CN117836404A - 肾间质前体细胞的制造方法及促红细胞生成素产生细胞和肾素产生细胞的制造方法 - Google Patents

Abstract

一种肾间质前体细胞的制造方法，所述制造方法包括：将HOXC10阳性细胞在包含GSK(糖原合成酶激酶)‑3β抑制剂、SHH(音猬因子(Sonic Hedgehog))信号活化剂和TGF(转化生长因子(Transforming growth factor))β抑制剂、优选还包含IL(白介素(Interleukin))‑1β和视黄酸的培养基中培养以诱导成肾间质前体细胞的工序。

Description

肾间质前体细胞的制造方法及促红细胞生成素产生细胞和肾 素产生细胞的制造方法

技术领域

本发明涉及一种将HOXC10阳性细胞诱导分化出肾间质前体细胞的方法。本发明还涉及一种将肾间质前体细胞诱导分化出肾促红细胞生成素产生细胞、以及系膜细胞和肾小球旁细胞等肾素产生细胞的方法。

背景技术

目前，推测日本的慢性肾病(CKD)患者人数为约1300万人，被称为新的国民病。针对慢性肾病的根治性治疗方法少，根据其进展情况，必须进行透析治疗的晚期慢性肾功能衰竭患者有34万人以上，这不仅是医学上的一大问题，也是医疗经济上的一大问题。作为包括晚期慢性肾功能衰竭在内的慢性肾病的根治方法，可举出肾移植，但由于严重的供体器官不足而处于供应完全跟不上需求的状态。

肾脏来源于作为早期胚胎组织的间介中胚层，在脊椎动物中，由间介中胚层形成前肾、中肾、后肾3个肾脏，在哺乳类中，后肾形成成体的肾脏。后肾是将分化出被称为间充质的成体肾的肾单位和间质的组织与将由被称为输尿管芽的成体肾的集合管分化出下部的肾盂、尿管等的一部分的组织这两种组织的相互作用而产生的。

如果确立了将诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)等多能干细胞高效地诱导分化出构成肾脏的细胞的方法，则可以期待将来通过三维肾脏的重建来解决肾移植供体不足的问题、作为肾小球、肾小管细胞的供应源用于细胞疗法。进一步地，还可以期待发展使用肾小球、肾小管细胞、包含它们的肾组织的药物肾毒性评价体系、使用由疾病特异性iPS细胞制作的肾细胞和肾组织的疾病模型的制作、治疗药物的开发等研究。

本发明人等的团队报道了将多能干细胞诱导分化出肾单位前体细胞的方法(专利文献1、2)。

另一方面，对于肾脏的复杂树状结构，特别是集合管树状结构的形成，来自间质细胞的信号被认为是必须的。若干团队报道了利用由人多能干细胞分化得到的前端间介中胚层和后端间介中胚层的相互作用来制作包括间质细胞的多系统肾脏类器官(非专利文献1、2)。但是，没有实现将人多能干细胞选择性地诱导出肾间质前体细胞。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO 2014/200115

专利文献2：WO 2018/216743

非专利文献

非专利文献1：Takasato et al.,Nature volume 526,pages 564-568(2015)

非专利文献2：Uchimura et al.,Cell Rep.2020Dec 15；33(11):108514.

发明内容

发明所要解决的问题

近年来使用多能干细胞的再生医疗研究中，开发了多个肾脏系统的细胞、类器官，但为了形成更具功能性的肾段，需要上皮细胞和间质细胞的多种相互作用，期待一种将多能干细胞选择性地诱导出肾间质前体细胞的方法。

因此，本发明的目的在于提供一种高效地诱导分化出肾间质前体细胞的方法。还提供一种将肾间质前体细胞诱导分化出肾EPO产生细胞、以及系膜细胞和肾小球旁细胞等肾素产生细胞的方法。

用于解决问题的手段

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。结果发现通过将HOXC10阳性细胞在包含GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂，优选还包含SHH信号活化剂、IL-1β和视黄酸的培养基中培养，可以选择性地诱导分化出肾间质前体细胞(IPC)。将该诱导得到的IPC和肾单位前体细胞(NPC)混合后移植至生物体内，形成系膜样结构。进一步地，通过筛选诱导分化因子，成功地在体外(in vitro)将多能干细胞来源IPC诱导分化成系膜细胞、肾小球旁细胞等肾素产生细胞、肾促红细胞生成素(EPO)产生细胞系。本发明是基于这样的认知而完成的。

即，本发明具有以下特征：

[1]一种肾间质前体细胞的制造方法，所述制造方法包括：将HOXC10阳性细胞在包含GSK(糖原合成酶激酶)-3β抑制剂、SHH(音猬因子(Sonic Hedgehog))信号活化剂和TGF(转化生长因子(Transforming growth factor))β抑制剂的培养基中培养以诱导成肾间质前体细胞的工序。

[2]根据[1]所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含IL(白介素(Interleukin))-1β。

[3]根据[2]所述的肾间质前体细胞的制造方法，所述制造方法包括下述工序1)、工序2)：1)将HOXC10阳性细胞在包含GSK-3β抑制剂、SHH信号活化剂、TGFβ抑制剂和IL-1β的培养基中培养的工序；接着

2)在包含GSK-3β抑制剂、SHH信号活化剂和TGFβ抑制剂的培养基中培养的工序。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含视黄酸。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，所述培养通过悬浮培养进行。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，GSK-3β抑制剂为CHIR99021，SHH信号活化剂为SHH蛋白、嘌吗啡胺(Purmorphamine)或SAG(平滑激动剂(Smoothened Agonist))，TGFβ抑制剂为SB431542、A83-01或LDN193189。

[7]根据[1]至[6]中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，HOXC10阳性细胞为将多能干细胞诱导分化得到的HOXC10阳性细胞。

[8]根据[7]所述的方法，其中，所述HOXC10阳性细胞为通过包括以下工序(i)至工序(iv)的方法制造的HOXC10阳性细胞：

(i)将多能干细胞在包含bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、BMP(骨形成蛋白)4、GSK-3β抑制剂和视黄酸或其衍生物的培养基中培养的工序；

(ii)将工序(i)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂和BMP7的培养基中培养的工序；

(iii)将工序(ii)中得到的细胞在包含GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中培养的工序；以及

(iv)将工序(iii)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂、激活素和ROCK抑制剂的培养基中培养的工序。

[9]根据[7]或[8]所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞(iPS细胞)。

[10]一种肾间质前体细胞，所述肾间质前体细胞通过根据[1]至[9]中任一项所述的方法制造。

[11]一种药物组合物，所述药物组合物包含根据[10]所述的肾间质前体细胞。

[12]根据[11]所述的药物组合物，所述药物组合物还包含肾单位前体细胞。

[13]一种肾EPO产生细胞的制造方法，所述制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂、SHH信号活化剂和HIF(低氧诱导因子)抑制剂的培养基中培养以制造肾EPO(促红细胞生成素)产生细胞的工序。

[14]根据[13]所述的肾EPO产生细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含TGFβ抑制剂和/或视黄酸。

[15]根据[13]或[14]所述的肾EPO产生细胞的制造方法，其中，肾间质前体细胞是通过根据[1]至[9]中任一项所述的方法得到的肾间质前体细胞。

[16]一种肾素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂和TGFβ抑制剂且不含SHH信号活化剂的培养基中培养以制造肾素产生细胞的工序。

[17]根据[16]所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，肾素产生细胞是系膜细胞或肾小球旁细胞。

[18]根据[16]或[17]所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含BMP、VEGF(血管内皮细胞生长因子)和/或视黄酸。

[19]根据[16]至[18]中任一项所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含HIF抑制剂。

[20]根据[16]至[19]中任一项所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，肾间质前体细胞是通过根据[1]至[9]中任一项所述的方法得到的肾间质前体细胞。

