CN116814857A

CN116814857A - 猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法

Info

Publication number: CN116814857A
Application number: CN202310861644.9A
Authority: CN
Inventors: 赵洪进; 桂亚萍; 钱卫东; 白艺兰; 刘健; 王建; 杨显超; 王曲直; 陶军; 陈备娟; 齐新永; 夏炉明; 朱晓英; 张玉杰; 向蒙
Original assignee: Shanghai Animal Epidemic Prevention And Control Center (shanghai Veterinary Drug Feed Testing Institute And Shanghai Animal Husbandry Technology Promotion Center)
Current assignee: Shanghai Animal Epidemic Prevention And Control Center (shanghai Veterinary Drug Feed Testing Institute And Shanghai Animal Husbandry Technology Promotion Center)
Priority date: 2023-07-14
Filing date: 2023-07-14
Publication date: 2023-09-29

Abstract

本发明提供了一种猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法，试剂盒包括猫细小病毒、引物对、探针、缓冲液和乙酸镁，猫细小病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，引物对的序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.8所示，探针的序列如SEQ ID NO.9所示；本发明通过利用重组酶聚合酶扩增技术结合荧光探针技术，本发明试剂盒建立的检测方法灵敏度高于荧光PCR，检测限可达8.47 copies/μL，实现对猫细小病毒核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单等优势。

Description

猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法。

背景技术

猫细小病毒病又称猫瘟、猫泛白细胞减少症、猫传染性肠炎，是由猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)感染引起的一种高接触性、高致死率传染病。该病于1928年由欧美学者发现，但直到1957年病毒才获得分离培养。FPV是目前肉食兽细小病毒中感染范围最广、致病性最强的一种病毒，在世界各地均有分布。在自然条件下，FPV可感染猫科、浣熊科和鼬科等多种动物，其中主要以小型猫科动物为主。各种年龄段的猫均可感染，幼猫的感染率甚至超过90％。感染FPV后出现呕吐、贫血、出血性胃肠炎等严重临床症状，幼猫表现为共济失调、免疫抑制，孕猫则会引起流产。FPV的传播途径较为广泛，不仅可经唾液等分泌物直接接触传播，也可通过衣物、饲饮用具等进行间接传播，甚至可通过母猫进行垂直传播。此外，FPV对外界环境有着较强的抵抗能力，即使存在于环境中长达几年仍具有传染性，且不易被杀灭。家养宠物猫主要通过宠主的衣物等间接接触感染该病毒。FPV具备的高感染性、广泛的宿主以及高致死率对猫科动物健康构成极大威胁。

由于现有的FPV商品化疫苗无法产生完全保护力和猫群养殖数量的快速增长给该病毒的传播与进化提供的有利条件，导致临床FPV感染病例治疗难度逐渐增大。因此，及时发现并掌握FPV的流行现状及感染情况对控制该病的传播和制定治疗措施具有关键作用。当前阶段检测FPV的方法主要是病原分离培养法、免疫学方法和核酸检测法等。其中，病原分离培养法存在操作复杂、耗时长、仪器设备及操作人员要求高等缺点，不适合早期、现场快速诊断；免疫学方法由于前期需要制备高质量的抗原或特异性抗体，致使检测易出现假阴性或假阳性结果，无法广泛应用于基层单位；PCR作为经典的分子检测方法已广泛应用于病原的快速诊断，其中荧光PCR技术是当前病原检测的金标准，但该方法对设备和人员要求较高，程序繁琐且耗时相对较长，很难满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求。本方法在重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification,RPA)技术的基础上，进而借助荧光探针技术高灵敏性优势，建立猫细小病毒荧光RPA检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

猫细小病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

扩增上述的猫细小病毒的引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示。

一种检测猫细小病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述的猫细小病毒和上述的引物对。

优选地，试剂盒还包括探针、缓冲液和乙酸镁。

优选地，探针的序列如SEQ ID NO.9所示。

优选地，缓冲液包括dNTPs、T4 UvsX重组酶、T4 UvsY重组酶、T4 gp32、Bsu DNA聚合酶。

一种利用上述的检测细小病毒的试剂盒进行荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)的方法，该方法包括如下步骤：

(1)、针对FPV基因筛选靶向序列，在靶向基因内设计并合成上、下游引物，将其稀释至工作浓度；

(2)、将稀释后的引物对、靶向序列和探针一起加入到RPA反应体系中进行等温扩增，同时读取荧光值，根据荧光曲线和荧光值判定方法是否成立。

优选地，步骤(1)中，靶向序列如SEQ ID NO.10所示。

优选地，步骤(1)中，引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示。

优选地，步骤(1)中，探针的序列如SEQ ID NO.9所示。

另外，检测FPV的RPA检测方法的步骤：在靶向基因内设计相应引物，合成和稀释至工作浓度，将引物与靶向序列一起加入到RPA反应体系中，将扩增产物与酚氯仿进行等体积混合，离心(离心的转速为5000rpm，时间为5min)，取上清液进行1％凝胶电泳，观察电泳条带是否与目的条带大小一致，将RPA产物进行测序比对，确认扩增序列为FPV目标序列。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种猫细小病毒核酸快速检测试剂盒，通过利用RPA技术结合荧光探针技术，建立FPV的荧光RPA检测试剂盒，实现对猫细小病毒核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单等优势。猫细小病毒常用的检测方法为荧光PCR，其检测限达10copies/μL，本发明试剂盒建立的检测方法灵敏度高于荧光PCR，检测限可达8.47copies/μL。

