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CN118201483A - ALS抑制剂除草剂耐受的甜菜(Beta Vulgaris)突变体 - Google Patents

ALS抑制剂除草剂耐受的甜菜(Beta Vulgaris)突变体 Download PDF

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CN118201483A
CN118201483A CN202280069372.2A CN202280069372A CN118201483A CN 118201483 A CN118201483 A CN 118201483A CN 202280069372 A CN202280069372 A CN 202280069372A CN 118201483 A CN118201483 A CN 118201483A
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als
plant
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beet
protein
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CN202280069372.2A
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O·恰尔内茨基
M·格茨
J·C·莱恩
D·武布斯
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Original Assignee
KWS SAAT SE and Co KGaA
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Abstract

本发明涉及具有突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白的栽培甜菜植物或植物部分，所述突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。此类植物的特征在于对ALS抑制剂除草剂具有增加的耐受性。本发明还涉及产生此类植物的方法以及鉴定此类植物的方法。

Description

ALS抑制剂除草剂耐受的甜菜(Beta Vulgaris)突变体
发明领域
本发明涉及农作物保护的技术领域。具体地，本发明涉及对乙酰乳酸合酶(ALS)除草剂具有抗性或耐受性的甜菜植物或其部分，以及产生和/或鉴定此类植物或植物部分的方法以及此类植物或植物部分在控制不想要的植被的方法中的用途。
发明背景
乙酰乳酸合酶(ALS)是产生亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的支链氨基酸生物合成途径的重要组成部分。ALS在不同物种中都是保守的，细菌、酵母和高等植物的酶显示出显著的序列相似性(Mazur等(1987)：Isolation and characterization of plant genes-coding for acetolactate synthase，the target enzyme for 2classes ofherbicides.Plant Physiol.85，1110-1117)。有趣的是，动物没有支链氨基酸途径，因此必须在其饮食中摄入这些氨基酸。ALS是参与亮氨酸和缬氨酸生物合成循环的一系列酶中的第一个，其位于叶绿体中。在拟南芥中，AtALS形成由四个相同亚基组成的四聚体。每个亚基含有焦磷酸硫胺素(TPP)作为辅基，并催化两分子丙酮酸形成乙酰乳酸。由此，TPP与一分子丙酮酸反应形成羟乙基-TPP和CO2。TPP的羟乙基残基随后转移至第二个丙酮酸分子，并形成乙酰乳酸。然后，乙酰乳酸进一步加工成缬氨酸和亮氨酸。同时，ALS催化苏氨酸和一分子丙酮酸生成2-乙酰-2-羟基丁酸，其进一步加工成异亮氨酸。ALS活性受到亮氨酸和缬氨酸的反馈抑制，所述亮氨酸和缬氨酸协同结合在ALS的两个单独结构域上来抑制其活性。
ALS是四类结构不相关的除草剂(HRACB类)、磺酰脲类、磺酰氨基-羰基-三唑啉酮类、咪唑啉酮类和三唑并嘧啶类的靶标酶。这些除草剂类别构成了五十多种商业除草剂的基础，所述商业除草剂在全球范围内用于保护基本的水稻、玉米、小麦和棉花作物。磺酰脲和咪唑啉酮与ALS结合，随后抑制ALS活性。除草剂的磺酰基和相邻的芳香环位于底物通道的入口处，导致酶的活性位点与分子的其余部分插入通道中(McCourt等(2006)：Herbicide-binding sites revealed in the structure of plant acetohydroxyacidsynthase.Proe.Natl.Aead.Sei.USA 103，569-573)。底物，例如丙酮酸，不能再到达酶活性中心。这导致亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的生物合成受到抑制并引起除草剂效应。
在磺酰脲类和咪唑啉酮类进入除草剂市场后不久，抗药性杂草开始出现(www.weedscience.org)。这些耐药性最常见的原因是单点突变导致氨基酸取代。最全面表征的突变是W574的那些突变(数字表示基于拟南芥蛋白质序列的位置)，它引起几种植物中的除草剂耐受性。色氨酸残基作用于将两类除草剂锚定到酶上，并且对于定义活性位点通道的形状很重要。因此，经常观察到的该残基突变为亮氨酸改变除草剂结合位点的形状，并导致几种相互作用的丧失(Endo等(2013)：Herbicide-resistant mutations inacetolactate synthase can reduce feedback inhibition and lead to accumulationof Branched-chain amino acids.Food and Nutrition Sei.4，31233.)。
多年前，通过在含有SU的培养基上培养甜菜细胞培养物以及随后的愈伤组织诱导和植物恢复，已鉴定出磺酰脲和咪唑啉酮抗性甜菜(栽培甜菜栽培种(Beta vulgarisL.spp.vulgaris))突变体。该突变系携带突变W569L(对应于拟南芥蛋白序列中的W574L)，其耐受磺酰脲和咪唑啉酮，即甲酰胺磺隆和噻酮磺隆，并作为供体系开发除草剂抗性品种(WO 2012/049268)。利用甜菜中的所述除草剂抗性的杂草控制系统几年来已以CONVISOSMART(www.convisosmart.com)品牌商业化。此类除草剂抗性甜菜纯合携带W569L，以确保最大程度的保护。WO 2014/091021公开了对甜菜中22种不同的ALS抑制剂除草剂的研究，并显示纯合状态的W569L赋予对所有测试的除草剂的耐受性，只有7种除草剂组合物具有中等毒性。与此相反，在位置569处杂合的甜菜植物仅对几种除草组合物具有部分抗性。12种除草剂组合物显示相当毒性效应，7种具有中等毒性。因此，对于商业应用来说，使用纯合状态的W569L显然是有利的。
然而，生产W569L纯合的杂交甜菜种子在育种过程中需要付出巨大的努力，因为需要在母本和父本库中引入并维持突变。此外，由于在杂交生产期间由例如野生甜菜进行的任何外来的、不想要的授粉都会产生杂合的杂交种子，因此需要满足对种子质量控制的高要求以便向农民提供仅携带W569L纯合的种子。这伴随着杂交种子生产的额外成本和时间。
因此，需要进一步提高甜菜和其他栽培形式的栽培甜菜(如饲用甜菜、红甜菜或瑞士甜菜)中的ALS抑制剂抗性。
发明概述
本发明涉及通过使用ALS(乙酰乳酸合酶；也称为AHAS(乙酰羟酸合酶；EC2.2.1.6；以前的EC 4.1.3.18))抑制剂除草剂针对栽培甜菜植物，例如甜菜、饲用甜菜、瑞士甜菜或红甜菜生长区域中不想要的植被进行作物保护的技术领域。
虽然已经在几种杂草中描述了许多ALS突变，但不能先验地预期在农作物中实施此类突变是可行的并且会产生期望的效果。事实上，赋予ALS抑制剂抗性，特别是在农作物中，特别是已知对ALS抑制剂除草剂极其敏感的栽培甜菜中，需要建立强大的除草剂抗性。在这种背景下，已知几个已鉴定的ALS突变仅赋予部分除草剂抗性，由此阻止其用于商业开发。通常，甚至可能需要组合多个突变来实现农艺学上重要且稳定的ALS抑制剂除草剂抗性。此外，ALS突变可能仅赋予对选定数量的ALS抑制剂除草剂的抗性，因此杂草控制的选择变得有限。此外，已经描述了ALS突变可能对生长特性和/或生育力产生负面影响，这尤其在农作物中是不希望的。此外，为了赋予强大的除草剂抗性，ALS突变可能需要纯合地存在，这可能在育种中造成问题，特别是当期望产生杂合体时。
本发明人已令人惊奇地发现，在位置371处突变栽培甜菜ALS蛋白赋予了针对多种ALS抑制剂除草剂的强大的ALS抑制剂除草剂抗性，同时保持了生长特性。甚至更令人惊讶的是，杂合ALS突变被发现同样适用。
因此，在一个方面，本发明涉及在ALS基因中包含突变的栽培甜菜植物，其中编码的ALS酶中位置371处的天冬氨酸被另一氨基酸(优选谷氨酸)取代。本发明还提供新的非转基因栽培甜菜供体系，其可用于开发对ALS抑制性除草剂具有抗性的杂交栽培甜菜品种。
氨基酸取代D371E基于SEQ ID NO:4的核苷酸位置1141处的点突变，其中T被A替换。因此，野生型GAT中的核苷酸位置1139至核苷酸位置1141的密码子被改变为GAA。cDNA中的相应位置是核苷酸位置1111-1113。
本发明的另一个方面是提供通过使用针对生长栽培甜菜植物区域中不想要的植被的ALS抑制剂除草剂进行作物保护的方法，所述栽培甜菜植物在ALS基因中包含突变，其中所编码的ALS酶中位置371处的天冬氨酸被另一种氨基酸(优选谷氨酸)取代。
本发明的有利方面是针对ALS抑制性除草剂抗性的新的且独立的供体的存在，其可有助于避免可能在已知的其他供体系中发生的不期望的负面影响，所述负面影响例如由各自突变或与突变有关的另一负连锁阻力的多效性效应引起。
此外，如果为了生产杂交甜菜，两个杂交池都使用了相同的供体，则可能会出现观察到近交衰退，导致潜在的产量差距。本发明的新供体允许可以在两个池中使用除草剂耐受性的不同供体，例如本发明的一个池具有W569L突变(参见SEQ ID NO:10-12)，另一个例如具有ALSD371E突变(参见SEQ ID NO:1-3)，由此可以解决上述问题。
此外，将新供体用于仅携带根据本发明的突变(例如ALSD371E突变，杂合或纯合)的独立产品(除草剂耐受甜菜品系)也可以是一个选项。
在另一方面，本发明涉及编码根据本发明的突变的ALS蛋白的多核酸，以及包含此类多核酸的载体，和包含此类多核酸或载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明涉及用于产生包含根据本发明的突变的ALS蛋白的植物的方法，以及用于鉴定包含根据本发明的突变的ALS蛋白的植物的方法。
在另一方面，本发明涉及ALS抑制剂除草剂用于控制作物区域中不想要的植被的用途，其中所述作物植物包含根据本发明的突变的ALS蛋白。
本发明特别由所附权利要求书涵盖，该权利要求书明确地通过引用并入本文。
发明详述
在描述本发明的系统和方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定系统和方法或组合，因为这样的系统和方法和组合当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语不旨在限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。
如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括单数和复数指示物，除非上下文另外明确指出。
本文使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprisedof)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除额外的、非-列举的成员、元素或方法步骤。应当理解，本文使用的术语“包含”、“包含”和“包含”包含术语“由......组成(consistingof)”、“由......组成(consists)”和“由......组成(consists of)”，以及术语“基本上由......组成(consisting essentially of)”、“基本上由......组成(consistsessentially)”和“基本上由......组成(consists essentially of)”。
通过端点列举的数值范围包括在各个范围内归入的所有数字和分数，以及所列举的端点。
本文中使用的术语“大约”或“约”当指可测量值，例如参数、量、时距等时，意在涵盖指定值的+/-20％或更小的变化，优选+/-10％或更小，更优选+/-5％或更小，并且还更优选+/-1％或更小，只要这样的变化适合在所公开的发明中执行即可。应当理解，修饰语“大约”或“约”所指的值本身也是具体且优选地公开的。
尽管术语“一个或多个”或“至少一个”，例如一组成员中的一个或多个或至少一个成员，本身是清楚的，但通过另外的示例，该术语尤其涵盖对任何一个所述成员、或任意两个或多个所述成员，例如任意≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等的所述成员，并且直至所有所述成员的引用。
本说明书中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。特别地，本文特别提及的所有参考文献的教导均通过引用并入。
除非另外定义，公开本发明时使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过另外的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
阐述重组DNA技术的一般原理的标准参考著作包括Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第4版，(Green和Sambrook等，2012，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Current Protocols in Molecular Biology，编辑Ausubel等，Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(“Ausubel等，1992”)；the seriesMethods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Innis等，PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications，Academic Press：San Diego，1990；PCR 2：A PracticalApproach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)；Harlow和Lane，编辑(1988)Antibodies，a Laboratory Manual；和Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑(1987)。微生物学的一般原理阐释于例如Davis，B.D.等，Microbiology，第3版，Harper&Row，publishers，Philadelphia，Pa.(1980)中。
在以下段落中，更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合，除非清楚地表明相反。具体地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个特征或多个组合。
在整个说明书中提及“一个实施方案”或“实施方案”意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的多个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指代相同的实施方案，而是可以指代相同的实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，如本领域技术人员根据本公开将显而易见的，可以以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性。此外，虽然本文描述的一些实施方案包括其他实施方案中包括的一些而不是其他特征，但是不同实施方案的特征的组合意味着在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域技术人员将理解的。例如，在所附权利要求中，任何要求保护的实施方案可以以任何组合使用。
在本发明的以下详细描述中，参考了构成本发明一部分的附图，并且其中仅以示例的方式示出了可以实践本发明的具体实施方案。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案并且可以进行结构或逻辑改变。因此，下面的详细描述不应被视为限制意义，并且本发明的范围由所附权利要求限定。
本发明的优选陈述(特征)和实施方案如下所述。如此定义的本发明的每个陈述和实施方案可以与任何其他陈述和/或实施方案组合，除非清楚地表明相反。具体地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征或多个特征或陈述组合。至此，本发明特别由以下编号的方面和实施方案1至76中的一个或多个与任何其他陈述和/或实施方案的任何一项或任何组合来体现。
1.栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含、表达或能够表达突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白或编码突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白的多核酸，所述突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
2.栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，任选地根据陈述1的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，包含编码ALS蛋白的突变的内源性等位基因，所述ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
3.根据陈述1或2的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS蛋白具有与SEQ ID NO:3至少80％相同、优选至少90％、更优选至少95％，例如至少98％相同的序列。
4.根据陈述1至3中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其表达或能够表达所述ALS蛋白。
5.根据陈述1至4中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS蛋白具有ALS活性。
6.根据陈述1至5中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS蛋白在位置371处包含谷氨酸(E)。
7.根据陈述1至6中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS蛋白具有SEQ ID NO:3的序列。
8.根据陈述1至7中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS是杂合的。
9.根据陈述1至7中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS是纯合的。
10.根据陈述1至9中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其耐受一种或多种ALS抑制剂除草剂。
11.根据陈述1至10中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其耐受一种或多种ALS抑制剂除草剂，其选自(磺)酰胺类，例如磺酰脲类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、磺酰苯胺类或三唑并嘧啶类；咪唑啉酮类；和嘧啶基(硫代/氧基)苯甲酸酯类，优选选自磺酰脲类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、咪唑啉酮类和嘧啶基(硫代/氧基)苯甲酸酯类。
12.根据陈述11的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述磺酰脲选自以下的一种或多种
酰胺磺隆[CAS RN 120923-37-7](＝A1-1)；
四唑嘧磺隆[CAS RN 120162-55-2](＝A1-2)；
苄嘧磺隆[CAS RN 83055-99-6](＝A1-3)；
氯嘧磺隆[CAS RN 90982-32-4](＝A1-4)；
氯磺隆[CAS RN 64902-72-3](＝A1-5)；
醚磺隆[CAS RN 94593-91-6](＝A1-6)；
环丙磺隆[CAS RN 136849-15-5](＝A1-7)；
胺苯磺隆[CAS RN 97780-06-8](＝A1-8)；
乙氧基磺隆[CAS RN 126801-58-9](＝A1-9)；
啶嘧磺隆[CAS RN 104040-78-0](＝A1-10)；
氟吡磺隆[CAS RN 412928-75-7](＝A1-11)；
氟吡嘧磺隆钠[CAS RN 144740-54-5](＝A1-12)；
酰胺磺隆[CAS RN 173159-57-4](＝A1-13)；
氯吡嘧磺隆[CAS RN 100784-20-1](＝A1-14)；
咪唑磺隆[CAS RN 122548-33-8](＝A1-15)；
碘甲磺隆钠[CAS RN 144550-36-7](＝A1-16)；
甲磺胺磺隆[CAS RN 208465-21-8](＝A1-17)；
甲磺隆[CAS RN 74223-64-6](＝A1-18)；
单嘧磺隆[CAS RN 155860-63-2](＝A1-19)；
烟嘧磺隆[CAS RN 111991-09-4](＝A1-20)；
嘧苯胺磺隆[CAS RN 213464-77-8](＝A1-21)；
环氧嘧磺隆[CAS RN 144651-06-9](＝A1-22)；
甲基氟嘧磺隆[CAS RN 86209-51-0](＝A1-23)；
氟磺隆[CAS RN 94125-34-5](＝A1-24)；
吡嘧磺隆[CAS RN 93697-74-6](＝A1-25)；
砜嘧磺隆[CAS RN 122931-48-0](＝A1-26)；
甲嘧磺隆[CAS RN 74222-97-2](＝A1-27)；
磺酰磺隆[CAS RN 141776-32-1](＝A1-28)；
噻吩黄隆[CAS RN 79277-27-3](＝A1-29)；
醚苯磺隆[CAS RN 82097-50-5](＝A1-30)；
苯磺隆[CAS RN 101200-48-0](＝A1-31)；
三氟啶磺隆[CAS RN 145099-21-4](钠)(＝A1-32)；
氟胺磺隆[CAS RN 126535-15-7](＝A1-33)；
三氟甲磺隆[CAS RN 142469-14-5](＝A1-34)；
NC-330[CAS RN 104770-29-8](＝A1-35)；
NC-620[CAS RN 868680-84-6](＝A1-36)；
TH-547[CAS RN 570415-88-2](＝A1-37)；
单甲嘧磺隆[CAS RN 175076-90-1](＝A1-38)
