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TW201739464A - 牛樟芝及單體羊毛甾烷３２在防治非酒精性脂肪肝中的應用 - Google Patents

牛樟芝及單體羊毛甾烷３２在防治非酒精性脂肪肝中的應用 Download PDF

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TW201739464A
TW201739464A TW106100631A TW106100631A TW201739464A TW 201739464 A TW201739464 A TW 201739464A TW 106100631 A TW106100631 A TW 106100631A TW 106100631 A TW106100631 A TW 106100631A TW 201739464 A TW201739464 A TW 201739464A
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TW106100631A
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Rong Qi
Lu Xu
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Univ Beijing
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Abstract

本發明公開了牛樟芝及單體羊毛甾烷32在防治非酒精性脂肪肝中的應用。本發明所提供的牛樟芝及單體羊毛甾烷32的新用途具體為牛樟芝或牛樟芝的子實體提取物或從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物或羊毛甾烷32或者含有上述各物質的物質在製備用於治療和/或預防非酒精性脂肪肝的產品中的應用。實驗證明，牛樟芝及單體羊毛甾烷32能夠使得非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積量降低、總甘油三脂含量降低、炎症因子和纖維化相關因子的表達水平降低，並降低血清中4-羥基壬烯醛的含量，還能防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積，以及體重和肝臟重量增加。可見牛樟芝及單體羊毛甾烷32對於防治非酒精性脂肪肝具有重要作用。

Description

牛樟芝及單體羊毛甾烷32在防治非酒精性脂肪肝中的應用
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種牛樟芝及單體羊毛甾烷32的新用途，具體為牛樟芝及單體羊毛甾烷32在防治非酒精性脂肪肝中的應用。
非酒精性脂肪肝又稱非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，是一種肝組織學改變與酒精性肝病相類似，但無過量飲酒史的臨床病理綜合征。其病理變化隨病程的進展而表現有單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。近年來NAFLD的發病率呈明顯的上升趨勢，已成為發達國家第一大慢性肝病及肝功能異常的首要病因，普通成年人NAFLD患病率為17%~33%。
目前，無論是酒精性脂肪肝(AFLD)還是NAFLD都無獲批上市的特效藥。由於脂肪肝不作為一個獨立疾病存在，目前脂肪肝的治療通常根據其發病原因，如酒精過量攝入、肥胖、糖尿病等，針對其原發病因進行治療，並堅持體育鍛煉和合理飲食，藥物僅其到輔助治療的作用。但是，由於治療原發類疾病的藥物(如降脂類藥物、降糖類藥物、減肥藥等)存在嚴重程度不等的副作用，在治療脂肪肝的同時，可能增加心臟和腎臟的毒性，且其中一些藥物可能存在加重肝臟代謝負擔，增加脂質在肝 臟中沉積的作用。因此，研究專門針對脂肪肝治療的、安全有效的藥物對脂肪肝的臨床治療不僅必須，而且意義重大。
已有的研究表明牛樟芝具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等方面的藥理學活性。研究者發現牛樟芝抗腫瘤的作用機制與其高p53路徑中Fas/APO-1的表達水平及泛素膜蛋白、可溶性泛素配體的含量和調節Bcl-2家族蛋白的表達，從而促進線粒體途徑的凋亡有關；抗炎機制與其抑制細胞外信號調節蛋白激酶系統和JNK信號轉導系統的磷酸化有關；而抗氧化與其上調肝臟中的谷胱甘肽酶，維持氧化型與還原型谷胱甘肽的比例，清除氧自由基，減少脂質過氧化作用有關。
國內一般人會將牛樟芝作為傳統中藥，用來解酒和保肝。牛樟芝對酒精引起的肝損傷的保護作用機制在於：1)下調脂質合成與代謝相關基因(SREBP1c、ACC1和PPAR α)的表達，有效減少慢性酒精攝入引起的肝臟脂質沉積，同時降低大鼠血清中AST和ALT的含量；2)降低血清/肝臟MMP-9的活性、TNF α、KLF-6以及TGF-β 1的表達；3)減少由酒精引起的ROS和NO的快速增加，並降低HO-1 mRNA的表達水平；4)上調酒精代謝的關鍵酶ALDH2的蛋白表達量，增加酒精在肝臟中的代謝速率。
