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CN117017834A - 一种丁香花和肉桂皮精油组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种丁香花和肉桂皮精油组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117017834A
CN117017834A CN202310916535.2A CN202310916535A CN117017834A CN 117017834 A CN117017834 A CN 117017834A CN 202310916535 A CN202310916535 A CN 202310916535A CN 117017834 A CN117017834 A CN 117017834A
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CN
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essential oil
streptococcus mutans
composition
cinnamon bark
oil composition
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Application number
CN202310916535.2A
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吴华
朴秀莲
肖俊松
田华峰
刘梓萱
袁丽蓉
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Beijing Technology and Business University
Original Assignee
Beijing Technology and Business University
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Abstract

本发明属于口腔护理技术领域，具体为一种丁香花和肉桂皮精油组合物及其制备方法和应用。该组合物由丁香花精油和肉桂皮精油按体积比1:1‑4混合制备，两者产生协同作用，本发明组合物可作为口腔抗菌剂及防龋剂，对变形链球菌的生长、产酸、生物膜形成和粘附均起到抑制作用，该精油组合物有潜力用于预防由变形链球菌引起的龋齿。

Description

一种丁香花和肉桂皮精油组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于口腔护理技术领域，具体涉及一种丁香花和肉桂皮精油组合物及其制备方法和应用。
背景技术
龋病是在以细菌为主的多因素影响下，牙体硬组织发生慢性破坏的一种疾病，主要表现为牙体脱矿、着色以及龋洞的形成等。
发生龋齿主要与变形链球菌的毒力因子表达及其产酸和生物膜形成有关，变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是口腔中的主要致龋菌，也被称为牙菌斑，是一种在牙齿坚硬表面上形成的多种生物膜。变形链球菌可以通过形成丰富的胞外多糖(EPS)和低pH环境来为其它产酸和酸性物种创造有利的生存空间。
变形链球菌(S.mutans)最初附着在牙齿表面，产生不溶性的葡聚糖层。葡聚糖由糖基转移酶(Gtfs)合成，有助于牙菌斑基质多糖的形成，从而加速牙菌斑的成熟。变形链球菌也有能力代谢食物中的碳水化合物，并释放有机酸，如乳酸作为副产品。释放出的有机酸可以降低牙菌斑的pH值，溶解牙釉质。龋齿的发展主要与饮食中碳水化合物的含量和消费频率有关。蔗糖是最致龋的碳水化合物，因为它是变形链球菌的主要代谢产物。变形链球菌利用产生碳水化合物的酸性代谢物，导致酸性破坏和脱矿，去除矿物物质，从而导致龋齿。这种蔗糖依赖的机制也基于Gtfs，涉及一些与致龋性相关的毒力因子，如葡聚糖结合蛋白(Gbps)。编码表面相关葡聚糖结合蛋白(Gbp)的gbpB也是细菌粘附的必需因子，因为该蛋白介导了细胞表面与葡聚糖之间的相互作用。此外，变形链球菌表达了spaP基因，该蛋白有助于变形链球菌的粘附因此，降低致龋细菌数量、减少酸的合成以及阻止菌斑生物膜形成也就成了防治龋病的最为有效的策略。
