CN102226169A - 山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，利用皮肤成纤维细胞外基质诱导和机械分离与酶消化相结合的方法，启动了ORSC的原代培养，并利用不同培养液，成功建立了山羊毛囊外根鞘细胞系。利用本发明构建的山羊毛囊外根鞘细胞系已稳定传至第40代以上，且生长分裂状态良好。本发明不仅可为阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及其调控机制提供研究模型；为提高山羊毛产量和羊绒品质的育种改良奠定基础；还可为提高羊毛品质、数量和毛皮花纹品质乃至医学领域的人类毛发再生研究等奠定基础。
Description
一、技术领域
本发明涉及山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，属于细胞生物学领域。
二、技术背景
毛囊（Hair follicle）是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官，是由胚胎期神经外胚层与间充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官，具有独特的结构和周期性再生的能力。毛囊在形成与分化过程中至少涉及到20余种不同的细胞群，主要由毛乳头、毛母质、内根鞘和外根鞘等细胞组成。其中，外根鞘细胞（Outer root sheath cell, ORSC）作为一种重要的毛囊上皮细胞，因具有高度增生的潜能，在毛发再生、伤口愈合、初级毛囊和次级毛囊分化等生理过程中均起着重要作用，因而越来越受到高度关注。
自Wetering 等（1981）利用经钴源照射后的牛晶状体包膜囊作为支持物，成功诱导人毛囊外根鞘细胞迁移出游离毛囊以来，已有不少学者针对ORSC体外培养体系与技术进行过改进。其中，Well等（1982）将分离的毛囊直接接种到塑料培养皿中，在控制培养液pH不高于7.2的条件下，贴壁毛囊周围便可游离出外根鞘细胞，但该方法获得的外根鞘细胞产量低且再生能力差，不便于进行进一步的研究与大量的应用。迄今，已有多种细胞分离技术和细胞培养方法运用于ORSC的体外培养，其中，较为常用的培养方法有两种：一种是将分离的毛囊经胰蛋白酶消化处理后，用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，然后接种于经丝裂霉素处理的3T3细胞滋养层上，37℃、5%CO2条件下进行原代培养（Rheinwald K. et al., 1985; Limat A. et al., 1986; Sabolinski M. L. ea al., 1996; Naughton G. et al., 1997; McElwee K. J. et al., 2003; 唐建兵等，2005）；另一种则是利用胶原包埋法进行外根鞘细胞的培养：分离带有外根鞘部位的毛囊，37℃下进行胰酶消化处理，随后将毛囊转移至Ⅰ型和Ⅳ型胶原包被的塑料培养皿中，加入含有10%FBS的DMEM培养液进行培养，待毛囊牢固贴附于培养皿底壁后，换用无血清的DMEM培养液进行培养（Detmar M. et al., 1993; Sotaro K. et al., 1994; Limat A. et al., 1996; Schirren C.G. et al., 1997; Oshima H. et al., 2001; Juergen S. et al., 2008; 伍津津等，2008）。以上两种方法虽均能获得毛囊外根鞘细胞，但仍存在少量非外根鞘细胞，且细胞传至8~10代后出现凋亡现象，以致无法继续进行传代培养。
上述外根鞘细胞的培养多以人的毛囊为细胞的组织来源。对于其它哺乳动物ORSC的培养，主要借鉴人毛发外根鞘细胞培养方法。研究表明，将分离得到的小鼠触须毛囊接种于含有表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）及10%FBS的RPMI1640培养基中，且细胞培养板预先用经丝裂霉素C处理的表皮细胞滋养层覆盖，可成功分离得到纯一的ORSC并稳定生长至8~10代（Jahoda CA. et al., 2001; 钟白玉等，1999；高强国等，2004）。亦有学者在上述分离培养方法的基础上加以改进，成功分离培养了大鼠、牛、羊驼、猪、兔等动物的毛外根鞘细胞及其它毛囊细胞（Tsuyoshi H. et al., 2001; Miyashita H. et al., 2004; Christiano AM. et al., 2004; 陈大元等，1999；魏泓等，2004；李键等，2007）。