CN117051175A

CN117051175A - 半生物合成皮草及其制备方法

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Publication number: CN117051175A
Application number: CN202311132944.XA
Authority: CN
Inventors: 顾鸿斌
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2023-09-05
Filing date: 2023-09-05
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2043-09-05
Also published as: CN117051175B

Abstract

本发明公开了半生物合成皮草及其制备方法，且半生物合成皮草的制备方法包括S1)毛发的获取、S2)毛发集束的准备、S3)组织鞘的整合和培养、S4)表皮细胞的合成以及S5)皮毛的结合。本发明一方面通过梳毛的方式无痛化且可持续地从动物身上获得所需的针毛和绒毛并组成毛发集束，另一方面从动物的血液内提取干细胞并诱导多能干细胞培育分化出所需的细胞和组织以构成人造皮层，最终可利用生物粘结的方式将毛发集束嵌入所造的人造皮层内并形成半生物合成皮草，所制备的半生物合成皮草不但从性能仿生性等方面与天然皮草几乎无异，而且相较于传统的人造皮草而言对于环境生态污染极小，还能够减少动物杀戮，维护如动物饲养人员等原产业就业人员的权益。

Description

半生物合成皮草及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及皮草的技术领域，特别是半生物合成皮草及其制备方法的技术领域。

【背景技术】

天然皮草由动物的皮毛所制成，保暖效果较好，外观较为美观。其中，狐狸、貂、貉子、獭兔、牛和羊等毛皮兽动物都是天然皮草原料的主要来源。近年来，在动物保护主义者的倡议下，人造皮草越来越流行。尽管关于天然皮草和人造皮草哪个更环保的话题尚无定论，但是比起动辄数万的天然皮草，人造皮草由于价格更为低廉，在经济上更容易被消费者所接受。

传统的人造皮草的制备方式为采用腈纶、改性腈纶和氯纶等合成纤维织造形成长毛绒型织物，如公开号为CN111041701A的发明专利所公开的一种仿狐狸毛面料的制备工艺以及公告号为CN111101300B的发明专利所公开的一种人造毛皮地毯的制备方法。虽然随着技术的升级，人造皮草的质感越来越逼真，远看能够以假乱真，但是外观在整体上与天然皮草还是存在一定的区别，且保暖性往往不及天然皮草。

此外，由于不同的天然皮草的原料价格相距甚远，因此部分厂商选择对原料价格较低的皮草进行二次加工以制备出能够模仿原料价格较高的皮草的人造皮草，从而在保障人造皮草质感逼真的情况下，大大降低人造皮草的售价，如公开号为CN105803132A的发明专利所公开的一种山羊毛皮加工工艺。但是，此种方式仍然需要对动物剥皮取毛，不仅原料获取方式较为残忍，而且也容易因动物保护人士的反对而被影响销售。

【发明内容】

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出半生物合成皮草及其制备方法，所制备的半生物合成皮草不但从性能仿生性等方面与天然皮草几乎无异，而且相较于传统的人造皮草而言对于环境生态污染极小，还能够减少动物杀戮，维护如动物饲养人员等原产业就业人员的权益。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

半生物合成皮草的制备方法，包括如下步骤：

S1)毛发的获取：从动物身上获取原毛混合物，对原毛混合物进行除杂并得到毛发；

S2)毛发集束的准备：对步骤S1)中所获得的毛发进行分拣并分别得到针毛(GuardHair)和绒毛(Under-hair)，根据动物自身的针毛和绒毛的分布比例将针毛和绒毛按比例排列混合成束并得到毛发集束；

S3)组织鞘(Connective tissue sheath,CTS)的整合和培养：按照动物自身的单位面积内的针毛的分布数量将步骤S2)中所获得的毛发集束于组织鞘细胞之上均匀排列并进行培养直至细胞与毛发集束相融合；

S4)表皮细胞的合成：从动物的血液内提取干细胞并将干细胞重新编程恢复至多能状态，利用诱导性多能干细胞定向合成动物的表皮层和/或真皮层构成所需要的各类角质细胞与纤维细胞；

S5)皮毛的结合：根据动物自身的表皮层和/或真皮层的结构，使步骤S4)中所获得的各类角质细胞与纤维细胞依序在负载有毛发集束的组织鞘之上生长。

作为优选，在所述步骤S1)中，在换毛季节通过梳理(Woolization)的方式从动物身上梳理收集原毛混合物，将原毛混合物浸泡在PH为8～10且温度为35～45℃的碱性溶液内0.5～1.5h以除去混杂的脂肪和毛脚。

