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CN117051173A - 一种猫消化道病毒性pcr检测方法及应用 - Google Patents

一种猫消化道病毒性pcr检测方法及应用 Download PDF

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CN117051173A
CN117051173A CN202311316335.XA CN202311316335A CN117051173A CN 117051173 A CN117051173 A CN 117051173A CN 202311316335 A CN202311316335 A CN 202311316335A CN 117051173 A CN117051173 A CN 117051173A
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cat
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CN202311316335.XA
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孙依欣
李�杰
黄挺
张晓婷
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Shanghai Jiling Biotechnology Co ltd
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Shanghai Jiling Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及猫消化道病毒检测技术领域，具体涉及一种猫消化道病毒性PCR检测方法及应用。该检测方法采用猫消化道病毒性PCR检测的试剂盒进行，该试剂盒包括上游引物、下游引物及探针。对猫细小病毒的NS2基因特异性序列进行扩增，并通过荧光法检测PCR扩增产物，从而实现对猫细小病毒的检测。相较于其他检测方法，此方法检测灵敏度高。

Description

一种猫消化道病毒性PCR检测方法及应用
技术领域
本发明涉及猫消化道病毒检测技术领域，具体涉及一种猫消化道病毒性PCR检测方法及应用。
背景技术
猫细小病毒又被称为猫泛白细胞减少症病毒、猫瘟病毒或猫传染性肠炎病毒，主要以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征，是危害猫科动物的主要疾病之一。猫细小病毒主要侵染胃肠道组织的黏膜上皮细胞，造成细胞的病变和死亡，由该病毒引起的猫泛白细胞减少症的临床表现有多种，可分为特急性型、急性型、亚急性型和不显性型。特急性型为突然死亡，无临床症状；急性型为24h内死亡；亚急性型在一周左右死亡，伴随发热、呕吐、厌食和脱水等症状。通过一系列病原学研究，证明了猫细小病毒在自然条件下容易感染猫科和鼬科等多种动物，其中水貂最为易感。目前，针对猫细小病毒的预防主要是疫苗的接种，包括灭活病毒疫苗和减毒活疫 苗。其中，灭活病毒疫苗的安全性较高，但是不如减毒活疫苗的临床效果好。针对预防该病 毒的疫苗在欧洲的一些国家已商品化，但是针对该病毒的诊断试剂却参差不齐。因此，建立一种快速、灵敏地检测猫细小病毒的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明目的是在于针对现有技术的不足，提供一种检测猫细小病毒的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。根据猫细小病毒NS2基因序列合成特异性的探针和引物，对猫细小病毒的NS2基因特异性序列进行扩增，并通过荧光法或试纸法检测PCR扩增产物，从而实现灵敏地检测猫细小病毒。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
第一方面，本发明提供了一种猫消化道病毒性PCR检测的试剂盒，包括：
上游引物F1：5’-tctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccg-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物R1：5’-ctctcaggtctgcctctatttcggaccacgtcg-3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针P1：5’-gactcgcttgcacgtctttgtgagtaacgc/iFAM6dT/c/THF/c/iBHQ1dT/gttggtttgattgtt (C3-spacer)-3’，如SEQ ID NO.3所示。
