CN112300104A - 马齿苋中一种木脂素类化合物及其提取分离方法和应用 - Google Patents
马齿苋中一种木脂素类化合物及其提取分离方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的新化合物及其提取分离方法和应用。本发明提供了一种从马齿苋中提取的木脂素类化合物oleralignan A及其提取分离方法和应用，该酯类化合物依次采用醇煎煮提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱及Sephadex LH‑20纯化、液相分离制备，该提取分离方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，药理实验证明所得的化合物具有抗肿瘤及抗胆碱酯酶作用，因此所述的一种从马齿苋中提取木脂素类化合物oleralignan A及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的医药应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的新化合物及其提取分离方法和应用，具体为一种木脂素类化合物提取分离方法及其应用。
背景技术
马齿苋(Portulaca oleracea L.)，又名马苋菜、长命菜、蚂蚁菜，为马齿苋科一年生草本植物。马齿苋分布广泛，资源丰富，是我国卫生部规定的78种药食同源的野生植物之一。马齿苋收载于2015版《中华人民共和国药典》，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。
马齿苋现代药理学研究表明，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。马齿苋主要化学成分包括黄酮类、香豆素、萜类、甾类、生物碱、氨基酸、木脂素类、挥发油、多糖、各种色素类和矿物质类等为其多样的药理作用提供了物质基础。其中生物碱是马齿苋中一类主要的化学成分，目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。
目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种从马齿苋中提取分离的新化合物oleralignan A及其提取分离方法和用途，经研究发现oleralignan A具有抗肿瘤、抗胆碱酯酶的作用，同时该化合物的提取分离方法简便、快速、环保、并且分离得到的化合物纯度高。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物，该化合物的分子式为C20H18O6，并且命名为oleralignan A，其化学结构式如下：
进一步地，所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用醇溶剂提取，醇提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用。
步骤2、将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物。
步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，乙醇蒸干后上硅胶柱，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。
步骤4、将步骤3中所得物经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用。
步骤5、将步骤4中所得物再经预处理的葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)层析分离，用甲醇洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。
步骤6、将步骤5中所得新化合物通过HPLC(高效液相)分离制备，以甲醇-0.1％甲酸为流动相进行等度洗脱，最终得到新的化合物。
进一步地，步骤1中醇溶剂为50％乙醇，提取次数为2次，每次提取回流2小时，乙醇量为药材的8～16倍。
进一步地，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。
进一步地，所述步骤3中用水和乙醇梯度洗脱为冷水、热水、纯乙醇。
进一步地，所述步骤3中用乙酸乙酯，及乙酸乙酯和甲醇的体积比为5：1，2：1梯度洗脱。
进一步地，所述步骤4中用甲醇和水的体积比为60：40、70：30、80：20、90：10和100：0梯度洗脱。
进一步地，所述步骤5中用甲醇洗脱程序为等度洗脱。
进一步地，所述ODS与葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物及其盐和衍生物在制备抗肿瘤和抗胆碱酯酶药物、食品和保健品中的用途。
与现有技术相比本发明的有益效果如下。
本发明中所述马齿苋中木脂素类化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道，本发明提供来源于马齿苋的木脂素类化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱、ODS中压柱、Sephadex LH-20及高效液相色谱仪进行分离纯化与制备，成功提取分离出新化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用醇提取及乙酸乙酯洗脱，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90％，此外经研究表明此化合物具有抗肿瘤、抗胆碱酯酶作用，因此本发明新化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗肿瘤、抗胆碱酯酶的药物。
附图说明
图1为本发明新化合物的高分辨质谱图。
图2为本发明新化合物的1H-NMR光谱图。
图3为本发明新化合物的13C-NMR光谱图。
图4为本发明新化合物的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。
图5为本发明新化合物的核磁共振1H-1H COSY光谱图
图6为本发明新化合物的核磁共振HMBC光谱图。
图7为本发明新化合物的核磁共振HSQC光谱图。
图8为本发明新化合物的核磁共振ROESY光谱图。
图9为本发明新化合物的红外光谱图。
图10为本发明新化合物的紫外光谱图。
具体实施方式
实施例1从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物及其提取分离方法。
一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物，该化合物的分子式为C20H18O6，并且命名为oleralignan A，其化学结构式如下：
所述化合物的命名为oleralignan A，表1为该新化合物的核磁数据：1H-NMR与13C-NMR在氘代DMSO中。
表1.本发明新化合物的核磁数据。
所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的结构鉴定参阅图1-10，所述化合物生物结构鉴定与推导如下。