发明效果

根据本发明的方法，可以选择性地得到肾间质前体细胞。

另外，通过进一步培养肾间质前体细胞，还可以得到肾EPO产生细胞、以及系膜细胞和肾小球旁细胞等肾素产生细胞。

通过本发明的方法得到的肾间质前体细胞、肾EPO产生细胞、以及系膜细胞和肾小球旁细胞等肾素产生细胞作为可适用于慢性肾病等的再生医疗用的细胞制剂是有用的。另外，通过将肾间质前体细胞与肾单位前体细胞混合来重建肾脏，可以得到高功能性的再生医疗用的细胞制剂。

另外，通过本发明的方法得到的肾间质前体细胞、肾EPO产生细胞、以及系膜细胞和肾小球旁细胞等肾素产生细胞在肾病模型制作中也是有用的。肾病模型在针对肾病的治疗方法、治疗药探索的观点中也是有用的。

附图说明

图1是示出将人iPS细胞分化成后部原条(PPS)的方案和将得到的后部原条诱导分化成肾间质前体细胞的因子的筛选策略的图。

图2是示出将人iPS细胞诱导分化得到的PPS细胞的免疫组织染色的结果的图(照片)。

图3是示出诱导分化6至11天期间(相当于图1的筛选(Screening)期间)用各种因子的组合进行处理后，第11天的细胞的流式细胞术分析(FOXD1和OSR1)的结果的图。关于浓度，CHIR99021(CHIR)为1μM、SB431542(SB)为10μM、视黄酸(RA)为100nM、FGF9为200ng/ml、头蛋白(Noggin)为25ng/ml。

图4是示出通过二维粘附培养(2D)或三维悬浮培养(3D)进行培养的第11天的细胞的流式细胞术分析(FOXD1和OSR1)的结果的图。分布图中间的点和线分别表示实验数据和平均值。*表示p<0.05，**表示p<0.01(t检验(Student’s t-test))。

图5是示出诱导分化6至8天期间用或不用平滑激动剂(SAG)(浓度500nM)处理的细胞在第11天进行流式细胞术分析(FOXD1及OSR1)的结果的图。**表示p<0.01(t检验(Student’s t-test))，NS表示无显著差异。

图6是示出诱导分化6至8天期间用各种因子处理的细胞在第11天进行流式细胞术分析(FOXD1及OSR1)的结果的图。关于浓度，CHIR为1μM、Wnt3a为10％、RSPO1(R-Spondin-1)为200ng/ml、SAG为500nM、IL-1β为10ng/ml、雌二醇(Estradiol)为50ng/ml、TGFβ1为10ng/ml。

图7是示出SI+S诱导条件(6至8天SAG+IL1β→9至11天SAG)下，并用或不并用给药各种ALK抑制剂和视黄酸(RA)后第11天的FOXD1的qRT-PCR(定量RT-PCR)分析结果的图。SB431542为1μM或10μM、A83-01为1μM或10μM、LDN193189为10nM或100nM。

图8是示出由hiPSC来源GFP(+)NPC和GFP(-)IPC制作的肾脏移植片移植10天后对HOPX、NPHS1和GFP的免疫染色像的照片图。下图是上图中的框内放大后的图像。

图9是示出在得到肾间质前体细胞后的第11至14天，进行EPO和肾素的qRT-PCR分析，比较肾EPO产生细胞或肾素产生细胞诱导分化候选因子的组合的效果的结果的图。SAG浓度为500nM、SB、CHIR的浓度单位为μM。

图10是示出在得到肾间质前体细胞后的第11至14天，进行EPO和肾素的qRT-PCR分析，比较各种诱导分化候选因子的组合的效果的结果的图。SAG浓度为500nM、SB、A83的浓度单位为μM；LDN的单位为nM；TGFβ1、BMP7、激活素(ACT)的单位为ng/mL。

图11是示出在得到肾间质前体细胞后的第11至14天，进行肾素的qRT-PCR分析，比较各种因子的效果的结果的图。在CHIR99021、RA和FG-4592(CFR)的存在下，在用或不用SB431542(1μM)处理的条件下对BMP4、BMP5或BMP7(10ng/mL或100ng/mL)的效果进行研究。SB的单位为μM；TGFβ1、ACT的单位为ng/mL。

图12是示出CFR+BMP7+SB处理后0小时和96小时的系膜细胞系(GATA3、肾素、GJA5)和IPC(FOXD1)的标记表达的qRT-PCR分析的结果的图。对照示出iPSC。

图13是示出在得到肾间质前体细胞后的第11至15天在低氧(5％O₂中CFR+B7+SB)或常氧(20％O₂中CFR+B7+SB去除FG-4592)条件下处理的细胞中的JG(肾素和GJA4)和系膜细胞(EBF1、GJA5、ITGA8和GATA3)的标记的qRT-PCR分析的结果的图。*表示p<0.05，**表示p<0.01，NS表示无显著差异(t检验(Student’s t-test))。

图14是示出在得到肾间质前体细胞后的第11至15天，对与VEGF(100ng/mL)或阿西替尼(Axitinib)(3μM)处理一起在低氧条件(5％O₂中CFR+B7+SB)或正常条件(20％O₂中CFR+B7+SB去除FG-4592)下处理的细胞中的JG(肾素和GJA4)、系膜细胞(EBF1、GJA5、ITGA8和GATA3)和VEGFA的标记的qRT-PCR分析的结果。

图15是示出在得到肾间质前体细胞后的第11至14天，在使用CHIR99021、RA、A83-01的诱导条件下的用于比较各种音猬因子(SHH)信号调节剂的效果的EPO的qRT-PCR分析的结果的图。So、Vi、Pu、Sa、Ga分别表示索尼德吉(Sonidegib)、维莫德吉(Vismodegib)、Purmophamine、SANT-1、GANT61，浓度单位表示为μM。SAG的浓度为500nM，SHH的浓度为100ng/mL。

图16是示出将多能干细胞经由IPC分化成系膜细胞、JG细胞、肾EPO产生细胞的方案的一个例子的图。

具体实施方式

下面将详细说明本发明。

<肾间质前体细胞>

肾间质前体细胞优选哺乳动物来源、更优选灵长类或啮齿类来源、优选人或小鼠来源。因此，本说明书中，用于制造肾间质前体细胞的HOXC10阳性细胞、由肾间质前体细胞得到的肾EPO产生细胞、系膜细胞和肾小球旁细胞等肾素产生细胞也优选哺乳动物来源、更优选灵长类或啮齿类来源、优选人或小鼠来源。

肾间质前体细胞是可以在体外分化成肾脏的间质细胞、肾EPO产生细胞、系膜细胞和肾小球旁细胞等肾素产生细胞的细胞，由FOXD1(叉头框(Forkhead Box)D1)阳性定义。还可以由OSR1阳性定义。进一步可以由PDGFRB(血小板源生生长因子受体β)阳性定义。需要注意的是，本说明书中，可以通过使用标记特异性抗体的免疫染色或使用标记特异性引物的RT-PCR等来确认标记为阳性。

<肾间质前体细胞的制造方法>

根据本发明一个方案的肾间质前体细胞的制造方法包括：将HOXC10阳性细胞在包含GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中培养以诱导出肾间质前体细胞的工序(以下，有时称为肾间质前体细胞诱导分化工序)。

这里，优选培养基还包含SHH信号活化剂。

优选培养基还包含IL-1β。

优选培养基还包含视黄酸。

示例如下的培养基。

包含GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK-3β抑制剂、TGFβ抑制剂和SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK-3β抑制剂、TGFβ抑制剂和IL-1β、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK-3β抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号活化剂和IL-1β、且还可包含视黄酸的培养基