作为优选，在所述步骤S3)中，采用体外培养的成纤维细胞作为组织鞘细胞来源。

作为优选，在所述步骤S3)中，采用添加了8～12％的胎牛血清以及0.5～1.5％的抗生素-抗真菌剂的DMEM/F-12培养基作为培养负载有毛发集束的组织鞘细胞的培养基，将负载有毛发集束的组织鞘细胞于温度为36.5～37.5℃且CO₂浓度为4.5～5.5％的培养环境中培养15～25天并允许组织鞘细胞与毛发集束进行交互，同时保持组织鞘细胞的细胞密度为0.5×10⁵～1.5×10⁵个/cm²。

作为优选，所述步骤S4)具体如下：

S41)外周血单个核细胞(PBMCs)的分离：从动物的血液内分离出外周血单个核细胞；

S42)外周血单个核细胞的初步增殖：将步骤S41)中所获得的外周血单个核细胞培养形成单层的附着细胞并洗脱非附着细胞；

S43)外周血单个核细胞的定向培养：将步骤S42)中所获得的单层的附着细胞接种至培养基之上，再在加入重编程载体之后进行电转染；

S44)外周血单个核细胞的扩增传代：手动挑选出类似人工诱导多能干细胞(iPSC)的群落，再在培养基内进行扩增并定期进行传代。

作为优选，在所述步骤S42)中，采用StemPro 34SFM培养基作为培养外周血单个核细胞的培养基，将外周血单个核细胞于温度为36.5～37.5℃且CO₂浓度为4.5～5.5％的培养环境中进行培养并定期采用磷酸盐缓冲生理盐水进行非附着细胞的洗脱以及更换培养基。

作为优选，在所述步骤S43)中，培养基为StemPro 34SFM培养基，重编程载体为Epi5 Episomal重编程载体，利用P2 Primary Cell Kit进行电转染。

作为优选，在所述步骤S44)中，培养基为mTeSR+培养基，每隔4～6天使用GCDR进行传代，扩增传代环境保持温度为36.5～37.5℃、CO₂浓度为4.5～5.5％且O₂浓度为18～22％。

作为优选，还包括如下步骤S6)：

S6)皮毛的后处理：对皮毛进行硝制处理。

半生物合成皮草，由上述制备方法所制得。

本发明的有益效果：

本发明一方面通过梳毛的方式无痛化且可持续地从动物身上获得所需的针毛和绒毛并组成毛发集束，另一方面从动物的血液内提取干细胞并诱导多能干细胞培育分化出所需的细胞和组织以构成人造皮层，最终可利用生物粘结的方式将毛发集束嵌入所造的人造皮层内并形成半生物合成皮草，所制备的半生物合成皮草不但从性能仿生性等方面与天然皮草几乎无异，而且相较于传统的人造皮草而言对于环境生态污染极小，还能够减少动物杀戮，维护如动物饲养人员等原产业就业人员的权益。

本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。

【附图说明】

图1是毛发集束的实物图；

【具体实施方式】

实施例一：

以仿制水貂皮草为例制备半生物合成皮草，制备步骤如下：

S1)毛发的获取：

由于大部分的皮草动物为哺乳动物，具有角质层变化脱落(退毛脱毛)的特点，因而可对其毛发进行梳理收集，从而把取皮动物价值变为可持续的无痛化利用。具体而言，在换毛季节(夏季)通过梳理的方式从被麻醉的水貂身上梳理收集原毛混合物(即羊毛化利用)，将原毛混合物浸泡在PH为9且温度为40℃的碱性溶液内1h以除去混杂的脂肪和毛脚。

S2)毛发集束的准备：

利用人工分拣的方式对步骤S1)中所获得的毛发进行分拣并分别得到针毛和绒毛，根据水貂自身的针毛和绒毛的分布比例将针毛和绒毛按比例排列混合成束并得到毛发集束。由于水貂的针毛和绒毛分布比例通常为1：60～70，因而此处将针毛和绒毛按照1：65的比例排列混合成束并得到毛发集束。其中，含有不同根数的毛发的毛发集束的实物图如图1所示。

S3)组织鞘的整合和培养：

按照水貂自身的单位面积内的针毛的分布数量将步骤S2)中所获得的毛发集束于组织鞘细胞之上均匀排列并进行培养直至细胞与毛发集束相融合。由于水貂的单位面积内的针毛的分布数量为479～540根/cm²，因而此处将毛发集束按照500个/cm²的分布密度按网状均匀分布在组织鞘细胞之上并以此作为皮胆各细胞培养基。具体而言，选用直径为90mm的细胞培养皿并确保细胞培养皿的表面干净无菌，加入添加了10％的胎牛血清(FBS)以及1％的抗生素-抗真菌剂的DMEM/F-12培养基，在培养基之上加入组织鞘细胞并使组织鞘细胞的细胞密度为1×10⁵个/cm²，再利用显微操作器具将毛发集束小心地放置在培养皿内的组织鞘细胞之上，最后在温度为37℃且CO₂浓度为5％的培养环境中将负载有毛发集束的组织鞘细胞培养21天并允许组织鞘细胞与毛发集束进行交互。其中，采用体外培养的成纤维细胞作为组织鞘细胞来源。在培养期间，可每隔3～4天更换一次培养基以保持养分供应，同时定期使用显微镜观察细胞的生长状态和毛发集束的整合情况。若组织鞘细胞因扩增而出现密度增加的现象，可将多余的组织鞘细胞分割到新的培养皿之中以保持合适的细胞密度。此外，在培养结束后，还可通过细胞分析、显微镜观察和染色等方式以评估细胞与毛发集束的相互作用。