尽管许多学者在动物毛囊细胞培养方面进行了大量的研究，但有关山羊毛囊细胞体外培养研究，尤其是外根鞘细胞系建立等方面的报道相对较少，可应用于动物毛囊研究方面的细胞株与细胞系亦不多。因此，有必要建立体外培养毛囊外根鞘细胞系和完善培养方法，为进一步开展毛囊细胞的生长、发育、分化等研究建立离体细胞模型。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是建立与完善山羊体外培养毛囊外根鞘细胞系（Outer root sheath cell line）的构建方法，不仅可为阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及其调控机制提供研究模型；为提高山羊毛产量和羊绒品质的育种改良奠定基础；还可为提高羊毛品质、数量和毛皮花纹品质乃至医学领域的人类毛发再生研究等奠定基础。
技术方案
本发明所述的构建外根鞘细胞系过程中，首先利用中性蛋白酶（Dispase）分离毛囊的上皮部分和真皮部分，以利于纯化培养毛囊外根鞘细胞。为了促进细胞由毛外根鞘部迁移与贴壁生长，接种游离毛囊用的细胞培养板前期已进行皮肤成纤维细胞外基质的覆盖处理。然后，采用机械分离与酶消化相结合的方法，分离完整毛囊及纯一的ORSC：即先利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后拔出毛囊，再对毛囊进行酶（胰蛋白酶）消化处理，随即将毛囊培养于含有表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、类胰岛素生长因子-I（Insulin-like growth factor-I，IGF-I）、氢化可的松（hydrocortisone）和10%FBS的DMEM/F12培养液中，置5%CO2浓度的37℃饱和湿度培养箱中进行培养。当培养板中的毛囊迁移出大量细胞时（约4~5天），换为含有EGF、IGF-I和氢化可的松的无血清角质细胞培养液（Keratinocyte-Serum Free Medium，K-SFM）中启动原代培养。待原代外根鞘细胞生长至汇合时，进行传代，将稳定生长至8~10代的细胞更换含EGF、IGF-I、氢化可的松和2%FBS的DMEM/F12培养液中培养，以利于外根鞘细胞在体外长期传代培养。采用该方法本细胞系已经稳定传至40代以上，其生长分裂状态良好。
一种山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，包括以下步骤：
（1）活体采集1~3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cm×0.5cm大小的含完整毛囊的皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后迅速放入无血清DMEM/F12培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；
（2）预先采用组织块贴壁方法，分离并培养山羊皮肤成纤维细胞于6孔细胞培养板中，待细胞生长至会合时，除去所述无血清培养液，按每孔3mL量加入含1% Triton X-100的无菌超纯水，37℃孵育30min后，去除Triton X-100溶液，用无菌超纯水冲洗干净，置于4℃下备用；
（3）将皮肤组织样经无菌化处理剪成组织悬液，利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后拔出毛囊，采用组织培养与消化培养相结合的方法，将游离毛囊进行胰蛋白酶消化处理后接种于步骤（2）制备的6孔培养板中，每孔加入3mL量含10ng/mL EGF、10ng/mL IGF-I、0.4μg/mL氢化可的松和10%FBS的DMEM/F12完全培养液，在37℃，5%CO2浓度饱和湿度条件下进行培养；约4—5天待毛囊周围迁移出大量细胞后，更换为等量含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松的无血清角质细胞培养液，在37℃，5%CO2浓度饱和湿度培养箱中启动原代培养；待游离出的毛囊外根鞘细胞生长成单层后，消化移入培养瓶中，按照每瓶10mL量加入含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松的无血清角质细胞培养液进行培养，每2~3天更换一次工作培养液；