牛樟芝的子實體及菌絲體的提取物中包括多糖、甾體、三萜類和苯類化合物。其中，三萜類化合物(包括麥角甾烷和羊毛甾烷)是牛樟芝的主要活性成分。
目前為止，尚未有將牛樟芝及單體羊毛甾烷32用於研究防治非酒精性脂肪肝的相關報導。
本發明的目的是提供一種牛樟芝及單體羊毛甾烷32的新用途。
本發明所提供的新用途具體為牛樟芝或牛樟芝的子實體提取物或從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物或羊毛甾烷32或者含有上述各物質(牛樟芝或牛樟芝的子實體提取物或從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物)的物質在如下(A)或(B)中的應用：(A)製備用於治療和/或預防非酒精性脂肪肝的產品；(B)治療和/或預防非酒精性脂肪肝。
更加具體的，為如下任一中的應用：(a)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積；(b)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂(TG)含量的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂(TG)含量；(c)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平(如mRNA表達水平)的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平(如mRNA表達水平)；(d)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-羥基壬烯醛(4-HNE)的含量的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-羥基壬烯醛(4-HNE)的含量； (e)製備用於防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積的產品，或防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積；(f)製備用於防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重量增加的產品，或防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重量增加。
相應的，本發明還請求保護一種產品，其活性成分為牛樟芝和/或牛樟芝的子實體提取物和/或從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物和/或羊毛甾烷32；所述產品具有如下功能中的至少一種：(a1)治療和/或預防非酒精性脂肪肝；(a2)降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積；(a3)降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂(TG)含量；(a4)降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平(如mRNA表達水平)；(a5)降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-羥基壬烯醛(4-HNE)的含量；(a6)防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積；(a7)防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重量增加。
進一步，所述炎症因子具體為TNF α和/或IL-1 β。所述纖維化相關因子具體為TGF-β和/或Smad2。
在本發明中，所述機體具體為小鼠。相應的，所述非酒精性脂肪肝為如下(I)或(II)：(I)由於蛋氨酸、膽鹼缺乏飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝； (II)由於高脂飼料誘導的小鼠非酒精性脂肪肝。
其中，所述產品可為藥物。
在本發明中，牛樟芝或牛樟芝的子實體提取物或羊毛甾烷32所體現出來的在治療和/或預防非酒精性脂肪肝方面的作用是由乙醛脫氫酶2(ALDH2)所介導的。
在本發明中，所述羊毛甾烷32的結構式如式I所示：
在本發明中，所述牛樟芝的子實體提取物具體可按照“Xue Qiao,Qi Wang,Shuai Jia,et al.Metabolites identification and multi-component pharmacokinetics ofergostane and lanostane triterpenoids in the anticancer mushroomAntrodia cinnamomea.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 111(2015)266-276”一文中記載的方法製備獲得。
在本發明的實施例中，所述牛樟芝的子實體提取物或所述羊毛甾烷32的用量約為500mg/kg體重。
