定定位区间，由此将ZmL75基因定位在位于一号染色体的标记M77和M124之间。而后用标记M77和M124检测BC₁F₁群体的所有单株的基因型，结合表型筛选出交换单株。并在标记M77和M124的区间内设计SSR和IDP分子标记(表2)，用于检测所有交换单株，进一步将定位区间缩小到358kb，参考B73基因组(RefGen_v4)序列，该区段涉及10个基因(图7中A)。

表2用于基因定位的分子标记引物序列

四、ZmL75基因的克隆

参考玉米基因组测序信息，定位区间的358kb范围内包含10个基因。以玉米突变体S75和野生型L75的基因组DNA为模板，扩增这10个基因并比较其序列差异，发现只有Zm00001d033915基因在S75和L75之间存在DNA序列上的差异。相对于L75，该基因在突变体S75中缺失1340bp，造成基因编码蛋白氨基酸序列的大段缺失(图7中B)。因此推测候选基因Zm00001d033915即为要克隆的ZmL75基因。

以玉米自交系B73的基因组DNA为模板，采用引物对F1/R1进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列3，序列3即为ZmL75基因在玉米基因组中的序列。以玉米自交系L75 的基因组DNA为模板，采用引物对F1/R1进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列 4，序列4亦为ZmL75基因在玉米基因组中的序列。以玉米突变体S75的基因组DNA为模板，采用引物对F1/R1进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列5，序列5是突变了的ZmL75 基因在玉米基因组中的序列。

F1：5’-GAGTGGTGTAGTACGCTTGGTGC-3’；

R1：5’-GCATCTGCTACGTGCGAAAAC-3’。

序列3编码序列表中序列1所示的ZmL75蛋白。序列4编码序列表中序列2所示的ZmL75蛋白。

对本实施例中大田单独种植的L75和S75，提取根系总RNA，采用引物对F2/R2对ZmL75 基因的相对表达量进行检测，L75根系中ZmL75基因的相对表达量极显著性高于S75中的(图5 中H)。分别检测本实施例中温室单独种植下和混合种植下L75和S75的根系ZmL75基因的相对表达量(图6中F)。其在L75根系中的相对表达量在混合种植下极显著性高于在单独种植下。其在S75根系中的相对表达量在混合种植下和在单独种植下没有显著性差异。不论在单独种植下还是在混合种植下，其在L75根系中的表达量都极显著性高于在S75中的。ZmL75基因的相对表达量(图6中F)与玉米根系的菌根真菌侵染率表型(图6中E)趋势一致。

F2：5’-CATGTTCCACGGGACAACGG-3’；

R2：5’-CACCTCGTGGCTGCTCTTGC-3’。

实施例2、玉米与菌根真菌共生基因ZmL75的功能验证(互补实验)

一、互补载体的构建

设计针对ZmL75基因的基因组序列的特异引物。具体序列为：

P1-F：5′-ATGACCATGATTACGAATTCTCACCGAGTGATTCTATTAAGCACT-3′；

P1-R：5′-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTAAATCTAAGGGGTTTAAAAGATGCA-3′。

其中，P1-F位于ZmL75基因起始密码子ATG上游2576bp，P1-R位于ZmL75基因终止密码子TAG下游881bp。P1-F的第1-20位为同源臂，P1-R的第1-20位为同源臂。

以玉米自交系B73的基因组DNA为模板，采用包含同源臂的引物对P1-F/P1-R进行PCR扩增ZmL75的基因组序列，扩增获得的PCR产物经测序显示其序列如序列表中序列6所示。其中序列6的第1-45位是引物P1-F，序列6的第5160-5204位是引物P1-R的反向互补序列，ZmL75基因起始密码子ATG位于序列6的第2621-2623位，ZmL75基因终止密码子TAG位于序列6的第 4277-4279位。采用同源重组的方式将该序列连入pCAMBIA3300中构建成为互补实验的重组表达载体。

重组表达载体p3300-ZmL75的结构描述：将pCAMBIA3300载体上的DNA片段ATGACCATGATTACGAATTC与AAGCTTGGCACTGGCCGTCG之间的小片段替换为序列6 第21-5184位所示DNA片段后得到的重组质粒。

二、玉米遗传转化实验

交由公司完成重组表达载体p3300-ZmL75向玉米自交系B104的遗传转化，具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化。遗传转化总共得到了2个独立的转基因株系 (CM1和CM2)。

