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CN118203583B - 胸腺嘧啶在制备治疗或预防阿霉素致心脏损伤的药物中的应用 - Google Patents

胸腺嘧啶在制备治疗或预防阿霉素致心脏损伤的药物中的应用

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CN118203583B
CN118203583B CN202410530758.XA CN202410530758A CN118203583B CN 118203583 B CN118203583 B CN 118203583B CN 202410530758 A CN202410530758 A CN 202410530758A CN 118203583 B CN118203583 B CN 118203583B
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李培海
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Qilu University of Technology
Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
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Qilu University of Technology
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Abstract

本发明提供了胸腺嘧啶在制备治疗或预防阿霉素致心脏损伤的药物中的应用，属于抗阿霉素致心脏损伤药物技术领域，本发明首次发现胸腺嘧啶具有明显的抗阿霉素致心脏损伤的作用，本发明为抗阿霉素致心脏损伤新药物的研发提供了理论基础和实验依据。

Description

胸腺嘧啶在制备治疗或预防阿霉素致心脏损伤的药物中的 应用
技术领域
本发明属于抗阿霉素致心脏损伤药物技术领域，具体涉及胸腺嘧啶在制备治疗或预防阿霉素致心脏损伤的药物中的应用。
背景技术
阿霉素(DOX)是一种抗瘤谱较广的癌症化疗药物，但阿霉素治疗会引起药物不良反应，其中，阿霉素具有明显的心脏毒副作用，会导致心脏损伤，阿霉素心脏毒性极大地限制了其临床使用。阿霉素导致扩张型心肌病(DCM)是最常见的副作用之一，由阿霉素导致的扩张型心肌病(DCM)是难治性心血管疾病之一。扩张型心肌病主要临床特征为心室扩张、心脏收缩功能障碍、心律失常、心肌缺血、心肌细胞凋亡。有研究指出，心肌病患者心室壁逐渐变薄，通过心电图、超声等技术可以检测到患者出现心律失常和房室传导阻滞障碍等症状。扩张型心肌病预后较差。右雷佐生(DEX)是目前FDA唯一批准可以降低阿霉素引起的心肌病的药物。但右雷佐生在血浆中半衰期短，且有过敏、肝损伤等不良反应，临床应用中常受到限制。因此，治疗阿霉素致心肌病的创新药物已成为临床的迫切需求。
斑马鱼与人类基因组同源性高，与哺乳动物在心脏结构和功能上高度相似，心脏均由心房和心室组成，其舒张和收缩机制是高度保守的。和小鼠相比，斑马鱼心率(120-140次/分钟)更接近人类。由于斑马鱼幼鱼身体透明，借助绿色荧光标记心脏的转基因斑马鱼可以通过显微镜直接观察斑马鱼心脏的跳动和血液流动，并计算斑马鱼的心率、心包面积、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量、血流速度等指标快速评估心功能。而且斑马鱼对有心脏毒性的药物的表现与人类相似，心脏毒性药物会导致斑马鱼心功能出现障碍和心脏组织形态发生改变，但斑马鱼在心脏受损的情况下仍可以存活一段时间，这些优势使得斑马鱼模型成为研究心功能的优势模型。
胸腺嘧啶(Thy)是从胸腺中分离得到的一种嘧啶碱，是抗核酸代谢类抗肿瘤药物三氟代胸腺嘧啶脱氧核苷的原料。三氟代胸腺嘧啶脱氧核苷在临床上常用于治疗恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、消化道肿瘤、卵巢癌和原发性支气管肺癌等疾病的化疗中。胸腺嘧啶的心脏保护活性以及抗心肌病活性暂无报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了胸腺嘧啶在制备治疗或预防由阿霉素导致的心脏损伤的药物中的应用。