本發明實驗證明，牛樟芝及單體羊毛甾烷32能夠使得非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積量降低、總甘油三脂降低、炎症因子和纖維化相關因子的表達水平降低，並降低血清中4-羥基壬烯醛的含量，還能防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積，以及體重和肝臟 重量增加。可見牛樟芝及單體羊毛甾烷32對於防治非酒精性脂肪肝具有重要作用，在對非酒精性脂肪肝的防治中具有應用前景。
第1圖為AC對MCD飲食誘導的非酒精性脂肪肝的抵抗作用。A為小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色；B為小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定結果。**P<0.01，n=10。
第2圖為AC對MCD飲食誘導的非酒精性脂肪肝肝臟炎症及纖維化相關因子的保護作用。A為小鼠肝臟炎症因子TNF α和IL-1 β的mRNA水平表達量；B為小鼠肝臟纖維化因子TGF-β和Smad2的mRNA水平表達量。*P<0.05，**P<0.01，n=10。
第3圖為AC對MCD飲食誘導的ALDH2 KO小鼠非酒精性脂肪肝無明顯抵抗作用。A為小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色；B為小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定結果。**P<0.01，n=7。
第4圖為DEA32對MCD飲食誘導的非酒精性脂肪肝的抵抗作用。A為小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色；B為小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定結果。**P<0.01，n=10。
第5圖為DEA32對MCD飲食誘導的非酒精性脂肪肝小鼠血清4-HNE水平具有下調作用。*P<0.05，**P<0.01，n=5。
第6圖為AC對HFD誘導的非酒精性脂肪肝引起的體重、肝重升高具有預防及逆轉作用。A、B分別為AC對HFD小鼠體重、肝重的預防保護作用；C、D分別為AC對HFD小鼠體重、肝重的逆轉保護作用。*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001，n=7。
第7圖為AC對HFD誘導的非酒精性脂肪肝具有預防與逆轉治療作用。A為AC對HFD小鼠預防作用實驗肝臟冰凍切片油紅O染色；B為AC對HFD小鼠逆轉作用實驗肝臟冰凍切片油紅O染色。n=7。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
牛樟芝：記載於“Xue Qiao,Qi Wang,Shuai Jia,et al.Metabolites identification and multi-component pharmacokinetics ofergostane and lanostane triterpenoids in the anticancer mushroomAntrodia cinnamomea.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 111(2015)266-276”一文，公眾可從申請人處獲得，僅可用于重複本發明的實驗使用。
牛樟芝的子實體提取物(簡稱AC)：具體的製備方法參見“Xue Qiaoa,Qi Wanga,Shuai Jia,et al.Metabolites identification and multi-component pharmacokinetics ofergostane and lanostane triterpenoids in the anticancer mushroomAntrodia cinnamomea.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 111(2015)266-276”一文。
羊毛甾烷32(簡稱DEA32)：結構式如式I所示，具體的製備方法及結構鑒定參見“Xue Qiaoa,Qi Wanga,Shuai Jia,et al.Metabolites identification and multi-component pharmacokinetics ofergostane and lanostane triterpenoids in the anticancer mushroomAntrodia cinnamomea.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 111(2015)266-276”一文。
實施例1、牛樟芝的子實體提取物(AC)/羊毛甾烷32(DEA32)對蛋氨酸、膽鹼缺乏(methionine choline deficient diet，MCD)飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝的抑制作用
一、蛋氨酸、膽鹼缺乏(methionine choline deficient diet，MCD)飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝模型的製備