2-碘-N-[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪基)氨基甲酰基]苯磺酰胺(＝A1-39)；
通式(I)的化合物
其中M+表示化合物(I)各自的盐，即
其锂盐(＝A1-40)；其钠盐(＝A1-41)；其钾盐(＝A1-42)；其镁盐(＝A1-43)；其钙盐(＝A1-44)；其铵盐(＝A1-45)；其甲基铵盐(＝A1-46)；其二甲基铵盐(＝A1-47)；其四甲基铵盐(＝A1-48)；其乙基铵盐(＝A1-49)；其二乙基铵盐(＝A1-50)；其四乙基铵盐(＝A1-51)；其丙基铵盐(＝A1-52)；其四丙基铵盐(＝A1-53)；其异丙基铵盐(＝A1-54)；其二异丙基铵盐(＝A1-55)；其丁基铵盐(＝A1-56)；其四丁基铵盐(＝A1-57)；其(2-羟基乙基-1-基)铵盐(＝A1-58)；其双-N，N-(2-羟基乙基-1-基)铵盐(＝A1-59)；其三-N，N，N-(2-羟基乙基-1-基)铵盐(＝A1-60)；其1-苯乙基铵盐(＝A1-61)；其2-苯乙基铵盐(＝A1-62)；其三甲基锍盐(＝A1-63)；其三甲基氧鎓盐(＝A1-64)；其吡啶鎓盐(＝A1-65)；其2-甲基吡啶鎓盐(＝A1-66)；其4-甲基吡啶鎓盐(＝A1-67)；其2，4-二甲基吡啶鎓盐(＝A1-68)；其2，6-二甲基吡啶鎓盐(＝A1-69)；其哌啶鎓盐(＝A1-70)；其咪唑鎓盐(＝A1-71)；其吗啉鎓盐(＝A1-72)；其1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-7-烯盐(＝A1-73)；其1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯盐(＝A1-74)；
式(II)的化合物或其盐
其中R2和R3具有下表中所定义的含义
化合物 R2 R3
A1-75 OCH3 OC2H5
A1-76 OCH3 CH3
A1-77 OCH3 C2H5
A1-78 OCH3 CF3
A1-79 OCH3 OCF2H
A1-80 OCH3 NHCH3
A1-81 OCH3 N(CH3)2
A1-82 OCH3 Cl
A1-83 OCH3 OCH3
A1-84 OC2H5 OC2H5
A1-85 OC2H5 CH3
A1-86 OC2H5 C2H5
式(III)的化合物(＝A1-87)，即化合物(A1-83)的钠盐
式(IV)的化合物(＝A1-88)，即化合物(A1-82)的钠盐
13.根据陈述11的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述磺酰氨基羰基三唑啉酮选自以下的一种或多种
氟酮磺隆钠[CAS RN 181274-17-9](＝A2-1)；
丙苯磺隆钠[CAS RN 181274-15-7](＝A2-2)；和
噻酮磺隆[CAS RN 317815-83-1](＝A2-3)。
14.根据陈述11的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述三唑并嘧啶选自以下的一种或多种
氯酯磺草胺[147150-35-4](＝A3-1)；
双氯磺草胺[CAS RN 145701-21-9](＝A3-2)；
双氟磺草胺[CAS RN 145701-23-1](＝A3-3)；
唑嘧磺草胺[CAS RN 98967-40-9](＝A3-4)；
磺草唑胺[CAS RN 139528-85-1](＝A3-5)；
五氟磺草胺[CAS RN 219714-96-2](＝A3-6)；
甲氧磺草胺[CAS RN 422556-08-9](＝A3-7)。
15.根据陈述11的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述磺酰苯胺(sulfonanilide)选自以下的一种或多种
来自通式(V)所描述的组的化合物或其盐：
其中
R1是卤素，优选氟或氯，
R1是氢且R<3>是羟基或
R2和R3与它们所连接的碳原子一起为羰基C＝O并且
R4为氢或甲基；
且更特别地具有以下给出的化学结构(A4-1)至(A4-8)的化合物
16.根据陈述11的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述咪唑啉酮选自以下的一种或多种
甲基咪草酯[CAS RN 81405-85-8](＝B1-1)；
甲氧咪草酸[CAS RN 114311-32-9](＝B1-2)；
甲咪唑烟酸[CAS RN 104098-48-8](＝B1-3)；
咪唑烟酸[CAS RN 81334-34-1](＝B1-4)；
咪唑喹啉酸[CAS RN 81335-37-7](＝B1-5)；
咪唑乙烟酸[CAS RN 81335-77-5](＝B1-6)；
SYP-298[CAS RN 557064-77-4](＝B1-7)；
SYP-300[CAS RN 374718-10-2](＝B1-8)。
17.根据陈述11的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述嘧啶氧基苯甲酸酯(pyrimidinyloxybenzoate)选自以下的一种或多种
双草醚-纳[CAS RN 125401-92-5](＝C1-1)；
嘧啶肟草醚[CAS RN 168088-61-7](＝C1-2)；
嘧草醚[CAS RN 136191-64-5](＝C1-3)；
异丙酯草醚[CAS RN 420138-41-6](＝C1-4)；
丙酯草醚[CAS RN 420138-40-5](＝C1-5)。
18.根据陈述11的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述嘧啶基硫代苯甲酸酯(pyrimidinylthiobenzoate)选自以下的一种或多种
环酯草醚[CAS RN 135186-78-6](＝C2-1)；
嘧草硫醚[CAS RN 123343-16-8](＝C2-2)。
19.根据陈述1至18中任一项的甜菜植物部分，其中所述植物部分是根甜菜、种子、细胞、组织或器官。
20.根据陈述1至19中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含编码突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白的多核酸，所述突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白包含以下的任意一种或多种
在位置113处是不同于丙氨酸(A)的氨基酸；
在位置188处是不同于脯氨酸(P)的氨基酸；
在位置196处是不同于丙氨酸(A)的氨基酸；
在位置372处是不同于精氨酸(R)的氨基酸；
在位置569处是不同于色氨酸(W)的氨基酸；
在位置648处是不同于丝氨酸(S)的氨基酸；
在位置649处是不同于甘氨酸(G)的氨基酸。
21.根据陈述1至20中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含编码ALS蛋白的突变的内源性等位基因，所述ALS蛋白包含以下的任意一种或多种
在位置113处是不同于丙氨酸(A)的氨基酸；
在位置188处是不同于脯氨酸(P)的氨基酸；
在位置196处是不同于丙氨酸(A)的氨基酸；
在位置372处是不同于精氨酸(R)的氨基酸；
在位置569处是不同于色氨酸(W)的氨基酸；
在位置648处是不同于丝氨酸(S)的氨基酸；
在位置649处是不同于甘氨酸(G)的氨基酸。
22.根据陈述1至20中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS蛋白在位置569处包含丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或精氨酸，优选亮氨酸。
23.根据陈述1至22中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其是转基因的、基因编辑的或诱变的。
24.根据陈述1至23中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述甜菜植物或植物部分是糖用甜菜植物或植物部分。
25.(分离的)多核酸，其编码如陈述1至24中任一项所定义的突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白。
26.根据陈述25的(分离的)多核酸，其是分离的多核酸。
27.载体，其包含根据陈述25或26的多核酸。
28.根据陈述25至27中任一项的(分离的)多核酸或载体，其中所述多核酸包含与编码ALS蛋白的序列可操作地连接的一个或多个调控序列。
29.宿主细胞，其包含根据陈述25至28中任一项的多核酸或载体。
30.根据陈述29的宿主细胞，其是植物宿主细胞，优选甜菜宿主细胞。
31.(分离的)多核酸，其与根据陈述25至28中任一项的多核酸、其互补体或其反向互补体特异性杂交。
32.根据陈述31的(分离的)多核酸，其具有范围为10至200个核苷酸的长度。
33.根据陈述31或32的(分离的)多核酸，其是引物或探针。
34.根据陈述31至33中任一项的(分离的)多核酸，其是KASP引物。
35.根据陈述31至34中任一项的(分离的)多核酸，其包含SEQ ID NO:7的至少10个最靠3'的核苷酸，优选至少15个最靠3'的核苷酸、其互补体或其反向互补体。
36.根据陈述31至35中任一项的(分离的)多核酸，其包含SEQ ID NO:7、其互补体或其反向互补体或由SEQ ID NO:7、其互补体或其反向互补体组成。
37.根据陈述31至36中任一项的多核酸用于鉴定栽培甜菜植物的用途。
38.根据陈述31至36中任一项的多核酸用于鉴定根据陈述1至24中任一项的栽培甜菜植物的用途。
39.权利要求31至36中任一项的多核酸用于鉴定对一种或多种ALS抑制剂除草剂具有耐受性的栽培甜菜植物的用途。
40.根据陈述39的用途，其中所述ALS抑制剂除草剂是如陈述11至18中任一项所定义的一种或多种ALS抑制剂除草剂。
41.根据陈述25至30中任一项的多核酸、载体或宿主细胞用于产生栽培甜菜植物的用途。
42.根据陈述25至30中任一项的多核酸、载体或宿主细胞用于产生根据陈述1至24中任一项的栽培甜菜植物的用途。
43.根据陈述25至30中任一项的多核酸、载体或宿主细胞用于产生对一种或多种ALS抑制剂除草剂具有耐受性的栽培甜菜植物的用途。
44.根据陈述40的用途，其中所述ALS抑制剂除草剂是如陈述11至18中任一项所定义的一种或多种ALS抑制剂除草剂。
45.用于鉴定栽培甜菜植物或植物部分的方法，其包括筛选ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的存在，或筛选编码ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的密码子的存在。
46.根据陈述45的方法，其进一步包括选择栽培甜菜植物或植物部分，所述甜菜植物或植物部分包含ALS蛋白，所述ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸，或者包含编码ALS蛋白的多核酸，所述ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
47.根据陈述45或46的方法，其包括筛选具有与SEQ ID NO:3至少80％、优选至少90％、更优选至少95％，例如至少98％相同的序列的ALS蛋白的存在，或筛选编码具有与SEQID NO:3至少80％、优选至少90％、更优选至少95％，例如至少98％相同的序列的ALS蛋白的多核酸的存在。
48.根据陈述45至47中任一项的方法，其中所述植物或植物部分表达或能够表达所述ALS蛋白。
49.根据陈述45至48中任一项的方法，其中所述ALS蛋白具有ALS活性。
50.根据陈述45至49中任一项的方法，其中所述ALS蛋白在位置371处包含谷氨酸(E)。
51.根据陈述45至50中任一项的方法，其中所述ALS蛋白具有SEQ ID NO:3的序列。
52.根据陈述45至51中任一项的方法，其中所述ALS是杂合的。
53.根据陈述45至51中任一项的方法，其中所述ALS是纯合的。
54.根据陈述45至53中任一项的方法，其中所述植物或植物部分耐受一种或多种ALS抑制剂除草剂。
55.根据陈述45至54中任一项的方法，其中所述ALS抑制剂除草剂是如陈述11至18中任一项所定义的一种或多种ALS抑制剂除草剂。
56.用于产生栽培甜菜植物或植物部分的方法，其包括在植物或植物部分的基因组中突变的内源性ALS等位基因，产生编码在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的ALS蛋白的ALS等位基因。
57.根据陈述55的方法，其包括以下步骤：
a)用至少0.5％ EMS或至少0.3％ ENU诱变栽培甜菜细胞或组织，
b)从诱变的细胞或组织(M0)产生stecks，
c)重新种植stecks以产生种子群体(M1)，
d)从M1种子长成的植物产生种子(M2)，
e)播种M2种子并施用ALS抑制剂除草剂，
f)任选地，将存活的植物重新种植在盆中并对生长的植物施用ALS抑制剂除草剂，以及
g)选择没有除草剂损害的存活植物和/或选择包含编码ALS蛋白的ALS等位基因的植物，所述ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
58.用于产生栽培甜菜植物或植物部分的方法，其包括向植物或植物部分的基因组中引入(并表达)编码突变的内源性ALS蛋白的多核酸，所述突变的内源性ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
59.根据陈述58的方法，其中所述多核酸包含与编码ALS蛋白的序列可操作地连接的一个或多个调控序列。
60.根据陈述58或59的方法，其中引入基因组包括转基因、基因编辑或诱变。
61.根据陈述58至60中任一项的方法，其包括用根据陈述25至29中任一项的多核酸或载体转化植物或植物部分，优选植物细胞，更优选原生质体，并且任选地从所述植物细胞，优选原生质体再生植物。
62.根据陈述58或59的方法，其中引入基因组包括基因渗入。
63.通过根据陈述56至62中任一项的方法(直接)获得或可获得的栽培甜菜植物或植物部分或其后代。
64.根据陈述63的植物部分，其中所述植物部分是甜菜根、种子、细胞、组织或器官。
65.控制栽培甜菜生长区域中不想要的植被或提高栽培甜菜生长区域中产量的方法，其包括以下步骤：
a)种植根据陈述1至24中任一项的栽培甜菜植物或播种根据陈述1至24中任一项的栽培甜菜种子，
b)优选以足以抑制不想要的植被生长的剂量，更优选以足以杀死不想要的植被的剂量，向生长的植物施用一种或多种ALS抑制剂除草剂，和
c)任选地，在生长季节重复步骤b)。
66.根据陈述64的方法，其中步骤b)在不想要的植被授粉之前进行，优选在开花前阶段或最迟在花开放时进行。
67.根据陈述65或66的方法，其中所述产量是甜菜根产量。
68.一种或多种ALS抑制剂除草剂用于控制栽培甜菜生长区域中不想要的植被的用途，其中栽培甜菜植物是根据陈述1至24中任一项的。
69.根据陈述65至68中任一项的方法或用途，其中所述不想要的植被是或包含bolters、杂草甜菜(weedBeets)或一年生甜菜。
70.根据陈述65至69中任一项的方法或用途，其中所述一种或多种ALS抑制剂除草剂是如陈述11至18中任一项所定义的一种或多种ALS抑制剂除草剂。
71.用于产生栽培甜菜根甜菜的方法，其包括以下步骤：
a)进行陈述65至67、69或70中任一项的方法，和
b)优选在生长季节结束时收获栽培甜菜根甜菜。
72.根据陈述1至24中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体在用于糖生产、厌氧消化或发酵的方法中的用途。
73.根据陈述1至24中任一项的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体在沼气或生物燃料生产的方法中的用途。
74.栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含：
a)包含SEQ ID NO:1所示序列的多核酸；
b)包含SEQ ID NO:2所示序列的多核酸；
c)编码具有SEQ ID NO:2所示cDNA序列的ALS蛋白的多核酸；
d)编码具有SEQ ID NO:3所示序列的ALS蛋白的多核酸。
75.根据陈述75的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含：
a)包含SEQ ID NO:10所示序列的多核酸；
b)包含SEQ ID NO:11所示序列的多核酸；
c)编码具有SEQ ID NO:11所示cDNA序列的ALS蛋白的多核酸；
d)编码具有SEQ ID NO:12所示序列的ALS蛋白的多核酸。
76.(分离的)多核酸，其包含SEQ ID NO:7所示的序列。
一方面，本发明涉及包含、表达或能够表达突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白或编码突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白的多核酸的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，所述突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。在一个实施方案中，栽培甜菜植物、植物部分或植物群体包含编码ALS蛋白的突变的内源性等位基因，所述ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
一方面，本发明涉及包含突变的内源性等位基因的栽培甜菜植物、植物部分或植物群体，所述突变的内源性等位基因编码在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的ALS蛋白。
栽培甜菜种的植物特别是栽培甜菜栽培种的植物。例如，其中的编号为Betavulgaris subsp.vulgaris var.altissima(狭义上的甜菜)、Beta vulgarisssp.vulgaris var.favescens(甜菜)、Beta vulgaris ssp.vulgaris var.cicla(菠菜甜菜)、Beta vulgaris ssp.vulgaris var.conditiva(甜菜根/红甜菜/花园甜菜)、Betavulgaris ssp.vulgaris var.crassa/alba(饲用甜菜)。在优选的实施方案中，根据本发明在本文中提及的甜菜是Beta vulgaris subsp.vulgaris，更优选Beta vulgarissubsp.vulgaris var.altissima(即甜菜)。
如本文所用，ALS(乙酰乳酸合酶；也称为AHAS(乙酰羟酸合酶)；EC 2.2.1.6；以前的EC 4.1.3.18))涉及两个丙酮酸分子向乙酰乳酸分子和二氧化碳的转化。该反应使用胸腺嘧啶焦磷酸来连接两个丙酮酸分子。该反应的所得产物乙酰乳酸最终变成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(Singh(1999)"Biosynthesis of valine，leucine and isoleucine"，PlantAmino Acids，Singh，B.K.，编辑，Marcel Dekker Inc.New York，New York，第227-247页)。ALS抑制剂会中断植物中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成。其结果是各个氨基酸库立即耗尽，引起蛋白质生物合成停止，导致植物生长停止，最终植物死亡，或者至少被损坏。
在某些实施方案中，野生型栽培甜菜ALS具有如SEQ ID NO:6中提供的氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜ALS具有优选在整个长度上与SEQ ID NO:6的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS活性，条件是位置371处的氨基酸残基是天冬氨酸(D)。应当理解，本文所用的天冬氨酸可以与天冬氨酸(aspartate)互换使用。在某些实施方案中，野生型栽培甜菜ALS具有如NCBI参考序列XP_010695365.1中提供的氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜ALS具有优选在整个长度上与NCBI参考序列XP_010695365.1的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS活性，条件是位置371处的氨基酸残基是天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中，根据本发明的突变栽培甜菜ALS具有如SEQ ID NO:3中提供的氨基酸序列。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS具有优选在整个长度上与SEQ ID NO:3的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS活性，条件是位置371处的氨基酸残基不是天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS具有如NCBI参考序列XP_010695365.1中提供的氨基酸序列。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS具有优选在整个长度上与NCBI参考序列XP_010695365.1的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS活性，条件是位置371处的氨基酸残基不是天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中，野生型栽培甜菜ALS基因具有如SEQ ID NO:6中提供的氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜ALS基因具有这样的序列，其编码优选在整个长度上与SEQ ID NO:6的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS合酶活性，条件是位置371处的氨基酸残基是天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，野生型栽培甜菜ALS基因具有如NCBI参考序列XP_010695365.1中提供的氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜ALS具有这样的序列，其编码优选在整个长度上与NCBI参考序列XP_010695365.1的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS合酶活性，条件是位置371处的氨基酸残基是天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中，根据本发明的突变的栽培甜菜ALS基因具有编码如SEQ IDNO:3中提供的氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS基因具有这样的序列，其编码优选在整个长度上与SEQ ID NO:3的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS合酶活性，条件是位置371处的氨基酸残基不是天冬氨酸(D)。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS基因具有编码如NCBI参考序列XP_010695365.1中提供的氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS基因具有这样的序列，其编码优选在整个长度上与NCBI参考序列XP_010695365.1的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有ALS合酶活性，条件是位置371处的氨基酸残基不是天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中，野生型栽培甜菜ALS基因具有如SEQ ID NO:4中提供的核苷酸序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜ALS基因具有优选在整个长度上与SEQ IDNO:4的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的核苷酸，并且优选具有ALS活性，条件是对应于位置371处的氨基酸残基的密码子编码天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中，根据本发明的突变的栽培甜菜ALS基因具有如SEQ ID NO:1中提供的核苷酸序列。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS基因具有优选在整个长度上与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的核苷酸序列，并且优选具有ALS活性，条件是对应于位置371处的氨基酸残基的密码子不编码天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中，野生型栽培甜菜ALS编码序列(cDNA)具有如SEQ ID NO:5中提供的核苷酸序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜ALS编码序列具有优选在整个长度上与SEQ ID NO:5的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的核苷酸序列，并且优选具有ALS活性，条件是对应于位置371处的氨基酸残基的密码子编码天冬氨酸(D)。