HOXC10阳性细胞只要是这些标记为阳性的细胞就没有特别限制。进一步地，也可以是CITED1(Cbp/P300与富含Glu/Asp的羧基末端结构域1相互作用的反式激活因子(Cbp/P300 Interacting Transactivator With Glu/Asp Rich Carboxy-Terminal Domain 1))阳性。进一步地，也可以是HOXD11和BRACHYURY(T)阳性。HOXC10阳性细胞包括后部原条(Posterior Primitive Streak)细胞、神经中胚层前体细胞、后幼中胚层等。

HOXC10阳性细胞的来源没有特别限制，优选将多能干细胞诱导分化得到的HOXC10阳性细胞。将多能干细胞诱导分化成HOXC10阳性细胞的方法没有特别限制，例如可以使用后述的将多能干细胞诱导分化成HOXC10阳性细胞的方法。

用于肾间质前体细胞诱导分化工序的HOXC10阳性细胞可以是包含其他细胞种类的细胞群，也可以是纯化后的HOXC10阳性细胞。例如，包含10％及以上、20％及以上、30％及以上、40％及以上、50％及以上、60％、70％、80％及以上的HOXC10阳性细胞的细胞群用于肾间质前体细胞诱导分化工序。

肾间质前体细胞诱导分化工序中的培养可以通过粘附培养或悬浮培养进行，优选通过悬浮培养进行。

这里，悬浮培养意指细胞在与培养基材不粘附的状态下培养，例如，可以例示使用低细胞粘附性的培养器培养的方案。

这里，粘附培养意指细胞在粘附到培养基材上的状态下培养，例如，意指在经涂覆处理的培养皿中培养。作为涂覆剂，优选细胞外基质，例如可举出胶原蛋白、蛋白多醣、纤连蛋白、透明质酸、腱生蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、血纤维蛋白和层粘连蛋白等物质或它们的片段。

肾间质前体细胞诱导分化工序中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂，进一步地根据需要添加SHH信号刺激剂、IL-1β和视黄酸中的一种或多种来制备。作为基础培养基，例如可包含IMDM培养基、培养基199、Eagle最低基础培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM))培养基、αMEM培养基、杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM))培养基、Ham’s F12(F12)培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、及它们的混合培养基等。培养基中可以含有血清(例如牛胎儿血清(FBS))，也可以是无血清的。根据需要，可以含有例如白蛋白、运铁蛋白、KnockOut血清替代物(KnockOut Serum Replacement(KSR))(ES细胞培养时的血清替代物)(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等一种及以上血清替代物，也可以含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类及它们的等同物等一种及以上物质。也可以使用ReproFF2(ReproCELL)、Stem Fit AK02N培养基(味之素健康供应)等预先针对干细胞培养进行了优化的培养基。

<GSK-3β抑制剂>

GSK-3β抑制剂只要能够抑制GSK-3β的功能、例如激酶活性就没有特别限定，例如可举出作为靛玉红衍生物的BIO(别名，GSK-3β抑制剂IX；6-溴靛玉红-3’-肟)、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、作为苯基-α-溴甲基酮化合物的GSK-3β抑制剂VII(α,4-二溴苯乙酮)、作为细胞膜透过型磷酸化肽的L803-mts(别名，GSK-3β肽抑制剂；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH₂)和具有高选择性的CHIR99021(Nature(2008)453：519-523)。这些化合物例如可以从Stemgent公司、Calbiochem公司、Biomol公司等获得，此外也可以自行制作。作为本工序中使用的优选的GSK-3β抑制剂，可举出CHIR99021。本领域技术人员可以根据使用的GSK-3β抑制剂适当选择培养基中的GSK-3β抑制剂的浓度，例如为0.1μM至10μM、优选为0.5μM至3μM、进一步优选为0.5μM至1.5μM。

<TGFβ抑制剂>

TGFβ抑制剂是抑制TGFβ与受体的结合而继续向SMAD传导信号的物质，可举出抑制TGFβ与作为受体的ALK家族的结合的物质或抑制ALK家族导致的SMAD磷酸化的物质(也称为ALK抑制剂)，例如，可例示Lefty-1(作为NCBI登录号，可例示小鼠：NM_010094、人：NM_020997)、SB431542、SB202190(以上，R.K.Lindemann等人,Mol.Cancer,2003,2:20)、SB505124(Glaxo Smith Kline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A83-01(WO 2009146408)、LDN193189及它们的衍生物等。TGFβ抑制剂可以优选为SB431542。

本领域技术人员可以根据使用的TGFβ抑制剂适当选择培养基中的TGFβ抑制剂的浓度，例如SB431542为0.5μM至100μM、优选为1μM至50μM、进一步优选为5μM至25μM；A83-01为0.1μM至100μM、优选为0.5μM至50μM、进一步优选为1μM至10μM；LDN193189为0.01μM至1μM、优选为0.05μM至0.5μM、进一步优选为0.05μM至0.2μM。

<SHH信号活化剂>

SHH(音猬因子(Sonic hedgehog))信号刺激剂定义为引起SHH与其受体Patched(Ptch1)结合引起的Smoothened(Smo)的去抑制和随后Gli2的活化的物质，例如，可例示属于刺猬家族的蛋白质，具体地，SHH蛋白(例如，GenBank登录号：NM_000193、NP_000184)或IHH(印度刺猬因子(Indian Hedgehog))、SHH受体、SHH受体激动剂、Hh-Ag1.5(Li,X.,等,Nature Biotechnology,23,215～221(2005).)、平滑激动剂(Smoothened Agonist)(SAG)(N-甲基-N'-(3-吡啶基苄基)-N'-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-环己二胺(N-Methyl-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane)、20a-羟胆固醇、嘌吗啡胺(PMA；9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)及它们的衍生物等(Stanton BZ,Peng LF.,Mol Biosyst.6:44-54,2010)。作为SHH信号活化剂，可以适当选择其中的一种或两种以上使用。作为SHH信号活化剂，优选可举出SHH蛋白、嘌吗啡胺、SAG。

培养基中的优选浓度，在SAG的情况下为10nM至1000nM、优选为100nM至1000nM；在SHH蛋白的情况下为10ng/ml至1000ng/ml、优选为50ng/ml至200ng/ml；在Purmophamine的情况下，优选为0.1μM至10μM、优选为0.5μM至5μM。

<视黄酸>

本说明书中，视黄酸的定义不仅包括视黄酸本身，还包括保持了天然视黄酸具有的诱导分化功能的视黄酸衍生物。作为视黄酸衍生物，例如可以举出3-脱氢视黄酸、4-[[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羰基]氨基]-苯甲酸(AM580)(4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-Benzoic acid)(Tamura K，等人，Cell Differ.Dev.32：17－26(1990))、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯-1-基]-苯甲酸(TTNPB)(4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoicacid)(TTNPB)(Strickland S，等人，Cancer Res.43：5268-5272(1983))，及Tanenaga，K.等人，CancerRes.40：914-919(1980)中记载的化合物、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醛、3-脱氢视黄醇、3-脱氢视黄醛等。

培养基中的视黄酸的浓度例如为1nM至1000nM、优选为10nM至500nM、更优选为50nM至250nM。

<IL-1β>

IL-1β没有特别限制，但优选人IL-1β，作为人IL-1β，例如可举出具有NCBI(美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))的登录号：1TOO_A的氨基酸序列的蛋白。IL-1β只要具有诱导分化活性即可，也包括其片段和功能突变体。IL-1β可以使用市售产品，也可以使用从细胞纯化的蛋白、通过基因重组产生的蛋白。培养基中的IL-1β的浓度例如为1ng/ml至500ng/ml、1ng/ml至100ng/ml、5ng/ml至50ng/ml或5ng/ml至25ng/ml。

在本发明的肾间质前体细胞的制造方法的优选方案中，将HOXC10阳性细胞诱导成肾间质前体细胞的工序可在以下两个阶段中进行。

1)将HOXC10阳性细胞在包含GSK-3β抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号活化剂和IL-1β、且还可包含视黄酸的培养基中培养的工序；以及

