CN117106028B - 一种蛋白酶激活肽及其在制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用 - Google Patents
一种蛋白酶激活肽及其在制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛋白酶激活肽及其在制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。所述蛋白酶激活肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明研究发现该蛋白酶激活肽能够减少心肌缺血/再灌注和心肌细胞缺氧/复氧后的细胞凋亡，减少氧化应激水平。此外，该蛋白酶激活肽还能够提高蛋白酶体活性，改善心肌细胞缺氧/复氧后的线粒体功能和状态，使线粒体膜电位升高，ATP生成增多，膜通透转化孔减少，线粒体分裂减少。由此可见，该蛋白酶激活肽可用于制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种蛋白酶激活肽及其在制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
背景技术
缺血性心肌病是指冠状动脉病变(CAD)情况下的左心室收缩功能障碍，是全球Heart Failure(HF)最常见的病因，缺血性心肌病患者都有一定程度的心衰症状。心肌缺血是发病率和死亡率最高的心血管疾病最常见的形式。为改善患者预后，及时恢复缺血性心肌的血流(再灌注)是必不可少的。然而，这种再灌注可能导致进一步的心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)，从而导致心肌功能障碍，例如心肌惊晕、再灌注心律失常、肌细胞死亡以及内皮和微血管功能障碍，包括无回流现象、炎症反应和其他心肌组织损伤，比原始缺血性损伤引起的损伤更可怕。由研究报告表明，致死性再灌注损伤占最终心肌梗死病例的50％。MI/RI病理机制涉及了复杂系统网络，例如氧化应激、炎症反应、钙超负荷和线粒体功能障碍。
蛋白酶激活肽分为封闭构象和开放构象：PAP和PAP1，蛋白酶激活肽显著提高了蛋白酶体的糜蛋白酶样(ChT-L)催化活性，从而提高了蛋白质水解率。此外，在肌萎缩性侧索硬化症细胞模型中，用PAP1培养和H2O2激发的成纤维细胞可以保护其免于死亡，并且PAP1可以阻止蛋白质聚集。在这两种细胞模型中，当细胞与PAP1预孵育时，氧化应激后氧化蛋白池减少。PAP1促进20SPT腔室的打开，但对细胞内多泛素化蛋白池没有明显影响，PAP1的主要细胞靶点是空闲的20SPT池。
然而，目前关于PAP1在缺血性心肌病和心衰中的作用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白酶激活肽及其在制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该蛋白酶激活肽可以抑制心肌缺血/再灌注和心肌细胞缺氧/复氧后的细胞凋亡，降低氧化应激水平，提高蛋白酶体活性，改善心肌细胞缺氧复/氧后的线粒体功能和状态，因此可用于制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种蛋白酶激活肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供上述的蛋白酶激活肽在制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用。
进一步地，所述药物通过抑制心肌缺血/再灌注和心肌细胞缺氧/复氧后的细胞凋亡以及降低氧化应激水平，来发挥预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的作用。
进一步地，所述药物通过提高蛋白酶体活性，改善心肌细胞缺氧复/氧后的线粒体功能和状态，来发挥预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的作用。
本发明还提供一种预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物，活性成分包括上述的蛋白酶激活肽。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供上述的蛋白酶激活肽在制备辅助治疗缺血性心肌病的药物中的应用。