本发明提供的一种利用猫细小病毒核酸试剂盒检测猫细小病毒核酸的方法，在恒温条件下，全程1h内就能完成样品核酸提取以及检测。满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求。

附图说明

图1显示了不同引物对普通RPA检测结果图(M.DL2000 DNAMarker；1-4.引物对1-引物对4)。

图2显示了引物对FPV1F/FPV1R普通RPA扩增产物测序后BLAST结果图。

图3显示了不同引物对荧光RPA检测结果图。

图4显示了荧光RPA敏感性检测结果图。

图5显示了荧光RPA特异性检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种猫细小病毒及其试剂盒和荧光重组酶聚合酶扩增的方法。

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明中RPA体系中的无核酸酶水(RNase free water)、缓冲液(RehydrationBuffer)和乙酸镁(MgAc)均来自乐尚生物科技(无锡)有限公司试剂盒(Lesunbio，普通RPA检测试剂盒产品编号：DNA-LS01，荧光RPA检测试剂盒产品编号：DNA-LS02)；猫细小病毒标准DNA、RPA引物对和探针合成均由上海赛恒生物科技有限公司完成；Magen磁珠法抽提试剂盒(Magen，产品编号：Md5416-01)；ABI ViiA7实时荧光定量PCR仪(可用QT-F1620RPA荧光检测仪等同仪器代替)。

实施例1

猫细小病毒标准DNA的制备及RPA引物对和探针

本发明针对猫细小病毒FPV-BJ04株保守基因NS1(FPV FPV-BJ04株NS1，登录号为MH165481.1，全长2007bp)，筛选出其中一段基因片段(NS1的850位至1253位，其DNA序列如SEQ ID NO.10所示，该基因片段命名为猫细小病毒标准DNA)，依据该猫细小病毒标准DNA特别设计的RPA引物对以及探针可以高灵敏度和高特异性的检测猫细小病毒。

猫细小病毒毒株标准DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)：

5’-TCAATCAAATGTACTTTGCGGGACTTGGTTAGTAAAAGAGTAACATCACCTGAA GACTGGATGATGTTACAACCAGATAGTTATATTGAAATGATGGCACAACCAGGAGGTGAAAATCTTTTAAAAAATACACTTGAAATTTGTACTTTGACTTTAGCAAGAACAAAAACAGCATTTGAATTAATACTTGAAAAAGCAAATAATACTAAACTAACTAACTTTGATCTTGCAAATTCTAGAACATGTCAAATTTTTAGAATGCACGGATGGAATTGGATTAAAGTTTGTCACGCTATAGCATGTGTTTTAAATAGACAAGGTGGTAAAAGAAATACAGTTCTTTTTCATGGACCAGCAAGTACAGGAAAATCTATTATTGCTCAAGCCATAGCACAAGCTGTGGG-3’。

设计的用于扩增猫细小病毒标准DNA的RPA引物对，包括正向引物和反向引物(见表1)。

表1FPV的RPA引物序列

设计的用于结合猫细小病毒荧光RPA扩增产物的探针(FPV Probe)(SEQ IDNO.9)，如下：

FPV Probe：5’-ATTTGAATTAATACTTGAAAAAGCAAATAAT[FAM-dT](THF)CT[BHQ1-dT]AAACTAACTAACTTT(C3-Spacer)-3’(位置1023-1071)。

缓冲液包括dNTPs、T4 UvsX重组酶、T4 UvsY重组酶、T4 gp32、Bsu DNA聚合酶。

实施例2

本实施例提供了一种猫细小病毒普通RPA检测体系。

猫细小病毒普通RPA检测体系(50μL)包括：

正向引物(如表1所示)：浓度10μM，体积2μL；

反向引物(如表1所示)：浓度10μM，体积2μL；

缓冲液：体积25μL；

乙酸镁：浓度280mM，体积3μL；

ddH₂O：16μL；

待检样本核酸：2μL。

实施例3

猫细小病毒普通RPA最佳引物对的筛选和产物验证

本实施例应用普通RPA检测方法对靶向序列SEQ ID NO.10实施检测，验证4对引物的特异性和敏感性。

在相同的检测体系中，应用不同的引物对进行普通RPA检测，产物加入等体积的酚/氯仿混合液充分混匀，5000rpm离心5min，取上清利用1％琼脂糖电泳法分析不同引物的产物扩增效率，检测结果见图1。研究结果表明引物对FPV1F/FPV1R和FPV3F/FPV3R的条带特异性和敏感性均较好。选择引物对FPV1F/FPV1R普通RPA扩增产物进行测序，测序结果在NCBI上进行BLAST，结果见图2。研究表明引物对FPV1F/FPV1R普通RPA扩增产物序列为猫细小病毒，符合RPA检测体系要求。