（4）当毛囊外根鞘细胞生长至会合状态后，进行传代；待ORSC稳定生长至8~10代时，更换成10mL含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松和2%FBS的DMEM/F12维持培养液进行培养，以利于外根鞘细胞在体外长期传代；
（5）选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×105个/mL的细胞密度接种于培养瓶。
本发明的有益效果：
（1）本发明利用皮肤成纤维细胞外基质诱导和机械分离与酶消化相结合的方法，成功启动了ORSC的原代培养，添加多种生长因子，成功建立了山羊毛囊外根鞘细胞系。
（2）本细胞系已稳定传至第40代以上，其生长分裂状态良好，细胞群体倍增时间约为51.9h。染色体分析结果表明，体外培养细胞尽管出现了非整倍性染色体现象，但其特征染色体数仍为60条。
（3）利用不同培养液对ORSC进行细胞形态回复实验，结果显示，培养在无血清角质细胞培养液中的ORSC，一周后便回复到以多角形内皮样细胞形态为主，说明传至第40代以上的细胞在形态上依然具有毛囊外根鞘细胞的性质。
经上述细胞染色体分析、细胞免疫化学鉴定与形态回复的实验鉴定结果表明，所建毛囊外根鞘细胞系特征明显，可为研究毛囊生长与分化机制，尤其是毛囊主要细胞间的相互作用机制研究提供良好的实用模型。
四、附图说明
图1 体外培养的青山羊原代毛囊外根鞘细胞（×100）
（a）新游离生长出的ORSC，细胞呈圆形和多角形；（b）培养1周左右的ORSC，大量细胞由外根鞘边缘长出；（c）培养15天左右的ORSC，细胞呈梭形和多角形形态；（d）生长至汇合状态下的ORSC，细胞呈短梭状平行排列。
图2 体外培养的青山羊毛囊外根鞘细胞Giemsa 染色（×200）
（a）经Giemsa 染色后的ORSC；（b）经Giemsa 染色的不同分裂时相的ORSC；（c）达到汇合状态的ORSC；（d）经Giemsa 染色后的第40代ORSC。
图3 青山羊毛囊外根鞘细胞生长曲线
图4 第40代毛囊外根鞘细胞的染色体分析
（a）第40代ORSC染色体数目；（b）第40代ORSC分裂中期染色体。
图5 山羊毛囊外根鞘细胞免疫细胞化学染色（×100）
图6 冻存前与复苏后的山羊毛囊外根鞘细胞（×100）
（a）冻存前的毛囊外根鞘细胞；（b）复苏后24h的毛囊外根鞘细胞。
图7 第40代青山羊毛囊外根鞘细胞的形态回复（×100）
（a）培养于无血清角质细胞培养液中的ORSC；（b）培养于含2% FBS的DMEM/F12培养基中的ORSC。
五、具体实施方案
本发明以济宁青山羊ORSC细胞系（其它山羊品种亦可，但以外根鞘细胞的供体山羊品种为最佳）的构建为例详细说明如下：
（一）材料与方法
（1）主要试剂与药品
DMEM/F12（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/ Ham’s Nutrient Mixture F12，1:1）培养基为Gibco公司产品；K-SFM（Keratinocyte-Serum Free Medium，K-SFM）培养基为Gibco公司产品；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）为MDgenics产品；中性蛋白酶（dispase）为Gibco公司产品；胰蛋白酶为Sigma公司产品；表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）为Sigma公司产品；胰岛素样生长因子-I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）和氢化可的松（hydrocortisone）为Peprotech公司产品；青霉素钠（benzylpenicillin Sodium）为山东鲁抗辰欣药业有限公司产品；硫酸链霉素（streptomycin sulfate）为山东瑞阳药业有限公司产品；秋水仙碱（colchicine）为Sigma公司产品；Giemsa染液（Giemsa stain）为Fluka公司产品；细胞角蛋白19抗体（cytokeratin-19, CK-19）为Acris公司产品；即用型BiotinSP-HRP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒为北京鼎国昌盛生物技术公司产品。
完全培养液：含10ng/mL EGF、10ng/mL IGF-I、0.4μg/mL氢化可的松和10%FBS的DMEM/F12培养液；
