CN117658811B - 从卷柏中分离纯化活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了卷柏中多种活性成分的分离纯化方法，这些成分具有一定的抗肿瘤活性，为进一步对其进行研究提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域。
背景技术
卷柏(Selaginella tamariscina(P.Beauv.)Spring)，是卷柏科卷柏属土生或石生蕨类植物。根多分叉，密被毛，和茎及分枝密集形成树状的主干；小枝稀疏且规则，分枝无毛，背腹扁；叶片交互排列，叶质厚，光滑，边缘具白边，绿色或棕色，边缘有细齿；大孢子浅黄色，小孢子桔黄色；花期7-9月；果期9-10月。卷柏因其茎叶似柏树的幼枝叶，而且枝叶内卷得名。
卷柏原产中国，喜温暖、湿润和半阴环境，多生于向阳的山坡岩石上，或干旱的岩石缝中。卷柏的繁殖方式为孢子繁殖。
《本草求真》中记载，卷柏具有活血通经、化瘀止血的功效，可用于治疗经闭痛经、癥瘕痞块、吐血、崩漏、便血、脱肛等疾病。卷柏的枝叶舒展、翠绿可人，室内微型盆景，四季常绿，形如高山劲松，用于假山、大型盆景栽培点缀，具有较高的观赏价值。卷柏拥有长达4亿年的演化历史，是迄今为止陆地植物中最为古老的类群。
发明内容
本发明提供了从卷柏中分离纯化活性成分的方法，包括如下内容：
(1)卷柏70～80％乙醇-水溶液，提取，浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏；用水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，各有机溶剂萃取层，减压回收溶剂得浸膏；
(2)取乙酸乙酯浸膏，通过HP20大孔吸附树脂进行分离，以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液为洗脱溶剂洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，浓缩得到5个流份Fr.1→Fr.5；取Fr.3流份通过硅胶柱色谱依次以二氯甲烷-甲醇100:0、50:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1:1v/v进行梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，得到7个流份Fr.3-1→Fr.3-7，其中Fr.3-5流份通过p-HPLC以65％甲醇-水洗脱得到化合物2；
所述化合物结构式如下：
进一步地，卷柏提取使用75％乙醇-水溶液。
进一步地，还包括化合物1、3、4、5的分离纯化方法：
(3)取二氯甲烷层浸膏，采用HP20大孔吸附树脂进行分离，流动相为甲醇-水溶液，依次以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液梯度洗脱；
(4)取60％甲醇-水溶液洗脱部位，通过聚酰胺柱色谱，依次以二氯甲烷-甲醇100:0、50:1、10:1、5:1、2:1、1:1v/v进行梯度洗脱；取二氯甲烷-甲醇10:1的洗脱部位，通过p-HPLC以50％甲醇-水等度洗脱，得到化合物5；
(5)取80％甲醇-水溶液洗脱部位，通过硅胶柱色谱，依次以二氯甲烷-甲醇100:0、100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、5:1、2:1、2:3v/v作为流动相洗脱，取8:1的洗脱部位，通过p-HPLC以70％甲醇水等度洗脱，依次得到化合物1、3、4；
所述化合物结构式如下：
本发明还提供了如下方法制备的提取物A在制备抗癌药物中的应用；方法包括如下内容：
卷柏70～80％乙醇-水溶液，提取，浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏；用水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，各有机溶剂萃取层，减压回收溶剂得浸膏，取乙酸乙酯层即得提取物A。
本发明还提供了如下方法制备的提取物B在制备抗癌药物中的应用；方法包括如下内容：
(1)卷柏70～80％乙醇-水溶液，提取，浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏；用水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，各有机溶剂萃取层，减压回收溶剂得浸膏；