本发明还提供上述的蛋白酶激活肽在制备辅助治疗缺血性心肌病导致的心衰的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明开发了蛋白酶激活肽PAP1的新用途，研究发现PAP1能够减少心肌缺血/再灌注和心肌细胞缺氧/复氧后的细胞凋亡，减少氧化应激水平。此外，PAP1还能够提高蛋白酶体活性，改善心肌细胞缺氧/复氧后的线粒体功能和状态，使线粒体膜电位升高，ATP生成增多，膜通透转化孔减少，线粒体分裂减少。由此可见，PAP1可用于制备预防和/或治疗心肌缺血/再灌注损伤的药物。本发明证明PAP1可用于制备辅助治疗缺血性心肌病及心衰的药物，具有重要的临床指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1各实验组大鼠心肌细胞的蛋白酶体活性检测结果；其中，A-C分别为类胱天蛋白酶(Caspase-like)、胰蛋白酶样(Trypsin-like)和糜蛋白酶样催化活性(Chymotrypsin-like)检测结果；
图2为实施例1各实验组大鼠心肌细胞的TUNEL荧光染色显微图(A)以及TUNEL阳性细胞核数百分比对比统计图(B)；
图3为实施例1各实验组大鼠心肌细胞的DHE荧光染色显微图(A)以及相对荧光强度对比统计图(B)；
图4为实施例1各实验组大鼠心肌细胞的MPTP荧光染色显微图(A)以及荧光强度统计图(B)；
图5为实施例2各实验组小鼠的心脏功能检测结果；其中A为心脏舒缩运动图像；B和C分别为左心室射血分数(EF)和左心室短轴缩短率(FS)比较图；
图6为实施例2各实验组小鼠的心脏梗死面积检测结果；其中A为心脏TTC染色的截面图；B和C分别为心肌危险区和梗死区占左室心肌面积的比例；
图7为实施例2各实验组小鼠心脏组织的TUNEL荧光染色显微图(A)以及TUNEL阳性细胞核数百分比对比统计图(B)；
图8为实施例2各实验组小鼠心脏组织的DHE荧光染色显微图(A)以及相对荧光强度对比统计图(B)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语说明：
本发明所指的PAP1是蛋白酶体激活剂，是一种多肽，可进行合成，结构为：Ile-Pro-Arg-Cys-Arg-Lys-Met-Pro-Gly-Val-Lys-Met-Cys-NH2(SEQ ID NO.1)。
实施例1
1.从1日龄的SD大鼠提取新生大鼠心肌细胞(NRCM)，用75％酒精灭菌。用提前高压灭菌的眼科剪迅速取出左心室，切成小块，并用0.08％的胰蛋白酶进行消化。将分离处的心肌细胞在补充有15％FBS的DMEM/F12中孵育24小时，然后在无血清DMEM/F12中孵育以进行后续体外研究。
2.大鼠原代心肌细胞缺氧/复氧模型构建。
取NRCM细胞，分为4个实验组，按表1所示对各实验组进行操作后，进行蛋白酶体活性测定和MPTP染色。
表1细胞实验分组
| 实验组 | 操作 |
| Vehicle组 | NRCM不进行任何操作 |
| PAP1组 | NRCM在含有10μMPAP1的培养基中培养4h |
| H/R组 | NRCM进行体外缺氧/复氧操作 |
| PAP1+H/R组 | NRCM在含有10μMPAP1的培养基中培养4h后，进行体外缺氧/复氧操作 |
体外缺氧/复氧(H/R)操作：NRCM在含有NaCl、NaHCO3、NaH2PO4·2H2O、无水CaCl2、MgCl2·6H2O、乳酸钠、KCl、2-D-核糖和2-脱氧葡萄糖的缺氧缓冲液中在缺氧条件下(1％O2)孵育6小时，然后将细胞在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中孵育，并在正常氧气条件下(95％O2)复氧24小时。
3.蛋白酶体活性测定
各取上述4组SD大鼠乳鼠原代心肌细胞(n＝6)细胞悬液，使用proteasome-GloTMChymo-trypsin-like，Trypsin-like and Caspase-like cell-BasedAssays(promega，货号G8661,G8760.G8861)试剂盒测量4组原代心肌细胞细胞悬液的蛋白酶体活性水平。
检测结果如图1所示，与Vehicle组相比，H/R后原代心肌细胞的Chymotryspin-like蛋白酶体活性下降，而PAP1预处理能逆转这一情况，提高蛋白酶体活性。
4.TUNEL染色
4组小鼠细胞以20％蔗糖浸泡至沉塘，OCTC包埋，-20℃冰冻切片，50℃烤片20min后用甲醇固定10min，PBS清洗并用组画笔在片子上圈出组织，使用0.1％TritonX-100溶液4℃打孔2min，PBS溶液清洗，TUNEL染料37℃孵箱孵育60min，PBS溶液清洗，DAPI染色5min，PBS溶液清洗，将α-actinin染料用PBS稀释100倍，每个组织30μL 4℃过夜。第二天复温30min后，将488荧光二抗用PBS稀释100倍，每个组织30μL 37℃孵育30min，结束后PBS溶液清洗，用抗荧光淬灭封片剂封片，全程避光操作；用荧光显微镜拍摄荧光亮度，使用Image J软件分析。