2)将工序1)中得到的细胞(后端未分节中胚层细胞)在包含GSK-3β抑制剂、TGFβ抑制剂和SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基中培养的工序这样在两个阶段中进行，在工序2)中除去IL-1β，可以提高肾间质前体细胞的诱导分化效率。

肾间质前体细胞诱导分化工序中的培养天数例如可举出2天及以上、3天及以上、4天及以上、5天及以上。由于长时间培养对肾间质前体细胞的制造效率没有特别影响，因此没有上限，例如为30天及以下。肾间质前体细胞诱导分化工序中，只要得到肾间质前体细胞，培养条件没有特别限定，培养温度为约30℃至40℃、优选为约37℃；氧浓度为通常的氧浓度(例如为15％至25％、优选为约20％)；CO₂浓度优选为约2％至5％。

得到的肾间质前体细胞可以分离或浓缩。分离或浓缩例如可以通过使用针对PDGFRB的抗体的流式细胞术等进行。

通过进一步培养通过前述方法得到的肾间质前体细胞，可以得到肾EPO产生细胞、系膜细胞、肾小球旁细胞等肾素产生细胞。

<肾EPO产生细胞的制造方法>

本发明的一个方案涉及由肾间质前体细胞制造肾EPO产生细胞的方法。

即，在本发明的一个方案中，提供一种肾EPO产生细胞的制造方法，该制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂、SHH信号活化剂和HIF抑制剂的培养基中培养以制造肾EPO产生细胞的工序(以下，有时称为肾EPO产生细胞诱导分化工序)。

优选培养基还包含TGFβ抑制剂。

优选培养基还包含视黄酸。

示例如下的培养基。

包含GSK3β抑制剂、SHH信号活化剂和HIF抑制剂、且还可包含视黄酸的培养基包含GSK3β抑制剂、SHH信号活化剂、HIF抑制剂和TGFβ抑制剂、且还可包含视黄酸的培养基

肾间质前体细胞的来源没有特别限定，可以使用任意的肾间质前体细胞，只要是FOXD1阳性细胞即可，但优选使用通过上述肾间质前体细胞的制造方法得到的肾间质前体细胞。

肾EPO产生细胞的特征在于EPO的表达和/或产生。

肾EPO产生细胞诱导分化工序中的培养可以通过粘附培养或悬浮培养进行，优选通过悬浮培养进行。

肾EPO产生细胞诱导分化工序中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加GSK3β抑制剂、SHH信号活化剂和HIF抑制剂，进一步地根据需要添加TGFβ抑制剂和/或视黄酸来制备。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

作为GSK-3β抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的GSK-3β抑制剂(CHIR99021等)，优选浓度范围也是同样的。

作为SHH信号活化剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的SHH信号活化剂(SAG、SHH蛋白、嘌吗啡胺等)，优选浓度范围也是同样的。

作为HIF(低氧诱导因子)抑制剂，只要是发挥作为HIF抑制剂功能的物质即可，没有特别限定，可以使用公知的HIF抑制剂，例如可举出N-[[4-羟基-2-氧代-1-(苯甲基)-1,2-二氢-3-喹啉基]羰基]甘氨酸、N-[[1-(2-环丙基乙基)-6-氟-4-羟基-2-氧代-1,2-二氢-3-喹啉基]羰基]甘氨酸、LW6、MK-8617、FG-2216、莫利司他(Molidustat)(BAY85-3934)、KC7F2、罗沙司他(Roxadustat)(FG-4592)和2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol)等。

HIF抑制剂的浓度只要是对肾EPO产生细胞的诱导分化具有效果的浓度即可，例如，0.5μM至100μM、优选为1μM至50μM、进一步优选为5μM至25μM。

作为TGFβ抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的TGFβ抑制剂(SB431542、A83-01、LDN193189等)，优选浓度范围也是同样的。

作为视黄酸，可以是如上述的肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的其衍生物，优选浓度范围也是同样的。

肾EPO产生细胞诱导分化工序的培养天数只要是足以生成肾EPO产生细胞的时间即可，由于长时间培养对肾EPO产生细胞的制造效率没有特别影响，因此没有上限，例如可举出2天及以上、3天及以上、4天及以上、5天及以上。EPO产生细胞诱导分化工序中，培养温度不限于以下，但为约30℃至40℃、优选为约37℃。肾EPO产生细胞诱导分化工序中，培养可在通常的氧浓度(例如15％至25％、优选约20％)下进行，但优选在低氧条件下进行，例如在1％至10％、优选3％至8％、更优选4％至6％，特别优选5％的氧浓度下培养。CO₂浓度优选为约2％至5％。

<肾素产生细胞的制造方法>

本发明的一个方案涉及由肾间质前体细胞制造肾素产生细胞的方法。

即，在本发明的一个方案中，提供一种肾素产生细胞的制造方法，该制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂和TGFβ抑制剂且不含SHH信号活化剂的培养基中培养以制造肾素产生细胞的工序(以下，有时称为肾素产生细胞诱导分化工序)。

优选培养基还包含BMP。

优选培养基还包含VEGF。

优选培养基还包含视黄酸。

优选培养基包含HIF抑制剂。

示例如下的培养基。

包含GSK3β抑制剂和TGFβ含抑制剂、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂和BMP、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂和VEGF、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂和HIF抑制剂、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、BMP和VEGF、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、BMP和HIF抑制剂、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、HIF抑制剂和VEGF、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、BMP、HIF抑制剂和VEGF、不含SHH信号活化剂、且还可包含视黄酸的培养基

肾素产生细胞诱导分化工序中使用的肾间质前体细胞的来源没有特别限定，可以使用任意的肾间质前体细胞，只要是FOXD1阳性细胞即可，但优选使用通过上述肾间质前体细胞的制造方法得到的肾间质前体细胞。

作为肾素产生细胞，可例示系膜细胞和肾小球旁(juxtaglomerular：JG)细胞。这些细胞都产生肾素，但肾小球旁细胞的肾素表达更高。系膜细胞表达GJA5(缝隙连接蛋白α-5(Gap junction alpha-5)和EBF1(EBF转录因子1(transcription factor 1))。肾小球旁细胞表达GJA4(缝隙连接蛋白α-4(Gap junction alpha-4))。

肾素产生细胞诱导分化工序中的培养可以通过粘附培养或悬浮培养进行，优选通过悬浮培养进行。

肾素产生细胞诱导分化工序中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、进一步地根据需要添加BMP、VEGF、HIF抑制剂、视黄酸等来制备。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

作为GSK-3β抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的GSK-3β抑制剂(CHIR99021等)，优选浓度范围也是同样的。

作为TGFβ抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的TGFβ抑制剂(SB431542、A83-01、LDN193189等)，优选浓度范围也是同样的。

作为视黄酸，可以是如上述的肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的其衍生物，优选浓度范围也是同样的。

BMP可举出BMP4、BMP5、BMP7等，但更优选BMP7。BMP优选为人的BMP，作为人BMP7，例如可举出具有NCBI(美国国立生物技术信息中心)的登录号：NP_001710.1的293至431的氨基酸序列的蛋白。需要注意的是，BMP只要具有肾素产生细胞诱导分化活性即可，也包括其片段和功能突变体。BMP可以使用市售产品，也可以使用从细胞纯化的蛋白、通过基因重组产生的蛋白。该工序中使用的BMP的浓度为1ng/mL至500ng/mL、优选为5ng/mL至200ng/mL、更优选为10g/mL至100ng/mL。

VEGF没有特别限制，但优选人的VEGF，作为人VEGF，例如可举出具有NCBI(美国国立生物技术信息中心)的登录号：AAK95847的氨基酸序列的蛋白。需要注意的是，VEGF只要具有肾素产生细胞诱导分化活性即可，也包括其片段和功能突变体。VEGF可以使用市售产品，也可以使用从细胞纯化的蛋白、通过基因重组产生的蛋白。该工序中使用的VEGF的浓度为1ng/mL至500ng/mL、优选10ng/mL至200n g/mL、更优选50ng/mL至150ng/mL。