在某些实施方案中，根据本发明的突变的栽培甜菜ALS编码序列(cDNA)具有如SEQID NO:2中提供的核苷酸序列。在某些实施方案中，突变的栽培甜菜ALS编码序列具有优选在整个长度上与SEQ ID NO:2的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少98％、例如至少99％序列同一性的核苷酸序列，并且优选具有ALS活性，条件是对应于位置371处的氨基酸残基的密码子不编码天冬氨酸(D)。
优选地，如本文所用，当涉及ALS的氨基酸残基位置时，编号对应于SEQ ID NO:6中的氨基酸位置。SEQ ID NO:3对应于具有D371E突变的SEQ ID NO:6的序列。
当根据本发明使用时，术语“位置”是指本文所述的氨基酸序列内的氨基酸的位置或本文所述的核苷酸序列内的核苷酸的位置。本文所用的术语“相应”还包括位置不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数目确定。
可以被取代的根据本发明的给定核苷酸的位置可以由于ALS 5'-非翻译区(UTR)，包括启动子和/或任何其他调节序列或基因(包括外显子和内含子)中其他地方的缺失或附加核苷酸而变化。类似地，可以被取代的根据本发明的给定氨基酸的位置可以由于ALS多肽中其他地方的氨基酸的缺失或添加而变化。
因此，在根据本发明的“相应位置”下，应当理解，核苷酸/氨基酸可以在指示的数目上不同，但仍然可以具有相似的相邻核苷酸/氨基酸。可被交换、缺失或添加的所述核苷酸/氨基酸也包含在术语“相应位置”内。
为了确定给定ALS核苷酸/氨基酸序列中的核苷酸残基或氨基酸残基是否对应于例如SEQ ID NO:1、2、4或5的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:3或6的氨基酸序列中的某个位置，技术人员可以使用本领域熟知的手段和方法，例如手动比对或通过使用计算机程序例如BLAST(Altschul等(1990)，Journal of MolecularBiology，215，403-410)，其代表LocalAlignment Search Tool或(Thompson等(1994)，Nucleic Acid Res.，22，4673-4680)或适合生成序列比对的任何其他合适的程序。
鉴于栽培甜菜(B.vulgaris)野生型ALS基因与本发明的甜菜植物所包含的ALS基因之间的差异，本发明的甜菜植物所包含的ALS基因(或多核苷酸或核苷酸序列)还可以被视为“突变的ALS基因”、“突变的ALS等位基因”、“突变的ALS多核苷酸”等。因此，在整个说明书中，术语“突变型等位基因”、“突变型ALS等位基因”、“突变型ALS基因”或“突变型ALS多核苷酸”可互换使用。
相反，除非另有说明，术语“野生型等位基因”、“野生型ALS等位基因”、“野生型ALS基因”或“野生型ALS多核苷酸”是指编码缺少D371取代的ALS蛋白的核苷酸序列。此类“野生型等位基因”、“野生型ALS等位基因”、“野生型ALS基因”或“野生型ALS多核苷酸”可以包含或可以不包含除引起D371取代的突变之外的突变。ALS中天然存在的多态性(位置371除外)也可以被视为由术语“野生型”涵盖。
如本文所用，术语“ALS活性”是指ALS蛋白的酶活性。在某些优选的实施方案中，在如上所述的变体ALS(例如与列举的SEQ ID NO具有一定百分比的序列同一性的ALS蛋白)的上下文中，术语“具有ALS活性”是指与野生型或天然ALS(例如具有所列举的SEQ ID NO的序列的ALS)相比，其酶活性不受影响或基本上不受影响的ALS。在某些实施方案中，酶活性是野生型ALS活性的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％，例如至少95％。酶活性可以通过本领域已知的方法测量，例如测定丙酮酸向乙酰乳酸的转化。
在某些实施方案中，根据本发明的栽培甜菜植物具有(突变的)ALS，其酶活性不受或基本上不受一种或多种ALS抑制剂除草剂影响。在某些实施方案中，根据本发明的栽培甜菜植物具有这样的ALS，其酶活性在一种或多种ALS抑制剂除草剂存在下与不存在此类除草剂的情况相比最多低50％，优选最多低40％，更优选最多低30％，甚至更优选最多低20％，最优选最多低10％，例如最多低5％。酶活性可以通过本领域已知的方法测量。优选地在ALS抑制剂除草剂存在下以相关适用的除草剂剂量(例如对应于所推荐的田间施用的剂量)测定酶活性。
在某些实施方案中，根据本发明的突变ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含相似的氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明的突变的ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含保守取代。在某些实施方案中，根据本发明的突变的ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含不相似的氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明的突变的ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含非保守取代。在某些实施方案中，根据本发明的突变ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含极性氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明的突变ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含选自谷氨酰胺-Gln-Q、天冬酰胺-Asn-N、组氨酸-His-H、丝氨酸-Ser-S、苏氨酸-Thr-T、酪氨酸-Tyr-Y、半胱氨酸-Cys-C的氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明的突变ALS，即在位置371具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含酸性氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明的突变ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含酸性极性氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明的突变ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含谷氨酸(谷氨酸，E)。在某些实施方案中，根据本发明的突变ALS，即在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，其在位置371处包含非极性氨基酸。
如本文所用，术语“能够表达”是指蛋白质可以在植物或植物部分中表达。因此，需要蛋白质的基因序列或蛋白质的编码序列存在于植物或植物部分中，优选存在于植物或植物部分的基因组中。还应该存在适当的调控序列以确保转录。因此，ALS编码多核苷酸应当可操作地连接至一个或多个调节序列，例如启动子。然而，转录(可以是但)不一定是普遍存在的(组成型的)。转录可以是细胞、组织或器官特异性的。或者或另外，转录可以是发育特异性的(即仅在某些发育阶段蛋白质才表达)。或者或另外，转录可以是条件性的或诱导性的。对于这些情况中的每一个来说合适的启动子是本领域已知的。在某些优选的实施方案中，根据本发明的突变的ALS基因位于基因组中的其天然(内源性)位置(基因座)，因此处于其天然(内源性)启动子的控制之下。
如本文所用，术语“可操作地连接”或“有效连接”意指以这样的方式连接在共同的核酸分子中，使得连接的元件相对于彼此定位和定向，使得可以发生核酸分子的转录。与启动子可操作地连接的DNA处于该启动子的转录控制之下。
除非另有明确说明，否则本文所用的术语“植物”旨在表示处于任何发育阶段的植物。
优选地，本发明的栽培甜菜植物是正倍体或异倍体。正倍体植物可优选为单倍体、二倍体、四倍体、六倍体、八倍体、十倍体或十二倍体，而异倍体植物可优选为三倍体或五倍体。在某些优选的实施方案中，根据本发明的栽培甜菜植物是二倍体。
根据本发明的术语“植物”包括整个植物或该整个植物的部分。整个植物优选是种子植物或作物。“植物的部分”是例如枝条营养器官/结构，例如叶、茎和块茎；根、花和花器官/结构，例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠；种子，包括胚、胚乳和种皮；果实和成熟的子房；植物组织，例如维管组织、基本组织等；和细胞，例如保卫细胞、卵细胞、花粉、毛状体等；及其后代。植物的部分可以附着在整个完整的植物上，也可以与整个完整的植物分开。植物的此类部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞，并且优选种子。“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或者作为高级组织单位例如植物组织、植物器官或整个植物的一部分。“植物细胞培养物”是指植物单位的培养物，例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和处于多个发育阶段的胚。“植物材料”是指叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产品。这还包括愈伤组织或愈伤组织以及提取物(例如来自主根的提取物)或样品。“植物器官”是植物的独特且明显结构化和分化的部分，例如根、茎、叶、花芽或胚。本文所用的“植物组织”是指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括在植物中或培养物中的植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞群。该术语与如上列出的或该定义以其他方式包含的任何特定类型的植物组织结合或不存在的情况下的使用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。在某些优选的实施方案中，本文提及的植物部分或植物器官是根甜菜(或根甜菜)或种子。术语甜菜根(或甜菜根)是指主根或下胚轴或已转化为肉质储存器官的甜菜。在某些实施方案中，本文所用的植物部分是原生质体。
如本文所用，术语“植物群体”可以与植物的群体互换使用。植物群体优选包含大量个体植物，例如优选至少10个，例如20、30、40、50、60、70、80或90个，更优选至少100个，例如200、300、400、500、600、700、800或900个，甚至更优选至少1000个，例如至少10000或至少100000个。
术语“序列”当在本文中使用时涉及核苷酸序列、多核苷酸、核酸序列、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于其中使用术语“序列”的上下文。
术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且是指核苷酸，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸或两者的组合，其为任何长度的聚合无分支形式。核酸序列包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、合成形式和混合聚合物、有义链和反义链，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员容易理解的。
当本文使用时，术语“多肽”或“蛋白质”(这两个术语在本文中可互换使用)是指包含给定长度的氨基酸链的肽、蛋白质或多肽，其中氨基酸残基通过共价肽键来连接。然而，本发明还涵盖这样的蛋白质/多肽的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键已被功能类似物，以及除了20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸，例如硒代半胱氨酸替换。肽、寡肽和蛋白质可称为多肽。术语多肽还指但不排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。这些修饰在基础文本和更详细的专著以及研究文献中都有很好的描述。
氨基酸取代涵盖氨基酸改变，其中氨基酸被不同的天然存在的氨基酸残基取代。此类取代可被归类为“保守性”，其中野生型蛋白质中含有的氨基酸残基被具有相似特征的另一种天然存在的氨基酸，例如Gly<>Ala、Val<>lle<>Leu、Asp<>Glu、Lys<>Arg、Asn<>Gln或Phe<>Trp<>Tyr替换。本发明涵盖的取代也可以是“非保守性的”，其中存在于野生型蛋白质中的氨基酸残基被具有不同特性的氨基酸，例如来自不同组的天然存在的氨基酸取代(例如用丙氨酸取代带电或疏水氨基酸。如本文所用，“相似氨基酸”是指具有相似的氨基酸侧链的氨基酸，即具有极性、非极性或实际上中性侧链的氨基酸。如本文所用，“不相似的氨基酸”是指具有不同氨基酸侧链的氨基酸，例如具有极性侧链的氨基酸与具有非极性侧链的氨基酸不相似。极性侧链通常倾向于存在于蛋白质的表面上，其中它们可以与细胞中发现的水环境(“亲水”氨基酸)相互作用。另一方面，“非极性”氨基酸倾向于位于蛋白质的中心，其中它们可以与类似的非极性邻居(“疏水”氨基酸)相互作用。具有极性侧链的氨基酸的实例是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸(除疏水性的半胱氨酸外，所有氨基酸都是亲水性的)。具有非极性侧链的氨基酸的实例是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸(除了中性的甘氨酸之外，所有氨基酸都是疏水性的)。
术语“基因”当用于本文时是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。该术语包括双链和单链DNA和RNA。它还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸。优选地，基因包含编码本文定义的多肽的编码序列。“编码序列”是当置于合适的调节序列或处于合适的调节序列的控制下时转录成mRNA和/或翻译成多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5'末端的翻译起始密码子和3'末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核酸序列或基因组DNA，而在某些情况下也可以存在内含子。
如本文所用，术语“内源性的”是指存在于其天然基因组位置的基因或等位基因。术语“内源性的”可以与“天然的”互换使用。然而，这并不排除与野生型等位基因存在一种或多种核酸差异。在具体的实施方案中，与野生型等位基因的差异可以限制在小于9个、优选小于6个、更具体小于3个核苷酸差异。更具体地，与野生型序列的差异可以仅在于一个核苷酸。优选地，内源性等位基因编码与野生型蛋白质具有小于9个、优选小于6个、更具体小于3个、甚至更优选仅1个氨基酸差异的修饰蛋白质。
如本文所用，术语“纯合子”是指在一个或多个或所有基因座处具有相同等位基因的个体细胞或植物。当该术语用于特定基因座或基因时，它至少意味着该基因座或基因具有相同的等位基因。如本文所用，术语“纯合的”是指当相同等位基因位于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传状况。如本文所用，术语“杂合子”是指在一个或多个或所有基因座处具有不同等位基因的个体细胞或植物。当该术语用于特定基因座或基因时，它至少意味着该基因座或基因具有不同的等位基因。如本文所用，术语“杂合的”是指当不同等位基因位于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传状况。
如本文所用，“等位基因”是指与不同形式的基因或任何种类的可识别遗传元件相关的多种遗传单位的备选形式，其在遗传中是备选，因为它们位于同源染色体中的相同基因座处。在二倍体细胞或生物体中，给定基因(或标记)的两个等位基因通常占据一对同源染色体上的相应基因座。
术语“基因座”(基因座复数)是指染色体上的一个或多个特定位置或一个位点，其中发现例如QTL、基因或遗传标记，例如本发明的(突变)ALS编码序列。
如本文所用，术语“序列同一性”是指任何给定核酸序列与靶核酸序列之间的同一性程度。序列百分比同一性是通过确定比对核酸序列中匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比对核苷酸的总数，然后乘以100计算的。匹配位置是指其中在比对的核酸序列中相同位置出现相同核苷酸的位置。还可以确定任何氨基酸序列的序列百分比同一性。为了确定序列百分比同一性，使用来自含有BLASTN和BLASTP的BLASTZ独立版本的BLAST2Sequences(Bl2seq)程序将靶核酸或氨基酸序列与鉴定的核酸或氨基酸序列进行比较。BLASTZ的这个独立版本可以从Fish&Richardson网站(World Wide WeBatfr.com/blast)或U.S.government's National Center forBiotechnology Information网站(World WideWeBat ncbi.nlm.nih.gov)获取。解释如何使用Bl2seq程序的说明可以在BLASTZ附带的自述文件中找到。BI2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间进行比较。
BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为了比较两个核酸序列，选项设置如下：-i设置为包含要比较的第一个核酸序列的文件(例如，C:\seql.txt)；-j设置为包含要比较的第二核酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何期望的文件名(例如，C:\output.txt)；-q设置为-1；-r设置为2；所有其他选项均保留默认设置。以下命令将生成包含两个序列之间比较的输出文件：C:\B12seq-i c:\seql.txt-jc:\seq2.txt-pBlastn-o c:\output.txt-q-1-r 2。如果靶序列与已识别序列的任何部分具有同源性，则指定的输出文件将把这些同源区域呈现为比对序列。如果靶序列与已识别序列的任何部分不具有同源性，则指定的输出文件将不会呈现比对序列。一旦比对，通过计数来自靶序列的连续核苷酸的数量来测定长度，所述靶序列呈现在与来自以任何匹配位置开始并以任何其他匹配位置结束的识别序列的序列的比对中。匹配位置是其中在靶序列和识别序列中均呈现相同核苷酸的任何位置。由于空白不是核苷酸，因此不计算靶序列中呈现的空白。同样，由于计数的是靶序列核苷酸，而不是来自所识别序列的核苷酸，所以不计数所识别序列中存在的空白。具体长度上的百分比同一性是通过计数该长度上匹配位置的数量并将该数量除以长度，然后将所得值乘以100来测定的。例如，如果(i)将500个碱基的核酸靶序列与目标核酸序列进行比较，(ii)Bl2seq程序呈现来自靶序列的200个碱基，所述靶序列与目标序列的区域比对，其中该200个碱基区域的第一个和最后一个碱基是匹配的，并且(iii)这200个比对碱基上的匹配数为180，则500个碱基的核酸靶序列含有200的长度和该长度上90％的序列同一性(即180/200x 100＝90)。应当理解，与识别的序列比对的单个核酸靶序列内的不同区域可以各自具有其自己的百分比同一性。注意，百分比同一性值四舍五入到最接近的十分之一。例如，78.11、78.12、78.13和78.14向下舍入为78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19向上舍入为78.2。还要注意的是，长度值始终是整数。
“分离的核酸”应理解为从其天然或原始环境分离的核酸。该术语还包括合成制造的核酸。因此，“分离的核酸序列”或“分离的DNA”是指不再存在于其分离的天然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞中或植物核或质体基因组中的核酸序列。当本文提及“序列”时，应理解具有这样的序列的分子是指例如核酸分子。“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化细胞”是指由于至少一种核酸分子已被引入所述细胞而产生的新个体细胞(或生物体)的术语。宿主细胞优选是植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可以含有作为染色体外(附加型)复制分子的核酸，或包含整合到宿主细胞的核或质体基因组中的核酸，或作为引入的染色体，例如微型染色体。