检测结果如下：图2为4组心肌细胞的TUNEL荧光染色显微镜拍摄图以及4组TUNEL阳性细胞核数百分比对比统计图，结果表明I/R后心肌细胞凋亡增多；而PAP1预处理后，心肌细胞凋亡明显减少，说明PAP1预处理能够使小鼠心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡减少。
5.DHE染色
4组细胞予以20％蔗糖浸泡至沉塘，OCTC包埋，-20℃冰冻切片，50℃烤片20min后用甲醇固定10min，PBS清洗并用组画笔在片子上圈出组织，使用0.5％TritonX-100溶液打孔15min，PBS清洗，用PBS将DHE染料稀释100倍，每个组织30μL 37℃孵育30min，PBS溶液清洗，结束后用抗荧光淬灭封片剂封片，全程避光操作；用荧光显微镜拍摄荧光亮度，使用ImageJ软件分析。原代心肌细胞种植在24孔板中，PBS清洗后甲醇固定10min，其余步骤同上。
检测结果如下：图3是4组心肌细胞的DHE荧光染色显微镜拍摄图以及4组相对的荧光强度对比统计图，结果显示I/R后心肌细胞的氧化应激水平增高，活性氧含量增多；但PAP1预处理后，心肌细胞的氧化应激水平明显下降，说明PAP1预处理能够减少小鼠心肌缺血再灌注损伤后的氧化应激。
6.MPTP染色
对各组NRCM细胞进行MPTP染色，方法如下：将细胞置于在24孔板中，吸除培养液，用PBS清洗细胞1-2遍，加入CalceinAM染色液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，37℃避光孵育30min。孵育结束后，更换成新鲜的37℃预热的培养液，37℃再避光孵育30min，以保证细胞内酯酶充分水解CalceinAM以生成有绿色荧光的Calcein。吸除培养液，用PBS清洗3次，然后加入检测缓冲液即可在荧光显微镜下观察。
检测结果如下：图4为4组原代心肌细胞的MPTP荧光染色显微镜拍摄图以及4组荧光强度统计图，结果表明H/R后原代心肌细胞的线粒体通透性转化孔开放程度增高；而PAP1预处理后，原代心肌细胞线粒体通透性转化孔开放程度减少，说明PAP1预处理能够降低缺氧复氧后的原代心肌细胞的线粒体通透性转化孔的开放程度。
实施例2
1.实验动物及饲养
C57BL/6雄性小鼠，8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；分笼饲养，恒温(23-25℃)，恒湿(55-70％)。
2.实验分组
动物实验分为4组：健康对照组(Vehicle组)、正常药物组(PAP1组)、模型组(I/R组)和治疗组(PAP1+I/R组)，每组各6只；其中，如表2所示，Vehicle组和I/R组小鼠是将C57BL/6小鼠腹腔注射生理盐水0.2mL/只；PAP1组和PAP1+I/R组均是用PAP1预处理实验小鼠(PAP110mg/kg，PAP1用生理盐水稀释后腹腔注射，注射量0.2mL/只)，随后对I/R组和PAP1+I/R组小鼠分别进行心肌缺血/再灌注操作，评估小鼠心肌组织的凋亡和氧化应激的变化情况、能量代谢及相关信号分子。
心肌缺血/再灌注操作的具体方法参考文献“Y.L.Zhang,P.B.Li,X.Han,B.Zhang,H.H.Li,Blockage of fibronectin 1ameliorates myocardial ischemia/reperfusioninjury in association with activation of AMP LKB1-AMPK signaling pathway,Oxid.Med.Cell.Longev.2022(2022),6196173(1942-0994(Electronic))”。
表2动物实验分组
3.心脏超声心动图评价
小鼠缺血/再灌注损伤模型再灌注后24h，将4组小鼠分别放在1.5％异氟烷的麻醉箱中麻醉后，仰卧位固定于操作台上，以1％异氟烷维持麻醉；先找到胸骨旁长轴切面，保存B-mode数据，旋转探头90°获取小鼠心脏左心室胸骨旁短轴切面，胸骨旁短轴切面以左心室乳头肌水平的切面为标志点，用M型超声模式记录下左心室射血分数(EF)，左心室短轴缩短率(FS)，左心室收缩末期内径(ESD)，左心室舒张末期内径(EDD)，左心室收缩末期容积(ESV)，左心室舒张末期容积(EDV)；胸骨旁长轴切面以左心室流出道水平切面为标志点，用B型超声心动图记录室壁运动图像。
检测结果如下：M型超声心动图记录的4组小鼠心脏舒缩运动图像如图5中A所示，结果显示小鼠I/R后的心脏收缩舒张功能明显下降，而PAP1预处理的模型小鼠，心脏舒缩功能显著改善；图5中B和C依次为4组小鼠EF和FS比较图，表明模型小鼠PAP1预处理后EF和FS显著升高，能够有效缓解I/R损伤造成的心脏功能下降。以上结果显示对心肌缺血再灌注小鼠提前注射PAP1(10mg/kg)改善了小鼠的心脏功能。
4.2，3，5-三苯基四氯化唑(TTC)染色