作为HIF抑制剂，可以使用在上述肾EPO产生细胞诱导分化工序中说明的HIF抑制剂(FG-4592等)，优选浓度范围也是同样的。

肾素产生细胞诱导分化工序的培养天数只要是足以生成肾素产生细胞的时间即可，由于长时间培养对肾素产生细胞的制造效率没有特别影响，因此没有上限，例如可举出2天及以上、3天及以上、4天及以上、5天及以上。肾素产生细胞诱导分化工序中，培养条件不限于以下，但培养温度为约30℃至40℃、优选为约37℃；CO₂浓度优选为约2％至5％。

氧浓度可以为通常的氧浓度(例如为15％至25％、优选为约20％)，但优选低氧浓度(为1％至10％、优选为3％至8％、更优选为4％至6％、特别优选为5％)。在低氧培养条件下，优选培养基包含HIF抑制剂。

以下，作为肾素产生细胞的制造方法的例子，对系膜细胞的制造方法的优选方案进行说明。

<系膜细胞的制造方法>

本发明的一个方案涉及由肾间质前体细胞制造系膜细胞的方法。

即，在一个优选方案中，提供一种系膜细胞的制造方法，该制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、BMP和VEGF且不含SHH信号活化剂的培养基中培养以制造系膜细胞的工序(以下，有时称为系膜细胞诱导分化工序)。

优选培养基还包含视黄酸。

如上所述，系膜细胞诱导分化工序中使用的肾间质前体细胞的来源没有特别限定，可以使用任意的肾间质前体细胞，但优选使用通过上述肾间质前体细胞的制造方法得到的肾间质前体细胞。

另外，系膜细胞诱导分化工序中的培养可以通过粘附培养或悬浮培养进行，优选通过悬浮培养进行。

系膜细胞诱导分化工序中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、BMP、VEGF、进一步地根据需要添加视黄酸来制备。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

GSK-3β抑制剂、TGFβ抑制剂、视黄酸、BMP、VEGF如上所述，优选物质、浓度范围也如上所述。

系膜细胞诱导分化工序的培养天数只要是足以生成系膜细胞的时间即可，由于长时间培养对系膜细胞的制造效率没有特别影响，因此没有上限，例如可举出2天及以上、3天及以上、4天及以上、5天及以上。系膜细胞诱导分化工序中，培养条件不限于以下，但培养温度为约30℃至40℃、优选为约37℃；氧浓度为通常的氧浓度(例如为15％至25％、优选为约20％)或低氧浓度(为1％至10％、优选为3％至8％、更优选为4％至6％、特别优选为5％)；CO₂浓度优选为约2％至5％。

以下，作为肾素产生细胞的制造方法的例子，对肾小球旁细胞的制造方法的优选方案进行说明。

<肾小球旁细胞的制造方法>

本发明的一个方案涉及由肾间质前体细胞制造肾小球旁(juxtaglomerular：JG)细胞的方法。

即，在一个优选方案中，提供一种肾小球旁细胞的制造方法，该制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、HIF抑制剂、BMP和VEGF的培养基中培养以制造肾小球旁细胞的工序(以下，有时称为肾小球旁细胞诱导分化工序)。

优选培养基还包含视黄酸。

如上所述，肾小球旁细胞诱导分化工序中使用的肾间质前体细胞的来源没有特别限定，可以使用任意的肾间质前体细胞，但优选使用通过上述肾间质前体细胞的制造方法得到的肾间质前体细胞。

另外，肾小球旁细胞诱导分化工序中的培养可以通过粘附培养或悬浮培养进行，优选通过悬浮培养进行。

肾小球旁细胞诱导分化工序中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、HIF抑制剂、BMP、VEGF、进一步地根据需要添加视黄酸来制备。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

GSK-3β抑制剂、TGFβ抑制剂、HIF抑制剂、BMP、VEGF、视黄酸如上所述，优选物质、浓度范围也如上所述。

肾小球旁细胞诱导分化工序的培养天数只要是足以生成肾小球旁细胞的时间即可，由于长时间培养对肾小球旁细胞的制造效率没有特别影响，因此没有上限，例如可举出2天及以上、3天及以上、4天及以上、5天及以上。肾小球旁细胞诱导分化工序中，培养温度不限于以下，但为约30℃至40℃、优选为约37℃。肾小球旁细胞诱导分化工序中，培养可在通常的氧浓度下进行，但优选在低氧条件下进行，例如在1％至10％、优选3％至8％、更优选4％至6％，特别优选5％的氧浓度下培养。CO₂浓度优选为约2％至5％。

<将多能干细胞诱导分化成HOXC10阳性细胞>

在本发明的一个实施方案中，上述HOXC10阳性细胞是诱导多能干细胞得到的HOXC10阳性细胞。通过使用诱导多能干细胞得到的HOXC10阳性细胞，可以由多能干细胞得到肾间质前体细胞、进一步地肾EPO产生细胞、肾素产生细胞(系膜细胞、肾小球旁细胞等)。

多能干细胞是指具有能够分化出生物体中存在的多种细胞的多能性、且同时具有増殖能力的干细胞，包括诱导出肾间质前体细胞和肾促红细胞生成素产生细胞、肾素产生细胞的任意细胞。多能干细胞没有特别限定，例如包括胚胎干细胞(ES细胞)、通过核移植得到的克隆胚来源的核移植ES细胞(ntES细胞)、生殖干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)、培养成纤维细胞、骨髓干细胞来源的多能性细胞(Muse细胞)等。从在制造工序中不会破坏胚、卵子等且能够获得的观点出发，优选多能干细胞为iPS细胞。

iPS细胞的制造方法是本领域公知的，可以通过向任意的体细胞导入初始化因子来制造。这里，初始化因子是指例如可例示Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-联蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物，这些初始化因子可以单独使用，也可以组合使用。作为初始化因子的组合，例示了WO 2007/069666、WO 2008/118820、WO2009/007852、WO 2009/032194、WO 2009/058413、WO 2009/057831、WO 2009/075119、WO2009/079007、WO 2009/091659、WO 2009/101084、WO 2009/101407、WO 2009/102983、WO2009/114949、WO 2009/117439、WO 2009/126250、WO 2009/126251、WO 2009/126655、WO2009/157593、WO 2010/009015、WO 2010/033906、WO 2010/033920、WO 2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO 2010/068955、WO 2010/098419、WO 2010/102267、WO2010/111409、WO 2010/111422、WO 2010/115050、WO 2010/124290、WO 2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D，等人(2008)，Nat.Biotechnol.，26：795-797、Shi Y，等人(2008)，Cell Stem Cell，2：525-528、Eminli S，等人(2008)，Stem Cells.26：2467-2474、HuangfuD，等人(2008)，Nat.Biotechnol.26：1269-1275、Shi Y，等人(2008)，Cell Stem Cell，3，568-574、Zhao Y，等人(2008)，Cell Stem Cell，3：475-479、Marson A，(2008)，Cell StemCell，3，132-135、Feng B，等人(2009)，Nat.Cell Biol.11：197-203、R.L.Judson等人(2009)，Nat.Biotechnol.，27：459-461、Lyssiotis CA，等人(2009)，Proc Natl Acad SciUSA.106：8912-8917、Kim JB，等人(2009)，Nature.461：649-643、Ichida JK，等人(2009)，Cell Stem Cell.5：491-503、Heng JC，等人(2010)，Cell Stem Cell.6：167-74、Han J，等人(2010)，Nature.463：1096-100、Mali P，等人(2010)，Stem Cells.28：713-720、MaekawaM，等人(2011)，Nature.474：225-9.中记载的组合。