工作培养液：含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松的无血清角质细胞培养液；
维持培养液：含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松和2%FBS的DMEM/F12培养液；
D-Hank’s 液：由8g/L NaCl、0.4g/L KCl、0.06g/L Na2HPO4·H2O、0.06g/L KH2PO4、0.35g/L NaHCO3和0.4g/L苯酚红组成；
PBS：由8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.56g/L Na2HPO4·H2O和0.2g/L KH2PO4组成；
冻存培养液：含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12培养液；
Carnoy’s 固定液：3份甲醇加1份冰醋酸，现配现用并于冰上保存。
（2）实验动物与样品采集
怀孕母羊购自山东省济宁市嘉祥县种羊场，饲养于山东农业大学动物科技学院畜牧科技试验站羊场。运用外科手术的方法，随机活体采集出生1~3日龄的羔羊背部约0.5cm×0.5cm的皮肤组织样，将皮肤组织样先用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后迅速放入无血清DMEM/F12培养液，于冰盒中带回实验室。在12h内进行分离培养。
（3）外根鞘细胞原代培养用细胞培养板的处理
将皮肤组织样在无菌超净台内剪成1mm3 的组织碎块，用无菌弯头镊将组织碎块均匀接种于6孔细胞培养板中，先加入每孔1mL含10%FBS的DMEM/F12培养液，37℃，5%CO2浓度的饱和湿度条件下进行培养。4h后补加含10%FBS的DMEM/F12培养液至每孔3mL，放回继续培养，经3~5天细胞生长至汇合时，除去皮肤组织碎块和培养液。加入约10ml的无菌1% Triton X-100于单层细胞上，37℃孵育30min后，去除Triton X-100溶液，用无菌超纯水冲洗干净，置于4℃下备用。
（4）山羊毛囊外根鞘细胞的原代培养
将步骤（2）中采集的皮肤组织样经70%酒精浸泡，D-Hank’s液冲洗后，剪成组织悬液，吸去D-Hank’s液，加入约10mL 0.25%中性蛋白酶，4℃消化过夜。体式镜下，用无菌弯头镊揭去皮肤表皮层后拔出毛囊，浸入0.25%胰蛋白酶中消化5min，随后将游离毛囊均匀贴附于步骤（3）中经处理的6孔培养板中，按照每孔3mL加入完全培养液，37℃，5%CO2浓度的饱和湿度条件下进行培养。待毛囊周围迁移出大量细胞后，更换为相同体积的工作培养液，在37℃，5%CO2浓度的饱和湿度培养箱中启动原代培养。待游离出的毛囊外根鞘细胞（ORSC）生长成单层后，消化移入培养瓶中进行培养，按照每瓶10mL量加入工作培养液进行培养，2~3天更换一次工作培养液。
（5）细胞的传代培养
当毛囊外根鞘细胞（ORSC）生长至会合状态后，进行传代。首先弃掉旧培养液，D-Hank’s液冲洗细胞一次，加入约1mL浓度为0.25%的胰蛋白酶浸润细胞数秒。弃去后，再加入4mL浓度为0.25%的胰蛋白酶，常温下消化处理约5min。当观察到有细胞贴附的瓶壁逐渐变白，且轻轻晃动有微小细胞团块脱落时，便可加入6mL工作培养液洗净残余消化液，1000r/min下离心5min后收集细胞，分瓶后按每瓶10mL量加入工作培养液放回培养箱中继续培养，此后每3天更换工作培养液1次。待外根鞘细胞稳定生长至8~10代时，更换等量的维持培养液进行培养，以利于外根鞘细胞在体外长期传代。挑选可稳定遗传的对数期毛囊外根鞘细胞进行形态学观察并测定生长曲线。
（6）山羊毛囊外根鞘细胞的Giemsa 染色
将灭菌盖玻片放入一次性细胞培养皿中，取2mL毛囊外根鞘细胞悬液加入培养皿中，置于CO2培养箱中培养。待ORSC在盖玻片上长成良好单层后，取出玻片并浸入无水甲醇中固定15min，再用新的无水甲醇冲洗细胞，随即放入纯的Giemsa染液中染色5~10min。从Giemsa染液中取出玻片经过干燥和二甲苯透明。最后，中性树脂封片，显微镜下观察、拍照。
（7）细胞生长曲线的测定
收获生长状态良好的对数期ORSC，采用细胞传代的方法制成细胞悬液。经计数后，将密度为每mL含1.02×104个细胞的细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL。每隔24h取出3个孔的细胞分别进行计数，取平均值。以培养时间为横轴，每天的细胞数平均值为纵轴，作图，即得到体外培养毛囊外根鞘细胞的生长曲线。