其中，FAM为荧光基团，THF为四氢呋喃位点，iBHQ1dT为荧光猝灭基团，(C3-spacer)为封闭基团。
进一步地，所述的试剂盒还包括RAA冻干粉、醋酸镁溶液、反应缓冲液和标准质粒；RAA冻干粉包括重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合酶和dNTPs，所述标准质粒为携带猫细小病毒NS2基因的特异性序列的载体，所述特异性序列如SEQ ID NO.7所示。
第二方面，本发明提供了一种猫消化道病毒性PCR检测的试剂，包括上游引物、下游引物和探针。
上游引物：5’-tctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccg-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’-FITC-ctctcaggtctgcctctatttcggaccacgtcg-3’，如SEQ ID NO.8所示；
探针：5’-BIOTIN-gactcgcttgcacgtctttgtgagtaacgc/c/THF/c/gttggtttgattgtt-PHO-3’，如SEQ ID NO.9所示；其中，FITC为荧光基团，BIOTIN为生物素，THF为四氢呋喃位点，PHO为磷酸修饰基团。
其中，探针序列中插入一个四氢呋喃(THF)来模拟一个基本位点进行修饰位点，THF修饰核苷酸在DNA聚合酶的作用下，可以高效地实现DNA链的延伸。
本发明提供根据如上所述检测猫消化道病毒的扩增引物对和探针设计的试剂盒，所述试剂盒包括RAA反应体系和LFD试纸条，所述LFD试纸条的检测线上带有生物素抗体和荧光基团抗体，质控线上带有亲和素-胶体金特异性抗体。
进一步地，所述荧光基团抗体为FAM抗体的纳米金粒。
将带有生物素标记、6-羧基荧光激素FAM标记的引物和探针与靶核酸进行扩增反应，产物为同时带有生物素和FAM标记的扩增子。LFD试纸条前端是靠近浸液区的检测线，靠近手持端吸液区即后端是质控线。LFD试纸条前端检测线带有FAM抗体的纳米金粒，检测线上还带有生物素抗体，将扩增产物滴到试纸条上，扩增子上的FAM基团与FAM抗体反应，检测线处的生物素抗体与扩增子上的生物素结合后，检测线上显示条带，未被捕获的产物与质控线处的亲和素-胶体金特异性抗体结合显示条带。检测线与质控线条带颜色，根据胶体金粒径和还原剂选择的改变，肉眼所看到颜色会有改变，但不影响检测结果，可根据需要选择合适的胶体金粒径和还原剂。
进一步地，所述RAA反应体系中，所述RAA反应通用干粉的加入量为1μg/10~30μL；所述RAA反应通用干粉中包括重组酶、Bst DNA聚合酶、SSB蛋白、修复酶和dNTPs。本领域技术人员可以根据需要选择合适的RAA基础通用反应试剂产品进行应用。
进一步地，所述上游引物的浓度为10μM；下游引物的浓度为10μM；探针ZHU-PRO的浓度为10μM。
进一步地，所述醋酸镁的浓度为300mM。
进一步地，该试剂盒反应条件为37~42℃条件下反应15~25min。
进一步地，该试剂盒还包括有阳性对照；所述阳性对照为携带猫细小病毒基因特异性序列的标准质粒。将合成的猫细小病毒NS1基因构建至pUC57载体上，转入Top10 感受态细胞，筛选、PCR和测序鉴定阳性颗粒，并提取阳性质粒，即为标准质粒。
优选地，RAA反应体系以47.5μL计，包括25μL RAA反应缓冲液、4μL 正向引物（10μM）、4μL 反向引物（10μM）、1μL 103拷贝/μL标准质粒、灭菌双蒸水 17.5μL。混合后加入到含有RAA反应通用干粉的反应管中，然后向每个反应管中加入 2.5μL 300mM 醋酸镁溶液。将以上反应体系混合均匀，置 PCR 反应仪 36°C条件下反应 30 min。
第三方面，于体外检测猫消化道病毒的方法，所述方法采用所述的试剂盒进行，所述包括如下步骤：
采用所述DNA提取试剂从所述猫消化道样本中提取基因组DNA；
配制RRA反应体系：将RRA冻干粉加入至所述反应缓冲液中，加入所述正向引物、所述反向引物、所述探针、所述基因组DNA，加入无菌水，混匀离心，再加入醋酸镁，混匀离心；
将所述RRA反应体系置于20~50℃温度范围的恒温装置或环境中，孵育20min，得到扩增产物。