三、转基因后代群体配制

为鉴定ZmL75基因的功能，将转p3300-ZmL75载体的T0代转基因植株配制成群体。

在此，将玉米基因组上正常的ZmL75基因以基因型AA表示，突变的zml75基因以基因型aa 表示。同时，将转基因阴性植株或非转基因植株的基因型以bb表示，将转基因阳性植株(即含有ZmL75基因的互补载体片段已整合到玉米基因组上)以B表示，那么转基因杂合植株的基因型是Bb，转基因纯合植株的基因型是BB。则玉米突变体S75的基因型是aabb，转化B104的转基因阳性株的基因型是AABb。

将转化B104的转基因阳性株系CM1和CM2分别给S75(aabb)授粉，获得T₁代(AaBb和Aabb)。选取基因型为AaBb的植株自交，获得T₂代。T₂代植株包含4类基因型(A_B_、Aabb、aaB_和aabb)(图8中A)，其中aaB_基因型的单株，在玉米基因组上一号染色体定位区间内的基因型为aa，由此对应的表型应为植株根部没有形成菌根结构，然而由于转基因阳性(B_)使得玉米基因组上整合了ZmL75基因，aaB_基因型的单株的表型实则应为植株根部能够形成菌根结构。

本发明检测的2个转化事件共31个aaB_基因型单株，用北京昌平轻微胁迫大田土种植，其表型均为正常生长(图8中B和C)，植株根部有丛枝菌根真菌定殖，菌根真菌侵染率较高，形成菌根结构(图8中E和F)；同时分离出的20个aabb基因型单株的表型均为苗期生长受阻，叶尖发黄枯萎(图8中B和C)，植株根部几乎没有菌根真菌侵染，不能形成菌根结构(图8中 D和F)。由此得出，转化的ZmL75基因可以互补突变体S75的菌根真菌侵染和菌根结构表型，并在轻微胁迫土壤中正常生长。

实施例3、玉米与菌根真菌共生基因ZmL75的功能验证(敲除实验)

除了上述互补实验，本发明的发明人还设计实验将玉米菌根真菌共生正常的植株中的 ZmL75基因进行编辑。具体是采用CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats associated 9)基因编辑系统，对玉米受体植株中ZmL75基因的基因组序列进行定点编辑。CRISPR-Cas9技术可针对基因组上特定位点DNA进行切割，利用生物体对DNA 链的修复无法每次都保证100％正确的特点，重新连接的DNA链在序列上与未被切割前会产生差异，从而使得基因序列发生变化，其编码的蛋白质也随之变化。

具体到本实验中，根据CRISPR-Cas9系统的特点，选取ZmL75基因的第一外显子上含有 Nco I酶切位点的特定序列做为sgRNA(single guide RNA)靶点序列，并将其连入到pBUN411 载体(除草剂抗性)，构建成为ZmL75基因敲除载体，并采用农杆菌介导的方法转化玉米受体综31。该部分的载体构建和玉米遗传转化工作是委托天津吉诺沃生物科技有限公司完成的。具体操作如下：

(1)设计靶位点

5’-GCTCATCTTCGCGTCCATGGCGG-3’(即序列6的第2875-2897位)。

由于该靶位点序列中含有Nco I酶切识别序列(斜体的序列)，可以被Nco I限制性内切酶切割。靶序列区域被CRISPR-Cas9核酸酶识别切割，自身修复后，如果发生了突变，则Nco I酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶Nco I切割；如果没有发生突变，将可以被限制性内切酶Nco I切割。

(2)用限制性内切酶Bsa I酶切pBUN411载体，回收约12.4kb的载体骨架，命名为BUN411。

(3)根据步骤(1)设计的靶位点序列，合成如下带有粘性末端(下划线部分)的引物：

ZmL75F：5’-ggcgGCTCATCTTCGCGTCCATGG-3’；

ZmL75R：5’-aaacCCATGGACGCGAAGATGAGC-3’。

(4)将ZmL75F和ZmL75R进行退火，形成有粘性末端的双链DNA，将其和步骤(2)中的胶回收产物BUN411连接，得到重组质粒pBUN411-ZmL75。重组质粒pBUN411-ZmL75的结构描述为：将pBUN411质粒的两个限制性内切酶Bsa I的识别序列之间的片段(约1.1kb)替换为DNA片段“5’-GCTCATCTTCGCGTCCATGG-3’”后所得的重组质粒。

(5)将构建好的重组质粒pBUN411-ZmL75通过农杆菌转化的方法导入玉米材料综31。以综31未成熟胚及愈伤组织为转化受体，转化后经过组织培养获得完整再生植株。