8周齡的雄性C57BL/6(斯貝福(北京)生物技術有限公司)或C57BL/6背景乙醛脫氫酶敲除(ALDH2 KO)小鼠(來自Jackson Laboratory，由北京大學心血管所繁殖)，體重平均25g，使用大小鼠普通繁殖飼料(軍事醫學科學院實驗動物中心喂飼同時，加入MCD飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司，其產品目錄號為TP36006)過渡3天后，給予單純MCD飼料喂飼同時灌胃0.5%(0.5g/100ml)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)200μL(200μL是每只小鼠每天的用量)連續7天，得到MCD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型。
二、牛樟芝的子實體提取物(AC)/羊毛甾烷32(DEA32)對MCD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的抑制作用研究
1、試驗分組及處理
含有AC的0.5% CMC-Na的配製：稱取一定質量的AC，超聲溶解於0.5% CMC-Na，使AC濃度為50mg/mL。
含有DEA32的0.5% CMC-Na的配製：稱取一定質量的DEA32，超聲溶解於0.5% CMC-Na，使DEA32濃度為25mg/mL。
給藥實驗組：步驟一製備的MCD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型，分為C57BL/6小鼠和C57BL/6背景乙醛脫氫酶敲除(ALDH2 KO)小鼠兩種。將以上配製好的含有AC/DEA32的0.5% CMC-Na在給予單純MCD飼料喂飼同時每天給每只小鼠灌胃200μL(折合約500mg/kg體重/天，其中500mg指的是AC/DEA32的質量)，這樣連續7天。
給藥對照組：步驟一製備的MCD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型，分為C57BL/6小鼠和C57BL/6背景乙醛脫氫酶敲除(ALDH2 KO)小鼠兩種。給MCD飼料連續7天每天每只小鼠灌胃0.5% CMC-Na 200μL。
陰性對照組：正常未經任何處理的C57BL/6小鼠和C57BL/6背景乙醛脫氫酶敲除(ALDH2 KO)小鼠，使用大小鼠普通繁殖飼料喂飼同時，每天每只小鼠灌胃0.5% CMC-Na 200μL。
2、動物處死取材
將各組(給藥組和對照組)小鼠在第8天處死前，過夜禁食，處死前小鼠稱重，並用毛細管內眥取血，然後用PBS對小鼠進行灌流沖洗。完整分離小鼠肝臟，稱量肝臟總重。留取同一部位肝臟作為肝臟脂質抽提用，稱量該部分肝臟重量後放入離心管中液氮凍存，-80℃保存備用；留取另一塊被膜完整光滑肝臟用於組織形態學實驗固定用，其餘肝臟裝入潔淨的離心管中迅速凍入液氮中，-80℃保存。全血37℃孵育10分鐘後，4000rpm離心10分 鐘，取上清備用。
3、AC對MCD誘導非酒精性脂肪肝的肝臟內脂質沉積的保護作用研究
本研究中的給藥實驗組(MCD+AC)和給藥對照組(MCD)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的MCD誘導C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。具體的給藥為AC。
(1)小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色
取材後小心取一部分新鮮肝組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定30分鐘時取出一部分肝臟轉移至20%蔗糖溶液中，過夜後用OCT包埋，放入液氮中冷凍，進行冰凍切片，每一片7μm厚。即制得冰凍切片。
將冰凍切片用PBS沖洗2次；4%多聚甲醛固定5分鐘(甲醛溶液即福馬林稀釋10倍即為4%多聚甲醛)；雙蒸水2分鐘×3次；60%異丙醇10分鐘(脫水)；油紅O中染色30分鐘；60%異丙醇中迅速過數次(1分鐘)；雙蒸水中迅速過數次(保存在水中即可)；蘇木精染細胞核1分鐘；雙蒸水中迅速過數次；90%甘油封片；照相。可通過染色深淺判斷肝細胞內脂質沉積多少(肝細胞內的脂肪滴呈紅色，細胞核呈紫色。紅顏色越多越深說明肝細胞內脂質沉積越多)。
其中，油紅O配製方法如下：0.5%儲存液(母液)由1g油紅O粉末加入200mL異丙醇製成。60%工作液是將母液(6份)加入雙蒸水(4份)中，激烈震盪，靜置10分鐘後過濾使用(現用現配，2小時內用完)。
(2)小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定
另取一塊新鮮肝組織用作肝臟脂質抽提，稱重，放入1mL預冷的PBS中勻漿，將勻漿液轉移至10mL乾淨、乾燥的玻璃管中，加入2：1(體積比)的氯仿/甲醇4mL，充分渦旋30s後，4℃ 2000rpm離心30min。將上層水相轉移至新玻璃管中稱為水相管，轉移下層有機相至另一套新玻璃管中稱為有機管。往水相管中加入2：1(體積比)的氯仿/甲醇3mL，充分渦旋30秒，4℃ 2000rpm離心30min。將下層有機相轉移至有機管中，通風櫥氮氣吹幹。加入500μL濃度為3%(體積百分含量)的TritonX-100，反復吹打，恒溫50℃搖床震盪30分鐘，使脂質溶解，測總膽固醇(TC)、總甘油三脂(TG)含量，再除以用於脂質抽提的肝臟重量，作為肝細胞內脂質含量。