体细胞非限定地包括胎儿(幼崽)的体细胞、新生儿(幼崽)的体细胞和成熟的健康或疾病性的体细胞中的任一种，此外，还包括初代培养细胞、继代细胞和株系细胞中的任一种。具体地，体细胞可例示例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)，(2)组织前体细胞，(3)血液细胞(外周血细胞、脐带血细胞等)、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞(胰外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞及脂肪细胞等已分化的细胞等。

另外，在将iPS细胞用作移植用细胞的材料的情况下，从不发生排斥反应的观点出发，优选使用与移植目标的个体的HLA基因型相同或实质上相同的体细胞。这里，“实质上相同”是指，HLA基因型一致到能够利用免疫抑制剂抑制对移植的细胞的免疫反应的程度，例如是具有HLA-A、HLA-B和HLA-DR这3个基因座或加上HLA-C这4个基因座一致的HLA型的体细胞。

在将多能干细胞诱导分化成HOXC10阳性细胞时，例如可以使用包括以下工序的方法。

(i)将多能干细胞在包含bFGF、BMP(骨形成蛋白)4、GSK-3β抑制剂和视黄酸的培养基中培养的工序；

(ii)将工序(i)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂和BMP7的培养基中培养的工序；

(iii)将工序(ii)中得到的细胞在包含GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中培养的工序；以及

(iv)将工序(iii)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂、激活素和ROCK抑制剂的培养基中培养的工序需要注意的是，在工序(iv)的中途或结束时，可以冷冻保存细胞，解冻后可用于肾间质前体细胞等的诱导分化。

以下进一步对各工序进行说明。

(i)将多能干细胞在包含bFGF、BMP4、GSK-3β抑制剂和视黄酸或其衍生物的培养基 中培养的工序在工序(i)中，通过本领域公知的任意方法分离多能干细胞，优选通过粘附培养进行培养。

作为分离多能干细胞的方法，例如可举出力学分离、使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的分离溶液(例如可举出Accutase(TM)和Accumax(TM)(Innovative CellTechnologies，Inc)或仅具有胶原酶活性的分离溶液的分离。也可以是TrypLE选择酶(TrypLE Select Enzyme)(Thermo Fisher Scientific)和EDTA/PBS的混合液。作为工序(i)中使用的人多能干细胞，优选使用培养至相对于使用的培养皿70％至80％汇合的菌落。

工序(i)中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加bFGF、BMP4、GSK-3β抑制剂和视黄酸或其衍生物来制备。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

作为工序(i)中使用的GSK-3β抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的GSK-3β抑制剂(CHIR99021等)，浓度范围也可以在同样的范围内调整。

工序(i)中使用的bFGF(碱性FGF)优选为人bFGF，作为人bFGF，例如可举出具有NCBI(美国国立生物技术信息中心)的登录号：ABO43041.1的氨基酸序列的蛋白。bFGF只要具有诱导分化活性即可，包括其片段和功能突变体的bFGF可以使用市售产品，也可以使用从细胞纯化的蛋白、通过基因重组产生的蛋白。该工序中使用的bFGF的浓度为1ng/mL至1000ng/mL、优选为10ng/mL至500ng/mL、更优选为50ng/mL至250ng/mL。

工序(i)中使用的BMP4优选为人BMP4，作为人BMP4例如可举出具有NCBI(美国国立生物技术信息中心)的登录号：AAH20546.1的氨基酸序列的蛋白。BMP4只要具有诱导分化活性即可，包括其片段和功能突变体的BMP4可以使用市售产品，也可以使用从细胞纯化的蛋白、通过基因重组产生的蛋白。该工序中使用的BMP4的浓度为0.1ng/mL至100ng/mL、优选为0.5ng/mL至50ng/mL、更优选为0.5ng/mL至5ng/mL。

工序(i)中使用的视黄酸可以是如上述的肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的其衍生物，优选的浓度范围为1nM至50nM。

工序(i)中，培养条件不限于以下，但培养温度为约30℃至40℃、优选为约37℃；氧浓度为通常的氧浓度(例如为15％至25％、优选为约20％)；CO₂浓度优选为约2％至5％。工序(i)的培养时间例如为1至2天的培养，优选为1天。

(ii)将工序(i)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂和BMP7的培养基中培养 的工序

工序(ii)中，可以分离前述工序(i)中得到的细胞群，在另外准备的经涂覆处理的培养皿中进行粘附培养，也可以将工序(i)中通过粘附培养得到的细胞直接通过交换培养基继续培养。

工序(ii)中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加bFGF、GSK-3β抑制剂和BMP7来制备。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

工序(ii)中使用的bFGF与工序(i)中说明的同样，其优选浓度范围也是同样的。

作为工序(ii)中使用的GSK-3β抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的GSK-3β抑制剂(CHIR99021等)，浓度范围也可以在同样的范围内调整。

工序(ii)中使用的BMP7优选为人BMP7，作为人BMP7，例如可举出具有NCBI(美国国立生物技术信息中心)的登录号：NM_001719.2的氨基酸序列的蛋白。BMP7只要具有诱导分化活性即可，包括其片段和功能突变体的BMP7可以使用市售产品，也可以使用从细胞纯化的蛋白、通过基因重组产生的蛋白。该工序中使用的BMP7的浓度为0.1ng/mL至100ng/mL、优选为0.5ng/mL至50ng/mL、更优选为0.5ng/mL至5ng/mL。

工序(ii)中，培养条件不限于以下，但培养温度为约30℃至40℃、优选为约37℃；氧浓度为通常的氧浓度(例如为15％至25％、优选为约20％)；CO₂浓度优选为约2％至5％。工序(ii)的培养时间例如为10小时至2天、或1至2天、优选为0.5至1天。

(iii)将工序(ii)中得到的细胞在包含GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中培 养的工序

工序(iii)中，可以分离前述工序(ii)中得到的细胞群，在另外准备的经涂覆处理的培养皿中进行粘附培养，也可以将工序(ii)中通过粘附培养得到的细胞直接通过交换培养基继续培养。

工序(iii)中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂来制备。培养基中还可以包含BMP7。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

作为工序(iii)中使用的GSK-3β抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的GSK-3β抑制剂(CHIR99021等)，浓度范围也可以在同样的范围内调整。另外，在添加BMP7的情况下，BMP7是与工序(ii)同样的，其优选浓度范围也是同样的。

作为工序(iii)中使用的TGFβ抑制剂，可以使用一种或两种以上在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的TGFβ抑制剂(SB431542、A83-01、LDN193189等)，优选浓度范围也如上述中说明。

工序(iii)中，培养条件不限于以下，但培养温度为约30℃至40℃、优选为约37℃；氧浓度为通常的氧浓度(例如为15％至25％、优选为约20％)；CO₂浓度优选为约2％至5％。工序(iii)的培养时间例如为0.5至3天的培养，优选为1天。

(iv)将工序(iii)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂、激活素和ROCK抑制剂 的培养基中培养的工序通过该工序，诱导出HOXC10阳性的后部原条细胞(后肾谱系晚期原条)。需要注意的是，在工序(iv)的中途或结束时，可以冷冻保存细胞，解冻后可用于肾间质前体细胞等的诱导分化。

工序(iv)中，可以分离前述工序(iii)中得到的细胞群，在另外准备的经涂覆处理的培养皿中进行粘附培养，也可以将工序(iii)中通过粘附培养得到的细胞直接通过交换培养基继续培养。

工序(iv)中使用的培养基可以通过向在动物细胞的培养中使用的基础培养基中添加bFGF、GSK-3β抑制剂、激活素和ROCK抑制剂来制备。作为基础培养基，可举出肾间质前体细胞诱导分化工序中例示的培养基。

工序(iv)中使用的GSK-3β抑制剂，可以使用在上述肾间质前体细胞诱导分化工序中说明的GSK-3β抑制剂(CHIR99021等)，浓度范围也可以在同样的范围内调整。bFGF是与工序(i)同样的，其优选浓度范围也是同样的。