本研究利用阿霉素致心脏损伤斑马鱼模型，以斑马鱼心包面积、SV-BA距离、心率、每搏输出量、短轴缩短率、射血分数、血流速度、心脏红细胞面积、心肌细胞凋亡和心脏组织形态为评价指标，评价胸腺嘧啶的抗阿霉素致心脏损伤作用。
胸腺嘧啶在制备治疗或预防阿霉素致心脏损伤的药物中的应用。
根据本发明优选的，所述阿霉素致心脏损伤包括：心肌病、心律失常、心力衰竭。
进一步优选的，心肌病为扩张型心肌病。
根据本发明优选的，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。
进一步优选的，所述辅剂为缓释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。
根据本发明优选的，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。
一种抗阿霉素致心脏损伤的药物，有效成分包含胸腺嘧啶。
根据本发明优选的，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。
进一步优选的，所述辅剂为缓释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。
根据本发明优选的，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。
根据本发明优选的，所述阿霉素致心脏损伤包括：心肌病、心律失常、心力衰竭。
本发明的有益效果至少包括如下：
本发明首次发现胸腺嘧啶具有明显的抗阿霉素致心脏损伤的作用，如抗阿霉素致心肌病的作用，本发明为抗阿霉素致心脏损伤新药物的研发提供了理论基础和实验依据。
附图说明
图1为各组斑马鱼处理24小时后的心脏形态变化图；
图中：A给药处理24小时，各组斑马鱼形态图，其中红色虚线框表示心脏；B给药处理24小时，各组斑马鱼SV-BA距离统计图；C给药处理24小时，各组斑马鱼心包面积统计图；
DOX代表阿霉素，DEX代表右雷佐生，Thy代表胸腺嘧啶；
与空白组相比，****P＜0.0001；与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###P<0.001，####P＜0.0001。
图2为各组斑马鱼处理24小时后的心功能指标变化图；
图中：图A给药处理24小时，各组斑马鱼心脏形态图；图B给药处理24小时，各组斑马鱼心率统计图；图C给药处理24小时，各组斑马鱼射血分数统计图；图D给药处理24小时，各组斑马鱼短轴缩短率统计图；图E给药处理24小时，各组斑马鱼每博输出量统计图；
DOX代表阿霉素，DEX代表右雷佐生，Thy代表胸腺嘧啶；
与空白组相比，****P＜0.0001；与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，
###P<0.001，####P＜0.0001。
图3为各组斑马鱼处理24小时后的血流速度变化图；
图中：DOX代表阿霉素，DEX代表右雷佐生，Thy代表胸腺嘧啶；
与空白组相比，****P＜0.0001；与模型组相比，####P＜0.0001。
图4为各组斑马鱼处理24小时后的红细胞染色图；
图中：图A给药处理24小时，各组斑马鱼心脏红细胞染色图，红色虚线框内表示红细胞染色面积；图B给药处理24小时，各组斑马鱼心脏红细胞染色面积统计图；
DOX代表阿霉素，DEX代表右雷佐生，Thy代表胸腺嘧啶；
与空白组相比，****P＜0.0001；与模型组相比，####P＜0.0001。
图5为各组斑马鱼处理24小时后的心肌细胞凋亡情况(AO染色)图；
图中：红色框表示心包面积，白色箭头所指荧光点表示凋亡细胞；
DOX代表阿霉素，DEX代表右雷佐生，Thy代表胸腺嘧啶。
图6为各组斑马鱼处理24小时后的心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色)图；
图中：绿色虚线框表示斑马心包区域，白色箭头所指荧光点表示凋亡细胞；DOX代表阿霉素，DEX代表右雷佐生，Thy代表胸腺嘧啶。
图7为斑马鱼经DOX+Thy处理24小时后的心脏组织病理情况图；
图中：蓝色箭头表示细胞间间隙正常，心肌细胞排列紧密；绿色箭头表示细胞间间隙较大，心肌细胞排列紊乱；
DOX代表阿霉素，Thy代表胸腺嘧啶。
图8为斑马鱼经DOX+Thy处理24小时后的差异基因聚类情况图；