实施例4

本实施例提供了一种猫细小病毒荧光RPA检测体系。

猫细小病毒荧光RPA检测体系(50μL)包括：

正向引物(如表1所示)：浓度10μM，体积2.1μL；

反向引物(如表1所示)：浓度10μM，体积2.1μL；

探针(FPVProbe)：浓度10μM，体积0.6μL；

缓冲液：体积25μL；

乙酸镁：浓度280mM，体积3μL；

ddH₂O：15.2μL；

待检样本核酸：2μL。

实施例5

猫细小病毒荧光RPA最佳引物对的筛选

本实施例应用荧光RPA检测方法对靶向序列SEQ ID NO.10实施检测，验证4对引物和探针的特异性和敏感性。

在相同的检测体系中，应用不同的引物对进行荧光RPA检测，检测结果见图3。研究结果表明引物对FPV1F/FPV1R、FPV2F/FPV2R和探针FPV Probe的曲线特异性和敏感性均较好，符合荧光RPA检测体系要求。结合猫细小病毒普通RPA引物对筛选结果，最终确定引物对FPV1F/FPV1R为FPV荧光RPA检测方法的引物。

实施例6

猫细小病毒荧光RPA灵敏度验证

标准模板质粒DNA的制备：由上海赛恒生物科技有限公司合成猫细小病毒标准DNA(SEQ ID NO.10)，并插入到pUC57载体中，构建猫细小病毒的标准模板质粒DNA，命名为FPV_pUC57，继而转化入E.coli大肠杆菌内。猫细小病毒标准DNA(SEQ ID NO.10)在添加了200μg/mL(终浓度)氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8h后，按照Magen磁珠法抽提试剂盒(Magen，产品编号：Md5416-01)说明书进行质粒提取。通过超微量分光光度计测得提取的FPV_pUC57浓度为289ng/μL，根据公式(质粒拷贝数copies/μL)＝(6.02×10²³copies/μL)×(质粒浓度g/μL)/(3114×660g/mol)计算出FPV_pUC57拷贝数浓度为8.47×10¹⁰copies/μL。

将FPV_pUC57进行10倍梯度稀释，制备浓度从8.47×10⁷copies/μL到8.47×10^- ¹copies/μL的系列浓度的标准模板质粒DNA，将其作为模板DNA(待测样品)。阴性对照：模板DNA用灭菌双蒸水替代。然后按照实施例4实施，结果如图4所示，当模板浓度为8.47×100copies/μL时，荧光曲线仍有上升，则该方法检测猫细小病毒的灵敏度可达8.47×100copies/μL。

实施例7

猫细小病毒荧光RPA特异性验证

将FPV_pUC57、猫传染性腹膜炎病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒1型、犬冠状病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬瘟热病毒的基因组DNA作为模板DNA(浓度为1.00×10⁵copies/μL)。然后按照实施例4实施，结果如图5所示，猫细小病毒的检测体系与其他病原体并无交叉反应，特异性较好。

实施例8

猫细小病毒荧光RPA临床样品的核酸检测

为了进一步评价本发明建立的猫细小病毒荧光RPA核酸快速检测试剂盒及检测方法的效果，对64份临床样品，利用Magen磁珠法病毒抽提试剂盒(磁珠法)(Magen，产品编号：Md5416-01)以及全自动核酸提取仪(KingFisher-700)提取待测样品DNA，分别按照实施例4和猫细小病毒荧光PCR试剂盒(上海尔创生物科技有限公司，产品编号：EC20210603)对样品进行核酸快速检测。

对64份临床样品猫细小病毒检测结果进行分析，其中23份为猫细小病毒阳性样品，有41份为猫细小病毒阴性样品；结果临床样品的检测结果如表2所示，23份阳性检测结果与荧光定量PCR检测一致，40份阴性样品检测结果与荧光定量PCR检测一致，而本发明建立的检测方法的检测结果与荧光定量PCR检测结果敏感性为95.83％，特异性为100％(表2)。

表2荧光RPA和荧光定量PCR方法的临床样本检测结果比对

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.猫细小病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.扩增权利要求1所述的猫细小病毒的引物对的序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.8所示。

3.一种检测猫细小病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的猫细小病毒和权利要求2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括探针、缓冲液和乙酸镁。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的序列如SEQ ID NO.9所示。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液包括dNTPs、 T4 UvsX重组酶、T4 UvsY重组酶、T4 gp32、Bsu DNA聚合酶。

7.一种利用权利要求3-6任一项所述的检测细小病毒的试剂盒进行荧光重组酶聚合酶扩增的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）、针对猫细小病毒的靶向序列设计引物对，并稀释；

（2）、将稀释后的引物对、靶向序列和探针进行重组酶聚合酶扩增，同时读取荧光值，根据荧光曲线和荧光值判定方法是否成立。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述靶向序列如SEQ ID NO.10所示。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述引物对的序列如SEQ IDNO.1- SEQ ID NO.8所示。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述探针的序列如SEQ IDNO.9所示。