当提及与参考序列具有“基本序列同一性”或与参考序列具有至少80％>的序列同一性，例如至少85％、90％、95％、98％>或99％>的核酸序列同一性的核酸序列(例如DNA或基因组DNA)时，在一个实施方案中，所述核苷酸序列被认为与给定的核苷酸序列基本上相同，并且可以使用严格杂交条件来鉴定。在另一个实施方案中，与给定的核苷酸序列相比，核酸序列包含一个或多个突变，但仍然可以使用严格杂交条件来鉴定。“严格杂交条件”可用于鉴定与给定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境下会有所不同。一般来说，严格条件选择为比特定序列在定义的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在定义的离子强度和pH下)。通常选择严格的条件，其中在pH 7下盐浓度为约0.02摩尔并且温度为至少60℃。降低盐浓度和/或提高温度增加严格性。用于RNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的Northern印迹)是例如包括在0.2X SSC中在63℃下至少一次20分钟洗涤的那些条件，或等同条件。用于DNA-DNA杂交(使用例如100nt的探针的Southern印迹)的严格条件是例如包括在0.2X SSC中在至少50℃，通常约55℃的温度下至少一次(通常2次)洗涤的那些条件，或同等条件。也参见Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。
术语“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”是指其中单链核酸分子将其自身附着至互补核酸链，即与该碱基配对一致的过程。例如，Sambrook等(MolecularCloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第3版2001)描述了用于杂交的标准程序。优选地，这将被理解为是指核酸链的至少50％，更优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的碱基与互补核酸链形成碱基对。这种结合的可能性依赖于杂交条件的严格性。术语“严格性”是指杂交条件。如果碱基配对较困难，则为高严格性；如果有利于碱基配对，则为低严格性。杂交条件的严格性依赖于例如盐浓度或离子强度和温度。通常，可以通过提高温度和/或降低盐度来提高严格性。“严格杂交条件”定义为其中杂交主要仅在同源核酸分子之间发生的条件。术语“杂交条件”不仅指核酸在主要条件下的实际结合，而且还指在随后的洗涤步骤中的主要条件。严格杂交条件是，例如，其中主要仅具有至少70％，优选至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的那些核酸分子发生杂交的条件。不太严格的杂交条件包括：在37℃下在4×SSC中杂交，然后在室温下在1×SSC中重复洗涤。严格的杂交条件包括：在65℃下在4×SSC中杂交，然后在65℃下在0.1×SSC中重复洗涤总共约1小时。在某些实施方案中，据说与某些其他多核苷酸杂交的多核苷酸在严格杂交条件下杂交。
在某些方面，本发明涉及耐受一种或多种ALS抑制剂，特别是耐受足够高的剂量以实现最佳除草活性的ALS抑制剂的栽培甜菜植物或植物部分。在某些实施方案中，本文所述的栽培甜菜植物耐受除草活性推荐剂量的一种或多种ALS抑制剂。优选地，所述剂量是单次施用剂量。应当理解，如果在生长季节期间需要多次施用，则根据本发明的栽培甜菜植物优选耐受所述多次施用。优选地，根据本发明的ALS抑制剂耐受性栽培甜菜植物在其他重要农艺特性例如生长、产量、质量、病原体抗性、生理功能等方面没有缺点。
如本文所用，“抵抗的”、“抗性”、“耐受性”或“耐受的”是指当施用于各栽培甜菜植物，特别是含有在位置371处包含突变的ALS多肽的甜菜时，施用一种或多种ALS抑制剂除草剂，例如本文别处描述的那些，不显示关于生理功能/植物毒性的任何明显效果，而将相同量的各ALS抑制剂除草剂施用于非耐受的栽培甜菜植物导致关于植物生长、其生理功能的显著负面影响或表现出植物毒性症状。观察到的效果的质量和数量可能依赖于所施用的各ALS抑制剂除草剂的化学成分、施用的剂量率和时间以及所处理植物的生长条件/阶段。
如本文所用，术语“增加的耐受性”和“增加的抗性”涉及施用ALS抑制剂除草剂的任何症状(例如生物量的损害或损失)的任何缓解、减少的呈现、改善或其任何组合。本文提到的增加的抗性或耐受性还可以涉及植物在ALS抑制剂除草剂施用时或之后维持例如其生物量生产(例如可收获的生物量生产，例如种子产量)的能力。ALS抑制剂除草剂抗性或耐受性植物、植物细胞或植物部分在本文中可以分别指与它们所源自的亲本植物(且不具有在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸的ALS蛋白)相比，对ALS抑制剂除草剂具有增加的抗性/耐受性的植物、植物细胞或植物部分。抗性或耐受性在本文中可以涉及植物降低一种或多种ALS抑制剂除草剂对其适应性、产量、生物量(产量)等的影响的能力。测定除草剂抗性/耐受性的方法，例如除草剂引起的损害的视觉评分、生物量(产量)的测定等是本领域技术人员已知的。
ALS抑制剂耐受性可以例如通过基于从0(死亡植物)至9(完全不受影响的植物)的等级的植物活力和植物失绿的视觉损伤评级来测定，例如在草甘膦施用后2周对单个植物进行评级。0到3的等级是易感植物的特征。3到7的等级表示低到中等的耐受性水平，8或9的等级表示良好的耐受性水平。具体而言，评级具有以下含义：9.与未处理的对照相同的未受影响的植物；8.仅叶尖出现非常小的坏死，受影响叶面积小于5％，呈黄色；7.叶尖出现非常小的坏死，所述叶开始卷曲；小于5％的叶面积受到影响并变黄；6，5，4.坏死和卷叶增加；叶子变得比正常小；3，2.叶子不生长或生长非常有限；所有叶子都卷曲并受到坏死影响；1.植物没有生长；高达5％的植物保持绿色；0.死植物。在某些优选的实施方案中，根据本发明的栽培甜菜植物具有至少3，优选至少7，更优选至少8，甚至更优选9的评级。
在某些实施方案中，根据本发明的栽培甜菜植物比相应的野生型栽培甜菜植物对ALS抑制剂除草剂不太敏感。在某些实施方案中，根据本发明的栽培甜菜植物的敏感性降低至少10倍，例如敏感性降低100倍，更优选降低500倍，甚至更优选降低1000倍，并且最优选降低2000倍。如本文所用，术语“增加的耐受性”和“增加的抗性”可以与“降低的敏感性”或“降低的易感性”互换使用。因此，对一种或多种ALS抑制剂除草剂具有更高抗性或更高耐受性的根据本发明的植物、植物部分或植物群体被认为对此类除草剂较不敏感。当本文使用时较不敏感或较不易感可被视为“更耐受”或“更有抗性”。类似地，“更耐受”或“更有抗性”反之亦然可以被视为“较不敏感”或“较不易感”。当在本文中使用时，更敏感或更易感，反之亦然，可被视为“较不耐受”或“抗性较低”。类似地，“较不耐受”或“抗性较低”反之亦然，可以被视为“更敏感”或“更易感”。
通常优选本发明的甜菜植物及其部分在农艺上是可利用的。“农艺上可利用的”是指甜菜植物及其部分可用于农艺目的。例如，甜菜植物应当用于糖生产、生物燃料生产(例如沼气、生物丁醇)、乙醇生产、甜菜碱和/或尿苷生产的目的。当本文使用时，术语“农艺上可利用的”还包括本发明的甜菜植物优选对ALS抑制剂除草剂较不敏感，更优选其敏感性降低至少100倍，更优选500倍，甚至更优选1000倍，最优选降低2000倍。ALS抑制剂除草剂是本文所述的一种或多种，优选其是单独的甲磺隆或与来自磺酰脲类除草剂亚类或磺酰脲类除草剂的任何其他亚类的一种或多种另外的ALS抑制剂除草剂的组合，最优选其为甲磺隆与另外的磺酰脲类除草剂和/或磺酰氨基羰基三唑啉酮除草剂亚类的ALS-抑制剂的组合。
优选地，本发明的农艺上可利用的甜菜植物，最优选甜菜植物是完全可育的，更优选具有野生型可育性。对于本发明的甜菜植物来说，为了在农艺上可利用，可育性是最重要的。
农艺上可利用的甜菜植物的一个实例是甜菜。本发明的甜菜植物当在一公顷产量(约80，000至90，000个甜菜)的面积中栽培时应优选用于生产至少4吨糖。或者，本发明的甜菜植物应优选含有15-20％，优选至少17％的糖含量，以便在农艺上可利用。因此，含有15-20％，优选至少17％的糖含量的甜菜植物是本发明的优选实施方案。
可以用于本发明的某些实施方案的属于ALS抑制剂类别的除草化合物包括(a)磺酰脲类除草剂(Beyer E.M等(1988)，Sulfonylureas in Herbicides：Chemistry，Degradation，and Mode of Action；Marcel Dekker，New York，1988，117-189)，(b)磺酰氨基羰基三唑啉酮除草剂(Pontzen，R.，Pflanz.-NachrichtenBayer，2002，55，37-52)，(c)咪唑啉酮除草剂(Shaner，D.L.，等，Plant Physiol.，1984，76，545-546；Shaner，D.L.，和O'Connor，S.L.(编辑)The Imidazolinone Herbicides，CRC Press，Boca Rato，FL，1991)，(d)三唑并嘧啶除草剂(Kleschick，W.A.等，Agric.FoodChem，1992，40，1083-1085)和(e)嘧啶基(氧基/硫代)苯甲酸酯除草剂(Shimizu，T.J.，Pestic.Sci.，1997，22，245-256；Shimizu，T.等，Acetolactate Synthase Inhibitors in Herbicide Classes inDevelopment，Boger，P.，Wakabayashi.K.，Hirai，K.，(编辑)，Springer Verlag，Berlin，2002，1-41)。
在某些实施方案中，ALS抑制剂选自磺酰脲、磺酰氨基羰基三唑啉酮、三唑并嘧啶、磺酰苯胺、咪唑啉酮、嘧啶基氧基苯甲酸、嘧啶基硫代苯甲酸。可用于本发明某些方面的另外的ALS抑制剂描述于例如WO 2014/090760、WO 2012/049268、WO 2012/049266、EP 2 627183和WO 2014/091021中，其各自以其整体通过引用并入本文。
在某些实施方案中，ALS抑制剂选自WO2012/049266的权利要求2-4中列出的ALS抑制剂，所有这些都通过引用明确并入本文。
早已知来自(磺)酰胺类的化合物为用于控制不想要的植被的除草活性化合物；参见例如EP 239414、US 4288244、DE 3303388、US 5457085、US 3120434、US 3480671、EP206251、EP 205271、US2556664、US 3534098、EP 5301 1、US 04385927、EP 348737、DE2822155、US 3894078、GB869169、EP 447004、DE 1039779、HU 176582、US 3442945、DE2305495、DE 2648008、DE 2328340、DE 1014380、HU 53483、US 4802907、GB1040541、US2903478、US 3177061、US2695225、DE 1567151、GB574995、DE 1031571、US 3175897、JP1098331、US2913327、WO 8300329、JP 80127302、DE 1300947、DE 2135768、US 3175887、US3836524、JP 85067463、US 3582314、US 53330821、EP 131258、US 4746353、US 4420325、US4394506、US 4127405、US 4479821、US 5009699、EP 136061、EP 324569、EP 184385、WO2002030921、WO 09215576、WO 09529899、US 4668277、EP 305939、WO 09641537、WO09510507、EP 7677、CN 010801 16、US 4789393、EP 971902、US 5209771、EP 84020、EP120814、EP 87780、WO 08804297、EP 5828924、WO 2002036595、US 5，476，936、WO 2009/053058和在上述出版物中引用的文献。
早已知来自咪唑啉酮类组的化合物为用于控制不想要的植被的除草活性化合物；例如参见Proc.South.Weed Sci.Soc.1992.45，341，Proc.South.WeedSci.Soc.Annu.Mtg.36th，1983，29，Weed Sci.Soc.Annu.Mtg.36th，1983，90-91，WeedSci.Soc.Mtg.，1984，18，Modern Agrochemicals，2004，14-15。
早已知来自嘧啶基(硫代)苯甲酸酯组的化合物作为用于控制不想要的植被的除草活性化合物；参见例如US 4906285、EP 658549、US 51 18339、WO 91/05781、US4932999和EP 315889。
早已知来自磺酰胺类组的化合物为用于控制不想要的植被的除草活性化合物；参见例如WO 93/09099、WO 2006/008159和WO 2005/096818。
本公开中引用的所有出版物和专利均以其整体通过引用并入。
在某些实施方案中，赋予对ALS抑制剂的抗性的合适的突变ALS如EP 2 931 902和WO 2012/049268中所述，其以其整体通过引用并入本文。
在某些实施方案中，如本文使用的ALS抑制剂除草剂选自(磺)酰胺类，例如磺酰脲类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、磺酰苯胺类或三唑并嘧啶类；咪唑啉酮类；和嘧啶基(硫代/氧基)苯甲酸酯，优选选自磺酰脲类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、咪唑啉酮类和嘧啶基(硫代/氧基)苯甲酸酯类。这些类别的ALS抑制剂除草剂可分为A组(包含A1、A2、A3和A4亚组)、B(B1)和C组(包含C1和C2亚组)。
在某些实施方案中，本文使用的ALS抑制剂除草剂是选自以下的一种或多种的磺酰脲：
酰胺磺隆[CAS RN 120923-37-7](＝A1-1)；
四唑嘧磺隆[CAS RN 120162-55-2](＝A1-2)；
苄嘧磺隆[CAS RN 83055-99-6](＝A1-3)；
氯嘧磺隆[CAS RN 90982-32-4](＝A1-4)；
氯磺隆[CAS RN 64902-72-3](＝A1-5)；
醚磺隆[CAS RN 94593-91-6](＝A1-6)；
环丙磺隆[CAS RN 136849-15-5](＝A1-7)；
胺苯磺隆[CAS RN 97780-06-8](＝A1-8)；
乙氧基磺隆[CAS RN 126801-58-9](＝A1-9)；
啶嘧磺隆[CAS RN 104040-78-0](＝A1-10)；
氟吡磺隆[CAS RN 412928-75-7](＝A1-11)；
氟吡嘧磺隆钠[CAS RN 144740-54-5](＝A1-12)；
酰胺磺隆[CAS RN 173159-57-4](＝A1-13)；
氯吡嘧磺隆[CAS RN 100784-20-1](＝A1-14)；
咪唑磺隆[CAS RN 122548-33-8](＝A1-15)；
碘甲磺隆钠[CAS RN 144550-36-7](＝A1-16)；
甲磺胺磺隆[CAS RN 208465-21-8](＝A1-17)；
甲磺隆[CAS RN 74223-64-6](＝A1-18)；
单嘧磺隆[CAS RN 155860-63-2](＝A1-19)；
烟嘧磺隆[CAS RN 111991-09-4](＝A1-20)；
嘧苯胺磺隆[CAS RN 213464-77-8](＝A1-21)；
环氧嘧磺隆[CAS RN 144651-06-9](＝A1-22)；
甲基氟嘧磺隆[CAS RN 86209-51-0](＝A1-23)；
氟磺隆[CAS RN 94125-34-5](＝A1-24)；
吡嘧磺隆[CAS RN 93697-74-6](＝A1-25)；
砜嘧磺隆[CAS RN 122931-48-0](＝A1-26)；
甲嘧磺隆[CAS RN 74222-97-2](＝A1-27)；
磺酰磺隆[CAS RN 141776-32-1](＝A1-28)；
噻吩黄隆[CAS RN 79277-27-3](＝A1-29)；
醚苯磺隆[CAS RN 82097-50-5](＝A1-30)；
苯磺隆[CAS RN 101200-48-0](＝A1-31)；
三氟啶磺隆[CAS RN 145099-21-4](钠)(＝A1-32)；
氟胺磺隆[CAS RN 126535-15-7](＝A1-33)；
三氟甲磺隆[CAS RN 142469-14-5](＝A1-34)；
NC-330[CAS RN 104770-29-8](＝A1-35)；
NC-620[CAS RN 868680-84-6](＝A1-36)；
TH-547[CAS RN 570415-88-2](＝A1-37)；
单甲嘧磺隆[CAS RN 175076-90-1](＝A1-38)
2-碘-N-[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪基)氨基甲酰基]苯磺酰胺(＝A1-39)；
通式(I)的化合物
其中M+表示化合物(I)各自的盐，即
其锂盐(＝A1-40)；其钠盐(＝A1-41)；其钾盐(＝A1-42)；其镁盐(＝A1-43)；其钙盐(＝A1-44)；其铵盐(＝A1-45)；其甲基铵盐(＝A1-46)；其二甲基铵盐(＝A1-47)；其四甲基铵盐(＝A1-48)；其乙基铵盐(＝A1-49)；其二乙基铵盐(＝A1-50)；其四乙基铵盐(＝A1-51)；其丙基铵盐(＝A1-52)；其四丙基铵盐(＝A1-53)；其异丙基铵盐(＝A1-54)；其二异丙基铵盐(＝A1-55)；其丁基铵盐(＝A1-56)；其四丁基铵盐(＝A1-57)；其(2-羟基乙基-1-基)铵盐(＝A1-58)；其双-N，N-(2-羟基乙基-1-基)铵盐(＝A1-59)；其三-N，N，N-(2-羟基乙基-1-基)铵盐(＝A1-60)；其1-苯乙基铵盐(＝A1-61)；其2-苯乙基铵盐(＝A1-62)；其三甲基锍盐(＝A1-63)；其三甲基氧鎓盐(＝A1-64)；其吡啶鎓盐(＝A1-65)；其2-甲基吡啶鎓盐(＝A1-66)；其4-甲基吡啶鎓盐(＝A1-67)；其2，4-二甲基吡啶鎓盐(＝A1-68)；其2，6-二甲基吡啶鎓盐(＝A1-69)；其哌啶鎓盐(＝A1-70)；其咪唑鎓盐(＝A1-71)；其吗啉鎓盐(＝A1-72)；其1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-7-烯盐(＝A1-73)；其1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯盐(＝A1-74)；
式(II)的化合物或其盐
其中R2和R3具有下表中所定义的含义
式(III)的化合物(＝A1-87)，即化合物(A1-83)的钠盐
式(IV)的化合物(＝A1-88)，即化合物(A1-82)的钠盐
在某些实施方案中，本文使用的ALS抑制剂除草剂是选自以下的一种或多种的磺酰氨基羰基三唑啉酮：
氟酮磺隆钠[CAS RN 181274-17-9](＝A2-1)；
丙苯磺隆钠[CAS RN 181274-15-7](＝A2-2)；和
噻酮磺隆[CAS RN 317815-83-1](＝A2-3)。
在某些实施方案中，本文使用的ALS抑制剂除草剂是选自以下的一种或多种的三唑并嘧啶：
氯酯磺草胺[147150-35-4](＝A3-1)；
双氯磺草胺[CAS RN 145701-21-9](＝A3-2)；
双氟磺草胺[CAS RN 145701-23-1](＝A3-3)；
唑嘧磺草胺[CAS RN 98967-40-9](＝A3-4)；
磺草唑胺[CAS RN 139528-85-1](＝A3-5)；
五氟磺草胺[CAS RN 219714-96-2](＝A3-6)；
甲氧磺草胺[CAS RN 422556-08-9](＝A3-7)。
在某些实施方案中，本文使用的ALS抑制剂除草剂是选自通式(V)所描述的组的化合物或其盐的一种或多种的sulfonanilide：
其中
R1是卤素，优选氟或氯，
R1是氢且R3是羟基或
R2和R3与它们所连接的碳原子一起为羰基C＝O并且
R4为氢或甲基；
且更特别地具有以下给出的化学结构(A4-1)至(A4-8)的化合物
在某些实施方案中，本文使用的ALS抑制剂除草剂是选自以下的一种或多种的咪唑啉酮：
甲基咪草酯[CAS RN 81405-85-8](＝B1-1)；
甲氧咪草酸[CAS RN 114311-32-9](＝B1-2)；
甲咪唑烟酸[CAS RN 104098-48-8](＝B1-3)；
咪唑烟酸[CAS RN 81334-34-1](＝B1-4)；
咪唑喹啉酸[CAS RN 81335-37-7](＝B1-5)；
咪唑乙烟酸[CAS RN 81335-77-5](＝B1-6)；
SYP-298[CAS RN 557064-77-4](＝B1-7)；
SYP-300[CAS RN 374718-10-2](＝B1-8)。
在某些实施方案中，本文使用的ALS抑制剂除草剂是选自以下的一种或多种的嘧啶氧基苯甲酸酯：
双草醚-纳[CAS RN 125401-92-5](＝C1-1)；
嘧啶肟草醚[CAS RN 168088-61-7](＝C1-2)；
嘧草醚[CAS RN 136191-64-5](＝C1-3)；
异丙酯草醚[CAS RN 420138-41-6](＝C1-4)；
丙酯草醚[CAS RN 420138-40-5](＝C1-5)。
在某些实施方案中，本文使用的ALS抑制剂除草剂是选自以下的一种或多种的嘧啶基硫代苯甲酸酯：
环酯草醚[CAS RN 135186-78-6](＝C2-1)；
嘧草硫醚[CAS RN 123343-16-8](＝C2-2)。
A至C组中提到的名称(通用名称)后面方括号中规定的“CAS RN”对应于“化学文摘服务登记号”，这是一个习惯参考号，其允许对命名的物质进行明确分类，因为“CAS RN”尤其在异构体，包括立体异构体之间进行区分。
术语“ALS-抑制剂除草剂”或简单地“ALS-抑制剂”可互换使用。如本文所用，“ALS抑制剂除草剂”或“ALS抑制剂”并不意味着限于干扰ALS酶活性的单一除草剂。因此，除非另有说明或从上下文中显而易见，“ALS抑制剂除草剂”或“ALS抑制剂”可以是本领域已知的一种除草剂或两种、三种、四种或更多种除草剂的混合物，优选如在本文中指定的，它们各自干扰ALS酶的活性。
根据本发明优选的属于组(A)的ALS抑制剂除草剂是：
酰胺磺隆[CAS RN 120923-37-7](＝A1-1)；
氯嘧磺隆[CAS RN 90982-32-4](＝A1-4)；
胺苯磺隆[CAS RN 97780-06-8](＝A1-8)；
乙氧基磺隆[CAS RN 126801-58-9](＝A1-9)；
氟吡嘧磺隆钠[CAS RN 144740-54-5](＝A1-12)；
酰胺磺隆[CAS RN 173159-57-4](＝A1-13)；
碘甲磺隆钠[CAS RN 144550-36-7](＝A1-16)；
甲磺胺磺隆[CAS RN 208465-21-8](＝A1-17)；
甲磺隆[CAS RN 74223-64-6](＝A1-18)；
单嘧磺隆[CAS RN 155860-63-2](＝A1-19)；
烟嘧磺隆[CAS RN 1 1 1991-09-4](＝A1-20)；
磺酰磺隆[CAS RN 141776-32-1](＝A1-28)；
噻吩黄隆[CAS RN 79277-27-3](＝A1-29)；
苯磺隆[CAS RN 101200-48-0](＝A1-31)；
2-碘-N-[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪基)氨基甲酰基]苯磺酰胺(＝A1-39)；
2-碘-N-[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪基)氨基甲酰基]苯磺酰胺钠盐(＝A1-41)；
(A1-83)或其钠盐(＝A1-87)；
丙苯磺隆钠[CAS RN 181274-15-7](＝A2-2)；
噻酮磺隆[CAS RN 317815-83-1](＝A2-3)；
双氟磺草胺[CAS RN 145701-23-1](＝A3-3)；
磺草唑胺[CAS RN 139528-85-1](＝A3-5)；
甲氧磺草胺[CAS RN 422556-08-9](＝A3-7)
(A4-1)；
(A4-2)；和
(A4-3)。
根据本发明特别优选使用的属于组(A)的ALS抑制剂除草剂是：