图中：图A DOX-vs-Control组和Thy-vs-DOX组的veen图；图B DOX-vs-Control组和Thy-vs-DOX组差异表达基因火山图；
DOX代表阿霉素，Thy代表胸腺嘧啶。
图9为RNA-Seq检测斑马鱼经DOX+Thy处理后的基因表达谱图；
图中：图A DOX-vs-Control组KEGG图；图B Thy-vs-DOX组KEGG图；图C Thy-vs-DOX组GO图；图A-B中红色框线表示富集的与心功能相关的通路；
DOX代表阿霉素，Thy代表胸腺嘧啶。
图10为胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼PPAR信号通路相关基因表达水平的影响图；
图中：DOX代表阿霉素，Thy代表胸腺嘧啶；
与空白组相比，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001；与DOX组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。
图11为胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼铁死亡通路相关基因表达水平的影响图；
图中：DOX代表阿霉素，Thy代表胸腺嘧啶；
与空白组相比，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001；与DOX组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细阐述，但本发明的保护范围不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
发明人对多种化合物进行了抗阿霉素致心脏损伤的活性筛选评价，发现其中的化合物胸腺嘧啶具有明显的抗阿霉素致心脏损伤的作用。
1 实验材料
1.1 实验动物
本实验所用野生型AB斑马鱼和心脏标记绿色荧光转基因斑马鱼Tg(cmlc2：EGFP)，可由国家斑马鱼资源中心购买，可采用普通市售产品。斑马鱼成鱼在(28±0.5)℃下饲养，明暗周期为14h/10h，每日喂食2次。于前一天晚间选择健康的成年斑马鱼以雌雄比例2∶2放入排卵盒，次日亮灯时抽板，2h内收集鱼卵，鱼卵在28℃恒温光照培养箱中培养至受精后48hpf。
1.2药物与主要试剂
阿霉素(CAS号：23214-92-8，批号：A396641337769)购自美国APE×BIO公司、右雷佐生(CAS号：24584-09-6，批号：0448942-18)购自美国Cayman公司、胸腺嘧啶(CAS号：65-71-4，批号：C14851700)购自上海麦克林生化科技股份有限公司，3种化合物均用二甲基亚砜配制成母液，使用时再用新鲜E3培养液稀释成工作液。甲基纤维素(CAS号：9004-67-5，批号：Q22J9F63939，250g)购自上海源叶生物科技有限公司、二甲基亚砜(CAS号：67-68-5，批号：F508BA0021，500mL)购自生工生物工程股份有限公司、亚甲基蓝(CAS号：7220-79-3，批号：20110520，25g)、吖啶橙(AO)染色剂(货号：SigmaA6014)购自美国Sigma公司。E3培养液中含有5mmol/L NaCl、0.17mmol/L KCl、0.4mmol/L CaCl2和0.16mmol/L MgSO4。
1.3实验仪器
斑马鱼养殖系统(北京爱生科技有限公司)；HPG280BX光照培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；Zeiss AXIO zoom V16体视荧光显微镜(德国卡尔蔡司)；OLYMPUS倒置荧光显微镜(奥林巴斯(中国)有限公司)；电子分析天平(海梅特勒-托利多仪器有限公司)；LightCycler 96荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。
2 实验方法
2.1 药物分组
挑选48hpf时发育正常的Tg(cmlc2：EGFP)斑马鱼，放入24孔板中，每孔15尾幼鱼。根据预实验，设置空白对照组(加入新鲜E3培养液)、阿霉素造模组(60μM DOX)、右雷佐生阳性药组(60μM DOX+10μM DEX)、胸腺嘧啶药物处理组(60μM DOX+10、20、40μM Thy)。每个组设3个重复孔，放置于光照培养箱中恒温(28℃)孵育24h。