(3)結果
結果如第1圖所示，圖中A為小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色結果，MCD飲食喂飼7天后，由於小鼠肝臟極低密度脂蛋白合成與分泌收到限制，導致肝臟合成的TG外排有障礙，造成肝臟脂質沉積，油紅O染色顯著(MCD組)。同時給予AC灌胃組(MCD+AC組)油紅O染色顯著減少至陰性對照組(NS組)；圖中B為小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定結果，與油紅O染色結果相同，MCD飲食組小鼠肝臟TG含量顯著性增加，而同時給予AC灌胃組(MCD+AC組)肝臟TG水平回復至陰性對照組(NS組)所示的正常水平。
以上結果表明：AC對MCD飲食誘導的非酒精性脂肪肝模型的肝臟內脂質沉積具有保護作用，對於降低非酒精性脂肪肝患者肝臟內的脂質沉積具有重要作用。
4、AC對MCD誘導非酒精性脂肪肝的肝臟內炎症因子及纖維化相關因子的mRNA水平的抑制作用研究
本研究中的給藥實驗組(MCD+AC)和給藥對照組(MCD)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的MCD誘導C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。具體的給藥為AC。
(1)小鼠肝臟RNA提取及即時定量PCR
取一小部分-80℃保存的小鼠肝臟，用消毒無RNA酶的器械取出組織，迅速在預冷的PBS中沖洗乾淨，裝入離心管置於液氮中。在勻漿管中加入Trizol，每50-100mg的組織所需Trizol 1mL。組織從液氮中取出，立即倒入裝有Trizol的勻漿管中，勻漿。把勻漿後的樣品移入乾淨的離心管中，室溫靜置5分鐘。4℃ 12000rpm離心10分鐘，取上清至新的離心管中。每管加入200μL新鮮氯仿(提前放入冰箱)，用手劇烈震盪15秒，室溫靜置3分鐘。4℃ 12000rpm離心15分鐘。
此時液體分為三層，小心吸取上層液體並轉移至新的離心管中，注意不要吸到介面相的DNA和蛋白質。每管加入與上清等體積的新鮮異丙醇，反復顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃ 12000rpm離心15分鐘。此時可見管底有白色片狀沉澱。棄掉上清，加入預冷的用DEPC水配置的75%乙醇1mL進行洗滌，渦旋使沉澱懸起。4℃ 7500rpm離心5-10分鐘。小心倒掉上層液體(乙醇)。
小心吸掉殘餘的乙醇，冰上靜置直至乙醇完全揮發乾淨。加入適當體積(20-50μL)的DEPC水溶解RNA，難溶的RNA可置於55℃水浴5分鐘。使用RNA電泳和紫外分光光度計分別檢測RNA的質量和豐度。根據EvaGreen qPCR MasterMix(加拿大abm公司)提供的上樣體系進行即時定量RT-PCR。
其中，用於檢測肝臟炎症因子TNFα的引物序列如下：TNFα-F：5’-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3’；TNFα-R：5’-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3’。
用於檢測肝臟炎症因子IL-1β的引物序列如下：IL-1β-F：5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’；IL-1β-R：5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’。
用於檢測肝臟纖維化相關因子TGF-β的引物序列如下：TGF-β-F：5’-TCGACATGGATCAGTTTATGCG-3’；TGF-β-R：5’-CCCTGGTACTGTTGTAGATGGA-3’。
用於檢測肝臟纖維化相關因子Smad2的引物序列如下：Smad2-F：5’-AAGCCATCACCACTCAGAATTG-3’；Smad2-R：5’-CACTGATCTACCGTATTTGCTGT-3’。
以β-actin為內參，用於檢測內參的引物序列如下：β-actin-F：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；β-actin-R：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。
(2)結果
結果如第2圖所示，圖中A為肝臟炎症因子TNF α和IL-1 β的mRNA水平表達量檢測結果，與陰性對照組(NS)相比，MCD飲食7天后，肝臟內TNF α和IL-1 β的mRNA表達量顯著增加(MCD組)，而同時給予AC灌胃(MCD+AC組)則顯著抑制該增加趨勢，使其回落到陰性對照組(NS)組水平；圖中B為肝臟纖維化相關因子TGF-β和Smad2的mRNA水平表達量檢測結構，與陰性對照組(NS)相比，MCD飲食7天后，肝臟內TGF-β和Smad2的mRNA表 達量顯著增加(MCD組)，而同時給予AC灌胃(MCD+AC組)可以顯著抑制其表達量的上調。