酰胺磺隆[CAS RN 120923-37-7](＝A1-1)；
酰胺磺隆[CAS RN 173159-57-4](＝A1-13)；
碘甲磺隆钠[CAS RN 144550-36-7](＝A1-16)；
2-碘-N-[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪基)氨基甲酰基]苯磺酰胺(＝A1-39)；
2-碘-N-[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪基)氨基甲酰基]苯磺酰胺钠盐(A1-41)；
A1-83或其钠盐(＝A1-87)；
噻酮磺隆[CAS RN 317815-83-1](＝A2-3)。
根据本发明优选使用的属于组(B)的另一种ALS抑制剂除草剂是甲氧咪草酸[CASRN 1 1431 1-32-9](＝B1-2)。
根据本发明优选使用的属于组(C)的另一种ALS抑制剂除草剂是双草醚-钠[CASRN 125401-92-5](＝C1-1)。
还应当理解，关于所有上述定义的ALS抑制剂除草剂，并且当各CAS RN尚未指定时，所有使用形式，例如酸和盐都可以根据本发明应用。
另外，根据本发明使用的ALS抑制剂除草剂可以包含另外的组分，例如不同类型作用模式的农业化学活性化合物和/或作物保护中常用的制剂助剂和/或添加剂，例如作为农艺上可接受的载体，或可以与这些一起使用。
在优选的实施方案中，待根据本发明使用的除草剂组合包含有效量的属于组(A)、(B)和/或(C)的ALS抑制剂除草剂和/或具有协同作用。例如，当一起施用属于组(A)、(B)和/或(C)的一种或多种ALS抑制剂除草剂时，例如作为复合制剂或作为罐内混合可以观察到协同作用；然而，当活性化合物在不同时间(分次)施用时也可以观察到它们。还可以以多个部分施用除草剂或除草剂组合(顺序施用)，例如芽前施用随后芽后施用或芽后早期施用随后芽后中期或晚期施用。这里优选联合或几乎同时施用属于所讨论组合的组(A)、(B)和/或(C)的ALS抑制剂除草剂。协同效应允许减少单个ALS抑制剂除草剂的施用量，在相同施用量下获得更高的功效，控制尚未受控制的物种(空白)，控制对单个ALS抑制剂除草剂或许多ALS抑制剂除草剂具有耐受性或抗性的物种，延长施用期限和/或减少所需的单独施用次数，从而对用户而言杂草控制系统在经济和生态上更加有利。
待根据本发明使用的除草剂都是乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂除草剂(其也可以备选地且可互换地命名为“ALS抑制性除草剂”)并因此抑制植物中的蛋白质生物合成。属于组(A)、(B)或(C)(如上所定义)的ALS抑制剂除草剂的施用量可以在宽范围内变化，例如在0.001g和1500g ai/ha之间(ai/ha此处及下文指“每公顷活性物质”＝基于100％纯活性化合物)。以0.001g至1500g ai/ha的施用量施用属于本发明A、B和C类的除草剂，优选化合物A1-1；A1-4；A1-8；A1-9；A1-12；A1-13；A1-16；A1-17；A1-18；A1-19；A1-20；A1-28；A1-29；A1-31；A1-39；A1-41；A1-83；A1-87；A2-2；A2-3；A3-3；A3-5；A3-7、A4-3，当通过芽前和芽后方法使用时，控制相对广泛的有害植物，例如一年生和多年生单子叶或双子叶杂草，以及不想要的作物植物(一起也被定义为“不想要的植被”)，包括例如杂草甜菜、或一年生甜菜或bolters。
在根据本发明的许多应用中，施用量通常较低，例如在0.001g至1000g ai/ha的范围内，优选0.1g至500g ai/ha，特别优选0.5g至250g ai/ha，甚至更优选1.0g至200g ai/ha。在进行若干种ALS抑制剂除草剂施用的情况下，该数量代表所有施用的ALS抑制剂除草剂的总量。
例如，根据本发明的ALS抑制剂除草剂(属于(A)、(B)和/或(C)组)的组合允许以迄今为止且以意想不到的方式被协同增强的活性超过使用单个ALS抑制剂除草剂(属于(A)、(B)和/或(C)组)可实现的活性。
对于ALS抑制剂除草剂的组合，优选条件如下所示。
本发明特别感兴趣的是具有以下ALS抑制剂除草剂含量的除草组合物的用途：(A1-1)+(A1-4)；(A1-1)+(A1-8)；(A1-1)+(A1-9)；(A1-1)+(A1-12)；(A1-1)+(A1-13)；(A1-1)+(A1-16)；(A1-1)+(A1-17)；(A1-1)+(A1-18)；(A1-1)+(A1-19)；(A1-1)+(A1-20)；(A1-1)+(A1-28)；(A1-1)+(A1-29)；(A1-1)+(A1-31)；(A1-1)+(A1-39)；(A1-1)+(A1-41)；(A1-1)+(A1-83)；(A1-1)+(A1-87)；(A1-1)+(A2-2)；(A1-1)+(A2-3)；(A1-1)+(A3-3)；(A1-1)+(A3-5)；(A1-1)+(A3-7)；(A1-1)+(A4-1)；(A1-1)+(A4-2)；(A1-1)+(A4-3)；(A1-4)+(A1-8)；(A1-4)+(A1-9)；(A1-4)+(A1-12)；(A1-4)+(A1-13)；(A1-4)+(A1-16)；(A1-4)+(A1-17)；(A1-4)+(A1-18)；(A1-4)+(A1-19)；(A1-4)+(A1-20)；(A1-4)+(A1-28)；(A1-4)+(A1-29)；(A1-4)+(A1-31)；(A1-4)+(A1-39)；(A1-4)+(A1-41)；(A1-4)+(A1-83)；(A1-4)+(A1-87)；(A1-4)+(A2-2)；(A1-4)+(A2-3)；(A1-4)+(A3-3)；(A1-4)+(A3-5)；(A1-4)+(A3-7)；(A1-4)+(A4-1)；(A1-4)+(A4-2)；(A1-4)+(A4-3)；(A1-8)+(A1-9)；(A1-8)+(A1-12)；(A1-8)+(A1-13)；(A1-8)+(A1-16)；(A1-8)+(A1-17)；(A1-8)+(A1-18)；(A1-8)+(A1-19)；(A1-8)+(A1-20)；(A1-8)+(A1-28)；(A1-8)+(A1-29)；(A1-8)+(A1-31)；(A1-8)+(A1-39)；(A1-8)+(A1-41)；(A1-8)+(A1-83)；(A1-8)+(A1-87)；(A1-8)+(A2-2)；(A1-8)+(A2-3)；(A1-8)+(A3-3)；(A1-8)+(A3-5)；(A1-8)+(A3-7)；(A1-8)+(A4-1)；(A1-8)+(A4-2)；(A1-8)+(A4-3)；(A1-9)+(A1-12)；(A1-9)+(A1-13)；(A1-9)+(A1-16)；(A1-9)+(A1-17)；(A1-9)+(A1-18)；(A1-9)+(A1-19)；(A1-9)+(A1-20)；(A1-9)+(A1-28)；(A1-9)+(A1-29)；(A1-9)+(A1-31)；(A1-9)+(A1-39)；(A1-9)+(A1-41)；(A1-9)+(A1-83)；(A1-9)+(A1-87)；(A1-9)+(A2-2)；(A1-9)+(A2-3)；(A1-9)+(A3-3)；(A1-9)+(A3-5)；(A1-9)+(A3-7)；(A1-9)+(A4-1)；(A1-9)+(A4-2)；(A1-9)+(A4-3)；(A1-12)+(A1-13)；(A1-12)+(A1-16)；(A1-12)+(A1-17)；(A1-12)+(A1-18)；(A1-12)+(A1-19)；(A1-12)+(A1-20)；(A1-12)+(A1-28)；(A1-12)+(A1-29)；(A1-12)+(A1-31)；(A1-12)+(A1-39)；(A1-12)+(A1-41)；(A1-12)+(A1-83)；(A1-12)+(A1-87)；(A1-12)+(A2-2)；(A1-12)+(A2-3)；(A1-12)+(A3-3)；(A1-12)+(A3-5)；(A1-12)+(A3-7)；(A1-12)+(A4-1)；(A1-12)+(A4-2)；(A1-12)+(A4-3)；(A1-13)+(A1-16)；(A1-13)+(A1-17)；(A1-13)+(A1-18)；(A1-13)+(A1-19)；(A1-13)+(A1-20)；(A1-13)+(A1-28)；(A1-13)+(A1-29)；(A1-13)+(A1-31)；(A1-13)+(A1-39)；(A1-13)+(A1-41)；
(A1-13)+(A1-83)；(A1-13)+(A1-87)；(A1-13)+(A2-2)；(A1-13)+(A2-3)；(A1-13)+(A3-3)；
(A1-13)+(A3-5)；(A1-13)+(A3-7)；(A1-13)+(A4-1)；(A1-13)+(A4-2)；(A1-13)+(A4-3)；
(A1-16)+(A1-17)；(A1-16)+(A1-18)；(A1-16)+(A1-19)；(A1-16)+(A1-20)；(A1-16)+(A1-28)；
(A1-16)+(A1-29)；(A1-16)+(A1-31)；(A1-16)+(A1-39)；(A1-16)+(A1-41)；(A1-16)+(A1-83)；
(A1-16)+(A1-87)；(A1-16)+(A2-2)；(A1-16)+(A2-3)；(A1-16)+(A3-3)；(A1-16)+(A3-5)；
(A1-16)+(A3-7)；(A1-16)+(A4-1)；(A1-16)+(A4-2)；(A1-16)+(A4-3)；
(A1-17)+(A1-18)；(A1-17)+(A1-19)；(A1-17)+(A1-20)；(A1-17)+(A1-28)；(A1-17)+(A1-29)；
(A1-17)+(A1-31)；(A1-17)+(A1-39)；(A1-17)+(A1-41)；(A1-17)+(A1-83)；(A1-17)+(A1-87)；
(A1-17)+(A2-2)；(A1-17)+(A2-3)；(A1-17)+(A3-3)；(A1-17)+(A3-5)；(A1-17)+(A3-7)；
(A1-17)+(A4-1)；(A1-17)+(A4-2)；(A1-17)+(A4-3)；
(A1-18)+(A1-19)；(A1-18)+(A1-20)；(A1-18)+(A1-28)；(A1-18)+(A1-29)；(A1-18)+(A1-31)；
(A1-18)+(A1-39)；(A1-18)+(A1-41)；(A1-18)+(A1-83)；(A1-18)+(A1-87)；(A1-18)+(A2-2)；
(A1-18)-i-(A2-3)；(A1-18)+(A3-3)；(A1-18)+(A3-5)；(A1-18)+(A3-7)；(A1-18)+(A4-1)；
(A1-18)+(A4-2)；(A1-18)+(A4-3)；
(A1-19)+(A1-20)；(A1-19)-i-(A1-28)；(A1-19)+(A1-29)；(A1-19)+(A1-31)；(A1-19)+(A1-39)；
(A1-19)+(A1-41)；(A1-19)+(A1-83)；(A1-19)+(A1-87)；(A1-19)+(A2-2)；(A1-19)+(A2-3)；
(A1-19)+(A3-3)；(A1-19)+(A3-5)；(A1-19)+(A3-7)；(A1-19)+(A4-1)；(A1-19)+(A4-2)；
(A1-19)+(A4-3)；
(A1-20)+(A1-28)；(A1-20)+(A1-29)；(A1-20)+(A1-31)；(A1-20)+(A1-39)；(A1-20)+(A1-41)；
(A1-20)-i-(A1-83)；(A1-20)+(A1-87)；(A1-20)+(A2-2)；(A1-20)+(A2-3)；(A1-20)+(A3-3)；
(A1-20)+(A3-5)；(A1-20)+(A3-7)；(A1-20)+(A4-1)；(A1-20)+(A4-2)；(A1-20)+(A4-3)；
(A1-28)+(A1-29)；(A1-28)+(A1-31)；(A1-28)+(A1-39)；(A1-28)+(A1-41)；(A1-28)+(A1-83)；
(A1-28)+(A1-87)；(A1-28)+(A2-2)；(A1-28)+(A2-3)；(A1-28)+(A3-3)；(A1-28)+(A3-5)；
(A1-28)+(A3-7)；(A1-28)+(A4-1)；(A1-28)+(A4-2)；(A1-28)+(A4-3)；
(A1-29)+(A1-31)；(A1-29)+(A1-39)；(A1-29)+(A1-41)；(A1-29)+(A1-83)；(A1-29)+(A1-87)；
(A1-29)+(A2-2)；(A1-29)-i-(A2-3)；(A1-29)+(A3-3)；(A1-29)+(A3-5)；(A1-29)+(A3-7)；
(A1-29)+(A4-1)；(A1-29)+(A4-2)；(A1-29)+(A4-3)；
(A1-31)+(A1-39)；(A1-31)+(A1-41)；(A1-31)+(A1-83)；(A1-31)+(A1-87)；(A1-31)+(A2-2)；
(A1-31)+(A2-3)；(A1-31)+(A3-3)；(A1-31)+(A3-5)；(A1-31)+(A3-7)；(A1-31)+(A4-1)；
(A1-31)+(A4-2)；(A1-31)+(A4-3)；
(A1-39)+(A1-41)；(A1-39)+(A1-83)；(A1-39)+(A1-87)；(A1-39)+(A2-2)；(A1-39)+(A2-3)；
(A1-39)+(A3-3)；(A1-39)+(A3-5)；(A1-39)+(A3-7)；(A1-39)+(A4-1)；(A1-39)+(A4-2)；
(A1-39)+(A4-3)；
(A1-41)+(A1-83)；(A1-41)+(A1-87)；(A1-41)+(A2-2)；(A1-41)+(A2-3)；(A1-41)+(A3-3)；
(A1-41)+(A3-5)；(A1-41)+(A3-7)；(A1-41)+(A4-1)；(A1-41)+(A4-2)；(A1-41)+(A4-3)；
(A1-83)+(A2-2)；(A1-83)+(A2-3)；(A1-83)+(A3-3)；(A1-83)+(A3-5)；(A1-83)+(A3-7)；
(A1-83)+(A4-1)；(A1-83)+(A4-2)；(A1-83)+(A4-3)；
(A1-87)+(A2-2)；(A1-87)+(A2-3)；(A1-87)+(A3-3)；(A1-87)+(A3-5)；(A1-87)+(A3-7)；
(A1-87)+(A4-1)；(A1-87)+(A4-2)；(A1-87)+(A4-3)；
(A2-2)+(A2-3)；(A2-2)+(A3-3)；(A2-2)+(A3-5)；(A2-2)+(A3-7)；(A2-2)+(A4-1)；
(A2-2)+(A4-2)；(A2-2)+(A4-3)；
(A2-3)+(A3-3)；(A2-3)+(A3-5)；(A2-3)+(A3-7)；(A2-3)+(A4-1)；(A2-3)+(A4-2)；
(A2-3)+(A4-3)；
(A3-3)+(A3-5)；(A3-3)+(A3-7)；(A3-3)+(A4-1)；(A3-3)+(A4-2)；(A3-3)+(A4-3)；
(A3-5)+(A3-7)；(A3-5)+(A4-1)；(A3-5)+(A4-2)；(A3-5)+(A4-3)；
(A3-7)+(A4-1)；(A3-7)+(A4-2)；(A3-7)+(A4-3)；
(A4-1)+(A4-2)；(A4-1)+(A4-3)；和
(A4-2)+(A4-3)；
另外，根据本发明使用的ALS抑制剂除草剂可以包含其他组分，例如不同类型作用方式的农业化学活性化合物和/或作物保护中常用的制剂助剂和/或添加剂，或者可以使用与这些一起。
待根据本发明使用的ALS抑制剂除草剂或多种此类ALS抑制剂除草剂的组合还可包含多种农用化学活性化合物，例如选自安全剂、杀真菌剂、杀虫剂的组，或选自作物保护中常用的制剂助剂和添加剂的组。
在另一个实施方案中，本发明涉及有效量的ALS抑制剂除草剂(即组(A)、(B)和/或(C)的成员)和非ALS抑制剂除草剂(即除草剂，其显示出与抑制ALS酶[乙酰羟酸合酶；EC2.2.1.6](组D除草剂)不同的作用模式)，获得用于控制不想要的植被的协同效应的用途。例如，当施用一种或多种ALS抑制剂除草剂(即，组(A)、(B)和/或(C)的成员)和一种或多种非ALS抑制剂除草剂(组D除草剂)例如作为复合制剂或作为桶混制剂时，可以观察到这种协同作用；然而，当活性化合物在不同时间施用(分次)时也可以观察到它们。还可以分多个部分施用ALS抑制剂除草剂和非ALS抑制剂除草剂(顺序施用)，例如出苗前施用，随后出苗后施用，或者出苗后早期施用，随后中期或晚期施用。这里优选联合或几乎同时施用所讨论组合的除草剂((A)、(B)和/或(C))和(D)。
与ALS抑制剂除草剂一起施用的合适的partner除草剂是例如结构上不同于属于如上所定义的组(A)、(B)和(C)的除草剂的以下除草剂，优选这样的除草活性化合物，其作用基于对例如乙酰辅酶A羧化酶、PS I、PS II、HPPDO、八氢番茄红素去饱和酶、原卟啉原氧化酶、谷氨酰胺合成酶、纤维素生物合成、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合成酶的抑制，例如在Weed Research 26，441-445(1986)，或"The Pesticide Manual"，第14版，TheBritishCrop Protection Council，2007，或第15版2010，或相应的"e-Pesticide Manual"，第5版(2010)中所述，在British Crop Protection Council(以下也简称“PM”)发布的每种情况下，以及其中引用的文献中。通用名称列表也可在互联网上的“The Compendium ofPesticide Common Names”中获得。从文献中已知的除草剂(在下文通用名称后面的括号中，也按指示符D1至D426分类)，其可以与组(A)、(B)和/或(C)的ALS抑制剂除草剂组合并且可以根据本发明使用的除草剂例如是下列活性化合物：(注意：除草剂是指根据International Organization for Standardization(ISO)的“通用名称”或化学名，其中适当时具有惯用的代号，并且在每种情况下包括所有使用形式，例如酸、盐、酯和异构体，例如立体异构体和旋光异构体，特别是商业形式或多种商业形式，除非上下文另有说明。给出的引用是一种使用形式，在某些情况下是两种或多种使用形式)：
乙草胺(＝D1)、阿拉酸式苯(＝D2)、阿拉酸式苯-S-甲基(＝D3)、三氟羧草醚(＝D4)、三氟羧草醚钠盐(＝D5)、苯草醚(＝D6)、甲草胺(＝D7)、草毒死(＝D8)、alloxydim(＝D9)、禾草灭(＝D10)、莠灭净(＝D1 1)、氨唑草酮(＝D12)、先甲草胺(＝D13)、氯丙嘧啶酸(＝D14)、氯氨基吡啶酸(＝D15)、杀草强(＝D16)、氨基磺酸铵(＝D17)、嘧啶醇(＝D18)、莎稗磷(＝D19)、磺草灵(＝D20)、阿特拉津(＝D21)、唑啶草酮(＝D22)、叠氮津(＝D23)、氟丁酰草胺(＝D24)、苯那唑啉(＝D25)、草除灵(＝D26)、苯唑磺隆(＝D27)、苯氟拉林(＝D28)、三氮杂苯(＝D29)、地散磷(＝D30)、苯达松(＝D31)、双苯嘧草酮(＝D32)、苯并双环酮(＝D33)、吡草酮(＝D34)、乙羧氟草醚(＝D35)、新燕灵(＝D36)、氟吡草酮(＝D37)、甲羧除草醚(＝D38)、双丙氨膦(＝D39)、双丙氨膦钠(＝D40)、除草定(＝D41)、溴丁酰草胺(＝D42)、溴酚肟(＝D43)、溴苯腈(＝D44)、氯溴隆(＝D45)、布米纳福斯(＝D46)、羟草酮(＝D47)、丁草胺(＝D48)、氟丙嘧草酯(＝D49)、抑草磷(＝D50)、丁烯草胺(＝D51)、仲丁灵(＝D52)、丁氧环酮(＝D53)、苏达灭(＝D54)、苯酮唑(＝D55)、碳乙酰胺(＝D56)、三唑酮草酯(＝D57)、三唑酮草酯(＝D58)、甲氧除草醚(＝D59)、豆科威(＝D60)、炔禾灵(＝D61)、丁基炔禾灵(＝D62)、氯溴隆(＝D63)、氯炔灵(＝D64)、伐草克(＝D65)、伐草克钠(＝D66)、chlorfenprop(＝D67)、氯芴素(＝D68)、甲基氯芴素(＝D69)、氯草敏(＝D70)、矮壮素(＝D71)、氯硝芬(＝D72)、chlorophthalim(＝D73)、氯酞酸二甲酯(＝D74)、绿麦降(＝D75)、吲哚酮草酯(＝D76)、乙基吲哚酮草酯(＝D77)、环庚草醚(＝D78)、烯草酮(＝D79)、炔草酯(＝D80)、炔草酸(＝D81)、杀雄嗪酸(＝D82)、广灭灵(＝D83)、氯甲酰草胺(＝D84)、坐果安(＝D85)、二氯吡啶酸(＝D86)、氯酯磺草胺酸(＝D87)、氯酯磺草胺(＝D88)、苄草隆(＝D89)、氰胺(＝D90)、氰乙酰腈(＝D91)、环丙酸酰胺(＝D92)、草灭特(＝D93)、噻草酮(＝D94)、环莠隆(＝D95)、氰氟草酯(＝D96)、丁基氰氟草酯(＝D97)、苯草快(＝D98)、环草津(＝D99)、三环塞草胺(＝D100)、2，4-D(＝D101)、2，4-DB(＝D102)、杀草隆/莎草隆(＝D103)、茅草枯(＝D104)、丁酰肼(＝D105)、棉隆(＝D106)、正癸醇(＝D-107)、甜菜安(＝D108)、敌草净(＝D109)、detosyl-pyrazolate(＝D110)、燕麦敌(＝D111)、麦草畏(＝D112)、敌草腈(＝D113)、二氯丙醇(＝D114)、二氯丙醇-P(＝D115)、双氯芬酸(＝D116)、甲基双氯芬酸(＝D117)、甲基双氯芬酸-P(＝D118)、乙酰甲草胺(＝D119)、diethatyl-ethyl(＝D120)、枯莠隆(＝D121)、野燕枯(＝D122)、吡氟酰草胺(＝D123)、氟吡草腙(＝D124)、氟吡草腙钠(＝D125)、恶唑隆(＝D126)、敌草克钠(＝D127)、恶唑隆(＝D128)、哌草丹(＝D129)、二甲草胺(＝D130)、异戊乙净(＝D131)、二甲噻草胺(＝D132)、二甲噻草胺-P(＝D133)、噻节因(＝D134)、dimetrasulfuron(＝D135)、敌乐胺(＝D136)、地乐酚(＝D137)、特乐酚(＝D138)、二苯胺(＝D139)、杀草净(＝D140)、敌草快(＝D141)、敌草快(＝D142)、氟硫草定(＝D143)、敌草隆(＝D144)、DNOC(＝D145)、甘草津(＝D146)、草藻灭(＝D147)、EPTC(＝D148)、禾草畏(＝D149)、丁氟消草(＝D150)、乙烯利(＝D151)、磺噻隆(＝D152)、乙嗪草酮(＝D153)、乙氧呋草黄(＝D154)、氟乳醚(＝D155)、乙基氟乳醚(＝D156)、乙氧苯草胺(＝D157)、F-5331(＝2-氯-4-氟-5-[4-(3-氟丙基)-4，5-二氢-5-氧-1H-四唑-1-基]-苯基]-ethansulfonamid)(＝D158)、F-7967(＝3-[7-氯-5-氟-2-(三氟甲基)-1H-苯并咪唑-4-基]-1-甲基-6-(三氟甲基)pynmidin-2，4(1H，3H)-dion)(＝D159)、芬诺普(＝D160)、噁唑禾草灵(＝D161)、噁唑禾草灵-P(＝D162)、噁唑禾草灵-乙基(＝D163)、噁唑禾草灵-P-乙基(＝D164)、fenoxasulfone(＝D165)、四唑草胺(＝D166)、非草隆(＝D167)、氟燕灵(＝D168)、氟燕灵-M-异丙基(＝D169)、高效麦草氟甲酯(＝D170)、吡氟禾草灵(＝D171)、吡氟禾草灵-P(＝D172)、吡氟禾草灵丁基(＝D173)、吡氟禾草灵-P-丁基(＝D174)、异丙吡草酯(＝D175)、氟消草(＝D176)、氟噻草胺(氟噻草胺)(＝D177)、氟哒嗪草酯(＝D178)、氟哒嗪草乙酯(＝D179)、氟节胺(＝D180)、氟烯草酸(＝D181)、氟烯草酸戊酯(＝D182)、丙炔氟草胺(＝D183)、炔草胺(＝D184)、伏草隆(＝D185)、消草醚(＝D186)、乙羧氟草醚(＝D187)、乙羧氟草醚-乙基(＝D188)、氟胺草唑(＝D189)、flupropacil(＝D190