2.2胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心脏形态的影响
给药24小时后，将斑马鱼用麻醉剂(质量浓度为0.3％的三卡因)进行麻醉，然后用4％甲基纤维素固定。麻醉后在立体倒置显微镜下从侧面拍照，拍摄并记录各组斑马鱼幼鱼的心脏形态，利用Image-Pro Plus 6.0软件测量静脉窦-动脉球(SV-BA)距离和心包面积。
2.3胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心功能指标的影响
给药24h后，将斑马鱼用4％甲基纤维素固定，固定后在倒置荧光显微镜下记录斑马鱼俯卧位心跳视频，提取心室舒张末期和收缩末期图片。利用Image-Pro Plus 6.0软件测量斑马鱼舒张末期和收缩末期长轴、短轴长度，计算射血分数、短轴缩短率、每搏输出量，具体计算公式如(1)、(2)、(3)、(4)所示。
(1)心室体积＝0.523×短轴长2×长轴长
(2)
(3)每搏输出量＝舒张末期体积-收缩末期体积
(4)
2.4胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼血流速度的影响
给药24小时后，将斑马鱼用麻醉剂进行麻醉，再用4％甲基纤维素进行固定。用血流仪对斑马鱼动脉进行血流速度检测，使用zebrbloodTM(v1.3.2,ViewPoint,Lyon,France)分析血流视频，该软件可以通过检测像素密度的变化，并将其与血管直径相结合，以nl/s的速度生成每帧的流量。
2.5胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心脏红细胞的影响
给药24h后，用1mg/mL邻联茴香胺染液对斑马鱼幼鱼染色20min，每组随机挑选10条幼鱼于体视荧光显微镜下观察心脏区域红细胞情况并拍照。用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件进行定量分析心脏红细胞染色面积，从而评价其抗心肌缺血功能。
2.6心肌细胞凋亡检测(AO染色/TUNEL染色)
吖啶橙(AO)染色：野生型斑马鱼AB受精后48小时，挑选发育正常的斑马鱼幼鱼，放入24孔板中，每孔15尾幼鱼。给药24h后，将配置好的吖啶橙(AO)母液加入各组斑马鱼对应的孔板中至终浓度为5μg/mL，于28℃培养箱中孵育30min，然后用PBS冲洗3遍。将斑马鱼放于体视荧光显微镜下进行拍照，观察心脏部位凋亡细胞数量。
TUNEL染色：野生型斑马鱼AB受精后48小时，挑选发育正常的斑马鱼幼鱼，放入24孔板中，每孔15尾幼鱼。给药24h后，加入3mL 4％多聚甲醛固定，放置在4℃冰箱过夜。加入0.3％TritonX-100和柠檬酸钠抗原修复液(1X)以1：300的比例混合在一起，每孔加入3mL的混合液，放入4℃冰箱孵育10min。PBS清洗后，将Tdt酶和荧光标记液以1：10的比例混合在一起，之后每个离心管中加入50μL的混合液，在37℃恒温箱中避光孵育1.5h。最后，吸干离心管中的混合液，加入1mL的PBS，避光摇床5min，转速90rpm，重复三次。将斑马鱼幼鱼放于体视荧光显微镜下进行拍照，观察心脏部位凋亡细胞数量。
2.7心脏组织病理学检测
给药24h后，从空白对照组、阿霉素造模组(60μM)、药物处理组(20μM Thy+60μMDOX)中随机各取10条斑马鱼幼鱼，用4％的多聚甲醛固定液进行固定，然后经过乙醇梯度脱水后浸泡在二甲苯中至透明，随后进行石蜡包埋、切片，将切片依次经过二甲苯、无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中脱蜡至水，随后进行苏木素-伊红染色(HE染色)，再进行脱水封片后，在显微镜下观察组织切片并对心脏组织进行拍摄记录。
2.8RNA-Seq测序检测斑马鱼体内差异基因变化
给药24h后，从空白对照组、阿霉素造模组、药物处理组(20μM Thy)中各随机挑选90条鱼，用无酶水清洗三遍后收样。使用TRIzol试剂按照制造商的方案提取总RNA，进行RNA纯度和定量检测，然后使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,SantaClara,CA,USA)进行RNA完整性评估，根据TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit(Illumina,San Diego,CA,USA)的说明构建文库，整个RNA-Seq测序和分析过程由欧易生物技术有限公司(中国上海)完成。