以上結果表明：AC對MCD誘導非酒精性脂肪肝的肝臟內炎症因子及纖維化相關因子的mRNA水平表達量具有抑制作用，對於降低非酒精性脂肪肝患者肝臟內的炎症因子及纖維化相關因子的表達水平具有重要作用。
5、AC對MCD誘導的ALDH2 KO小鼠非酒精性肝臟脂質沉積的保護作用研究
本研究中的給藥實驗組(MCD+AC)和給藥對照組(MCD)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的MCD誘導C57BL/6背景乙醛脫氫酶敲除(ALDH2 KO)小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6背景乙醛脫氫酶敲除(ALDH2 KO)小鼠。具體的給藥為AC。
(1)小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色
參見步驟3。
(2)小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定
參見步驟3。
(3)結果
結果如第3圖所示，圖中A為小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色；圖中B為小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定結果。由圖可見：與以上步驟3研究結果相比，AC對MCD誘導的ALDH2 KO小鼠非酒精性肝臟脂質沉積的保護作用消失。給予MCD飲食後，通過油紅O染色及肝臟脂質抽提，小鼠肝臟脂質沉積程度在原有的基礎上有顯著性的增加，而同時給予AC灌胃後，肝臟脂質 沉積情況並無顯著降低。該結果表明，AC對MCD誘導非酒精性脂肪肝的治療效果是由乙醛脫氫酶2(ALDH2)所介導的。
6、DEA32對MCD誘導非酒精性脂肪肝的肝臟內脂質沉積的保護作用研究
本研究中的給藥實驗組(MCD+DEA32)和給藥對照組(MCD)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的MCD誘導C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。具體的給藥為DEA32。
(1)小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色
參見步驟3。
(2)小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定
參見步驟3。
(3)結果
結果如第4圖所示，圖中A為小鼠肝臟冰凍切片油紅染色結果，MCD飲食喂飼7天后，油紅O染色顯著(MCD組)，給予DEA32同時灌胃組(MCD+DEA32組)油紅O染色顯著減少至陰性對照組(NS組)；圖中B為小鼠肝臟脂質抽提TC、TG含量測定結果，與油紅O染色結果相同，MCD飲食組(MCD組)小鼠肝臟TG含量顯著性增加，而同時給予DEA32灌胃組(MCD+DEA32組)肝臟TG水平回復至陰性對照組(NS組)所示的正常水平。
以上結果表明：DEA32對MCD誘導非酒精性脂肪肝模型的肝臟內脂質沉積具有保護作用，對於降低非酒精性脂肪肝患者肝臟內的脂質沉積具有 重要作用。
7、DEA32對MCD誘導非酒精性脂肪肝小鼠血清4-HNE的下調作用研究
本研究中的給藥實驗組(MCD+DEA32)和給藥對照組(MCD)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的MCD誘導C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。具體的給藥為DEA32。
(1)小鼠血清4-羥基壬烯醛(4-HNE)水平檢測
採用小鼠4-羥基壬烯醛(4-HNE)ELISA劑盒進行操作，該試劑盒為中國鼎盛偉業公司產品。具體步驟如下：
①標準品的稀釋。
②加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然後再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
③溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30min。
④配液：將30倍(48T)的20倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用。
⑤洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30s後棄去，如此重複5次，拍幹。
⑥加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外。
⑦溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30min。
⑧洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30s後棄去，如此重複5次，拍幹。
⑨顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色10min.