)、四氟丙酸(＝D191)、抑草丁(＝D192)、抑草丁-丁基(＝D193)、氟草同(＝D194)、氟咯草酮(＝D195)、氟草定(＝D196)、氟草定-meptyl(＝D197)、调嘧醇(＝D198)、呋草酮(＝D199)、达草氟(＝D200)、达草氟-甲基(＝D201)、氟噻草胺(＝D202)、氟磺胺草醚(＝203)、氯吡苯脲(＝D204)、膦铵素(＝D205)、氟呋草醚(＝D206)、赤霉素(＝D207)、固杀草(＝D208)、草铵膦(＝D209)、草铵膦-P(＝D210)、精草铵膦(＝D211)、精草铵膦钠(＝D212)、草甘膦(＝D213)、草甘膦异丙胺盐(＝D214)、H-9201(＝O-(2，4-二甲基-6-硝基苯基)-O-乙基-异丙基硫逐磷酰胺)(＝D215)、氟硝磺酰胺(＝D216)、吡氟氯禾灵(＝D217)、吡氟氯禾灵-P(＝D218)、吡氟氯禾灵-乙氧基乙基(＝D219)、吡氟氯禾灵-P-乙氧基乙基(＝D220)、吡氟氯禾灵-甲基(＝D221)、吡氟氯禾灵-P-甲基(＝D222)、六嗪酮(＝D223)、HW-02(＝1-(二甲氧基磷酸基)-乙基(2，4-二氯苯氧基)乙酸酯)(＝D224)、抗倒胺(＝D225)、茚草酮(＝D226)、茚嗪氟草胺(＝D227)、吲哚-3-乙酸(IAA)(＝D228)、4-吲哚-3-基丁酸(IBA)(＝D229)、碘苯腈(＝D230)、唑酰草胺(＝D231)、丁咪胺(＝D232)、异丙乐灵(＝D233)、异丙隆(＝D234)、异恶隆(＝D235)、异噁酰草胺(＝D236)、异噁氯草酮(＝D237)、异噁氟草酮(＝D238)、噁草醚(＝D239)、KUH-043(＝3-({[5-(二氟甲基)-1-甲基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-基]甲基}磺酰基)-5，5-二甲基-4，5-二氢-1，2-噁唑)(＝D240)、特胺灵(＝D241)、缩酮环磺草酮(＝D242)、乳氟禾草灵(＝D243)、环草定(＝D244)、利谷隆(＝D245)、马来酰肼(＝D246)、MCPA(＝D247)、MCPB(＝D248)、MCPB-甲基、-乙基和钠(＝D249)、氯丙酸(＝D250)、氯丙酸-钠(＝D251)、氯丙酸-butotyl(＝D252)、氯丙酸-P-butotyl(＝D253)、氯丙酸-P-二甲基铵(＝D254)、氯丙酸-P-2-乙基己基(＝D255)、氯丙酸-P-钾(＝D256)、苯噻酰草胺(＝D257)、氟磺酰草胺(＝D258)、缩节胺(＝D259)、甲基磺草酮(＝D260)、噻唑隆(＝D261)、威百亩(＝D262)、噁唑酰草胺(＝D263)、苯嗪草酮(＝D264)、吡草胺(＝D265)、metazole(＝D266)、甲硫嘧磺隆(＝D267)、异噁唑啉(＝D268)、苯草酮(＝D269)、苯丙隆(＝D270)、1-甲基环丙烯(＝D271)、methylisothiocyanat(＝D272)、色满隆(＝D273)、溴谷隆(＝D274)、异丙甲草胺(＝D275)、S-异丙甲草胺(＝D-276)、甲氧隆(＝D277)、嗪草酮(＝D278)、草达灭(＝D279)、庚酰草胺(＝D280)、monocarbamide(＝D281)、甲酉先胺硫酸盐(＝D282)、绿谷隆(＝D283)、单嘧磺酯(＝D284)、灭草隆(＝D285)、MT-128(＝6-氯-N-[(2E)-3-氯丙基-2-烯-1-基]-5-甲基-N-苯基哒嗪-3-胺)(＝D286)、MT-5950(＝N-[3-氯-4-(1-甲基乙基)-苯基]-2-甲基戊酰胺)(＝D287)、NGGC-011(＝D288)、萘丙胺(＝D289)、敌草胺(＝D290)、萘草胺(＝D291)、NC-310(＝4-(2，4-二氯苯甲酰基)-1-甲基-5-苄氧基吡唑)(＝D292)、草不隆(＝D293)、吡氯草胺(＝D294)、甲磺乐灵(＝D295)、除草醚(＝D296)、硝基苯酚钠(异构体混合物)(＝D297)、三氟甲草醚(＝D298)、壬酸(＝D299)、达草灭(＝D300)、坪草丹(＝D301)、黄草消(＝D302)、炔丙噁唑草(＝D303)、噁草灵(＝D304)、氯噁嗪草(＝D305)、乙氧氟草醚(＝D306)、多效唑(＝D307)、百草枯(＝D308)、百草枯-二氯化物(＝D309)、天竺葵酸(；正壬酸)(＝D310)、胺硝草(＝D311)、pendralin(＝D312)、甲氯酰草胺(＝D313)、戊噁唑草(＝D314)、氟草磺胺(＝D315)、烯草胺(＝D317)、棉胺宁(＝D318)、甜菜宁(＝D319)、甜菜宁-乙基(＝D320)、氨氯吡啶酸(＝D321)、氟吡草胺(＝D322)、唑啉草酯(＝D323)、哌草磷(＝D324)、pirifenop(＝D325)、pirifenop-butyl(＝D326)、冰草胺(＝D327)、噻菌灵(＝D328)、氟唑草胺(＝D329)、环氰津(＝D330)、氨氟乐灵(＝D331)、prifluraline(＝D332)、环苯草酮(＝D333)、调环酸(＝D334)、调环酸-钙(＝D335)、prohydrojasmone(＝D336)、扑灭通(＝D337)、扑草净(＝D338)、毒草安(＝D339)、敌稗(＝D340)、喔草酯(＝D341)、扑灭津(＝D342)、苯胺灵(＝D343)、异丙草胺(＝D344)、炔苯酰草胺(＝D345)、磺亚胺草(＝D346)、苄草丹(＝D347)、广草胺(＝D348)、双唑草腈(＝D349)、吡草醚(＝D350)、吡草醚乙酯(＝D351)、磺酰草吡唑(＝D352)、吡唑特(吡唑特)(＝D353)、苄草唑(＝D354)、pyribambenz(＝D355)、稗草丹(＝D356)、pyridafol(＝D357)、哒草特(＝D358)、肟啶草(＝D359)、嘧氟磺草胺(＝D360)、砜吡草唑(＝D361)、二氯喹啉酸(＝D362)、氯甲喹啉酸(＝D363)、灭藻醌(＝D364)、喹禾灵(＝D365)、喹禾灵-乙基(＝D366)、喹禾灵-P(＝D367)、喹禾灵-P-乙基(＝D368)、喹禾糠酯(＝D369)、苯嘧磺草胺(＝D370)、密草通(＝D371)、稀禾定(＝D372)、环草隆(＝D373)、西玛津(＝D374)、西草净(＝D375)、SN-106279(＝甲基-(2R)-2-({7-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-萘基}氧基)-丙酸酯)(＝D376)、磺草酮(＝D377)、草克死(CDEC)(＝D378)、磺胺草唑(＝D379)、草硫膦(草硫膦)(＝D380)、SYN-523(＝D381)、SYP-249(＝1-乙氧基-3-甲基-1-氧丁-3-烯-2-基-5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸酯)(＝D382)、牧草胺(＝D383)、丁唑隆(＝D384)、四氯硝基苯(＝D385)、特糠酯酮(＝D386)、环磺酮(＝D387)、吡喃草酮(＝D388)、特草定(＝D389)、特草灵(＝D390)、猛杀草(＝D391)、甲氧去草净(＝D392)、特丁津(＝D393)、去草净(＝D394)、噻醚草胺(＝D395)、氟噻草胺(＝D396)、赛唑隆(＝D397)、噻草啶(＝D398)、噻二唑胺(＝D399)、赛二唑素(＝D400)、禾草丹(＝D401)、丁草威(＝D402)、苯唑草酮(＝D403)、苯草酮(＝D404)、燕麦畏(＝D405)、三嗪氟草胺(＝D406)、triazofenamide(＝D407)、三氯乙酸(TCA)(＝D408)、三氯吡(＝D409)、灭草环(＝D410)、草达津(＝D411)、氟乐灵(＝D412)、三甲隆(＝D413)、抗倒酯(＝D414)、抗倒酯乙酸酯(＝D415)、tsitodef(＝D416)、烯效唑(＝D417)、烯效唑-P(＝D418)、灭草猛(＝D419)、ZJ-0862(＝3，4-二氯-N-{2-[(4，6-二甲氧基嘧啶-2-基)氧]苄基}苯胺)(＝D420)及其化学结构分别定义的以下化合物:
优选地，在结构上并通过其作用方式与属于如上所定义的组(A)、(B)和(C)的ALS抑制剂除草剂不同并且根据本发明施用的另外的除草剂是属于以下组的那些：氯草敏(＝D70)、烯草酮(＝D79)、炔草酯(＝D80)、炔草酸(＝D81)、二氯吡啶酸(＝D86)、噻草酮(＝D94)、甜菜安(＝D108)、二甲噻草胺(＝D132)、二甲噻草胺-P(＝D133)、乙氧呋草黄(＝D154)、噁唑禾草灵(＝D161)、噁唑禾草灵-P(＝D162)、噁唑禾草灵-乙基(＝D163)、噁唑禾草灵-P-乙基(＝D164)、吡氟禾草灵(＝D171)、吡氟禾草灵-P(＝D172)、吡氟禾草灵-丁基(＝D173)、吡氟禾草灵-P-丁基(＝D174)、固杀草(＝D208)、草铵膦(＝D209)、草铵膦-P(＝D210)、精草铵膦(＝D211)、精草铵膦钠(＝D212)、草甘膦(＝D213)、草甘膦异丙胺盐(＝D214)、吡氟氯禾灵(＝D217)、吡氟氯禾灵-P(＝D218)、吡氟氯禾灵-乙氧基乙基(＝D219)、吡氟氯禾灵-P-乙氧基乙基(＝D220)、吡氟氯禾灵-甲基(＝D221)、吡氟氯禾灵-P-甲基(＝D222)、环草定(＝D244)、苯嗪草酮(＝D264)、甜菜宁(＝D319)、甜菜宁-乙基(＝D320)、喔草酯(＝D341)、氯甲喹啉酸(＝D363)、喹禾灵(＝D365)、喹禾灵-乙基(＝D366)、喹禾灵-P(＝D367)、喹禾灵-P-乙基(＝D368)、喹禾糠酯(＝D369)、稀禾定(＝D372)。
甚至更优选地，不同于属于如上所定义的组(A)、(B)和(C)的ALS抑制剂除草剂并且根据本发明与属于(A)、(B)和(C)组的ALS抑制剂除草剂一起施用的另外的除草剂是属于以下组的那些：甜菜安(＝D108)、乙氧呋草黄(＝D154)、固杀草(＝D208)、草铵膦(＝D209)、草铵膦(＝D209)、草铵膦-P(＝D210)、精草铵膦(＝D211)、精草铵膦钠(＝D212)、草甘膦(＝D213)、草甘膦异丙胺盐(＝D214)、环草定(＝D244)、苯嗪草酮(＝D264)、甜菜宁(＝D319)、甜菜宁-乙基(＝D320)。
为了根据本发明使用而非常特别感兴趣的含有ALS抑制剂除草剂和非ALS抑制剂除草剂的混合物，包含一种或多种ALS抑制剂除草剂(属于(A)、(B)和(C)组中的一种或多种的化合物)和非ALS抑制剂除草剂(组(D)成员；如上所定义)的混合物的组合物是：(A1-1)+(D108)；(A1-1)+(D154)；(A1-1)+(D208)；(A1-1)+(D209)；(A1-1)+(D210)；(A1-1)+(D212)；(A1-1)+(D213)；(A1-1)+(D214)；(A1-1)+(D244)；(A1-1)+(D264)；(A1-1)+(D319)；(A1-1)+(D320)。(A1-13)+(D108)；(A1-13)+(D154)；A1-13)+(D208)；(A1-13)+(D209)；(A1-13)+(D210)；(A1-13)+(D212)；(A1-13)+(D213)；(A1-13)+(D214)；(A1--13)+(D244)；A1-13)+(D264)；；A1-13)+(D319)；(A1-13)+(D320)。(A1-16)+(D108)；A1-16)+(D154)；A1-16)+(D208)；(A1-16)+(D209)；(A1-16)+(D210)；(A1-16)+(D212)；(A1-16)+(D213)；(A1-16)+(D214)；(A1--16)+(D244)；A1-16)+(D264)；A1-16)+(D319)；(A1-16)+(D320)。(A1-39)+(D108)；A1-39)+(D154)；A1-39)+(D208)；(A1-39)+(D209)；(A1-39)+(D210)；(A1-39)+(D212)；(A1-39)+(D213)；(A1-39)+(D214)；(A1-39)+(D244)；A1-39)+(D264)；A1-39)+(D319)；(A1-39)+(D320)。(A1-41)+(D108)；A1-41)+(D154)；A1-41)+(D208)；(A1-41)+(D209)；(A1-41)+(D210)；(A1-41)+(D212)；(A1-41)+(D213)；(A1-41)+(D214)；(A1-41)+(D244)；A1-41)+(D264)；A1-41)+(D319)；(A1-41)+(D320)。(A1-83)+(D108)；A1-83)+(D154)；A1-83)+(D208)；(A1-83)+(D209)；(A1-83)+(D210)；(A1-83)+(D212)；(A1-83)+(D213)；(A1-83)+(D214)；(A1-83)+(D244)；A1-83)+(D264)；A1-83)+(D319)；(A1-83)+(D320)。(A1-87)+(D108)；A1-87)+(D154)；A1-87)+(D208)；(A1-87)+(D209)；(A1-87)+(D210)；(A1-87)+(D212)；(A1-87)+(D213)；(A1-87)+(D214)；(A1-87)+(D244)；A1-87)+(D264)；A1-87)+(D319)；(A1-87)+(D320)。(A2-3)+(D108)；(A2-3)+(D154)；(A2-3)+(D208)；(A2-3)+(D209)；(A2-3)+(D210)；(A2-3)+(D212)；(A2-3)+(D213)；(A2-3)+(D214)；(A2-3)+(D244)；(A2-3)+(D264)；(A2-3)+(D319)；(A2-3)+(D320)。(B1-2)+(D108)；(B1-2)+(D154)；(B1-2)+(D208)；(B1-2)+(D209)；(B1-2)+(D210)；(B1-2)+(D212)；(B1-2)+(D213)；(B1-2)+(D214)；(B1-2)+(D244)；(B1-2)+(D264)；(B1-2)+(D319)；(B1-2)+(D320)。(C1-1)+(D108)；(C1-1)+(D154)；(C1-1)+(D208)；(C1-1)+(D209)；(C1-1)+(D210)；(C1-1)+(D212)；(C1-1)+(D213)；(C1-1)+(D214)；(C1-1)+(D244)；(C1-1)+(D264)；(C1-1)+(D319)；(C1-1)+(D320)。
在某些实施方案中，非ALS抑制剂除草剂可以与ALS抑制剂除草剂组合施用。在某些实施方案中，各除草剂的施用(i)联合或同时进行，或(ii)在不同时间和/或以多个部分进行(顺序施用)，在芽前施用，随后出苗后施用或出苗后早期施用，随后是出苗后中期或晚期施用。在某些实施方案中，所述除草剂选自氯草敏、烯草酮、炔草酯、炔草酸、二氯吡啶酸、噻草酮、甜菜安、二甲噻草胺、二甲噻草胺-P、乙氧呋草黄、噁唑禾草灵、噁唑禾草灵-P、噁唑禾草灵-乙基、噁唑禾草灵-P-乙基、吡氟禾草灵、吡氟禾草灵-P、吡氟禾草灵-丁基、吡氟禾草灵-P-丁基、固杀草、草铵膦、草铵膦-P、精草铵膦、精草铵膦钠、吡氟氯禾灵、吡氟氯禾灵-P、吡氟氯禾灵-乙氧基乙基、吡氟氯禾灵-P-乙氧基乙基、吡氟氯禾灵-甲基、吡氟氯禾灵-P-甲基、环草定、苯嗪草酮、甜菜宁、甜菜宁-乙基、喔草酯、氯甲喹啉酸、喹禾灵、喹禾灵-乙基、喹禾灵-P、喹禾灵-P-乙基、喹禾糠酯、稀禾定。
ALS抑制剂除草剂的施用也能有效地作用于多年生杂草，这些杂草从根茎(rhizome)、根茎(root stock)和其他多年生器官产生芽并且难以控制。在本文中，物质可以例如通过播种前方法、出苗前方法或出苗后方法例如联合地或单独地施用。例如，优选通过出苗后方法施用，特别是对已出苗的有害植物。
可以提及可以通过ALS抑制剂除草剂控制的单子叶和双子叶杂草植物群的一些代表的具体实例，但列举不限于某些物种。
根据本发明的施用对其有效起作用的杂草物种的实例是来自单子叶杂草物种的燕麦属(Avena spp.)、看麦娘属(Alopecurus spp.)、阿披拉草属(Apera spp.)、臂形草属(Brachiaria spp.)、雀麦属(Bromus spp.)、马唐属(Digitaria spp.)、黑麦草属(Loliumspp.)、稗属(Echinochloa spp.)、黍属(Panicum spp.)、Phalaris spp.、早熟禾属(Poaspp.)、狗尾草属(Setaria spp.)以及来自一年生类群的莎草属(Cyperus)物种，以及在多年生物种中，冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、白茅属(Imperata)和高粱属(Sorghum)以及多年生莎草属物种。
在双子叶杂草物种的情况下，作用谱延伸至这样的属，例如苘麻属(Abutilonspp.)、苋属(Amaranthus spp.)、藜属(Chenopodium spp.)、菊属(Chrysanthemum spp.)、拉拉藤属(Galium spp.)、番薯属(Ipomoea spp.)、地肤属(Kochia spp.)、野芝麻属(Lamium spp.)、母菊属(Matricaria spp.)、牵牛花属(Pharbitis spp.)、对蓼属(Polygonum spp.)、黄花稔属(Sida spp.)、胡麻属(Sinapis spp.)、马铃薯属(Solanumspp.)、繁缕属(Stellaria spp.)、马鞭草(Veronica spp.)，和在一年生杂草的情况下延伸至堇菜属(Viola spp.)、苍耳属(Xanthium spp.)，以及多年生杂草中的旋花属(Convolvulus)、蓟属(Cirsium)、酸模属(Rumex)和蒿属(Artemisia)。
本文描述的除草剂还可用于控制例如杂草甜菜(或一年生甜菜)。栽培的栽培甜菜为二年生植物，其在第一年形成贮藏根和莲座叶。经过一段时间的低温后，芽开始伸长(抽苔)和开花，而许多B.vulgaris ssp.maritima属的野生甜菜由于B基因座上存在抽苔基因B而显示出每年生长的习性。BOLTING基因(B基因)负责决定甜菜的一年生习性。Beta物种的一年生习性被认为是单基因和显性性状。携带显性B等位基因的植物能够以不依赖春化的方式从幼年阶段转变为生殖阶段，这与携带B等位基因的二年生植物相反，后者必须需要春化才发生抽苔和随后开花。基因座B的显性等位基因在野生甜菜中含量丰富，并且在长日照下会导致抽苔，而无需寒冷的要求，这对于携带隐性等位基因的两年生栽培种来说通常是必需的。本文所用的“B基因”是指负责确定甜菜，例如栽培甜菜的一年生习性(早期抽苔)的基因。携带显性等位基因B的植物能够以不依赖春化的方式从幼年阶段转变为生长阶段，即在不预先暴露于低温的情况下使芽伸长，随后开花。
一方面，本发明涉及用于控制不想要的植被，例如栽培甜菜生长区域中的不想要的植被，或者用于维持或增加栽培甜菜生长区域中的产量的方法，其包括以下步骤：
a)如本文其他地方所述，种植根据本发明的栽培甜菜植物或播种根据本发明的栽培甜菜种子，特别是包含在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸的ALS蛋白，
b)向生长的植物施用一种或多种ALS抑制剂除草剂，优选以足以抑制不想要的植被生长的剂量，更优选以足以杀死不想要的植被的剂量，和
c)任选地，在生长季节重复步骤b)。
在相关方面，本发明涉及如本文其他地方所定义的一种或多种ALS抑制剂除草剂用于控制不想要的植被，例如在栽培甜菜生长区域中的不想要的植被，或用于维持或增加栽培甜菜生长区域中的产量，其中栽培甜菜植物是根据本发明如本文其他地方所述的，特别是包含在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸的ALS蛋白。
特别优选维持或增加甜菜根(或甜菜根)产量。
在某些实施方案中，用于控制不想要的植被的方法包括用于控制如本文所述的bolters、杂草甜菜或一年生甜菜的方法，并且可以涉及用于在栽培甜菜生长区域中，优选栽培甜菜栽培种生长区域，特别是Beta vulgaris subsp.vulgaris var.altissima生长区域。在某些实施方案中，本文所述的用于控制不想要的植被例如bolters、杂草甜菜或一年生甜菜的方法涉及用于在两年生栽培甜菜生长区域，优选两年生栽培甜菜栽培种生长区域，特别是两年生Beta vulgaris subsp.vulgaris var.altissima生长区域中控制不想要的植被例如bolters、杂草甜菜或一年生甜菜的方法。
在某些实施方案中，本文所述的用途涉及在栽培甜菜生长区，优选栽培甜菜栽培种生长区域，特别是Beta vulgaris subsp.vulgaris var.altissima生长区域中的用途。在某些实施方案中，本文所述的用途涉及在二年生栽培甜菜生长区，优选两年生栽培甜菜栽培种生长区域，特别是两年生Beta vulgaris subsp.vulgaris var.altissima生长区域中的用途。
“两年生”或“biannual”的栽培甜菜是指需要两年才能完成其生物生命周期的栽培甜菜植物。“一年生”的栽培甜菜是指一年内发芽、开花和死亡的栽培甜菜植物。“一年生栽培甜菜”是指在B基因座处含有杂合或纯合状态的显性等位基因B的栽培甜菜植物。“二年生栽培甜菜”是指在B基因座处含有纯合状态的隐性等位基因b的栽培甜菜植物
“抽苔”是指从营养莲座叶阶段到花序或生殖生长阶段，特别是芽形成的过渡。抽苔(茎伸长)是从营养生长向生殖生长过渡的清晰可见的第一步。抽苔的特征在于在生长的第一年出现(不想要的)芽，这不利于收获和加工，而且还会降低作物产量。事实上，栽培甜菜植物的抽苔和开花是不希望的，因为例如在甜菜的情况下，使用的不是种子或果实，而是植物的地下部分，即储存根，以及根中储存的能量会在植物抽苔和开花期间被消耗掉。
如本文所用，术语“bolters”是指在生长季节期间抽苔的栽培甜菜植物，特别是与种植或播种栽培甜菜植物的同一年，优选在收获或需要收获甜菜之前。在某些实施方案中，bolters是一年生栽培甜菜植物。在某些实施方案中，bolters是杂草甜菜。在某些实施方案中，bolters是海甜菜(即Beta vulgaris subsp.maritima)。在某些实施方案中，bolters不是栽培甜菜栽培种。在某些实施方案中，bolters不是Beta vulgaris subsp.vulgarisvar.altissima。在某些实施方案中，bolters包含显性抽苔基因(B基因)。如本文所用，术语“杂草甜菜”是指不想要的甜菜植物，与甜菜生长区域中预期栽培的甜菜植物相反。杂草甜菜通常是野生甜菜。杂草甜菜优选是一年生甜菜，任选地是Beta vulgarissubsp.maritima。
如本文所用，在控制不想要的植被，例如bolters或不需要的植物或植被等的上下文中，“控制”包括抑制或防止bolters、杂草甜菜或一年生甜菜或不想要的植被的生长或抑制杂草甜菜或或一年生甜菜的抽苔，或至少抑制杂草甜菜或一年生甜菜的种子生产。“控制”还可以包括优选在抽苔发生之前，或至少在bolters、杂草甜菜或一年生甜菜的种子生产之前杀死bolters、杂草甜菜或一年生甜菜、或不想要的植被。“控制”还可包括优选在抽苔发生之前，或至少在bolters、杂草甜菜或一年生甜菜的种子生产之前，减少甜菜生长区域中bolters、杂草甜菜、或一年生甜菜、或不想要的植被的量。在某些实施方案中，控制bolters或不想要的植被等是指bolters或不想要的植被等的量至少50％的减少，或者bolters或不想要的植被等的生物量至少50％，例如优选至少60％，更优选至少70％，例如至少80％或至少90％的减少。
如本文所用，“不想要的植被”或“不想要的植被”应理解为意指在其中不想要的位置生长的所有植物。例如，这可以是有害植物(例如单子叶或双子叶杂草或不想要的农作物植物)。
如本文所用，“甜菜生长区域”是指以收获，例如甜菜根收获或种子收获为目的，栽培(即有意种植或播种)甜菜植物的农业地区。
如本文所述的根据本发明的方法和用途在某些方面可以用于增加栽培甜菜植物或植物部分(即栽培的栽培甜菜植物，与例如杂草甜菜相反)的产量。增加的产量可以例如是(栽培的)栽培甜菜的增加的量或(栽培的)栽培甜菜的增加的生物量，例如收获的或可收获的植物部分(例如甜菜根)的增加的生物量。增加的产量还可以是例如在甜菜的情况下总体增加的糖量或含量(例如每公顷增加的糖产量)。