进一步地，所述方法还包括根据扩增产物产生的荧光信号扩增曲线检测猫消化道病毒。例如，根据荧光信号扩增曲线是否为S型判断其能够的检出。例如，根据不同稀释级标准品的Ct值和浓度绘制标准曲线，以样本Ct值计算出样本浓度实现定量检测。
进一步地，将RAA反应与LFD试纸结合，该方法还包括：吸取扩增产物至新的反应管中，稀释50~300倍；LFD试纸条检测：将LFD试纸条插入稀释后的反应管中，等待条带出现；根据所述LFD试纸条显色情况直接读取检测结果；所述结果包括所述LFD试纸条上的质控线和检测线的显色结果。结果包括：仅在质控线出现一条线，表明样品中无猫细小病毒核酸，或其拷贝数低于试剂盒最低检测限；出现两条线，一条位于检测线，另一条位于质控线，表示样品中存在猫细小病毒核酸；质控线无条带出现，表明核酸试纸条失效。
进一步地，LFD试纸条10min内观察结果，10min后判读无效。
本发明提供的基于重组酶介导的等温核酸扩增检测猫细小病毒试剂盒及检测方法，提供了一种新的猫细小病毒核酸掺假现场检测方法，可实现肉眼结果的可视化检测。相较于其他检测方法，此方法检测灵敏度高，可稳定检测5个拷贝/μL的标准质粒，能够有效检出0.1pg/μL的基因组 DNA 样本。
另外，本发明还将重组酶介导的等温核酸扩增试剂与侧流免疫技术结合，是RAA技术和LFD技术的联合应用。整个检测过程也仅需20-30分钟即可完成，无需专门设备，结果准确可以满足现场样本的检测，特别适合宠物市场等现场检测。
附图说明
图1为实施例1检测采用F1/R1（泳道1）和F2/R2（泳道2）检测标准质粒的PCR扩增产物电泳图。
图2为实施例1检测采用F1/R1检测标准质粒的扩增温度优化结果，泳道1~7依次为36、37、38、39、40、41、42℃扩增温度。
图3为实施例1检测采用F1/R1检测标准质粒的正反向引物浓度优化结果，泳道1~6依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8μmol/L的正反向引物。
图4为实施例1检测采用F1/R1检测标准质粒的醋酸镁浓度优化结果，泳道1~7依次为7、9、11、13、15、17、20mmol/L的醋酸镁溶液。
图5为实施例1检测采用F1/R1检测标准质粒的敏感性结果，泳道1~8依次为107、106、105、104、103、102、10和5个拷贝/μL的标准质粒溶液。
图6为实施例1检测采用F2/R2检测标准质粒的敏感性结果，泳道1~8依次为107、106、105、104、103、102、10和5个拷贝/μL的标准质粒溶液。
图7为实施例2检测采用F1/R1/P1的荧光RAA法检测猫消化道样本基因组 DNA的结果，荧光扩增曲线自左至右依次为50ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，1pg/μL和0.1pg/μL的基因组 DNA 样本。
图8为实施例2检测采用F2/R2/P2的荧光RAA法检测猫消化道样本基因组 DNA的结果，荧光扩增曲线自左至右依次为50ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，1pg/μL和0.1pg/μL的基因组 DNA 样本。
图9为实施例3检测采用荧光RAA-LPF法检测不同浓度的标准质粒和猫消化道样本基因组 DNA的结果，由左至右依次为实验组的103、10和5个拷贝/μL的标准质粒的检测结果，对照组的103、10和5个拷贝/μL的标准质粒的检测结果，实验组的0.1ng/μL和0.01ng/μL猫细小病毒基因组DNA检测结果，对照组的0.1ng/μL和0.01ng/μL猫细小病毒基因组DNA检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1：基础反应体系的建立
本实施例根据重组酶介导的等温扩增技术原理建立猫消化道病毒检测技术，该方法不依赖PCR仪、反应快速、操作简便，可望为诊断提供一种新的手段。
1、携带猫细小病毒NS1基因特异性序列的重组质粒(作为标准质粒)构建
将合成的猫细小病毒NS1基因构建至pUC57载体上，转入Top10 感受态细胞，筛选、PCR和测序鉴定阳性颗粒，并提取阳性质粒，即为标准质粒。
2、引物及探针
上游引物F1：5’-tctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccg-3’，如SEQ ID NO.1所示。
下游引物R1：5’-ctctcaggtctgcctctatttcggaccacgtcg-3’，如SEQ ID NO.2所示。