目前，对于龋齿的预防和治疗方法通常包括激光防龋齿、免疫防龋齿、窝沟封闭治疗、药物防治以及日常护理防治。其中，以日常护理防治结合药物防治最为常用，目前广泛采用的技术是将具有防龋齿的化合物/组合物添加到口腔护理剂中，含氟牙膏是常用的保持口腔卫生方法之一，它具有很高的临床疗效，但使用含氟化物的化学物质会引起肠道和口腔菌群的变化，甚至导致牙齿染色、呕吐和口腔癌。三氯生(Triclosan,TCS)是一种常用的抗菌/抗真菌剂，存在于某些牙膏和漱口水中。虽然是一种有效的抗菌剂，但三氯生在日常产品中的广泛使用将导致抗生素耐药性。乙醇是市场上大多数漱口水的主要活性成分之一，有些产品的乙醇浓度甚至高达27％的。在这些产品中使用如此高浓度的乙醇会刺激口腔和干燥。因此，亟需开发一种新的抗菌防龋齿口腔护理组合物。
中国发明专利申请01129070.6公开了一种治疗由龋齿引起的牙痛的组合物，采用细辛、花椒、川芎、薄荷、铅丹、樟脑为原料制作治疗龋齿引起的牙痛药物，其中含有铅丹，长期使用会造成铅中毒等副作用。中国发明专利申请201010173234.8公开了一种多功能漱口水，采用消毒剂、防龋齿剂、清洁剂、清香剂、甜味剂、稳定剂和去离子水共同配置为一种具有抑制、清除口腔细菌，有效防止蛀牙，清除口臭功效的漱口水，其中的防龋齿剂为氟化钾、氟化钠和单氟磷酸钠中的一种或几种，这类物质均含氟，长期使用有引起氟中毒等副作用的危险，而且前两种物质还有腐蚀性，因此，该漱口水仍存在一定安全风险。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明实际解决的技术问题是提供一种丁香花和肉桂皮精油组合物及其制备方法和应用，该组合物有较好的抗菌活性，具有较好的龋齿治疗效果，并且香味明显，无任何毒副作用。
植物精油的自身性质在抑菌和抗生物膜方面都有巨大的优势，同时又具有安全性无副作用的性质，刚好满足作为口腔护理产品的要求。精油可同时具备抗炎镇痛、抗菌、止血及抗病原微生物的作用，对牙齿、口腔的健康保护具有很好的功效。
本发明提供一种复合精油组合物，组合物包括丁香花精油和肉桂皮精油。
优选地，所述丁香花精油和肉桂皮精油的体积比为1:0.8-10。
进一步优选地，所述丁香花精油和肉桂皮精油的体积比为1：1：1-4。
优选地，按质量百分比计，所述丁香花精油的有效成分包括丁香酚72％-73％和石竹烯16％-18％，进一步优选为丁香酚72.88％和石竹烯16.98％。
优选地，按质量百分比计，所述肉桂皮精油的有效成分包括(E)-肉桂醛55％-65％和乙酸肉桂酯9％-11％，进一步优选为(E)-肉桂醛60.98％和乙酸肉桂酯10.95％。
优选地，所述丁香花精油和肉桂皮精油通过水蒸馏回收的。
本发明还涉及一种组合物的制备方法，所述丁香花精油和肉桂皮精油混合即得。
本发明还涉及该组合物在制备抑制口腔细菌的药物或口腔护理品中的应用
优选地，所述口腔细菌包括变形链球菌，所述组合物能够治疗龋齿。
优选地，所述药物或产品能抑制变形链球菌的生长、产酸、生物膜形成和粘附能力。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)丁香花精油和肉桂皮精油混合后具有协同作用；
(2)本技术方案中的组合物可以添加到口腔制品(如：牙膏、漱口水、牙粉等)中，对于口腔致病菌变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)有明显的抑制作用，对其生长、产酸、生物膜形成和粘附均有抑制作用，该精油组合物有潜力用于预防由变形链球菌引起的龋齿；
(3)精油是多种挥发性芳香成分的混合物，相较于其他提取物的分子量小、脂溶性、挥发性强，能够快速渗透或破坏细菌磷脂双分子层膜，进入细胞内部发挥作用，见效快；本技术方案提供的复方精油配比较单方精油有明显的协同增效作用。
附图说明
图1是实施例1-3和对比例1-4精油对变形链球菌的抑菌圈直径效果图；
图2是实施例1精油对变形链球菌的时间-杀菌曲线图；
图3是实施例1精油对变形链球菌生物膜的影响图；
图4是实施例1精油对变形链球菌毒力因子vicR和relA表达的影响图；
图5是实施例1精油对变形链球菌毒力因子gtfB和gbpB表达的影响图；
图6是实施例1精油对变形链球菌毒力因子gtfD和gtfC表达的影响图；
图7是实施例1精油对变形链球菌毒力因子spaP和brpA表达的影响图。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案作进一步清晰地描述，所描述的实施例只是本发明的一部分，用于解释本发明，但不用于限定本发明，因此本领域其他技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明的保护范围。
丁香花(Syzygium aromaticum)精油，购于中国上海颇黎有限责任司，货号：PEC1601；
肉桂皮(Cinnamomum zeylanicum)精油，购于中国上海颇黎有限责任司，货号：PEC2201；
变形链球菌Streptococcus mutans，购自中国科学院微生物菌种保藏中心，保藏编号：ATCC700610；
脑心浸出液肉汤(BHI)培养基，BR，购自OXOID；