如本文所用，术语“生长季节”一般指种植或播种栽培甜菜植物或种子与收获栽培甜菜植物，特别是甜菜根之间的时间段。通常，生长季节是从四月到十月/十一月。然而，本领域技术人员将理解，生长季节可以更长或更短，这取决于例如气候或天气条件或地质条件。还应当理解，生长季节可能变动，例如在冬季甜菜或春季甜菜的生产中。
在某些方面，本文所述的除草剂以足以控制(例如杀死、抑制生长、防止或延迟开花等)不想要的植被，例如bolters、杂草甜菜或一年生甜菜的剂量施用于本文所述的根据本发明的方法和用途中。在某些实施方案中，这样的剂量是制造商推荐的。该剂量优选是指单次施用剂量。应当理解，在生长季节期间可能需要多于一次的施用，例如两次施用或三次施用。此类后续施用的剂量可以与第一次施用的剂量相同或可以不同。
在某些实施方案中，除了D371突变之外，根据本发明的植物或植物部分包含ALS中的一种或多种突变。在某些实施方案中，根据本发明的植物或植物部分包含ALS中的一种或多种突变以替代D371突变。
在某些实施方案中，植物或植物部分包含具有一种或多种突变的ALS，所述突变选自：在位置113处不同于丙氨酸(A)的氨基酸、在位置188处不同于脯氨酸(P)的氨基酸、在位置196处不同于丙氨酸(A)的氨基酸、在位置372处不同于精氨酸(R)的氨基酸、在位置569处不同于色氨酸(W)的氨基酸、在位置648处不同于丝氨酸(S)的氨基酸、在位置第649处不同于甘氨酸(G)的氨基酸。在某些实施方案中，植物或植物部分包含编码具有一个或多个突变的ALS的多核酸，所述突变选自：在位置113处不同于丙氨酸(A)的氨基酸、在位置188处不同于脯氨酸(P)的氨基酸、在位置196处不同于丙氨酸(A)的氨基酸、在位置372处不同于精氨酸(R)的氨基酸、在位置569处不同于色氨酸(W)的氨基酸、在位置648处不同于丝氨酸(S)的氨基酸、在位置第649处不同于甘氨酸(G)的氨基酸。在某些实施方案中，植物或植物部分包含编码具有一种或多种突变的ALS蛋白的内源性ALS等位基因，所述突变选自：在位置113处不同于丙氨酸(A)的氨基酸、在位置188处不同于脯氨酸(P)的氨基酸、在位置196处不同于丙氨酸(A)的氨基酸、在位置372处不同于精氨酸(R)的氨基酸、在位置569处不同于色氨酸(W)的氨基酸、在位置648处不同于丝氨酸(S)的氨基酸、在位置第649处不同于甘氨酸(G)的氨基酸。氨基酸取代如本文其他地方所定义。在具体实施方案中，突变是保守的氨基酸取代。
在某些实施方案中，根据本发明的植物或植物部分包含在位置569处具有不同于色氨酸的氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或精氨酸，优选亮氨酸的ALS蛋白(或编码(内源性)ALS蛋白的多核酸或编码ALS蛋白的内源性ALS等位基因)。
在某些实施方案中，根据本发明的植物或植物部分包含在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，优选谷氨酸，和在位置569处具有不同于色氨酸的氨基酸，优选亮氨酸的ALS蛋白(或编码(内源性)ALS蛋白的多核酸或编码ALS蛋白的内源性ALS等位基因)。
这些额外的突变可以位于相同的等位基因或不同的等位基因上(即双突变型ALS或两个单独的单突变型ALS)。
在某些实施方案中，根据本发明的植物或植物部分包含除ALS之外的其他基因中的一种或多种突变，特别是赋予除草剂抗性的其他基因中的突变。
草甘膦是一种独特的除草剂，因为它是唯一已知能抑制芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成的除草剂。不能合成这三种氨基酸的植物就没有生命力。通往芳香氨基酸的生物合成途径中受影响的酶是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，它催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)反应以形成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸盐(EPSP)。草甘膦具有与PEP的结构相似性，与EPSPS结合并以竞争性方式抑制酶的反应。草甘膦是唯一已知作用于EPSPS的除草剂。抑制芳香族氨基酸的合成会或多或少地导致生长立即停止，并最终在施用后几天内杀死植物。因此，草甘膦通常是一种非选择性除草剂，并会严重伤害或杀死与其接触的任何活植物组织。然而，它可以选择性地用于抗草甘膦作物，包括甜菜、玉米、大豆、棉花和油菜。
在某些实施方案中，野生型栽培甜菜epsp合酶具有如NCBI参考序列XP_010692222.1中提供的氨基酸序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜epsp合酶具有优选在整个长度上与NCBI参考序列XP_010692222.1的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有epsp合酶活性，条件是位置179处的氨基酸残基是脯氨酸，并且任选地位置175处的氨基酸残基是苏氨酸。
在某些实施方案中，野生型栽培甜菜epsp合酶基因具有编码如NCBI参考序列XP_010692222.1中提供的氨基酸序列的序列。在某些实施方案中，野生型或天然栽培甜菜epsp合酶基因具有这样的序列，其编码优选在整个长度上与NCBI参考序列XP_010692222.1的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、例如至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且优选具有epsp合酶活性，条件是位置179处的氨基酸残基是脯氨酸，并且任选地位置175处的氨基酸残基是苏氨酸。
优选地，如本文所用，其中提及epsp合酶的氨基酸残基位置时，编号对应于参考序列XP_010692222.1中的氨基酸位置。在优选的实施方案中，突变的EPSPS包含氨基酸位置179处的突变，特别是位置179不是脯氨酸，例如P179S突变。在优选的实施方案中，突变的EPSPS包含在氨基酸位置175处的突变，特别是位置175不是苏氨酸，例如T175I突变。在某些实施方案中，两种突变都存在于EPSPS中。两种突变都赋予草甘膦抗性。
在某些实施方案中，本发明的植物或植物部分就ALS基因而言优选是非转基因的，其是内源性的(除了在氨基酸位置371或本文提及的任何其他氨基酸位置处包含突变之外)。当然，本发明不排除可以通过基因工程或通过常规方法例如杂交将其他外源基因转移到植物中。所述基因可以是赋予除草剂耐受性，优选赋予与ALS抑制剂除草剂耐受性不同的除草剂耐受性的基因、提高产量的基因、提高对生物有机体的抗性的基因、和/或涉及含量修饰的基因。
术语“转基因”在本文中是指通过引入非内源性核酸序列进行遗传修饰。通常，物种特异性核酸序列以某种形式、排列或数量引入细胞中该核酸序列在细胞中不天然存在的位置。虽然根据本发明的栽培甜菜植物就突变的ALS合酶而言优选是非转基因的，但是应当理解，这样的栽培甜菜植物对于其他性状可以是转基因的。
一方面，本发明涉及编码如本文其他地方所述的突变的ALS蛋白的(分离的)多核酸。在某些实施方案中，(分离的)多核酸编码ALS蛋白，其优选在其整个长度上与具有如SEQID NO:3所示序列的ALS蛋白具有至少80％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，例如至少98％同一性，条件是位置371处的氨基酸不是天冬氨酸。在某些实施方案中，(分离的)多核酸优选在其整个长度上与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少80％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，例如至少98％同一性(即突变的ALS基因)，条件是对应于位置371处的ALS氨基酸的密码子不编码天冬氨酸。在某些实施方案中，(分离的)多核酸优选在其整个长度上与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少80％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，例如至少98％同一性(即突变的ALS cDNA或编码序列)，条件是对应于位置371处的ALS氨基酸的密码子不编码天冬氨酸。优选地，ALS蛋白具有ALS(酶)活性，如本文其他地方所定义。在某些实施方案中，位置371处的氨基酸是谷氨酸。在某些实施方案中，ALS蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的序列。一方面，本发明涉及包含此类多核酸的栽培甜菜植物或其部分。在优选的实施方案中，栽培甜菜植物或其部分在其内源性基因座处包含此类多核酸，优选在其内源性启动子的控制下。因此，在某些实施方案中，本发明涉及栽培甜菜植物或其部分，其中此类多核酸可操作地连接至天然ALS启动子。应当理解，多核酸可以对应于ALS cDNA或者可以对应于ALS基因序列。
在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于50000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于40000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于30000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于25000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于20000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于15000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于10000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含少于5000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核苷酸分子包含至少100个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于50000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于40000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于30000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于25000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于20000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于15000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于10000个核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的核酸分子包含至少100个核苷酸且少于5000个核苷酸。
一方面，本发明涉及包含本文提及的多核酸的载体。载体可以是本领域已知的任何载体，例如原核载体或真核载体。在某些实施方案中，多核酸可操作地连接至载体中的一个或多个调控序列，例如启动子，如本领域已知的。在某些实施方案中，启动子是植物启动子。在某些实施方案中，启动子是组成型启动子。在某些实施方案中，启动子是诱导型启动子。
如本文所用，“载体”具有本领域中的普通含义，并且可以例如是质粒、粘粒、噬菌体或表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体；它可以是双链或单链、线性或环状的；或者它可以通过整合到其基因组中或染色体外来转化原核或真核宿主。根据本发明的核酸优选在载体中与允许在原核或真核宿主细胞中转录和任选地表达的一个或多个调节序列可操作地连接。调节序列-优选DNA-可以与根据本发明的核酸同源或异源。例如，核酸处于合适的启动子或终止子的控制下。合适的启动子可以是组成型诱导的启动子(实例：来自“花椰菜花叶病毒”的35S启动子(Odell等，1985)；组织特异性的启动子尤其合适(实例：花粉特异性启动子，Chen等(2010)，Zhao等(2006)，或Twell等(1991))，或者是发育特异性的(实例：开花特异性启动子)。合适的启动子还可以是合成的或嵌合的启动子，其不存在于自然界中，由多个元件组成，并且含有最小启动子，以及-最小启动子的上游-用作特殊转录因子的结合位置的至少一个顺式调控元件。嵌合启动子可以根据所需的具体情况进行设计，并通过不同的因素进行诱导或抑制。此类启动子的实例可见于Gurr&Rushton(2005)或Venter(2007)。例如，合适的终止子是nos-终止子(Depicker等，1982)。载体可以通过接合、mobilization、基因枪转化、农杆菌介导的转化、转染、转导、真空渗透或电穿孔来引入。
所述载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体；它可以是双链或单链、线性或环状的。载体可以通过整合到其基因组中或染色体外来转化原核或真核宿主。
在某些实施方案中，载体是表达载体。优选地，核酸在载体中与允许在原核或真核宿主细胞中转录和任选地表达的一个或多个调节序列可操作地连接。调节序列可以与核酸同源或异源。例如，核酸处于合适的启动子或终止子的控制下。合适的启动子可以是组成型诱导的启动子，例如来自“花椰菜花叶病毒”的35S启动子(Odell等，1985.Identificationof DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus35Spromoter)。组织特异性启动子，例如Chen等(2010.Molecular Biology Reports37(2):737-744)，Zhao等(2006.Planta 224(2)：405-412)，或Twell等(1991.Genes&Development5(3)：496-507)中描述的花粉特异性启动子特别合适，如发育特异性启动子，例如开花特异性启动子也是如此。合适的启动子还可以是合成的或嵌合的启动子，其在自然界中不存在并且由多个元件组成。这种合成的或嵌合的启动子可以含有最小启动子，以及用作特殊转录因子的结合位置的至少一个顺式调控元件。嵌合启动子可以根据所需的具体情况进行设计，并且可以通过不同的因素来诱导或抑制。此类启动子的实例可见于Gurr&Rushton(2005.Trends in Biotechnology 23(6)：275-282)或Venter(2007.Trends in PlantScience：12(3)：118-124)。例如，合适的终止子是nos-终止子(Depicker等，1982.Journalof Molecular and Applied Genetics 1(6)：561-573)。
在某些实施方案中，载体是条件表达载体。在某些实施方案中，载体是组成型表达载体。在某些实施方案中，载体是组织特异性表达载体，例如叶特异性表达载体。在某些实施方案中，载体是诱导型表达载体。所有此类载体是本领域众所周知的。
制备所述载体的方法对于本领域技术人员来说是常见的(Sambrook等，2001)。
本文还设想的是宿主细胞，例如植物细胞或(植物)原生质体，其包含本文所述的核酸或本文所述的载体。宿主细胞可以含有作为染色体外(附加型)复制分子的核酸，或包含整合到宿主细胞的核或质体基因组中的核酸，或作为引入的染色体，例如微型染色体。
宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌)或真核细胞(例如，植物细胞或酵母细胞)。例如，宿主细胞可以是农杆菌，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。优选地，宿主细胞是植物细胞。
本文描述的核酸或本文描述的载体可以通过众所周知的方法引入宿主细胞中，这可能取决于所选择的宿主细胞，包括例如接合、mobilization、基因枪转化、农杆菌介导的转化、转染、转导、真空渗透或电穿孔。具体地，用于将核酸或载体引入农杆菌细胞中的方法是技术人员众所周知的并且可以包括接合或电穿孔方法。用于将核酸或载体引入植物细胞的方法也是已知的(Sambrook等，2001)并且可以包括多种转化方法，例如基因枪转化和农杆菌介导的转化。
在具体的实施方案中，本发明涉及转基因植物细胞，其包含本文所述的核酸，特别是诱导促进核酸或编码本文所述的双链RNA的核酸，作为如本文所述的转基因或载体。在进一步的实施方案中，本发明涉及包含转基因植物细胞的转基因植物或其部分。
例如，这样的转基因植物细胞或转基因植物是优选地用本文所述的核酸或本文所述的载体稳定转化的植物细胞或植物。
优选地，转基因植物细胞中的核酸与允许在植物细胞中转录和任选地表达的一种或多种调控序列可操作地连接。调节序列可以与核酸同源或异源。由根据本发明的核酸和调节序列组成的总结构然后可以代表转基因。
一方面，本发明涉及多核酸，优选分离的多核酸，其能够与本文所述的本发明的任何多核酸分子或其互补体或反向互补体特异性杂交。在某些实施方案中，此类多核酸能够与SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列分子；或其互补体或反向互补体特异性杂交。应当理解，如果这样的多核酸不与相关序列(例如突变基因相对于野生型基因)(功能性地)杂交，则其与所列举的序列特异性杂交。因此，此类多核酸可用于例如区分根据本发明的突变的ALS和例如野生型ALS。在某些实施方案中，多核酸包含少于500个核苷酸，例如少于400个核苷酸，例如少于300个核苷酸，例如少于200个核苷酸，例如少于100个核苷酸，例如优选少于80个核苷酸，更优选少于60个核苷酸，最优选少于50个核苷酸。在某些实施方案中，此类多核酸包含至少5个核苷酸，优选至少10个核苷酸，更优选至少15个核苷酸。在某些实施方案中，此类多核酸包含5至500个核苷酸，优选10至100个核苷酸，更优选15至50个核苷酸，例如20至50个核苷酸。在某些实施方案中，此类多核酸是引物或探针，如本文其他地方所述，例如KASP引物(竞争性等位基因特异性PCR)。
在某些实施方案中，此类多核酸包含SEQ ID NO:7的至少10个最靠3'核苷酸，优选至少15个最靠3'核苷酸，例如至少20个最靠3'核苷酸、其互补体或其反向互补体。在某些实施方案中，此类多核酸包含SEQ ID NO:7所示的序列、其互补体或其反向互补体或由其组成。
一方面，本发明涉及本文所述的多核酸(特别是编码突变型ALS的多核酸)、载体或宿主细胞用于产生如本文其他地方所述的根据本发明的栽培甜菜植物或植物部分，特别是包含(内源性)ALS蛋白(其在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸)的栽培甜菜植物或植物部分的用途。
一方面，本发明涉及如本文所述的多核酸，特别是引物或探针用于鉴定如本文其他地方所述的根据本发明的栽培甜菜植物或植物部分，特别是包含(内源性性)ALS蛋白(其在位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸)的栽培甜菜植物或植物的用途。
一方面，本发明涉及栽培甜菜植物或植物部分，其包含：
a)包含SEQ ID NO:1所示序列的多核酸；
b)包含SEQ ID NO:2所示序列的多核酸；
c)编码具有SEQ ID NO:2所示cDNA序列的ALS蛋白的多核酸；
d)编码具有SEQ ID NO:3所示序列的ALS蛋白的多核酸。
在某些实施方案中，此类栽培甜菜植物或植物部分进一步包含：
a)包含SEQ ID NO:10所示序列的多核酸；
b)包含SEQ ID NO:11所示序列的多核酸；
c)编码具有SEQ ID NO:11所示cDNA序列的ALS蛋白的多核酸；
d)编码具有SEQ ID NO:12所示序列的ALS蛋白的多核酸。
应当理解，优选这些多核酸包含在植物或植物部分的基因组中。优选地，这些多核酸是条件性或组成型表达的，因此受到合适的调节序列的控制，如本文其他地方所述。在优选的实施方案中，这些多核酸在内源性ALS启动子的控制下的内源性ALS位置处。
一方面，本发明涉及用于产生栽培甜菜植物或植物部分，例如本文所述的根据本发明的栽培甜菜植物或植物部分的方法，其包括向植物或植物部分中引入例如原生质体，根据本发明的多核酸，优选向植物或植物部分的基因组中引入，特别是编码如本文其他地方定义的根据本发明的(内源性)突变的ALS的多核酸。在某些实施方案中，此类方法进一步包括从植物部分例如原生质体再生植物。
一方面，本发明涉及用于产生栽培甜菜植物或植物部分，例如本文所述的根据本发明的栽培甜菜植物或植物部分的方法，其包括在植物或植物部分，例如原生质体或种子中突变编码(内源性)ALS的多核酸，优选在植物或植物部分的基因组中突变特别是编码如本文其他地方定义的根据本发明的(内源性)突变ALS的多核酸。在某些实施方案中，此类方法进一步包括从植物部分，例如原生质体或种子再生植物。
诱变可以根据本领域已知的任何技术进行。如本文所用，“诱变(mutagenization)”或“诱变(mutagenesis)”包括常规诱变和位置特异性诱变或“基因组编辑”或“基因编辑”。在传统的诱变中，DNA水平上的修饰不是以靶向方式产生的。植物细胞或植物暴露在诱变条件下，例如通过UV暴露或使用化学物质的TILLING(Till等，2004)。随机诱变的另一种方法是借助转座子的诱变。位置特异性诱变能够在DNA水平上以靶向方式在DNA中的预定义位置引入修饰。例如，TALENS、大范围核酸酶、归巢核酸内切酶、锌指核酸酶或CRISPR/Cas系统可用于此目的。
在某些实施方案中，ALS基因的核酸修饰通过随机诱变实现。细胞或生物体可以暴露于诱变剂，例如UV辐射或诱变化学品(例如甲磺酸乙酯(EMS))，然后选择具有所需特征的突变体。例如，可以通过TILLING(靶向诱导基因组局部突变技术)来鉴定突变体。该方法将诱变(例如使用化学诱变剂例如甲磺酸乙酯(EMS)的诱变)与鉴定靶基因中的单碱基突变/点突变的敏感DNA筛选技术相结合。TILLING方法依赖于DNA异源双链体的形成，该DNA异源双链体是通过PCR扩增多个等位基因，然后加热并缓慢冷却时形成的。两条DNA链错配时形成“气泡”，其然后被单链核酸酶切割。然后根据尺寸，例如通过HPLC分离产物。另请参见McCallum等“Targeted screening for induced mutations”；NatBiotechnol.2000Apr；18(4):455-7和McCallum等“Targeting induced local lesions IN genomes(TILLING)forplant functional genomics”；Plant Physiol.2000Jun；123(2):439-42。在某些实施方案中，突变型ALS可通过靶向诱变获得，例如基因编辑技术，包括CRISPR/Cas、锌指核酸酶、大范围核酸酶或TALEN基因编辑技术，如本领域已知的。
在某些实施方案中，根据本发明的突变的ALS可以通过以下方式获得：
a)用EMS和/或EMU，例如至少0.5％ EMS或至少0.3％ ENU诱变栽培甜菜细胞或组织，例如种子，
b)从诱变的细胞或组织(M0)产生stecks，
c)重新种植stecks以产生种子群体(M1)，
d)从M1种子长成的植物产生种子(M2)，
e)播种M2种子并施用ALS抑制剂除草剂，
f)任选地，将存活的植物重新种植在盆中并对生长的植物施用ALS抑制剂除草剂，以及