探针P1：5’-gactcgcttgcacgtctttgtgagtaacgc/iFAM6dT/c/THF/c/iBHQ1dT/gttggtttgattgtt (C3-spacer)-3’，如SEQ ID NO.3所示。
上游引物F2：5’-cggcaagcaatcctcagagtcaagaccaacttc-3’，如SEQ ID NO.4所示。
下游引物R2：5’-cgcttgcacgtctttgtgagtaacgccaaga-3’，如SEQ ID NO.5所示。
探针P2：5’-tggtttgattgttgatttgcagtttctgca/iFAM6dT/c/THF/c/iBHQ1dT/ggcgtatctggagtac (C3-spacer)-3’，如SEQ ID NO.6所示。
上述引物和探针均采用化学合成。
3、RAA 反应体系
在 0.5ml PCR 管中配制 RAA 反应体系:反应缓冲液（江苏奇天基因生物）25μL、2μL 正向引物（10μM）、2μL 反向引物（10μM）、模板 DNA（103拷贝/μL，标准质粒）1μL、灭菌双蒸水 17.5μL。将混合好的 47.5μL 溶液加入到含有重组酶的干粉反应管（重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合酶和dNTPs）中，然后向每个反应管中加入 2.5μL 280mM 醋酸镁溶液。将以上反应体系混合均匀，置 PCR 反应仪 37 °C条件下反应 30 min。反应结束后，取出反应管，加入 50 μL 酚/氯仿(1:1)，振荡均匀，12000 r/min 离心 1 min。吸取 10 μL 上层溶液进行琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1.2%）100V，40 min，置凝胶成像系统上扫描获取结果。结果如图1所示，以标准质粒为模板分别进行RAA法扩增，分别采用F1/R1和F2/R2作为引物对，进行RAA反应，结果扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下均可见清晰160 bp的特异性条带，与预期结果一致，但F2/R2作为引物对的扩增条带浓度较低。
4、RAA扩增条件的优化
按上述步骤配制反应体系，在36、37、38、39、40、41、42℃不同温度下进行RAA梯度扩增；确定最优温度后，依次加入终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8μmol/L的正反向引物，7、9、11、13、15、17、20mmol/L的醋酸镁溶液，总体积用双蒸水补齐。比较不同温度、不同引物浓度以及不同镁离子浓度对DNA扩增效率的影响。
如图2所示，36℃时扩增效果最佳。如图3所示，加入终浓度为0.8μmol/L的正反向引物扩增效果最佳。如图4所示，加入终浓度为13mmol/L的醋酸镁扩增效果最佳。
5、RAA法敏感性评价
以含NS2基因片段的标准质粒为模板评价RAA法敏感性经梯度稀释得到不同浓度（107、106、105、104、103、102、10和5个拷贝/μL），各取1μL进行RAA反应，反应产物后经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统上扫描获取结果。结果如图5所示，5个拷贝/μL的标准质粒仍然能够获得明显的扩增条带，说明采用本发明提供的F1/R1能够扩增低浓度的标准质粒，灵敏度非常高。
结果如图6所示，仅在103个拷贝/μL的标准质粒能够获得明显的扩增条带，说明采用本发明提供的F2/R2能够扩增低浓度的标准质粒，但灵敏度不及F1/R1。
实施例2 重组酶介导的猫消化道病毒核酸等温扩增荧光方法(荧光RAA法)的建立
1、猫消化道样本基因组 DNA 提取
样品中加入20μL Proteinase K，然后加入200μL BufferAL，涡旋振荡15s混匀。70℃孵育10min，将试管快速离心，加入200μL无水乙醇，漩涡15s后离心，用吸管将混合液移取到含有QIAamp Minispin column的收集管，以8000r/min的速度离心1min，弃去上清。将QIAamp Mini spincolumn置于新的2ml收集管中，加入500μL Buffer AW1，以8000r/min的速度离心1min，弃去上清。将QIAamp Mini spin column置于新的2mL收集管中，加入500μLBuffer AW2，以14000r/min的速度离心1min，弃去上清。将QIAamp Mini spin column置于新的2mL收集管中，全速离心1min。将QIAamp Mini spin column置于新的1.5mL收集管中，加入200μLBuffer AE，室温孵育1min。以8000r/min的速度离心1min以洗脱DNA。将提取的DNA保存于-80℃。