⑩終止：每孔加終止液50μL，終止反應(此時藍色立轉黃色)。
⑪測定：以空白空調零，使用酶標儀550型(美國Bio-Rad公司)450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液後15min以內進行。
根據系列已知濃度的4-HNE標準品的OD值繪製標準曲線，將待測樣品的OD值代入標注曲線，計算獲得待測樣品中4-HNE的含量。
(2)結果
結果如第5圖所示，由圖可見：與陰性對照組(NS)相比，MCD飲食7天后，小鼠血清4-HNE水平顯著增加(MCD組)，而同時給予DEA32灌胃後，血清中4-HNE水平顯著下調(MCD+DEA32)。
以上結果表明：DEA32能夠有效下調MCD誘導非酒精性脂肪肝模型的血清4-HNE，對於降低非酒精性脂肪肝患者血清中4-HNE的含量具有重要作用。
實施例2、牛樟芝的子實體提取物(AC)對高脂飼料(high fat diet，HFD)誘導的小鼠非酒精性脂肪肝的抑制作用
一、高脂飼料(high fat diet，HFD)誘導的小鼠非酒精性脂肪肝模型的製備
8周齡的雄性C57BL/6小鼠，體重平均25g，使用大小鼠普通繁殖飼料喂飼同時，加入HFD飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司，其產品目錄號為 TP23200)過渡3天后，換成完全HFD飼料喂飼，連續6周(即1.5個月，簡寫為1.5M)後，即得到HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型。
二、牛樟芝的子實體提取物(AC)對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的抑制作用研究
1、試驗分組及處理
含有AC的0.5% CMC-Na的配製：稱取一定質量的AC，超聲溶解於0.5% CMC-Na，使AC濃度為50mg/mL。
A．用於研究AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的“預防”作用
給藥實驗組：步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型，HFD飼料喂飼同時每天每只小鼠灌胃以上配製好的含有AC的0.5% CMC-Na200μL(折合約500mg/kg體重/天，其中500mg指的是AC的質量)，持續6周。
給藥對照組：步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型，給予HFD飼料喂飼同時連續6周每天每只小鼠灌胃0.5% CMC-Na 200μL。
陰性對照組：正常未經任何處理的C57BL/6小鼠，使用大小鼠普通繁殖飼料喂飼同時，每天每只小鼠灌胃0.5% CMC-Na 200μL。
B．用於研究AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的“治療”作用
給藥實驗組：步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型，HFD飼料喂飼6周後，在繼續HFD飼料喂飼同時每天給予每只小鼠灌胃以上配製好的含有AC的0.5% CMC-Na 200μL(折合約500mg/kg體重/天，其中500mg指的是AC的質量)，持續6周，整個實驗週期12周(即3個月，簡寫為3M)。
給藥對照組：步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型，給予HFD飼料喂飼同時連續12周每天每只小鼠灌胃0.5% CMC-Na 200μL。
陰性對照組：正常未經任何處理的C57BL/6小鼠，使用大小鼠普通繁殖飼料喂飼同時，每天每只小鼠灌胃0.5% CMC-Na 200μL。
2、動物處死取材
參照實施例1。
3、AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝引起的體重、肝重升高是否具有預防及治療作用的研究
本研究中用於研究AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的“預防”作用時採用的給藥實驗組(HFD+AC 1.5M)和給藥對照組(HFD 1.5M)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。
本研究中用於研究AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的“治療”作用時採用的給藥實驗組(HFD 3M with AC 1.5M)和給藥對照組(HFD 3M)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。
(1)測量各供試小鼠的體重和肝臟重量
(2)結果
結果如第6圖所示，圖中A、B分別為AC對HFD小鼠體重、肝臟重量的預防保護作用檢測結果；C、D分別為AC對HFD小鼠體重、肝臟重量的治療保護作用檢測結果。由圖中A、B可見：與陰性對照組(NS)相比，在給予HFD 6周後，小鼠體重和肝重顯著增加(HFD 1.5M組)，而同時給予AC 6周可以顯著下調體重和肝重的增加(HFD+AC 1.5M組)。由圖中C、D可見：與 陰性對照組(NS)相比，在給予HFD 12周後，體重和肝重較對照組有了更為顯著的增加(HFD 3M組)，在喂飼HFD 6周後，同時給予HFD並進行AC灌胃6周，可以顯著逆轉HFD引起的體重和肝重的增加(HFD 3M with AC 1.5M組)。
以上結果表明：AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝引起的體重、肝重升高具有預防及治療作用，AC對預防和治療由於非酒精性脂肪肝引起的體重、肝重升高重要作用。
4、AC對HFD誘導非酒精性脂肪肝的肝臟內脂質沉積是否具有預防及治療作用的研究
本研究中用於研究AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的“預防”作用時採用的給藥實驗組(HFD+AC 1.5M)和給藥對照組(HFD 1.5M)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。
本研究中用於研究AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的“治療”作用時採用的給藥實驗組(HFD 3M with AC 1.5M)和給藥對照組(HFD 3M)供試小鼠均為經過上述步驟1相應處理過的步驟一製備的HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝模型。陰性對照組(NS)供試小鼠為正常未經任何處理的C57BL/6小鼠。