经过转化pBUN411-ZmL75获得完整的转基因植株后，提取转基因植株基因组DNA，用能够扩增含有靶位点序列的特异引物对T3-F/T3-R进行PCR扩增，PCR产物用Nco I单酶切。

T3-F：5′-ATGCAAAACACACCAGAAAGC-3′(序列6的第2494-2514位)；

T3-R：5′-ACAATGTCCGTGCCGATGTA-3′(序列6的第3059-3078位的反向互补序列)。

以转基因植株的基因组DNA为模板，扩增获得的PCR产物用Nco I酶切后经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。如果PCR产物完全可以被Nco I酶切，则说明该位点没有发生变异，称之为转基因阴性；如果PCR产物部分可以被Nco I酶切，则说明该位点一条链发生变异，另一条链没有发生变异，是杂合突变，称之为转基因阳性；如果PCR产物完全不能被Nco I酶切，则说明该序列已经发生纯合突变，ZmL75基因被定点编辑成功，称之为转基因阳性(图9)。本实施例共获得PCR产物完全不能被Nco I切开的株系17个。选取其中4个株系(分别命名为CC1、CC2、CC3、CC4)的PCR产物测序，以翻译起始位点为+1bp，CC1株系在第271bp后插入1bp， CC2株系在第270bp后缺失1bp，CC3株系在第268bp后缺失4bp，CC4株系在第249bp后缺失 48bp，造成了移码突变或重要结构域氨基酸残基的缺失(图10中A)。实验同时设置了转基因阴性的对照，向玉米材料综31导入了pBUN411空载体的对照，以及未转基因的玉米材料综31野生型对照。每种实验材料的供试植株数不少于30株。

结果显示：转基因阳性株系CC1-CC4在用昌平轻微胁迫大田土种植下均表现为生长受到抑制，而玉米受体材料综31可正常生长(图10中B)。对转基因株系CC2、CC4进行qRT-PCR 检测，其ZmL75基因相对表达量与玉米受体材料综31相比呈极显著性下降(图10中C)。与玉米受体材料综31的根系可正常被丛枝菌根真菌侵染形成菌根结构相比，转基因阳性植株的根系不能形成菌根结构(图11中A和B)，侵染率极显著性下降(图11中C)。与综31结果相似，空载对照和转基因阴性对照植株均可以正常生长，并且根系能够观察到菌根结构。

由此得出，ZmL75基因被敲除会导致玉米丧失与丛枝菌根真菌共生并形成菌根结构的能力，表现为在轻微胁迫土壤中无法正常生长的表型。

实施例4、玉米基因ZmL75在拟南芥中的功能

首先构建CaMV35S启动子驱动ZmL75基因过量表达的载体，设计针对ZmL75基因的cDNA序列的特异引物。具体引物序列为：

L917-F：5′-AGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGGGCGACGACGACGGTGATGG -3′；

L917-R：5′-CCCTTGCTCACCATGGTACCGCAGCCCATGGCCTTGTTTTTGTCG-3′。

其中，L917-F的第1-20位为同源臂，L917-R的第1-20位为同源臂。

提取在大田种植的八叶期L75的根系RNA，反转录成cDNA，以此为模板，采用包含同源臂的引物对L917-F/L917-R进行PCR扩增ZmL75的cDNA序列，扩增获得的PCR产物经测序显示其序列如序列表中序列7所示。其中序列7的第1-45位是引物L917-F，序列7的第1529-1573位是引物L917-R的反向互补序列，序列7的第21-1553位是玉米材料L75中ZmL75基因的cDNA序列。采用同源重组的方式将该序列连入pCAMBIA1300-35S-hGFP-Nos中构建成为重组表达载体p1300-35S-ZmL75-hGFP-Nos。

重组表达载体p1300-35S-ZmL75-hGFP-Nos的结构描述：将pCAMBIA1300-35S-hGFP-Nos 载体上的DNA片段AGAACACGGGGGACTCTAGA与GGTACCATGGTGAGCAAGGG之间的小片段替换为序列7第21-1553位所示DNA片段后得到的重组质粒。