(2)取乙酸乙酯浸膏，通过HP20大孔吸附树脂进行分离，以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液为洗脱溶剂洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，浓缩得到5个流份Fr.1→Fr.5；取Fr.3流份即得提取物B。
本发明还提供了如下方法制备的提取物C在制备抗癌药物中的应用；方法包括如下内容：
(1)卷柏70～80％乙醇-水溶液，提取，浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏；用水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，各有机溶剂萃取层，减压回收溶剂得浸膏；
(2)取乙酸乙酯浸膏，通过HP20大孔吸附树脂进行分离，以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液为洗脱溶剂洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，浓缩得到5个流份Fr.1→Fr.5；取Fr.3流份通过硅胶柱色谱依次以二氯甲烷-甲醇100:0、50:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1:1v/v进行梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，得到7个流份Fr.3-1→Fr.3-7，其中Fr.3-5流份即为提取物C。
进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
本发明研究发现：
(1)化合物1-3为新化合物，化合物4、5为新构型，且这些化合物都具有良好的抗癌活性。本发明提供了这些化合物的提取分离方法，为进一步对其进行研究提供了可能。
(2)三阴性乳腺癌是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌。这类乳腺癌占所有乳腺癌病理类型的10.0％～20.8％，具有特殊的生物学行为和临床病理特征，预后较其他类型差，被称为“乳腺癌之王”。根据实验发现，本发明药物能够有效抑制该类癌细胞的生长。
附图说明
图1化合物1的HMBC(→)谱
图2化合物2的HMBC(→)谱
图3化合物3的HMBC(→)谱
图4化合物4的HMBC(→)谱
图5化合物5的HMBC(→)谱
具体实施方式
实施例1
卷柏干燥全草13.0kg，采用闪式提取器，以75％乙醇-水溶液12:1的液料比进行提取，提取3次，每次2min，经旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏(1.2kg)，用水混悬，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，取各个馏分提取物。减压回收溶剂得石油醚层(80.5g)、二氯甲烷层(160.0g)、乙酸乙酯层(180.5g)。
取二氯甲烷层浸膏160.0g，采用HP20大孔吸附树脂进行分离，流动相为甲醇-水，以50％、60％、70％、80％、90％梯度洗脱，每个流动相7个BV，合并浓缩液得到五个流份(D1→D5，该处表示“依次为D1、D2、D3、D4、D5”，后续类似表达同此释义)。
D2通过聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇(100:0、50:1、10:1、5:1、2:1、1:1,v/v)进行梯度洗脱依次得到6个流份。取二氯甲烷-甲醇10:1的洗脱部位，通过p-HPLC以50％甲醇-水等度洗脱，得到化合物5(3.0mg，tR＝21.9min)；取80％甲醇-水溶液洗脱部位，通过硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇100:0、100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、5:1、2:1、2:3v/v作为流动相得到10个流份(Fr.1→Fr.10)。其中Fr.7流份通过p-HPLC以70％甲醇水等度洗脱，依次得到化合物1(7.2mg，tR＝23.4min)、化合物3(6.4mg，tR＝33.6min)、化合物4(5.2mg，tR＝38.2min)。