S4)表皮细胞的合成：

从水貂的血液内提取干细胞并将干细胞重新编程恢复至多能状态(即iPSC诱导性多能干细胞)，利用诱导性多能干细胞定向合成水貂的表皮层和/或真皮层构成所需要的各类角质细胞与纤维细胞，具体步骤如下：

S41)外周血单个核细胞的分离：

利用6ml的抽吸管对全身麻醉的水貂骨脊无菌地吸取血液并轻轻地振荡混合，采用SepMate分离管从50ml的供体血液内分离出外周血单个核细胞并转移至50ml的圆锥离心管之中，再向含有PBMCs的圆锥离心管内加入5ml的RPMI 1640培养基并轻轻振荡；

S42)外周血单个核细胞的初步增殖：

将PBMCs转移到175cm²的通气瓶之中，在标准条件(5％ CO²和37℃)下的孵化箱之中于StemPro 34SFM培养基内进行培养，在培养24h后移除培养基并利用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)进行洗涤以去除非附着细胞，同时每3天更换一次培养基，直至附着细胞形成单层，在附着细胞形成单层之后可利用胰蛋白酶-EDTA进行处理并采用PBS进行洗涤，再在计数之后按照密度为2×10⁶/瓶分配到新的175cm²通气瓶之中并于相同的条件(5％ CO²和37℃)下进行孵育，最后根据需要重复上述步骤数次以获得更多PBMCs；

S43)外周血单个核细胞的定向培养：

向6孔板之中接种PBMCs并使细胞个数为1×10⁶/孔，向各个孔内分别加入Epi5Episomal重编程载体以及1ml的StemPro 34SFM培养基，再使用P2Primary Cell Kit对PBMCs进行电转染，同时每天对培养基进行补充；

S44)外周血单个核细胞的扩增传代：

在电转染后的第9天，手动挑选出类似人工诱导多能干细胞的群落并在mTeSR+培养基中扩增，同时使细胞每4～6天使用GCDR(STEMCELL Technologies)进行传代，整个过程保持在37℃、5％ CO₂以及20％ O₂的环境下。

S5)皮毛的结合：

根据水貂自身的表皮层和/或真皮层的结构，使步骤S4)中所获得的各类角质细胞与纤维细胞依序在负载有毛发集束的组织鞘之上生长。此外，由于真实的水貂毛皮在应用过程中会剔除大量的下皮层hypo-dermis的脂肪，所以在定向合成期间可筛选取消脂肪和血管等结构。其中，水貂自身的表皮层的主要合成细胞的种类、厚度和排列方向(由外向内)如下：

①角质层——角质细胞，为10层扁平无核的细胞，厚度是20μm；

②透明层——透明层细胞，为较扁平细胞，厚度是10μm；

③颗粒层——颗粒细胞，为扁平状细胞，厚度是0.45μm；

④棘细胞层——棘细胞，厚度是0.15μm；

⑤基底层——基底细胞，为活跃的干细胞，厚度是0.075μm。

S6)皮毛的后处理：

根据生长发展的具体情况，等待有明显的细胞分层之后，利用硝制工艺得到半生物合成皮草。由于硝制工艺为皮草领域的常见工艺，故不再赘述。

实施例二、毛发牢固性测试：

将实施例一的经过整合和培养的长度约为1cm的毛发集束取出并作为样本，再模拟缓慢的拉伸力(设置拉伸速度为1mm/s)进行拉伸，记录拉伸期间的应变(拉伸长度相对于初始长度的比例)和应力(施加的拉伸力除以初始截面积)以及拉伸过程中毛发集束的抗拉强度、最大拉伸力和断裂强度。

在拉伸实验中，记录的数据如下：

初始长度：1cm；

最大拉伸长度：1.8cm；

最大施加力：20N；

初始截面积为1mm²；

应变＝(最大拉伸长度-初始长度)/初始长度＝(1.8cm-1cm)/1cm＝0.8；

应力＝最大施加力/初始截面积＝20N/1mm²＝20N/mm²＝20MPa。

实施例三、毛发剪切测试：

将实施例一的经过整合和培养的长度约为1cm的毛发集束取出并作为样本，再模拟适度的剪切应力(设置剪切速度为2mm/s)进行剪切，记录剪切过程施加的剪切力和毛发集束的响应，观察毛发是否发生断裂或移位。