Oleralignan A：黄色粉末，易溶于甲醇。HR-ESI–-MS给出m/z 353.1021[M-H]–的准分子离子峰，分子量为353.1031。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C20H18O6，不饱和度为12。对化合物的1H，13C和HSQC光谱的研究表明，在1H和13C NMR中，几个信号都非常宽，一些信号也是重复的。最终证明这是由于不对称苯环(1'-6')的缓慢旋转引起的。该苯环在1H NMR中以6.70至6.94ppm的非常宽泛的信号形式出现，积分了3个质子。由于旋转的苯环的邻附近，C-6上的甲氧基(δH 3.74，δC55.6)和次甲基3a(δH 3.55，δC39.7)的信号也很宽。
关于结构的确定，通过质子H-5(δH 6.16)和H-8(δH 7.16)的信号以及各自对应的δC 114.9和113.9处的碳信号和与他们在HMBC上存在相关性的该苯环上的非质子化碳信号共同确定了1,2,4,5-四取代苯环的存在。由于质子H-5和H-8与C-6和C-7均相关以及MeO-C7与H-8的COZY和ROESY相关性，MeO-C6与H-2'ROESY相关性表明两个甲氧基的分别于C-6，C-7相连。通过COZY和ROESY光谱显示，H-4与H-5相关，H-9与H-8相关以及HMBC谱显示H-4与C-4a和C-8a相关以及H-9与C-4a，C-8a和C-8的相关，确定了4a和8a的取代基的关键信息。根据COZY光谱确定了一个质子序列H-4/H-3a/H-3，同时通过3位上的质子和碳的化学位移(δH3.97/4.33，δC 71.5)表明C-3与氧相连。HMBC表明，H-9/C-3a，H-9/C-1和H-3-y/C-1分别相关，确定了3a，4-二氢异苯并呋喃-1-酮亚基的存在。
H-4与C-1'，C-2'和C-6'的相关性表明芳环与C-4连接并且两个邻位均质子化。虽然信号非常宽且被分割并不能阻止结构确定，因为在ROESY光谱图中H-2'和H-6'均与H-3a，H-4相关，且H-2'与MeO-C6相关。由于芳环是不对称的，因此两个羟基必须位于C-3'和C-4'上。1H NMR中显示的羟基质子信号分别为δH 8.67和9.45。故剩余的次甲基分配到位置5'。H-3a和H-4之间的耦合常数为8.6Hz，以及ROESY谱中，H-4/H-3-x和H-3a/H-3-y的相关性与反平面构型的质子H-3a和H-4的相关性是一致的。在文献中描述的类似化合物中也发现了8-10Hz的耦合常数，包括conidendrin。最终，化合物1被确定为一种与conidendrin相关的木脂素，俗名为oleralignan A。
所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1：称取马齿苋干燥药材250kg，采用50％乙醇回流提取，50％乙醇用量为药材的8～16倍，回流提取两次，每次2h，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用。
步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯(115L)等度洗脱，其中硅胶为100-200目，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物。
步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用冷水，热水，纯醇梯度洗脱，乙醇部位蒸干后经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200～300目，依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇(5:1、2:1，v:v)梯度洗脱，共得到20个部位(即共得到20个瓶，每瓶300mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的1～13洗脱部位，将合并后的1～13部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(60/40，70/30，80/20，90/10，100/0，v/v)梯度洗脱(加压，使流速为1mL/min，温度为室温)，得到17个部位(即梯度洗脱得17个瓶，每瓶100mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的4～6部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤5：将步骤4中所得物再经预处理的葡聚糖凝胶柱层析分离(Sephadex LH-20)，用甲醇洗脱，得到32洗脱部位(即共得到32个瓶，每瓶50mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的12～14部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用，得到新化合物。所述ODS与葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
步骤6：将步骤5中所得新化合物经HPLC分离制备，以甲醇：0.1％甲酸(61：39，v/v)作为流动相，检测波长为210nm，280nm，分离制备得到本发明的新化合物，归一法测定纯度均为90～99％。
实施例2本发明新化合物的抗肿瘤作用。
1主要材料。
1.1药品和试剂。
实验所用新化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)。
1.2细胞株。
人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB(中科院上海细胞库)。
1.3分组。
分为对照组、实验组和调零组(含DMSO溶媒的培养液)。
2实验方法。
2.1细胞培养。
DMEM高糖培养基，加入10％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
2.2MTT法检测细胞增殖。
取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明新化合物，每组设3个复孔，加药后置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。将含药培养液吸去，加入体积比为4:1的无血清培养液和MTT(终质量浓度为5mg/mL)共100mL，继续孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150μL，放于震荡器上震荡以使结晶完全溶解(5min)，酶标仪在570nm波长下检测各孔的吸光度(A)值。然后，计算各浓度化合物对细胞生长的抑制率,抑制率公式：细胞生长抑制率＝(1-A加药孔/A对照孔)×100％，再应用SPSS软件处理数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC50值。
3实验结果。