g)选择没有除草剂损害的存活植物和/或选择包含编码ALS蛋白的ALS等位基因的植物，所述ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
根据本发明的突变型ALS还可以通过基因渗入获得。
如本文所用，术语“基因渗入(introgression)”、“基因渗入(introgressed)”和“基因渗入(introgressing)”是指天然和人工过程，由此一种植物、物种、品种或栽培品种cultivar的染色体片段或基因通过杂交这些植物或物种被移入另一种植物、物种、品种或栽培品种的基因组中。该过程可以任选地通过与轮回亲本回交来完成。例如，所需等位基因在特定基因座的渗入可通过同一物种的两个亲本之间的有性杂交传递至至少一个后代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。或者，例如，等位基因的传递可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需等位基因可以例如通过与QTL、转基因等处的表型相关的标记来检测，或者可以例如通过标准技术例如测序、杂交、PCR等来鉴定，如本文其他地方所定义。在任何情况下，包含所需等位基因的后代可以与具有所需遗传背景的品系重复回交并选择所需等位基因，以导致等位基因固定在选定的遗传背景中。当该过程重复两次或更多次时，“基因渗入”的过程通常被称为“回交”。“基因渗入片段”或“基因渗入区段”或“基因渗入区域”是指已人工或自然地例如通过杂交或传统育种技术，例如回交，被引入相同或相关物种的另一植物中的染色体片段(或染色体部分或区域)，即基因渗入的片段是动词“基因渗入”(例如回交)所指的育种方法的结果。应当理解，术语“基因渗入片段”从不包括整个染色体，而仅包括染色体的一部分。基因渗入片段可以是大的，例如甚至染色体的四分之三或一半，但优选较小，例如约15Mb或更少，例如约10Mb或更少、约9Mb或更少、约8Mb或更少，约7Mb或更少、约6Mb或更少、约5Mb或更少、约4Mb或更少、约3Mb或更少、约2.5Mb或2Mb或更少、约1Mb(等于1,000,000个碱基对)或更少，或约0.5Mb(等于500,000个碱基对)或更少，例如约200,000bp(等于200kb)或更少、约100,000bp(100kb)或更少、约50,000bp(50kb)或更少、约25,000Bp(25kb)或更少。在某些实施方案中，基因渗入片段包含如本文所述的根据本发明的突变的ALS(等位基因)、由其组成或基本上由其组成。
遗传元件、基因渗入片段、或赋予性状(例如ALS抑制剂除草剂耐受性)的基因或等位基因被认为是“可从……获得”或可以“从……获得”或“可从……衍生”或可以“衍生自”或“存在于”或“发现于”如本文其他地方所述的植物或植物部分，如果使用传统育种技术可以将从其存在的植物转移到其不存在的另一种植物(例如品系或品种)，同时除了添加由遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因赋予的性状之外，不会导致受体植物的表型变化。这些术语可互换使用，并且遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因因此可以转移到缺乏该性状的任何其他遗传背景中。不仅可以使用包含遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因的植物，而且可以使用来自已选择保留遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因的此类植物的后代/子代并包含在本文中。植物(或植物的基因组DNA、细胞或组织)是否包含与可从此类植物获得的相同的遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因可以由技术人员使用本领域已知的一种或多种技术来确定，例如表型测定、全基因组测序、分子标记分析、性状作图、染色体涂染、等位性测试等，或技术的组合。应当理解，还可以涵盖转基因植物。
如本文所用，术语“基因工程化”、“转化”和“遗传修饰”在本文中均用作将分离的和克隆的基因转移至另一生物体的DNA(通常为染色体DNA或基因组)中的同义词。
本文所用的“转基因”或“遗传修饰生物体”(GMO)是其遗传物质已使用通常称为“重组DNA技术”的技术改变的生物体。重组DNA技术包括将不同来源的DNA分子离体(例如在试管中)组合成一个分子的能力。该术语通常不涵盖其遗传组成已通过常规杂交育种或通过“诱变”育种而改变的生物体，因为这些方法早于重组DNA技术的发现。本文所用的“非转基因”是指植物和衍生自不是上述定义的“转基因”或“基因修饰生物体”的植物的食品。
“转基因”或“嵌合基因”是指包含DNA序列的遗传基因座，例如重组基因，其已通过转化例如农杆菌介导的转化引入植物的基因组中。包含稳定整合到其基因组中的转基因的植物被称为“转基因植物”。
“基因编辑”或“基因组编辑”是指在生物体的基因组中插入、缺失、修饰或替换DNA或RNA的基因工程。基因编辑可包括靶向或非靶向(随机)诱变。靶向诱变可以例如使用设计核酸酶来完成，例如使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活子样效应子的核酸酶(TALEN)和成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)系统。这些核酸酶在基因组中的所需位置产生位点特异性双链断裂(DSB)。诱导的双链断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)进行修复，产生靶向突变或核酸修饰。使用设计核酸酶特别适合产生基因敲除或敲低。在某些实施方案中，开发了特异性诱导ALS基因突变的设计核酸酶，如本文其他地方所述。设计核酸酶系统的递送和表达系统是本领域众所周知的。
在某些实施方案中，核酸酶或靶向/位点特异性/归巢核酸酶是、包含(修饰的)CRISPR/Cas系统或复合物、(修饰的)Cas蛋白、(修饰的)锌指、(修饰的)锌指核酸酶(ZFN)、(修饰的)转录因子样效应物(TALE)、(修饰的)转录因子样效应物核酸酶(TALEN)或(修饰的)大范围核酸酶，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，所述(修饰的)核酸酶或靶向/位点特异性/归巢核酸酶是、包含(修饰的)RNA引导的核酸酶，基本上由其组成或由其组成。应当理解，在某些实施方案中，核酸酶可以针对在植物中的表达进行密码子优化。如本文所用，术语所选核酸序列的“靶向”是指核酸酶或核酸酶复合物以核苷酸序列特异性方式起作用。例如，在CRISPR/Cas系统的背景下，指导RNA能够与选定的核酸序列杂交。
基因编辑可涉及基因编辑组件或系统的瞬时、诱导或组成型表达。基因编辑可涉及基因编辑组件或系统的基因组整合或游离存在。基因编辑组件或系统可以在载体例如质粒上提供，其可以通过适当的递送媒介物递送，如本领域已知。优选的载体是表达载体。
基因编辑可包括提供重组模板，以实现同源定向修复(HDR)。例如，可以通过其中提供重组模板的基因编辑来替换遗传元件。DNA可能在需要替换的序列的上游和下游被切割。因此，待替换的序列被从DNA中切除。通过HDR，切除的序列随后被模板替换。在某些实施方案中，如本文所述的本发明的突变的ALS基因或cDNA(或其包含本发明的突变的片段，即对应于不同于ALS的氨基酸位置371处的天冬氨酸的氨基酸)可以提供在模板上/作为模板。通过设计系统，使得双链断裂被引入不包含突变型ALS的植物基因组中相应区域的上游和下游，该区域被切除并且可以用包含本发明的突变型ALS(或片段)的模板替换。这样，将本发明的突变型ALS引入植物中不需要涉及多次回交，特别是在具有特定遗传背景的植物中。
一方面，本发明涉及栽培甜菜植物(或植物部分)，其通过如本文所述的根据本发明的产生栽培甜菜植物的方法(直接)获得或可获得。在优选的实施方案中，植物部分是根甜菜(或甜菜根)。
在某些实施方案中，栽培甜菜植物或植物部分中的突变型ALS是纯合的。在某些实施方案中，栽培甜菜植物或植物部分中的突变型ALS是杂合的，即植物或植物部分包含一种突变型ALS等位基因和一种野生型等位基因，或者备选地根据本发明的一种突变型ALS等位基因(即在氨基酸位置371处具有不同于天冬氨酸的氨基酸，如本文其他地方所述)，以及具有不同突变的一个突变ALS等位基因(例如优选在氨基酸位置569处具有不同于色氨酸的氨基酸，如本文其他地方所述)。
在某些实施方案中，本发明的栽培甜菜植物或植物部分包含ALS蛋白，其在氨基酸位置371处具有不同于本文其他地方所述的天冬氨酸的氨基酸，并且在氨基酸位置569处具有不同于本文其他地方所述的色氨酸的氨基酸(即同一等位基因中的双突变)。
一方面，本发明涉及用于鉴定栽培甜菜植物或植物部分(例如本文所述的根据本发明的栽培甜菜植物或植物部分)的方法，其包括筛选ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的存在，或筛选编码ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的密码子的存在。如果鉴定出ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸，或者鉴定出编码ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的密码子，则该方法还可以包括选择栽培甜菜植物或植物部分的步骤。
一方面，本发明涉及用于鉴定栽培甜菜植物或植物部分，例如对一种或多种ALS抑制剂除草剂具有耐受性或具有增加的耐受性的栽培甜菜植物或植物部分的方法，其包括在甜菜植物的ALS蛋白中筛选位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的存在，或筛选编码ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的密码子的存在。如果鉴定出ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸，或如果鉴定出编码ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的密码子，则该方法可以进一步包括鉴定对一种或多种ALS抑制剂除草剂具有耐受性或具有增加的耐受性的栽培甜菜植物或植物部分的步骤。如果鉴定出ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸，或如果鉴定出编码ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的密码子，则该方法可以进一步包括选择对一种或多种ALS抑制剂除草剂具有耐受性或具有增加的耐受性的栽培甜菜植物或植物部分的步骤。
一方面，本发明涉及用于检测或鉴定如本文所述的本发明的ALS突变的方法。
可以应用任何检测手段，如本文其他地方所述，并且包括例如测序、基于杂交的方法(例如(动态)等位基因特异性杂交、分子信标、SNP微阵列)、基于酶的方法(例如PCR、KASP、竞争性等位基因特异性PCR)、RFLP、ALFP、RAPD、Flap核酸内切酶、引物延伸、5'-核酸酶、寡核苷酸连接分析)、基于DNA物理性质的后扩增方法(例如单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、整个扩增子的高分辨率熔解、DNA错配结合蛋白的使用、SNPlex、surveyor核酸酶测定)等。
在某些实施方案中，突变型ALS的检测通过KASP进行。在某些实施方案中，等位基因特异性KASP引物(对于突变型ALS)包含SEQ ID NO:7的至少10个最靠3’核苷酸，优选至少15个最靠3’核苷酸，例如至少20个最靠3’核苷酸、其互补体、或其反向互补体。在某些实施方案中，此类KSAP引物包含SEQ ID NO:7所示的序列、其互补体或其反向互补体或由其组成。
在某些实施方案中，野生型ALS的检测通过KASP进行。在某些实施方案中，等位基因特异性KASP引物(对于野生型ALS)包含SEQ ID NO:8的至少10个最靠3’核苷酸，优选至少15个最靠3’核苷酸，例如至少20个最靠3’核苷酸、其互补体、或其反向互补体。在某些实施方案中，此类KSAP引物包含SEQ ID NO:8所示的序列、其互补体或其反向互补体或由其组成。
普通KASP引物(其用于突变型和野生型ALS的检测)可以由本领域技术人员适当选择，并且其位置没有特别限制。在某些实施方案中，共同引物包含SEQ ID NO:9所示的序列或由SEQ ID NO:9所示的序列组成。
一方面，本发明涉及试剂盒，其包含多核酸，特别是本文所述的引物或探针，以及任选地用于检测突变型ALS或用于区分突变型ALS和野生型ALS的试剂，例如如本文所述的KASP引物。
一方面，本发明涉及生产栽培甜菜根甜菜(或甜菜根)的方法，其包括播种如本文其他地方所述的根据本发明的栽培甜菜植物，并收获根甜菜(或甜菜根)，优选在生长季节结束时。
一方面，本发明涉及栽培甜菜植物或植物部分，优选根甜菜(或甜菜根)在用于糖生产、厌氧消化或发酵的方法中的用途。
一方面，本发明涉及栽培甜菜植物或植物部分，优选根甜菜(或甜菜根)在沼气或生物燃料生产方法中的用途。
本文所用的“发酵”是指使用微生物将有机分子转化为另一种分子的过程。例如，“发酵”可以指有氧转化来自植物材料(例如本发明的植物材料)的糖或其他分子以产生醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸[例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮类[例如，丙酮]、氨基酸[例如，谷氨酸]；气体(例如，H2和CO2)、抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和/或激素。发酵包括消费酒精工业(例如啤酒和葡萄酒)中使用的发酵。发酵还包括厌氧发酵，例如用于生产生物燃料。发酵可以通过适合在所需发酵步骤中使用的任何生物体来完成，包括但不限于细菌、真菌、古细菌和原生生物。合适的发酵生物体包括能够将单糖、二糖和三糖，尤其是葡萄糖和麦芽糖，或任何其他生物质衍生的分子直接或间接转化为所需发酵产物(例如，乙醇、丁醇等)的那些生物体。合适的发酵生物体还包括可以将非糖分子转化为所需发酵产物的那些生物体。此类生物体和发酵方法是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“生物燃料”是指衍生自生物质的燃料，即活的或最近活的生物有机体，例如植物或动物废物。生物燃料包括但不限于生物柴油、生物氢、沼气、生物质衍生的二甲基呋喃(DMF)等。特别地，术语“生物燃料”可用于指代植物衍生的醇，例如乙醇、甲醇、丙醇或丁醇，如果需要的话，其在使用前可被变性。术语“生物燃料”还可用于指包含植物衍生燃料的燃料混合物，例如醇/汽油混合物(即汽油醇)。汽油醇可包含任何所需百分比的植物衍生醇(即，约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％植物衍生的醇)。例如，一种有用的基于生物燃料的混合物是E85，它包含85％的乙醇和15％的汽油。生物燃料可以是通过植物材料的需氧或厌氧发酵产生的任何生物燃料。通过需氧发酵获得的生物燃料的非限制性实例是生物乙醇。可以通过厌氧发酵获得的生物燃料包括但不限于沼气和/或生物柴油。需氧和/或厌氧发酵的方法是本领域技术人员已知的。本发明还涵盖的是选自通过本发明的用于生产一种或多种生物燃料的方法生产的乙醇、沼气和/或生物柴油的生物燃料。
本发明包括其他工业应用，例如在本发明的甜菜植物中生产抗体或生物塑料。此外，本发明的甜菜植物或其部分也可以不经进一步加工而使用，例如用作牛饲料。
术语“糖”是指可发酵的单糖、二糖和三糖，特别是单糖和二糖。因此，在本发明中，糖包括但不限于蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖，优选蔗糖。
本发明的方面和实施方案受到以下非限制性实施例的进一步支持。
实施例
实施例1：
将250kg甲磺酸乙酯(EMS)和N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变的M2代KWS专有基因型甜菜种子播种在15公顷田地上。出苗后六周和八周，以0.5L ha-1的浓度向田地喷洒除草剂CONVISOONE(50g/L甲磺隆、30g/L噻卡巴松)。第二次处理后两周，选择存活的植物，进行移植，并在温室中进一步培养。在温室中又应用了一项CONVISOONE(0.5Lha-1)处理。总共选择了七株植物。从所有五个个体中提取DNA样本，并使用标准方法(Sanger测序)对BvALS编码序列进行测序。
名为18ZZJZJ7MS1001-0019和18ZZJZJ7MS1001-0023的两个突变体碰巧在位置1141(BvALS_g8976.t1_T807_基因组_DNA参考序列SEQ ID NO:1(所提供的CDS的位置1113，SEQ ID NO:2)处携带相同的T到A突变，其翻译BvALS蛋白序列(SEQ ID NO:3)的位置371处的氨基酸从Asp(D)变为Glu(E)。对于其他三个突变体，测序尚不清楚，首先假设它们在BvALS蛋白编码序列内没有突变。
为了确定接合状态并清楚地鉴定导致BvALS中D371E取代的点突变，已经开发了适用作KASP标记的特定标记sytxalss14as001：
Primer_AlleleX(突变型等位基因)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGAA(SEQ ID NO:7)
Primer_AlleleY(野生型等位基因)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGAT(SEQ ID NO:8)
Primer_Common：GGCTAGCAAACGCCTCGAGCTT(SEQ ID NO:9)
标记应用显示，突变型植物18ZZJZJ7MS1001-0019和18ZZJZJ7MS1001-0023对于导致BvALS中D371E取代的点突变是纯合的。通过标记，三个未知突变体中的两个，18ZZJZJ7MS1001-0018和18ZZJZJ7MS1001-0030，已被鉴定对于导致BvALS中D371E取代的点突变是杂合的。
所鉴定的ALS突变体已在用于田地处理的浓度的CONVISOONE处理，以及用CONVISOONE的单独活性成分甲磺隆和噻卡巴松的处理、用Pulsar40(活性成分：甲氧咪草酸)的处理、用活性成分双草醚的处理，以及用Broadway(活性成分：双氟磺草胺、Pyroxylam)的处理(表1)中反复进行了测试。所有除草剂处理均以对应于1X推荐田间施用浓度的量进行：将对BvALS_D371E突变纯合和杂合的植物以及M0背景基因型的后代种子播种，在温室中培养，并在出苗后移植到单盆中。当第一片真叶出现时进行除草剂处理。
表1：ALS抑制剂除草剂处理
处理后14天进行耐受性评级。第一对真叶的生长被用作除草剂耐受性的指标。令人惊讶的是，纯合的和杂合的BvALS_D371E突变体在五种已知ALS抑制剂类别中的四种中存活下来，加上作为两类此类抑制剂的混合物的CONVISOONE，没有可见的植物毒性除草剂损害(表2)。
表2：不同类别ALS抑制剂的测试
纯合突变体 杂合突变体
复合混合物 耐受的 耐受的
磺酰脲类 耐受的 耐受的
磺酰氨基羰基三唑啉酮 耐受的 耐受的
咪唑啉酮类 耐受的 耐受的
嘧啶基硫代苯甲酸酯 耐受的 耐受的
三唑并嘧啶类 敏感的 敏感的
此外，将对突变BvALS_D371E(RR)是纯合的一种甜菜基因型与第二种甜菜基因型杂交。后代对CONVISOONE的耐受性进行了表型分析。在遗传上，RR:Rs:ss(1:2:1)的分离是预料之中的。观察结果显示表型分离为3:1(耐受的：敏感的)。这再次证实，即使是杂合突变体也表现出适合商业应用的高水平耐受性。

Claims (15)

1.甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含、表达或能够表达突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白或编码突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白的多核酸，所述突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
2.根据权利要求1的甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含编码ALS蛋白的突变的内源性等位基因，所述ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
3.根据权利要求1或2的甜菜植物、植物部分或植物群体，其耐受一种或多种ALS抑制剂除草剂。
4.根据权利要求1至3中任一项的甜菜植物、植物部分或植物群体，其耐受一种或多种ALS抑制剂除草剂，所述ALS抑制剂除草剂选自(磺)酰胺类，例如磺酰脲类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、磺酰苯胺类或三唑并嘧啶类；咪唑啉酮类；和嘧啶基(硫代/氧基)苯甲酸酯，优选选自磺酰脲类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、咪唑啉酮类和嘧啶基(硫代/氧基)苯甲酸酯类。
5.根据权利要求1至4中任一项的甜菜植物、植物部分或植物群体，其包含编码突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白的多核酸或包含编码ALS蛋白的突变的内源性等位基因，所述ALS蛋白在位置569处包含不同于色氨酸(W)的氨基酸。
6.根据权利要求1至5中任一项的甜菜植物、植物部分或植物群体，其中所述ALS是纯合的或杂合的。
7.(分离的)多核酸，其编码权利要求1至6中任一项所定义的突变的内源性乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白。
8.根据权利要求7的(分离的)多核酸，其中所述ALS蛋白具有与SEQ ID NO:3至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，例如至少98％相同的序列。
9.载体，其包含根据权利要求7或8的多核酸。
10.(分离的)多核酸，其与根据权利要求7或8的多核酸、其互补体或其反向互补体特异性杂交，优选地其中所述多核酸是引物或探针。
11.用于鉴定甜菜植物或植物部分的方法，其包括筛选ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的存在，或筛选编码ALS蛋白中位置371处不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的密码子的存在。
12.用于生成甜菜植物或植物部分的方法，其包括在植物或植物部分的基因组中突变内源性ALS等位基因，产生编码在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸的ALS蛋白的ALS等位基因，或者在植物或植物部分的基因组中引入(并表达)编码突变的内源性ALS蛋白的多核酸，所述突变的内源性ALS蛋白在位置371处包含不同于天冬氨酸(D)的氨基酸。
13.通过根据权利要求12的方法(直接)获得的或可获得的甜菜植物或植物部分，或其后代。
14.用于控制甜菜生长区域中不想要的植被或提高甜菜生长区域中产量的方法，其包括以下步骤：
a)根据权利要求1至6中任一项种植甜菜植物或播种甜菜种子，
b)向生长的植物施用一种或多种ALS抑制剂除草剂，优选以足以抑制不想要的植被的生长的剂量，更优选以足以杀死不想要的植被的剂量，和
c)任选地，在生长季节重复步骤b)。
15.根据权利要求14的方法，其中所述不想要的植被包括bolters、杂草甜菜或一年生甜菜。
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