（8）山羊毛囊外根鞘细胞的染色体核型分析
待传代培养第40代的ORSC生长至对数生长期时，将细胞移入25mL培养瓶中，CO2培养箱中培养54h。将0.5μg/mL秋水仙素加入维持培养液中，继续培养约8h。消化收集细胞，逐滴加入0.5 mL 37℃的低渗液（即0.075mol/L的KCl溶液）并混匀，随即补加低渗液至5~10mL，用吸管轻轻吹打均匀，37℃孵育30min。低渗处理后向管中加入1mL新鲜Carnoy’s固定液进行预固定，离心去上清后加入10mL新鲜Carnoy’s液进行固定及再固定。最后，收集细胞进行Giemsa染色，中性树脂封片，镜检。
（9）毛囊外根鞘细胞的免疫细胞化学鉴定
取1.5mL ORSC悬液均匀接种于清洁无菌的盖玻片上，置于37℃，5%CO2浓度的饱和湿度培养箱中培养。待ORSC长至盖玻片80%以上面积时，取出盖玻片经PBS清洗后，用-20℃醋酸乙醇固定液固定20 min，PBS清洗3次（每次3 min）。按照即用型Biotin SP-HRP免疫组化试剂盒说明步骤进行细胞角蛋白19（CK-19）免疫细胞化学检测，最后用DAB底物于暗处显色3~10 min，蒸馏水清洗后，观察，照相。
（10）毛囊外根鞘细胞的冷冻保存与复苏
选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入冻存培养液（含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12培养液），以每毫升5×106个毛囊外根鞘细胞的细胞密度，分装入5mL无菌冻存管中，封口，标记。将冻存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞。
复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，然后逐滴加入30mL 维持培养液缓慢稀释冻存液，混匀后低速离心，去上清。再用维持培养液适当稀释后，按5×105个/mL的细胞密度接种于培养瓶。
（11）细胞活率与贴壁率的测定
运用Trypan蓝染料排斥法，计数1000个毛囊外根鞘细胞，测定外根鞘细胞冻存前和复苏后的活率，并观察外根鞘细胞复苏后的贴壁情况，统计分析外根鞘细胞活率与贴壁率。
（12）毛囊外根鞘细胞的形态回复试验
收获传至40代或40代以上的生长良好的单层ORSC，在37℃，5%CO2浓度的饱和湿度条件下，用10mL 维持培养液和10mL 工作培养液分别进行传代培养，每3天更换1次培养液，观察并比较两种培养液中ORSC的生长情况和形态变化。
（二）结果与分析
（1）毛囊贴壁法培养细胞的形态学观察
利用贴壁法分离毛囊外根鞘细胞，在含完全培养液中，4~5天便可见毛囊外根鞘边缘向外游离生长出单个细胞，细胞呈圆形，随后伸展成多角形的形态（图1（a））。培养一周左右即可明显看到大量细胞从外根鞘边缘生长出来（图1（b））。随着游离生长细胞的增多，生长速率逐渐加快，在第15天左右时，细胞进入对数生长期。在倒置相差显微镜下观察，可见游离出的毛囊外根鞘细胞以短梭形和多角形为主，细胞饱满，透明度高，胞体向外伸出2~4个片足，胞核卵圆形，胞质较少。随后细胞向四周呈克隆状生长，形成致密单层后细胞变化为短梭状平行排列（图1（c）、（d））。
（2）山羊毛囊外根鞘细胞Giemsa染色的观察结果
体外培养的毛囊外根鞘细胞经Giemsa染色后，可见细胞质呈淡蓝色，胞体近中央处有椭圆形的细胞核，呈深蓝色，其中可见1~2个核仁（图2（a））。观察处于对数生长期的ORSC，视野中可见较多量的有丝分裂相细胞，采用该染色法可较清晰的显示出细胞分裂的不同时相（图2（b））。当培养瓶内的细胞形成良好单层后，经染色可见只有极少量细胞处于分裂周期（M期），大部分细胞出现接触抑制（图2（c））。其中，个别细胞出现胞核分裂，胞质未分裂的现象，形成合胞体状（图2（d））。
（3）传代培养的毛囊外根鞘细胞的生长特性
传代培养的ORSC与其原代细胞在形态及生长速度上均无明显差异，细胞生长与分裂依然十分旺盛。单层细胞传代约一周后便可重新长成单层，其对于胰蛋白酶消化的敏感性也较原代培养细胞明显增强。从体外培养的ORSC对数生长期的生长曲线可以看出，细胞贴壁生长的前2天为迟缓期；第3~5天为对数生长期；第5天后便进入平稳期和衰退期（图3）。细胞群体倍增时间为51.9h，说明ORSC经传代培养后其生长与分裂能力依然旺盛（表1）。
表1 青山羊毛囊外根鞘细胞接种7天的细胞密度
×104 个·mL-1