实验结果表明本发明新化合物对人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB、的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增大，抑制率也明显升高，即呈浓度依赖。本发明新化合物对上述八种肿瘤细胞IC50值见表2。
表2.本发明对肿瘤细胞的抑制作用。
| 细胞株 | IC<sub>50</sub>(μM/L) |
| 结肠癌细胞Caco-2 | 39.85 |
| 乳腺癌细胞MCF-7 | 26.73 |
| 胃癌细胞BGC-823 | 39.51 |
| 肺腺癌细胞SPC-A1 | 41.13 |
| 肝癌细胞BEL-7402 | 31.54 |
| 宫颈癌细胞Hela-229 | 36.98 |
| 卵巢癌细胞Ho-8910 | 25.16 |
| 口腔表皮样癌细胞KB | 28.13 |
实施例3本发明化合物的抗胆碱酯酶作用。
1主要材料。
1.1药品和试剂。
实验所用木脂素化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)，毒扁豆碱(瀚香生物科技)，5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB，上海金穗生物科技有限公司)，乙酰胆碱酯酶(AChE)和碘化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine iodide，ATCI，大连美仑生物技术有限公司)。
1.2分组。
分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，各一组。
2.实验方法。
2.1样品准备。
分别精密称取样品和毒扁豆碱1mg，分别以甲醇为溶剂，配置成(5，10，20，30，50μM/mL)的五个梯度浓度。分别精密称取7.096g的磷酸二氢钠和6.002g的磷酸氢二钠，用蒸馏水定容至50ml，取3.40ml的磷酸二氢钠和46.6ml的磷酸氢二钠，配制成50ml PBS(0.1M pH＝8.0)；精密称取0.0598g DTNB，加入10ml的PBS，配制成DTNB溶液(15mmol/L)；精密称取0.01g AChE，加入10ml PBS，配制成AChE溶液(0.2u/mL)；精密称取0.041g ATCI，用蒸馏水定容至10ml，配制成ATCI溶液(15mmol/L)。
2.2.改进的Ellman方法测定抗胆碱酯酶活性。
在96孔酶标板中依次加入140uL PBS(0.1M pH＝8.0)，10uL DTNB(15mmol/L)，15uL AChE(0.2u/mL)，20μL样品溶液。阴性对照组实验用甲醇代替样品，阳性对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后，加10uL ATCI(15mmol/L)。20℃孵育10min后，用酶标仪在410nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率:抑制率(％)＝(空白组-样品)/空白组×100％。
3.实验结果。
实验结果如表3所示。实验结果表明本发明木脂素化合物有抗胆碱酯酶作用。
表3.本发明木脂素化合物抗胆碱酯酶抑制活性。
| 组别 | IC<sub>50</sub>(μM) |
| 毒扁豆碱 | 33.05 |
| Oleralignan A | 58.65 |
综上所述，本发明提供了从马齿苋中提取分离的化合物oleralignan A及其提取分离方法和应用，化合物oleralignan A依次采用醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱、葡聚糖凝胶柱层析分离纯化、液相分离制备，该提取分离方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗肿瘤及抗胆碱酯酶作用，因此本发明提供的从马齿苋中提取分离的化合物oleralignan A及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。
Claims (10)
1.一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物，其特征在于，所述化合物的分子式为C20H18O6，并且命名为oleralignan A，其化学结构式如下：
2.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用醇溶剂提取，醇提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2、将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，乙醇蒸干后上硅胶柱，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤4、将步骤3中所得物经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
步骤5、将步骤4中所得物再经预处理的葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)层析分离，用甲醇洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤6、将步骤5中所得新化合物通过HPLC(高效液相)分离制备，以甲醇-0.1％甲酸为流动相进行等度洗脱，最终得木脂素类化合物。
3.如权利要求2所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤1中醇溶剂为50％乙醇，提取次数为2次，每次提取回流2小时，乙醇量为药材的8～16倍。
4.如权利要求2所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。
5.如权利要求2所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中用水和乙醇梯度洗脱为冷水、热水、纯乙醇。
6.如权利要求2所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中用乙酸乙酯和甲醇的体积比为5：1和2：1梯度洗脱。
7.如权利要求2所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中用甲醇和水的体积比为60：40、70：30、80：20、90：10和100：0梯度洗脱。
8.如权利要求2所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤5中用甲醇洗脱程序为等度洗脱。
9.如权利要求2所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述ODS与葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
10.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取分离的木脂素类化合物及其盐和衍生物在制备抗肿瘤和抗胆碱酯酶药物、食品和保健品中的用途。
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