工序(iv)中使用的激活素包括人和其他动物来源的激活素以及它们的功能突变体，可以使用例如R&D systems公司等的市售产品。工序(iv)中使用的激活素的浓度为1ng/mL至100ng/mL、优选为5ng/mL至50ng/mL、更优选为5ng/mL至25ng/mL。

工序(iv)中使用的ROCK抑制剂，只要能够抑制Rho-激酶(ROCK)的功能就没有特别限定，例如可举出Y-27632(例如参照Ishizaki等人，Mol.Pharmacol.57，976-983(2000)；Narumiya等人，Methods Enzymol.325，273-284(2000))、Fasudil/HA1077(例如参照Uenata等人，Nature 389：990-994(1997))、H-1152(例如参照Sasaki等人，Pharmacol.Ther.93：225-232(2002))、Wf-536(例如参照Nakajima等人，Cancer Chemother Pharmacol.52(4)：319-324(2003))及它们的衍生物、以及针对ROCK的反义核酸、RNA干扰诱导性核酸(例如，siRNA)、显性负性突变体、以及它们的表达载体。另外，作为ROCK抑制剂，也可以使用其他公知的低分子化合物(例如参照，美国专利申请公开第2005/0209261号、美国专利申请公开第2005/0192304号、美国专利申请公开第2004/0014755号、美国专利申请公开第2004/0002508号、美国专利申请公开第2004/0002507号、美国专利申请公开第2003/0125344号、美国专利申请公开第2003/0087919号、以及国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。可以使用一种或两种以上ROCK抑制剂。作为优选的ROCK抑制剂，可举出Y-27632。本领域技术人员可以根据使用的ROCK抑制剂适当选择工序(iv)中使用的ROCK抑制剂的浓度，例如为0.1μM至100μM、优选为1μM至75μM、进一步优选为5μM至50μM。

工序(iv)中，培养条件不限于以下，但培养温度为约30℃至40℃、优选为约37℃；氧浓度为通常的氧浓度(例如为15％至25％、优选为约20％)；CO₂浓度优选为约2％至5％。工序(iv)的培养时间只要是足以诱导分化HOXC10阳性的后部原条细胞的时间即可，例如为1至5天的培养、优选为3天。

<包含肾间质前体细胞等的药物组合物>

本发明还提供了一种细胞制剂，其包含通过上述方法得到的肾间质前体细胞、肾EPO产生细胞、肾素产生细胞(系膜细胞、肾小球旁细胞等)或它们的多个组合。这样的细胞制剂可以用作治疗肾病等的药物组合物。

另外，可以通过将肾间质前体细胞与专利文献2中公开的肾单位前体细胞(OSR1阳性细胞，优选进一步HOXD11、WT1、SIX2和SALL1阳性细胞)混合提供一种能够重构肾组织的细胞制剂。肾间质前体细胞和肾单位前体细胞的比例优选为1:2至2:1的范围、更优选为约1:1。这样的细胞制剂还可以包含肾EPO产生细胞、肾素产生细胞(系膜细胞、肾小球旁细胞等)。

肾间质前体细胞和肾单位前体细胞混合后，可以形成肾脏类器官。

例如，可以通过对通过上述方法得到的肾间质前体细胞和肾单位前体细胞进行培养来制作细胞块、将其与3T3-Wnt4细胞等饲养细胞、小鼠胎幼崽脊髄细胞或小鼠胎幼崽肾细胞共培养、或通过使用包含GSK-3β抑制剂的基础培养基的半气相培养得到。

作为对需要治疗的患者给药细胞制剂的方法，例如可举出：将细胞制成片状，贴附于患者肾脏的方法；使细胞悬浮于生理盐水等而得到的细胞悬浮液、或者三维培养，将得到的细胞块直接移植至患者肾脏的方法；在由基质胶等构成的支架上进行三维培养，移植得到的细胞块的方法等。移植部位只要是在肾脏内就没有特别限定，优选在肾被膜下。作为肾病，可例示急性肾损伤、慢性肾功能衰竭、未导致慢性肾功能衰竭的慢性肾病。

细胞制剂中包含的肾间质前体细胞等的细胞数量，只要移植片在给药后能够植活就没有特别限定，也可以根据患部大小、躯体大小适当增减来制备。

通过上述方法得到的肾间质前体细胞、肾EPO产生细胞、肾素产生细胞(系膜细胞、肾小球旁细胞等)也可以用于肾病、高血压等治疗药物的候选物质的清洁、评价。

【实施例】

以下，基于实施例具体地对本发明进行说明，但本发明不受以下方案的限定。

<后期原条(PPS)诱导>

首先将人iPS细胞(hiPSC)(17K6：OSR1-GFP/FOXD1-tdTomato double knock-inhiPSC)用TrypLE选择酶(TrypLE Select Enzyme)(Thermo Fisher Scientific)和0.5mMEDTA/PBS的1:1混合液进行5分钟酶处理，用PBS(-)清洗。之后，用细胞刮取器剥离，温和地移液使其解离成单细胞，在分化开始前1天以1.3×10⁴个细胞/cm²的密度与添加了10μMY-27632和2.4μL/mL iMatrix-511(Matrixome)的0.5mL Stem Fit AK02N(味之素健康供应)一起接种至24孔板(康宁)。24小时后(第0天)、向由DMEM/F12 Glutamax(Thermo FisherScientific)、去除维生素A的B27添加剂(B27 supplement minus vitamin A)(ThermoFisher Scientific)、0.5×青霉素/链霉素组成的无血清分化培养基(以下，称为基础培养基)中添加5μM CHIR99021(Wako)、10nM RA(Sigma)、1ng/mL BMP4(Peprotech)和100ng/mLbFGF(Wako)，并开始培养。再过24小时(第1天)，在包含5μM CHIR99021、100ng/mL bFGF和1ng/mL BMP7(R&D Systems)的基础培养基中培养。第2天，将培养基替换成包含5μMCHIR99021、1ng/mL BMP7和10μM A83-01(Wako)的基础培养基。第3天，将培养基替换成包含5μM CHIR99021、30ng/mL bFGF、10ng/mL激活素A(R&DSystems)和30μM Y-27632(Wako)的基础培养基。第4天，用PBS(-)清洗细胞，并用Accumax(Innovative Cell Technologies)进行处理，温和地移液使其解离成单细胞，以1.05×10⁵个细胞/cm²的密度接种至24孔板(康宁)(2D培养)或者以2.0×10⁴个细胞/cm²的密度接种至96孔低细胞附着板(Thermo FisherScientific)(3D培养)。培养基使用包含5μM CHIR99021、30ng/mL bFGF、10ng/mL激活素A、30μM Y-27632的基础培养基(2D培养时还包含1.2μL/孔iMatrix-511或laminin-E8片段库)，培养48小时。由此，诱导出HOXC10和CITED1阳性的PPS细胞。

将人iPS细胞诱导分化得到的PPS细胞的免疫组织染色的结果示于图2。

<肾间质前体(IPC)细胞的诱导>

针对图1的培养方案的第6天的PPS细胞，组合各种因子测试若干诱导分化条件。其结果是，将GSK-3β抑制剂CHIR99021、ALK抑制剂SB431542、视黄酸(RA)组合并进行5天的处理，能够诱导出FOXD1阳性细胞(图3)。用RNA-seq比较诱导得到的IPC细胞和PPS细胞，在第11天的IPC细胞中，IPC标记基因的表达上升，原条标记基因下调。

图1的诱导分化方案中，将IPC诱导分化条件设为CHIR99021+SB431542+RA，在第4至11天通过悬浮(3D)培养进行培养，发现与粘附(2D)培养相比，FOXD1阳性细胞的诱导效率更高(图4)。