2.9RT-qPCR检测相关基因表达水平变化
给药24h后，从空白对照组、阿霉素造模组、药物处理组(DOX+20μM Thy)各随机挑选30条斑马鱼，用无酶水清洗三遍后收样。按说明书使用RNA提取试剂盒提取各组斑马鱼样本的总RNA，使用逆转录试剂盒和梯度PCR仪进行逆转录，获得各组斑马鱼样本的cDNA。使用RT-qPCR检测试剂盒在96上进行定量实时RT-qPCR。运行程序为：95℃预变性1分钟，每个循环变性95℃20秒，退火55℃20秒，延伸72℃30秒，共45次循环。β-actin为内参基因。本文中所使用的基因引物序列见表1。
表1RT-qPCR相关引物序列
2.10数据分析
实验数据用mean±SD表示，采用T检验进行统计学差异分析。P＜0.05代表有显著性差异，P＜0.01代表有极显著性差异。使用GraphPad Prism 8.0和Image-Pro Plus 6.0软件进行统计分析。
3实验结果
3.1胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心脏形态的影响
斑马鱼心包面积大小的改变，可以直接反映出斑马鱼心脏的异常；心脏S环拉开导致动脉球-静脉窦(SV-BA)距离变长，因此，发明人利用心包面积和SV-BA距离可以直接观察到斑马鱼心脏是否发生异常。如图1中A所示，与对照组比较，阿霉素造模组幼鱼心包水肿明显(红色虚线表示)，SV-BA距离明显变长，提示造模成功。与阿霉素造模组相比，右雷佐生阳性药组心包面积减小，SV-BA距离变短。10、20、40μM的Thy均对阿霉素导致的心包水肿(图1中B)、SV-BA增长有改善作用(图1中C)，都能够使心包面积减小、SV-BA距离变短，20μM浓度下抗阿霉素致心包水肿、SV-BA距离变大效果最为显著。
3.2胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心功能的影响
扩张型心肌病患者临床表现为心律失常、心室扩张、心脏收缩功能障碍，斑马鱼的心率、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量指标反应心脏心律、心室扩张、心脏收缩功能，可以利用这些指标评价胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心功能的影响。
如图2中A所示，给药24h后，阿霉素造模组斑马鱼心脏形态发生改变。与空白对照组相比，阿霉素造模组斑马鱼心率、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量标显著下降。与造模组相比，右雷佐生阳性药组心率、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量均显著升高，10μM Thy对斑马鱼的心率(图2中B)、射血分数(图2中C)无显著影响，短轴缩短率(图2中D)和每搏输出量(图2中E)上升；在Thy浓度为20μM时，斑马鱼的心率、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量均显著升高；在Thy浓度为40μM时，Thy使斑马鱼的心率、射血分数、短轴缩短率升高，但对和每搏输出量无影响。因此，浓度为20μM的Thy对DOX引起的心功能损伤具有较好的改善作用。
3.3胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼血流速度的影响
心肌病患者常常伴随心力衰竭，导致心脏泵血功能障碍，本实验通过检测血液流速，评价胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼血流速度的影响。
如图3所示，与空白对照组相比，DOX组斑马鱼血流速度显著下降。与造模组相比，右雷佐生阳性药组血流速度上升。经DOX和Thy共同处理后，血流速度较造模组有所恢复，其中当Thy浓度为20μM时，血液流速的恢复效果最为显著，Thy浓度为10、40μM时，无显著性变化。
3.4胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心脏红细胞的影响
心肌病患者临床表现为心功能减弱，常常会伴随着心肌缺血。本实验利用邻联茴香胺染色，观察红细胞数目，从而评价阿霉素是否导致心肌缺血、胸腺嘧啶是否有抗心肌缺血活性。