而后将重组表达载体p1300-35S-ZmL75-hGFP-Nos转化拟南芥野生型Col-0，获得8个转基因阳性株系，记作Col-0-ZmL75。将培养10天的野生型Col-0和转基因Col-0-ZmL75植株分别转移到含有0mM、150mM、200mM NaCl的培养基上。可见在0mM NaCl的培养基上，野生型Col-0和转基因Col-0-ZmL75植株均生长良好，没有明显差异；在150mM NaCl的培养基上生长 5天的野生型部分植株叶片萎蔫变白，无法继续存活，转基因绝大部分植株的叶片仍持绿性较好，表现出比野生型耐盐的表型；在200mM NaCl的培养基上生长3天的野生型植株叶片失绿，基本全部死亡，转基因植株部分失绿死亡，部分存活(图12)。因此，在野生型拟南芥中过量表达ZmL75基因，可以提高拟南芥的耐盐能力。

此外，我们选取了在拟南芥中与玉米ZmL75基因同源的AtGPAT6基因的T-DNA插入(图13 中A)突变体atgpat6。与野生型拟南芥Col-0发育良好的角果(图13中B)相比，atgpat6表现为角果发育不良，在果荚发育前期几乎没有种子发育，果荚发育后期能够形成极少量种子的半不育表型(图13中C)。将上述重组表达载体p1300-35S-ZmL75-hGFP-Nos转化拟南芥突变体 atgpat6，经过两代抗性筛选和分子鉴定，得到7个纯合的转基因阳性株系，其大部分角果恢复了正常的表型(图13中D)。因此，ZmL75可以恢复拟南芥突变体atgpat6的角果表型。

综合以上各实施例的研究结果，可见：通过图位克隆、基因的互补实验和敲除实验，本发明克隆的ZmL75基因是调控玉米与丛枝菌根真菌共生的基因，其突变可导致玉米丧失丛枝菌根真菌共生能力，无法形成菌根结构，在轻微胁迫土壤中无法正常生长；将ZmL75基因导入该基因纯合突变的个体中，可以使玉米恢复菌根侵染和定殖的表型，形成菌根结构，并在轻微胁迫土壤中正常生长。将ZmL75基因在野生型拟南芥中过量表达，可以提高拟南芥的耐盐能力。因此ZmL75基因可以在植物抗逆改良过程中得以利用。同时，过量表达ZmL75基因还可以恢复拟南芥突变体atgpat6的角果表型，表现出基因功能的多样性。

Claims

1.ZmL75蛋白质或编码ZmL75蛋白质的核酸分子或含有编码ZmL75蛋白质的核酸分子的重组载体、表达盒或重组微生物在如下任一中的应用：

a耐盐植物育种和/或制种；

b调控玉米与菌根真菌共生并形成菌根结构的能力；

c调控植物耐盐能力；

所述ZmL75蛋白质为序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述编码ZmL75蛋白质的核酸分子的核苷酸序列为序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子、SEQ ID NO.4所示的DNA分子或序列如SEQ ID NO.7的第21-1553位所示的DNA分子。

2.培育转基因玉米的方法，为如下A或B：

A培育能够形成菌根结构或者耐盐能力强的转基因玉米的方法，包括如下步骤：

a1向不能形成菌根结构或者耐盐能力弱的受体玉米中导入权利要求1中所述ZmL75蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因玉米；

a2从步骤a1所得转基因玉米中得到能够形成菌根结构或者耐盐能力强的转基因玉米；

B培育不能形成菌根结构或者耐盐能力弱的转基因玉米的方法，包括如下步骤：

b1抑制可形成菌根结构或者具有耐盐能力的受体玉米中权利要求1中所述ZmL75蛋白质的表达，得到转基因玉米；

b2从步骤b1所得转基因玉米中得到不能形成菌根结构或者耐盐能力弱的转基因玉米。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤a1中，所述编码基因是通过权利要求1中的所述重组载体导入所述受体玉米的；

步骤b1中，是通过如下实现抑制所述受体玉米中所述蛋白质的表达的：采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体玉米中权利要求1中所述ZmL75蛋白质的基因组DNA序列进行特异性剪切，使所述受体玉米丧失或降低表达有功能的ZmL75蛋白质的能力。

4.培育转基因拟南芥的方法，为如下C或D：

C培育耐盐能力增强的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：

c1向受体拟南芥中导入权利要求1中所述ZmL75蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因拟南芥；

c2从步骤c1所得转基因拟南芥中得到耐盐能力增强的转基因拟南芥；

D培育角果正常生长的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：

d1向角果不能正常生长的受体拟南芥中导入权利要求1中所述ZmL75蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因拟南芥；

d2从步骤d1所得转基因拟南芥中得到能够形成正常角果的转基因拟南芥。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤c1中，所述编码基因是通过权利要求1中的所述重组载体导入所述受体拟南芥的；

步骤d1中，所述编码基因是通过权利要求1中的所述重组载体导入所述受体拟南芥的。