2、荧光RAA反应体系
紫外分光光度计测得试剂盒提取的猫细小病毒基因组初始浓度为 167.8ng/μL，将基因组 DNA 稀释至10ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，1pg/μL和0.1pg/μL的基因组 DNA 样本，各取 1 μL 模板 DNA 进行扩增，观察荧光 RAA 法的敏感性。
以上述优化的RAA反应体系为基础，在0.5mlPCR管中配制RAA反应体系：25 μL反应缓冲液、2 μL 20μmol/L正向引物、2 μL 20μmol/L反向引物、1 μL 20μmol/L探针、1 μL DNA模板、双蒸水16.5μL。将混合好的47.5μL溶液加入到含有重组酶的干粉反应管中。然后向每个反应管中加入2.5μL 300 mM醋酸镁溶液。立即放入RAA-B6100恒温震动仪中震荡离心4min，混匀后将反应管置于RAA 荧光检测仪（RAA-F1620）进行检测，工作条件 36℃、总反应时间为 30 min。
结果如图7所示，采用F1/R1/P1的荧光RAA法检测猫消化道样本基因组 DNA ，能够有效检出0.1pg/μL的基因组 DNA 样本（出现S型扩增曲线）。而如图8所示。采用F2/R2/P2的荧光RAA法检测猫消化道样本基因组 DNA ，仅能够有效检出0.5ng/μL的基因组 DNA 样本。说明采用F1/R1/P1的荧光RAA法的灵敏度高于F2/R2/P2的荧光RAA法。
因此，荧光定量PCR仪根据接收的荧光信号扩增曲线，从而对猫消化道病毒核酸进行检测来诊断疾病。根据是否出现S型扩增曲线实现定性检测，其次根据不同稀释级标准品的Ct值和浓度绘制标准曲线，以样本Ct值计算出样本浓度实现定量检测。
实施例3 RAA-LFD
1、引物及探针
实验组：
上游引物：5’-tctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccg-3’，如SEQ ID NO.1所示。
下游引物：5’-FITC-ctctcaggtctgcctctatttcggaccacgtcg-3’，如SEQ ID NO.8所示。
探针：5’-BIOTIN-gactcgcttgcacgtctttgtgagtaacgc/c/THF/c/gttggtttgattgtt-PHO-3’，如SEQ ID NO.9所示。其中，FITC为荧光基团，BIOTIN为生物素，THF为四氢呋喃位点，PHO为磷酸修饰基团。
对照组：
上游引物：5’-cggcaagcaatcctcagagtcaagaccaacttc-3’，如SEQ ID NO.4所示。
下游引物：5’-FITC-cgcttgcacgtctttgtgagtaacgccaaga-3’，如SEQ ID NO.10所示。
探针：5’-BIOTIN-tggtttgattgttgatttgcagtttctgca/c/THF/c/ggcgtatctggagtac-PHO-3’，如SEQ ID NO.11所示。其中，FITC为荧光基团，BIOTIN为生物素，THF为四氢呋喃位点，PHO为磷酸修饰基团。
上述引物和探针均采用化学合成。
2、RAA反应
LFD试纸条，所述LFD试纸条的检测线上带有生物素抗体和荧光基团抗体，质控线上带有亲和素-胶体金特异性抗体。将带有生物素标记、6-羧基荧光激素FAM标记的引物和探针与靶核酸进行扩增反应，产物为同时带有生物素和FAM标记的扩增子。LFD试纸条前端是靠近浸液区的检测线，靠近手持端吸液区即后端是质控线。LFD试纸条前端检测线带有FAM抗体的纳米金粒，检测线上还带有生物素抗体，将扩增产物滴到试纸条上，扩增子上的FAM基团与FAM抗体反应，检测线处的生物素抗体与扩增子上的生物素结合后，检测线上显示条带，未被捕获的产物与质控线处的亲和素-胶体金特异性抗体结合显示条带。
RAA反应体系以47.5μL计，包括25μL RAA反应缓冲液、4μL 正向引物（10μM）、4μL反向引物（10μM）、1μL 103拷贝/μL标准质粒或猫消化道样本基因组 DNA、灭菌双蒸水 17.5μL。混合后加入到含有RAA反应通用干粉的反应管（重组酶、Bst DNA聚合酶、SSB蛋白、修复酶和dNTPs）中，然后向每个反应管中加入2.5μL 300mM 醋酸镁溶液。将以上反应体系混合均匀，置 PCR 反应仪 36°C条件下反应 30 min。RAA反应结束后，打开Eppendorf管，吸取扩增产物至一新的Eppendorf管中，做好标记，并稀释50倍，马上进行试纸检测。