将4组小鼠腹腔注射0.2mL三溴乙烷过饱和溶液，小鼠麻醉后进行固定，未造模两组(Vehicle、PAP1)与I/R造模时一样结扎左前降支，而造过模的两组(I/R、PAP1+I/R)沿心梗造模肋间开口处，将心脏再次挤出，在上次结扎处再次将心脏左前降支结扎，在心尖处注射0.9mL 1％伊文氏蓝染料，让其沿血流流向全身，可观察到小鼠全身变蓝；取下小鼠心脏用PBS清洗，将组织中的线取出，灌胶并将心脏放入-20℃冰箱冷冻定型30min，结束后将心脏放入模具中切成等厚的4个薄片并放入1％TTC染料中，37℃孵箱孵育30min，结束后将心脏切片放入4％组织固定液中固定一晚上，第二天取出拍照。
检测结果如下：4组小鼠心脏TTC染色的截面图如图6中A所示(其中，蓝色为正常区域，红色为缺血区域，白色为梗死区域)，与Vehicle组相比，I/R组的梗死区面积显著增大，而PAP1+I/R组小鼠的心肌梗死面积明显减小；图6中B和C分别为4组小鼠的心肌危险区和梗死区占左室心肌面积的比例。以上结果显示PAP1预处理后可部分挽救I/R损伤所致的心肌梗死面积。
4.TUNEL染色
4组小鼠心脏取材后予以20％蔗糖浸泡至沉塘，OCTC包埋，-20℃冰冻切片，50℃烤片20min后用甲醇固定10min，PBS清洗并用组画笔在片子上圈出组织，使用0.1％TritonX-100溶液4℃打孔2min，PBS溶液清洗，TUNEL染料37℃孵箱孵育60min，PBS溶液清洗，DAPI染色5min，PBS溶液清洗，将α-actinin染料用PBS稀释100倍，每个组织30μL4℃过夜。第二天复温30min后，将488荧光二抗用PBS稀释100倍，每个组织30μL 37℃孵育30min，结束后PBS溶液清洗，用抗荧光淬灭封片剂封片，全程避光操作；用荧光显微镜拍摄荧光亮度，使用ImageJ软件分析。
检测结果如下：图7为4组小鼠心脏组织的TUNEL荧光染色显微镜拍摄图以及4组TUNEL阳性细胞核数百分比对比统计图，结果表明I/R后小鼠的心肌细胞凋亡增多；而PAP1预处理后，小鼠心肌组织细胞凋亡明显减少，说明PAP1预处理能够使小鼠心肌缺血/再灌注损伤后的心肌细胞凋亡减少。
5.DHE染色
4组小鼠心脏取材后予以20％蔗糖浸泡至沉塘，OCTC包埋，-20℃冰冻切片，50℃烤片20min后用甲醇固定10min，PBS清洗并用组画笔在片子上圈出组织，使用0.5％TritonX-100溶液打孔15min，PBS清洗，用PBS将DHE染料稀释100倍，每个组织30μL 37℃孵育30min，PBS溶液清洗，结束后用抗荧光淬灭封片剂封片，全程避光操作；用荧光显微镜拍摄荧光亮度，使用ImageJ软件分析。原代心肌细胞种植在24孔板中，PBS清洗后甲醇固定10min，其余步骤同上。
检测结果如下：图8是4组小鼠心脏组织的DHE荧光染色显微镜拍摄图以及4组相对的荧光强度对比统计图，结果显示I/R后小鼠的心肌组织中的氧化应激水平增高，活性氧含量增多；但PAP1预处理后，小鼠心肌的氧化应激水平明显下降，说明PAP1预处理能够减少小鼠心肌缺血/再灌注损伤后的氧化应激。
综上所述，本发明发现用PAP1(50μM)培养的心肌细胞缺氧/复氧后，PAP1提高了蛋白酶体的活性，减少了细胞凋亡，降低氧化应激水平，增多了线粒体通透性转化孔。除此之外，本发明还建立了小鼠心肌缺血/再灌注模型，腹腔注射PAP1(10mg/Kg)进行干预，发现PAP1能够改善缺血/再灌注后小鼠的心脏功能，减少小鼠的心肌梗死面积，降低心肌组织的氧化应激水平和细胞凋亡。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种蛋白酶激活肽在制备预防心肌缺血/再灌注损伤的药物中的应用，其特征在于，所述蛋白酶激活肽如Ile-Pro-Arg-Cys-Arg-Lys-Met-Pro-Gly-Val-Lys-Met-Cys-NH2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过抑制心肌缺血/再灌注和心肌细胞缺氧/复氧后的细胞凋亡以及降低氧化应激水平，来发挥预防心肌缺血/再灌注损伤的作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过提高蛋白酶体活性，改善心肌细胞缺氧/复氧后的线粒体功能和状态，来发挥预防心肌缺血/再灌注损伤的作用。
4.一种蛋白酶激活肽在制备预防缺血性心肌病的药物中的应用，其特征在于，所述蛋白酶激活肽如Ile-Pro-Arg-Cys-Arg-Lys-Met-Pro-Gly-Val-Lys-Met-Cys-NH2所示。
5.一种蛋白酶激活肽在制备预防缺血性心肌病导致的心衰的药物中的应用，其特征在于，所述蛋白酶激活肽如Ile-Pro-Arg-Cys-Arg-Lys-Met-Pro-Gly-Val-Lys-Met-Cys-NH2所示。
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