（4）山羊毛囊外根鞘细胞的染色体分析
选取传至第40代的细胞，进行染色体标本计数。结果表明，济宁青山羊染色体为2n=60的细胞占主体，但是个别细胞的染色体发生缺失与丢失，出现了典型的非整倍体性细胞系染色体特征，说明体外培养环境对细胞的遗传稳定性有影响作用。然而，在选取进行计数培养细胞中，拥有60条染色体的细胞数仍可占总细胞数的58.3%（图4（a）），且这些细胞的核型均正常。因此，所建立的细胞系确为济宁青山羊细胞系（图4（b））。
（5）山羊毛囊外根鞘细胞免疫细胞化学鉴定
应用免疫细胞化学染色技术检测体外培养的低传代次数（5代以内）的ORSC的骨架蛋白-细胞角蛋白19表达情况。显微镜观察结果显示分离培养的细胞质呈黄褐色，表明外根鞘细胞角蛋白19表达呈阳性，而角蛋白19为毛外根鞘细胞和皮肤干细胞的标记，因此证实本发明分离培养的细胞确为由毛囊干细胞分化来的外根鞘细胞（图5）。
（6）细胞活率与贴壁率的测定结果
利用血球计数板测定细胞冻存前24h的平均活率及细胞复苏后24h的平均活率与贴壁率，统计分析结果表明，青山羊毛囊外根鞘细胞东存前和复苏后平均活率分别为94.4%和92.1%，复苏24h后约有85%细胞贴附瓶底生长。由此可见，冻存和复苏对传代细胞活力状况的损害较小，细胞生长状态良好（图6）。
（7）毛囊外根鞘细胞的形态回复试验
将传代培养至40代的ORSC，在工作培养液进行持续培养。一周后可观察到，在工作培养液中的ORSC，其形态由原来的以成纤维样细胞形态为主，逐渐转变成以内皮样细胞形态为主（图7（a））；而ORSC在含维持培养液中持续培养，其形态仍以成纤维样细胞形态为主（图7（b））。说明传至第40代的细胞在形态上依然具有毛囊外根鞘细胞的性质。
Claims (1)
1.一种山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
a、活体采集1~3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cm×0.5cm大小的含完整毛囊的皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后迅速放入无血清DMEM/F12培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；
b、预先采用组织块贴壁方法，分离并培养山羊皮肤成纤维细胞于6孔细胞培养板中，待细胞生长至会合时，除去所述无血清培养液，按每孔3mL量加入含1% Triton X-100溶液，37℃孵育30min后，去除Triton X-100溶液，用无菌超纯水冲洗干净，置于4℃下备用；
c、将皮肤组织样经无菌化处理剪成组织悬液，利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后拔出毛囊，采用组织培养与消化培养相结合的方法，将游离毛囊进行胰蛋白酶消化处理后接种于上述6孔细胞培养板中，每孔加入3mL量含10ng/mL EGF、10ng/mL IGF-I、0.4μg/mL氢化可的松和10%FBS的DMEM/F12完全培养液，在37℃，5%CO2浓度饱和湿度条件下进行培养；约4—5天待毛囊周围迁移出大量细胞后，更换为等量含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松的无血清角质细胞培养液，在37℃，5%CO2浓度饱和湿度培养箱中启动原代培养；待游离出的毛囊外根鞘细胞生长成单层后，消化移入培养瓶中，按照每瓶10mL量加入含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松的无血清角质细胞培养液进行培养，每2~3天更换一次工作培养液；
d、当毛囊外根鞘细胞生长至会合状态后，进行传代；待ORSC稳定生长至8~10代时，更换成10mL含10ng/mL IGF-I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松和2%FBS的DMEM/F12维持培养液进行培养，以利于外根鞘细胞在体外长期传代；
e、选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h、-20℃1h、-70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×105个/mL的细胞密度接种于培养瓶。
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