3、LFD试纸条操作
LFD操作步骤如下：将LFD试纸条的浸液区端(标示蓝色箭头向上)插入Eppendorf管，液面不得超过浸液区的MAX指示线，待判读区域全部浸润(约需30-60s)，将试纸平放1-3min，等待红色条带出现。根据试纸条显色情况直接读取检测结果。本方法一般1min左右即能出现条带，10min内观察结果，10min后判读无效。
4、灵敏度实验
以含NS2基因片段的标准质粒为模板评价RAA-LFD法敏感性经梯度稀释得到不同浓度（103、10和5个拷贝/μL），或0.1ng/μL和0.01ng/μL猫细小病毒基因组DNA为模板评价RAA-LFD法敏感性，各取1μL进行RAA反应，反应产物后经LFD试纸条操作，根据结果判断上述实验组和对照组的灵敏度。结果如图9所示，实验组能够检出103、10和5个拷贝/μL的标准质粒以及0.1ng/μL猫细小病毒基因组DNA，而对照组仅能检出103拷贝/μL的标准质粒、无法检测猫细小病毒基因组DNA，再次说明了实验组的灵敏度高于对照组。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猫消化道病毒性PCR检测的试剂盒，包括：
上游引物F1：5’-tctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccg-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物R1：5’-ctctcaggtctgcctctatttcggaccacgtcg-3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针P1：5’-gactcgcttgcacgtctttgtgagtaacgc/iFAM6dT/c/THF/c/iBHQ1dT/gttggtttgattgtt (C3-spacer)-3’，如SEQ ID NO.3所示；
其中，iFAM6dT为荧光基团，THF为四氢呋喃位点，iBHQ1dT为荧光猝灭基团，(C3-spacer)为封闭基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括RAA冻干粉、醋酸镁溶液、反应缓冲液和标准质粒；RAA冻干粉包括重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合酶和dNTPs，所述标准质粒为携带猫细小病毒NS2基因的特异性序列的载体，所述特异性序列如SEQ ID NO.7所示。
3.一种猫消化道病毒性PCR检测的试剂盒，包括：
上游引物：5’-tctgactccggacgtagtggaccttgcactggaaccg-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’-FITC-ctctcaggtctgcctctatttcggaccacgtcg-3’，如SEQ ID NO.8所示；
探针：5’-BIOTIN-gactcgcttgcacgtctttgtgagtaacgc/c/THF/c/gttggtttgattgtt-PHO-3’，如SEQ ID NO.9所示；
其中，FITC为荧光基团，BIOTIN为生物素，THF为四氢呋喃位点，PHO为磷酸修饰基团。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，还包括RAA冻干粉、醋酸镁溶液、反应缓冲液和LFD试纸条；所述LFD试纸条的检测线上带有生物素抗体和荧光基团抗体，质控线上带有亲和素-胶体金特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述RAA冻干粉包括重组酶、Bst DNA聚合酶、SSB蛋白、修复酶和dNTPs。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，还包括标准质粒，所述标准质粒为携带猫细小病毒NS2基因的特异性序列的载体，所述特异性序列如SEQ ID NO.7所示。
7.根据权利要求1、2或3所述的试剂盒，还包括DNA提取试剂。
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