取乙酸乙酯浸膏178.0g，通过HP20大孔吸附树脂进行初步分离，以50％、60％、70％、80％、90％梯度的甲醇-水为洗脱溶剂，梯度洗脱，每个梯度7个BV，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，浓缩得到5个流份(Fr.1→Fr.5)。Fr.3流份通过硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇(100:0、50:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1:1)为溶剂系统进行梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，得到7个流份Fr.3-1→Fr.3-7，其中Fr.3-5流份通过p-HPLC以65％甲醇水为洗脱条件得到化合物2(4.6mg，tR＝26.5min)。
化合物1
化合物1为红色无定形粉末(MeOH)，HR-ESI-MS谱给出准分子离子峰为m/z527.1877[M+H]+,提示分子量为526，分子式为C35H26O5，不饱和度为23。UV光谱267,299和431nm处有最大吸收。1H-NMR谱数据(表1)表明，δH 7.73(1H,d,J＝8.1Hz)和7.37(1H,d,J＝8.1Hz)为芳香环上的AB自旋系统。由δH 7.08和6.78(each 2H,d,J＝8.8Hz)、δH 6.83和6.53(each 2H,d,J＝8.5Hz)、δH 7.16和6.48(each 4H,d,J＝9.1Hz)为四个对位取代的自旋偶合系统，它们分别为B环、E环和对称取代的C环和D环上的质子信号。此外，1H-NMR谱提示存在一个羟甲基δH4.94(2H,s)，一个甲氧基δH 3.75(3H,s)氢信号。13C-NMR谱显示有35个碳信号，包括一个羧基碳(δC 177.5)、两个炔基碳(δC 98.6,83.7)、一个含氧亚甲基碳(δC62.0)、一个甲氧基碳(δC 54.3)和30个芳香碳信号。
通过HMBC谱对化合物1的结构进行了进一步确认，H-28/32(δH 7.08)和C-27(δC98.6)之间有相关提示炔基(δC 98.6,83.7)连接到B环。H-20/24(δH 6.83)和C-18(δC142.1)之间的相关说明E环连接到A环中的C-18，羟甲基连接在C-15上。H-3、H-5/C-7和H-8、H-12/C-7有相关，提示C环和D环之间的连接位于C-7(δC 166.7)。
因此，A环中的C-19连接C-7。此外，δH 3.75和C-30(δC 160.0)处的甲氧基质子信号相关，表明甲氧基与C-30相连。除了C-30位多了甲氧基信号[δH 3.75(3H,s)和δC 54.3]外，化合物1的1H-NMR和13C-NMR的数据与报道的Selaginellin(8)相似。
综上所述，化合物1为未见文献报道的新化合物，命名为Selariscinin H。
化合物2
化合物2为红色无定形粉末。根据高分辨质谱给出准分子离子峰m/z555.1810[M+H]+，推导其分子式为C36H26O6，不饱和度为24。UV光谱在265、300和425nm处显示出最大吸收，这是卷柏中炔酚的特征吸收。
化合物2的1H-NMR和13C-NMR谱显示出与Selaginellin(8)相似的结构特征，除了在34位羟甲基处多一个乙酰基[δH 2.14(3H,s),δC 19.4,δC 171.2]，其余数据基本一致。在HMBC谱中，观察到δH 2.14(H-36)和δC 171.2(C-35)，δH 5.43(H-34)和δC171.2(C-35)之间存在相关，进一步表明C-15处的-CH2OH被-CH2OOCCH3取代。
综上所述，化合物2为未见文献报道的新化合物，命名为Selariscinin I。
化合物3
化合物3是一种红色无定形粉末(MeOH)。在HR-ESI-MS中，在m/z 541.1676[M+H]+处显示出准分子离子峰，表明分子式为C35H24O6，并表明不饱和度为24。紫外光谱在265，292和431nm处显示出最大吸收。化合物3的1H-NMR和13C-NMR谱也显示出与化合物1相似的特征，甲氧基碳信号在δH 3.75处消失，在δH 5.92(2H,s)和δC 101.4处出现一个亚甲二氧基。Labat反应阳性，进一步说明结构中含有亚甲二氧基结构。
在HMBC谱中，亚甲基二氧基的典型1H-NMR信号(δH 5.92)分别与[δC 148.4(C-30)和δC 147.5(C-31)]的13C-NMR信号相关，表明亚甲基二氧基位于C-30和C-31处。综上所述，化合物为未见文献报道的新化合物，化合物3命名为Selariscinin J.