(1)小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色
參見實施例1步驟3。
(2)結果
結果如第7圖所示，圖中A為AC對HFD小鼠預防作用實驗肝臟冰凍切片 油紅O染色結果；圖中B為AC對HFD小鼠治療作用實驗肝臟冰凍切片油紅O染色結果。由圖中A可見：與陰性對照組(NS)相比，在給予HFD 6周後，小鼠肝臟油紅O染色顯著增加(HFD 1.5M組)，而同時給予AC 6周可以顯著下調此增加(HFD+AC 1.5M)。由圖中B可見：與陰性對照組(NS)相比，在給予HFD 12周後，小鼠肝臟油紅O染色顯著增加(HFD 3M組)，而在喂飼HFD 6周後，同時給予HFD並進行AC灌胃6周，可以顯著逆轉HFD引起的肝臟油紅O染色的增加(HFD 3M with AC 1.5M組)。
以上結果表明：AC對HFD誘導小鼠非酒精性脂肪肝的肝臟內脂質沉積具有預防及治療作用，AC對預防和治療由於非酒精性脂肪肝引起的肝臟內脂質沉積重要作用。

Claims (10)

  1. 牛樟芝或牛樟芝的子實體提取物或從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物在如下(A)或(B)中的應用：(A)製備用於治療和/或預防非酒精性脂肪肝的產品；(B)治療和/或預防非酒精性脂肪肝。
  2. 羊毛甾烷32在如下(A)或(B)中的應用：(A)製備用於治療和/或預防非酒精性脂肪肝的產品；(B)治療和/或預防非酒精性脂肪肝。
  3. 牛樟芝或牛樟芝的子實體提取物或從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物或羊毛甾烷32如下任一中的應用：(a)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積；(b)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂含量的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂含量；(c)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平；(d)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-烴基壬烯醛的含量的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-烴基壬烯醛的含量；(e)製備用於防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積的產品，或防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積； (f)製備用於防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重量增加的產品，或防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重量增加。
  4. 含有牛樟芝的物質或含有牛樟芝的子實體提取物的物質或含有從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物的物質或含有羊毛甾烷32的物質在如下任一中的應用：(A)製備用於治療和/或預防非酒精性脂肪肝的產品；(B)治療和/或預防非酒精性脂肪肝；(a)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積；(b)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂含量的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂含量；(c)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平；(d)製備用於降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-羥基壬烯醛的含量的產品，或降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-羥基壬烯醛的含量；(e)製備用於防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積的產品，或防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積；(f)製備用於防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重量增加的產品，或防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重 量增加。
  5. 一種產品，其活性成分為牛樟芝和/或牛樟芝的子實體提取物和/或從所述牛樟芝的子實體提取物中分離獲得的單體化合物和/或羊毛甾烷32；所述產品具有如下功能中的至少一種：(a1)治療和/或預防非酒精性脂肪肝；(a2)降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內脂質沉積；(a3)降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內總甘油三脂含量；(a4)降低非酒精性脂肪肝患病機體肝臟內炎症因子和/或纖維化相關因子的表達水平；(a5)降低非酒精性脂肪肝患病機體血清中4-羥基壬烯醛的含量；(a6)防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體肝臟內脂質沉積；(a7)防止由於非酒精性脂肪肝引起的機體體重和/或肝臟重量增加。
  6. 根據權利要求3或4所述的應用或權利要求5所述的產品，其特徵在於：所述炎症因子為TNF α和/或IL-1 β。
  7. 根據權利要求3-6中任一所述的應用或產品，其特徵在於：所述纖維化相關因子為TGF-β和/或Smad2。
  8. 根據權利要求3-7中任一所述的應用或產品，其特徵在於：所述機體為小鼠；所述非酒精性脂肪肝為如下(I)或(II)：(I)由於蛋氨酸、膽鹼缺乏飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝；(II)由於高脂飼料誘導的小鼠非酒精性脂肪肝。
  9. 根據權利要求1-8中任一所述的應用或產品，其特徵在於：所述產品為藥物。
  10. 根據權利要求1-9中任一所述的應用或產品，其特徵在於：所述羊毛甾烷32是結構式如式I所示的化合物；
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