如图4所示，给药24h后，造模组斑马鱼幼鱼红细胞染色面积较对照组明显减小。与造模组相比，右雷佐生阳性药组红细胞染色面积变大。Thy与DOX共处理后红细胞染色面积较阿霉素造模组变大。其中当Thy浓度为20μM时，胸腺嘧啶抗阿霉素致心肌缺血效果最佳。
3.5胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心肌细胞凋亡(AO/TUNEL)的影响
吖啶橙(AO)是一种能透过细胞膜的荧光染料，凋亡细胞核染色后，染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。如AO结果所示(图5)，与对照比较，阿霉素造模组斑马鱼心脏部位出现大量荧光点，提示60μM DOX处理可使斑马鱼心脏区域发生细胞凋亡(白色箭头指示)，且出现心包水肿(红色框指示)；与阿霉素造模组比较，右雷佐生阳性药组荧光点显著减少。不同浓度Thy处理组较造模组心脏区域荧光点明显减少，其中当浓度为20μM时，效果最为显著。说明胸腺嘧啶可以减弱阿霉素导致的心肌细胞凋亡。
TUNEL染色可以标记在细胞凋亡过程中由于DNA内切酶激活而导致的DNA断裂，从而检测细胞凋亡。如TUNEL染色结果所示(图6)，与对照比较，阿霉素造模组斑马鱼心脏部位出现大量荧光点(白色箭头指示)，说明60μM DOX处理可使斑马鱼心脏区域发生细胞凋亡，且出现心包水肿；与阿霉素造模组比较，右雷佐生阳性药组心脏区域荧光点均能显著减少。不同浓度Thy处理组较造模组心脏区域荧光点均能明显减少，其中当浓度为20μM时，效果最为显著。说明胸腺嘧啶可以减弱阿霉素导致的心肌细胞凋亡。
3.6胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼心脏病理结构的影响
心肌病患者心室壁逐渐变薄，心肌细胞排列紊乱，通过HE染色可以在显微镜下观察形态变化来诊断是否发生心肌病。HE染色结果如图7所示，正常对照组斑马鱼心房心室大小正常，细胞间间隙正常，心肌细胞排列紧密(蓝色箭头指示)。造模组组斑马鱼心房心室明显肿大，细胞间间隙较大，心肌细胞排列紊乱(绿色箭头指示)。经20μM Thy处理后，与造模组相比，心包水肿明显得到改善，细胞排列较为紧密。
3.7胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼基因表达谱的影响
为了探究胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼基因表达谱的影响，进行阿霉素造模组(DOX 60μM)和药物处理组(DOX+Thy 20μM)组之间的基因表达谱比较。将P小于0.05且基因表达量差异倍数大于1.5的基因定义为差异表达基因。差异表达基因检测结果如下：图8中A为差异基因veen图，由该图可以看出空白组和阿霉素造模组共有1242个差异基因，阿霉素造模组和药物处理组共有350个差异基因，其中共同差异基因156个。图8中B为差异表达基因火山图，结果显示阿霉素造模组和空白组相比，上调差异基因806个，下调差异基因436个，药物处理组和阿霉素造模组相比，上调差异基因271个，下调差异基因79个。
(1)KEGG富集分析结果KEGG富集通路分析气泡图中横坐标为富集分值，气泡越大的通路包含的差异基因越多；P值越小，显著性越高。KEGG富集通路分析气泡图显示空白组和阿霉素造模组差异基因主要富集在铁死亡、坏死性凋亡、P53信号通路、PPAR信号通路、心肌收缩通路(图9中A)，阿霉素造模组和药物处理组差异基因主要富集在聚焦粘附、坏死性凋亡、细胞粘附分子类固醇生物合成、PPAR信号通路通路(图9中B)。阿霉素造模组和空白组与药物处理组和阿霉素造模组共同差异基因在PPAR、铁死亡、坏死性凋亡通路的富集程度较高。
(2)GO富集分析结果图9中C为阿霉素造模组和药物处理组差异基因GO功能富集分析条形图。由图9中C可以看出阿霉素造模组和药物处理组之间的差异基因主要聚集在生物过程、细胞组成和分子功能三大GO条目中。其中涉及到的生物过程包括中性粒细胞激活、炎症反应、前列腺素的生物合成过程等。细胞组成部分包括核小体、溶酶体、胞外区等。分子功能部分包括水解酶活性、甲基化酶活性、细胞因子活性等。
3.8胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼PPAR信号通路相关基因表达水平的影响