在第6至8天添加作为音猬因子路径的活化物质的平滑(Smoothened)(SMO)激动剂(SAG)，发现FOXD1阳性细胞的诱导效率进一步提高(图5)。

IPA分析(QIAGEN公司)结果表明WNT/Ca²⁺路径、雌激素受体信号、肝纤维化、IL-1信号表达上升。因此，进行分别在第6至8天、第8至11天添加WNT3a和RSPO1、β-雌二醇(β-Estradiol)、TGFβ1、IL-1β的试验，可以确认第6至8天，通过添加IL-1β和SAG，OSR1阳性FOXD1阳性细胞的诱导效率提高(图6)。

另外，通过在第6至11天使用各种ALK抑制剂替代SB431542，确认同样也能诱导出IPC标记(图7)。

<IPC和NPC的移植>

根据专利文献2中记载的方法，将iPS细胞诱导分化成肾单位前体细胞(NPC)。

将上述得到的诱导分化第11天的IPC和NPC聚集块用Accumax(Innovative CellTechnologies)在37℃下孵育5分钟，通过温和地移液使其解离成单细胞。将解离的细胞混合，再悬浮于包含10μM Y-27632、10ng/mL bFGF、1μM CHIR99021和0.1μM RA的基础培养基中，以5.0×10⁴NPC/孔和5.0×10⁴IPC/孔的密度接种至96孔低细胞结合U底板并形成聚集体。24小时后，采集混合肾前体细胞聚集体进行移植。

将混合肾前体细胞聚集体移植至免疫缺陷小鼠(NSG小鼠)肾被膜下后，插入20μL的基质胶，解除张力，确保聚集体的空间。

移植10天后，通过免疫染色分析进行分析，显示包含NPHS1(+)足细胞的hiPSC来源的肾小球与小鼠血管整合，并且还包含HOPX(+)系膜样结构(图8)。

<将IPC进一步进行诱导分化>

接着，研究诱导得到的IPC能否在体外分化成肾素产生细胞、肾EPO产生细胞。

首先，使用第11天的IPC，在包含FG-4592(N-[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-3-异喹啉基)羰基]-甘氨酸(N-[(4-hydroxy-1-methyl-7-phenoxy-3-isoquinolinyl)carbonyl]-glycine)和RA的5％O₂低氧条件下添加各种因子进行培养，通过测定EPO和肾素的表达，进行肾素产生细胞、肾EPO产生细胞的诱导因子的筛选。

结果发现，CHIR99021和SB431542的组合在不存在SAG的情况下提高了肾素的表达，SB431542和SAG的组合提高了EPO的表达(图9)。

进一步研究BMP的参与。通过向包含CHIR99021、FG-4592、RA(CFR)的培养基中添加各因子并进行评价，其结果是，BMP7对肾素的表达在不存在SAG的情况下产生正的影响、A83-01和SAG的组合产生比SB431542和SAG的组合更高的EPO表达(图10)。

另外，对向包含CHIR99021、FG-4592、RA(CFR)的培养基中添加或不添加SB431542而加入BMP4、BMP5、BMP7的情况的效果进行了验证，结果发现在SB431542存在下三种BMP都使肾素高表达(图11)。

另外，用包含BMP7和SB431542的CFR培养基(CFR+B7+SB培养基)处理96小时后，确认GATA3、肾素、GJA5的表达上升、FOXD1的表达下降(图12)。

接着，在20％氧浓度的从CFR+B7+SB培养基中除去FG-4592的常氧浓度条件下进行诱导分化试验。其结果是，作为系膜发育后期的重要标记的EBF1的表达增强。另一方面，在使用5％O₂的CFR+B7+SB培养基的低氧条件下，肾素的表达被显著诱导(图13)。

进一步验证了VEGF的效果。结果发现，VEGF的添加增强了肾小球旁(JG)细胞和系膜细胞的标记表达，但其效果被阿西替尼(Axitinib)(VEGF受体抑制剂)减弱(图14)。

接着，研究各种SHH信号调节剂在将IPC诱导分化成EPO产生细胞的系统中的效果(图15)。进行若干SMO拮抗剂(索尼德吉、维莫德吉和SANT-1)和激动剂(SAG和Purmophamine)、GLI1抑制剂(GANT61)和人SHH蛋白的试验，结果发现，尽管SMO激动剂和人SHH蛋白均上调EPO，但单独使用人SHH蛋白产生最高表达，所有SMO拮抗剂均减弱SAG的效果，而GLI1抑制剂不减弱SAG的效果。

qRT-PCR结果确认EPO表达在约96小时达到峰值，通过免疫染色分析，EPO阳性细胞生成。这些结果表明，我们诱导得到的IPC通过SHH活化分化成EPO产生细胞。

如上所述，成功地开发了将hiPSC来源的IPC分别诱导成系膜细胞、JG细胞以及肾EPO产生细胞的诱导系统。优选分化方案示于图16。

Claims (20)

1.一种肾间质前体细胞的制造方法，所述制造方法包括：将HOXC10阳性细胞在包含GSK(糖原合成酶激酶)-3β抑制剂、SHH(音猬因子(Sonic Hedgehog))信号活化剂和TGF(转化生长因子(Transforming growth factor))β抑制剂的培养基中培养以诱导成肾间质前体细胞的工序。

2.根据权利要求1所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含IL(白介素(Interleukin))-1β。

3.根据权利要求2所述的肾间质前体细胞的制造方法，所述制造方法包括下述工序1)、工序2)：

1)将HOXC10阳性细胞在包含GSK-3β抑制剂、SHH信号活化剂、TGFβ抑制剂和IL-1β的培养基中培养的工序；接着

2)在包含GSK-3β抑制剂、SHH信号活化剂和TGFβ抑制剂的培养基中培养的工序。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含视黄酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，所述培养通过悬浮培养进行。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，GSK-3β抑制剂为CHIR99021，SHH信号活化剂为SHH蛋白、嘌吗啡胺或SAG(平滑激动剂(SmoothenedAgonist))，TGFβ抑制剂为SB431542、A83-01或LDN193189。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的肾间质前体细胞的制造方法，其中，HOXC10阳性细胞为将多能干细胞诱导分化得到的HOXC10阳性细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述HOXC10阳性细胞为通过包括以下工序(i)至工序(iv)的方法制造的HOXC10阳性细胞：

(i)将多能干细胞在包含bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、BMP(骨形成蛋白)4、GSK-3β抑制剂和视黄酸或其衍生物的培养基中培养的工序；

(ii)将工序(i)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂和BMP7的培养基中培养的工序；

(iii)将工序(ii)中得到的细胞在包含GSK-3β抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中培养的工序；以及

(iv)将工序(iii)中得到的细胞在包含bFGF、GSK-3β抑制剂、激活素和ROCK抑制剂的培养基中培养的工序。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞(iPS细胞)。

10.一种肾间质前体细胞，所述肾间质前体细胞通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法制造。

11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求10所述的肾间质前体细胞。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，所述药物组合物还包含肾单位前体细胞。

13.一种肾EPO产生细胞的制造方法，所述制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂、SHH信号活化剂和HIF(低氧诱导因子)抑制剂的培养基中培养以制造肾EPO(促红细胞生成素)产生细胞的工序。

14.根据权利要求13所述的肾EPO产生细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含TGFβ抑制剂和/或视黄酸。

15.根据权利要求13或14所述的肾EPO产生细胞的制造方法，其中，肾间质前体细胞是通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法得到的肾间质前体细胞。

16.一种肾素产生细胞的制造方法，所述制造方法包括：将肾间质前体细胞在包含GSK3β抑制剂和TGFβ抑制剂且不含SHH信号活化剂的培养基中培养以制造肾素产生细胞的工序。

17.根据权利要求16所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，肾素产生细胞是系膜细胞或肾小球旁细胞。

18.根据权利要求16或17所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含BMP、VEGF(血管内皮细胞生长因子)和/或视黄酸。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，所述培养基还包含HIF抑制剂。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的肾素产生细胞的制造方法，其中，肾间质前体细胞是通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法得到的肾间质前体细胞。