化合物4
化合物5
化合物4和化合物5均为红色无定形粉末。化合物4和5的1H-NMR和13C-NMR数据与(S)-selaginellin U和(S)-selaginellin V的结构相似，只是C-环和D-环的对称取代基位置存在一些差异。说明化合物4和5是(S)-selaginellin U和(S)-selaginellin V通过(R)和(S)形式互变异构合成的衍生物。
化合物4和5的绝对构型是通过旋光和CD的Cotton Effect(CE)来确定的。在CD光谱中，206和214nm处显示出+CE，在210和220nm处显示出-CE。化合物4和5的绝对构型为(R)，与文献报道的(S)构型相反(在206和214nm处产生-CE，在210和220nm处产生+CE)
表1化合物1-3 1H NMR(600MHz)、13C NMR(150MHz)
表2化合物4、5的1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)
实施例2中药卷柏体外抗肿瘤活性筛选研究
1、实验材料
受试的单体化合物均由实验室自制，纯度达到98％以上。
表3肿瘤细胞株来源
2、CCK-8法检测卷柏单体化合物对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞抑制活性
人三阴性乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞接种于培养瓶中，用DMEM培养基(含10％胎牛血清的L-15的培养基，100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素)置于37℃，0.1％ CO2培养箱内培养。
取对数生长期的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，弃去培养液，加入2mL的PBS缓冲液洗两次，弃去PBS，加入1mL胰酶，轻轻吹打细胞，加入2mL培养液终止消化，1500rmp离心5min后弃上清，加入适量新鲜培养液后进行细胞计数，混匀细胞，每孔加入100μL细胞悬液，接种于96孔板(1.5×103/孔)，每孔加入不同浓度的待测单体化合物或者5-氟尿嘧啶，每个药设定4个复孔，放入CO2培养箱继续培养48h，同时设立空白对照组。48小时后，加入CCK-8试剂，放入培养箱中，继续培养1.5h，之后取出细胞，打开酶标仪，在450nm处检测，记录吸光度(A)值，并计算细胞增殖抑制率。观察不同浓度下的抑制率情况，测定其IC50值。
3、实验结果
卷柏单体化合物对对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞抑制活性
表4化合物1-5对三阴性乳腺癌细胞的抑制活性
根据上述IC50值可知，本发明化合物具有一定的抗三阴性乳腺癌活性，其中，以化合物2的活性最佳，与阳性对照5-Fu相仿。
Claims (5)
1.从卷柏中分离纯化活性成分的方法，其特征在于，包括如下内容：
(1)卷柏70～80％乙醇-水溶液，提取，浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏；用水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，各有机溶剂萃取层，减压回收溶剂得浸膏；
(2)取乙酸乙酯浸膏，通过HP20大孔吸附树脂进行分离，以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液为洗脱溶剂洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，浓缩得到5个流份Fr.1→Fr.5；取Fr.3流份通过硅胶柱色谱依次以二氯甲烷-甲醇100:0、50:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1:1v/v进行梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，得到7个流份Fr.3-1→Fr.3-7，其中Fr.3-5流份通过p-HPLC以65％甲醇-水洗脱得到化合物2；
所述化合物结构式如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，卷柏提取使用75％乙醇-水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括化合物1、3、4、5的分离纯化方法：
(3)取二氯甲烷层浸膏，采用HP20大孔吸附树脂进行分离，流动相为甲醇-水溶液，依次以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液梯度洗脱；
(4)取60％甲醇-水溶液洗脱部位，通过聚酰胺柱色谱，依次以二氯甲烷-甲醇100:0、50:1、10:1、5:1、2:1、1:1v/v进行梯度洗脱；取二氯甲烷-甲醇10:1的洗脱部位，通过p-HPLC以50％甲醇-水等度洗脱，得到化合物5；
(5)取80％甲醇-水溶液洗脱部位，通过硅胶柱色谱，依次以二氯甲烷-甲醇100:0、100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、8:1、5:1、2:1、2:3v/v作为流动相洗脱，取8:1的洗脱部位，通过p-HPLC以70％甲醇水等度洗脱，依次得到化合物1、3、4；
所述化合物结构式如下：
4.如下方法制备的提取物B在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用；方法包括如下内容：
(1)卷柏70～80％乙醇-水溶液，提取，浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏；用水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，各有机溶剂萃取层，减压回收溶剂得浸膏；
(2)取乙酸乙酯浸膏，通过HP20大孔吸附树脂进行分离，以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液为洗脱溶剂洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，浓缩得到5个流份Fr.1→Fr.5；取Fr.3流份即得提取物B。
5.如下方法制备的提取物C在制备抗三阴性乳腺癌药物中的应用；方法包括如下内容：
(1)卷柏70～80％乙醇-水溶液，提取，浓缩至无醇味，得卷柏总浸膏；用水混悬，依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，各有机溶剂萃取层，减压回收溶剂得浸膏；
(2)取乙酸乙酯浸膏，通过HP20大孔吸附树脂进行分离，以50％、60％、70％、80％、90％甲醇-水溶液为洗脱溶剂洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，浓缩得到5个流份Fr.1→Fr.5；取Fr.3流份通过硅胶柱色谱依次以二氯甲烷-甲醇100:0、50:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1:1v/v进行梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，依洗脱早晚的顺序，将相同斑点的洗脱液合并，得到7个流份Fr.3-1→Fr.3-7，其中Fr.3-5流份即为提取物C。
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