在剪切过程中，记录的数据如下：

施加的最大剪切力：10N；

初始截面积为1mm²；

剪切应力＝施加的最大剪切力/初始截面积＝10N/1mm²＝10N/mm²＝10MPa。

实施例四、毛发弯曲测试：

将实施例一的经过整合和培养的长度约为1cm的毛发集束取出并作为样本，模拟较小的曲率情况(设置弯曲测试设备的曲率半径为5mm)进行弯曲，记录在给定曲率下毛发集束的应变和应力，观察毛发是否发生断裂或形变。

在弯曲测试中，采用曲率半径为5mm的弯曲测试设备。记录的数据如下：

在5mm曲率下的应变：0.05(表示5％的伸长)；

初始截面积为1mm²；

施加的弯曲力为10N；

根据这个应变计算出在5mm曲率下的应力，则弯曲应力＝施加的弯曲力/初始截面积＝10N/1mm²＝10N/mm²＝10MPa。

实施例五、毛发的湿度测试：

将实施例一的经过整合和培养的长度约为1cm的毛发集束取出并作为样本，再将样本置于80％相对湿度的环境内以模拟高湿度条件，观察毛发集束在湿润环境下的变化(包括变形和颜色变化等)。

在湿度测试中，将经过整合和培养的毛发集束放置在80％相对湿度的环境中。在湿度环境下观察到的现象为毛发集束略微变形且毛发的颜色变得稍微深一些。这些观察结果表明毛发在高湿度条件下可能会吸收水分，导致轻微的形变和颜色变化。

上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims

1.半生物合成皮草的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2)毛发集束的准备：对步骤S1)中所获得的毛发进行分拣并分别得到针毛和绒毛，根据动物自身的针毛和绒毛的分布比例将针毛和绒毛按比例排列混合成束并得到毛发集束；

S3)组织鞘的整合和培养：按照动物自身的单位面积内的针毛的分布数量将步骤S2)中所获得的毛发集束于组织鞘细胞之上均匀排列并进行培养直至细胞与毛发集束相融合；

2.如权利要求1所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于：在所述步骤S1)中，在换毛季节通过梳理的方式从动物身上梳理收集原毛混合物，将原毛混合物浸泡在PH为8～10且温度为35～45℃的碱性溶液内0.5～1.5h以除去混杂的脂肪和毛脚。

3.如权利要求1所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于：在所述步骤S3)中，采用体外培养的成纤维细胞作为组织鞘细胞来源。

4.如权利要求3所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于：在所述步骤S3)中，采用添加了8～12％的胎牛血清以及0.5～1.5％的抗生素-抗真菌剂的DMEM/F-12培养基作为培养负载有毛发集束的组织鞘细胞的培养基，将负载有毛发集束的组织鞘细胞于温度为36.5～37.5℃且CO₂浓度为4.5～5.5％的培养环境中培养15～25天并允许组织鞘细胞与毛发集束进行交互，同时保持组织鞘细胞的细胞密度为0.5×10⁵～1.5×10⁵个/cm²。

5.如权利要求1所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于，所述步骤S4)具体如下：

S41)外周血单个核细胞的分离：从动物的血液内分离出外周血单个核细胞；

S44)外周血单个核细胞的扩增传代：手动挑选出类似人工诱导多能干细胞的群落，再在培养基内进行扩增并定期进行传代。

6.如权利要求5所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于：在所述步骤S42)中，采用StemPro 34SFM培养基作为培养外周血单个核细胞的培养基，将外周血单个核细胞于温度为36.5～37.5℃且CO₂浓度为4.5～5.5％的培养环境中进行培养并定期采用磷酸盐缓冲生理盐水进行非附着细胞的洗脱以及更换培养基。

7.如权利要求5所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于：在所述步骤S43)中，培养基为StemPro 34SFM培养基，重编程载体为Epi5 Episomal重编程载体，利用P2Primary Cell Kit进行电转染。

8.如权利要求5所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于：在所述步骤S44)中，培养基为mTeSR+培养基，每隔4～6天使用GCDR进行传代，扩增传代环境保持温度为36.5～37.5℃、CO₂浓度为4.5～5.5％且O₂浓度为18～22％。

9.如权利要求1所述的半生物合成皮草的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤S6)：

S6)皮毛的后处理：对皮毛进行硝制处理。

10.半生物合成皮草，由权利要求1至9中任一项的制备方法所制得。