PPAR在心肌细胞中广泛表达，并参与心肌细胞能量代谢、增殖、分化、发育以及细胞死亡的调节。有研究发现，DOX可通过作用于PPAR，激活氧化应激和炎症并最终诱导细胞凋亡而引起线粒体功能障碍，此外PPAR影响心肌细胞的心脏能量代谢，从而影响心肌病。
通过RT-qPCR检测PPAR信号通路相关基因mRNA的表达水平。结果发现，与空白对照组相比，DOX组cpt1ab表达水平呈升高趋势，pparg、apoa1a、acsl5、pltp、fabp1b.1、slc27a2a、lpl的mRNA表达水平降低，与转录组结果一致。当Thy的浓度为10μM时，与DOX组相比，pparg、apoa1a、acsl5、pltp、fabp1b.1、slc27a2a、lpl的mRNA表达水平升高，cpt1ab的mRNA表达水平表达降低。当Thy的浓度为20μM时，与DOX组相比，cpt1ab的mRNA表达水平降低，apoa1a、acsl5、pltp、slc27a2a、lpl的mRNA表达水平升高，其他无显著性。当Thy的浓度为40μM时，与DOX组相比，acsl5、pltp、lpl的mRNA表达水平升高，cpt1ab的mRNA表达水平下降，其他无显著性(图10)。
3.9胸腺嘧啶对DOX致心脏损伤斑马鱼铁死亡通路相关基因表达水平的影响
铁死亡是一种非凋亡形式的调控性细胞死亡方式，其由以铁依赖性方式过量产生磷脂氢过氧化物诱导脂质过氧化和氧化损伤。有研究证明，阿霉素诱导的心肌病与铁死亡通路密切相关。
通过RT-qPCR检测铁死亡通路相关基因mRNA的表达水平。结果发现，与空白对照组相比，DOX组zgc：198419和zgc：92006表达水平呈升高趋势，tfa和si：ch211-254p-10.2的mRNA表达水平降低，与转录组结果一致。当Thy的浓度为10μM时，与DOX组相比，si：ch211-254p-10.2的mRNA表达水平升高，zgc：198419和zgc：92006的mRNA表达水平表达降低。当Thy的浓度为20和40μM时，与DOX组相比，zgc：198419和zgc：92006的mRNA表达水平表达降低，tfa和si：ch211-254p-10.2的mRNA表达水平升高(图11)。
本发明以心脏标记绿色荧光转基因斑马鱼Tg(cmlc2：EGFP)为研究对象，借助荧光显微镜观察斑马鱼心脏形态和功能。通过60μM的阿霉素干预，建立阿霉素致斑马鱼心脏损伤模型，该心脏损伤模型出现有扩张型心肌病的症状，并进一步验证了胸腺嘧啶抗阿霉素致心脏损伤的作用。结果发现，与对照组比较，阿霉素造模组斑马鱼心包水肿显著，SV-BA增大，心率、射血分数、短轴缩短率和每搏输出量显著下降，血液流速变慢，心肌细胞凋亡数目增多，心脏区域红细胞减少，心肌细胞排列紊乱；与阿霉素造模组比较，加入胸腺嘧啶后，阿霉素导致的心脏毒性得到缓解，并且与阳性药物的作用效果一致。除此之外，本研究还利用RNA-Seq获得胸腺嘧啶抗阿霉素致斑马鱼心脏损伤相关差异基因和通路，并采用RT-qPCR检测了PPAR信号通路、铁死亡通路相关基因表达，以阐明胸腺嘧啶对阿霉素致心脏损伤斑马鱼活性作用机制。以上结果为进一步研究胸腺嘧啶抗阿霉素致心脏损伤作用机制提供了理论基础和实验依据。
本发明首次发现胸腺嘧啶具有抗阿霉素致心脏损伤的作用，进一步的具有抗阿霉素致心肌病的作用。胸腺嘧啶能够抗阿霉素致心包水肿，与阿霉素造模组相比，胸腺嘧啶对心率、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量、血流速度均有提升作用，能够抗阿霉素导致的心肌缺血，减弱阿霉素导致的心肌细胞凋亡，改善阿霉素导致的心脏组织病理结构等。本发明为抗阿霉素致心脏损伤新药物的研发提供了理论基础和实验依据。

Claims (6)

1.胸腺嘧啶在制备治疗或预防阿霉素致心脏损伤的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述阿霉素致心脏损伤选自：心肌病、心律失常或心力衰竭。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，心肌病为扩张型心肌病。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述辅剂为缓释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。
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