营养琼脂，BR，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
实施例1
精油组合物，按体积份数计为：1份的丁香花精油和4份的肉桂皮精油。
实施例2
精油组合物，按体积份数计为：：2份的丁香花精油和3份的肉桂皮精油。
实施例3
精油组合物，按体积份数计为：1份的丁香花精油和1份的肉桂皮精油。
对比例1
精油组合物，按体积份数计为：3份的丁香花精油和2份的肉桂皮精油。
对比例2
精油组合物，按体积份数计为：4份的丁香花精油和1份的肉桂皮精油。
对比例3
单一组分：丁香花精油。
对比例4
单一组分：肉桂皮精油。
测试例1抑菌活性测试
1.培养基配制
液体培养基的制备：称取37g脑心浸出液肉汤(Brain Heart Infusion Broth,BHI)培养基于烧杯中，加蒸馏水溶解，并定容致1L，最后分装到适当的锥形瓶中，使用封口膜密封；120℃灭菌20min后备用。
固体培养基的制备：称取37g脑心浸出液肉汤(Brain Heart Infusion Broth,BHI)培养基和15g琼脂于烧杯中，加入适量蒸馏水加热溶解，搅拌均匀，调整pH值后，分装于适当大小锥形瓶中，用封口膜密封；120℃灭菌20min后，待温度降到50℃以下后，分装到无菌培养皿中(在超净工作台上进行此操作)冷却待用。
2.菌悬液的制备
挑取菌液在营养琼脂划线培养24h，然后选取长势良好的单菌落，接种到液体培养基中，于37℃厌氧条件下培养16h。然后逐级稀释后，平板涂布并采对其细菌菌落进行计数统计，计算菌液浓度，并制成106-107CFU/mL的悬浮液。
3.抑菌圈直径的测量
采用滤纸片法测量抑菌圈直径。取200μL制备好的菌悬液(2×106CFU/mL)均匀涂布于BHI琼脂培养基，随后，在每个皿中放入三个直径为6mm的无菌滤纸片，滴入3μL精油于滤纸片中央，以等体积无菌水为空白对照，37℃培养24h，测定抑菌圈直径，每种精油重复三次测量取平均值。抑菌圈实验的判定标准为阳性对照氯已定来计算的抑菌指数。
4.统计学处理
所有实验都分别进行了三次重复实验。实验数据采用SPSS19.0软件进行数据分析，各组总体均数之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。使用Origin 8.5.1执行映射。
5.对变形链球菌的抑菌活性测试
采用滤纸片法检测了实施例1-3和对比例1-4的精油抑菌活性，对所有抑菌圈直径的测量结果见图1。结果表明，丁香花精油和肉桂皮皮精油按体积比1:4、2:3和1:1复合后，具有协同抑菌的作用。本发明中复方精油的抑菌圈直径大于单方精油的抑菌圈直径、丁香花精油和肉桂皮皮精油体积比4:1及3:2的复合精油，表现出较好的协同作用，具体抑菌效果数据如表1所示。
表1抑菌活性测试结果
测试例2最低抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)的测定
采用微量肉汤稀释法测定实施例1中的复方精油对变形链球菌的MIC。由于精油不溶于水，因此将其与1:1(v/v)的DMSO:Tween20和BHI液体培养基混合(作为精油的乳化剂，促进与细菌的接触)。将已知浓度的精油溶液加入1×106CFU/mL的菌悬液中，37℃条件下摇床培养24h。阳性对照组为1％氯己定，与1:1(v/v)的DMSO:Tween20和BHI液体培养基。阴性对照组为含0.1％、1:1(v/v)的DMSO:Tween20及BHI液体培养基。肉眼观测能抑制培养基内未有细菌生长对应的精油浓度为最低抑菌浓度，细菌的生长以浊度表示。
判定MIC后，从最低抑菌浓度菌悬液和最低抑菌浓度以上的菌悬液各取100μL进行涂板BHI琼脂培养皿，37℃下厌氧培养24h。固体培养基中完全未见菌落长出来的菌液对应的精油的浓度即为MBC值。测试结果如表2所示。
表2精油的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
测试例3对变形链球菌的时间-杀伤作用测试
采用琼脂稀释法确定丁香花+肉桂皮精油的最低杀菌浓度为0.625μL/mL，测定实施例1中的精油组合物的时间-杀菌曲线，以此反映在不同时间MBC浓度杀灭细菌的效果。在BHI培养基中培养变形链球菌(1×106CFU/mL)，在MBC浓度下，将混合菌液置于37℃，180rpm的摇床中震荡培养。每隔1天取菌悬液涂布在固体BHI琼脂培养基，培养24h，记录皿内单菌落的数量的变化。实验重复3次，求平均值。以作用时间为横坐标，以活菌数的自然对数值为纵坐标，绘制杀菌曲线。
不添加精油组合物的菌悬液作为阴性对照组、添加1％氯己定的菌悬液作为阳性对照组及本发明实施例1中1:4配比的丁香花+肉桂皮精油组合物作为实验组；浓度为0.625μL/mL的精油组合物在10h内对变形链球菌的时间-杀菌曲线如图2所示。整个培养期，空白对照组的变形链球菌菌数呈逐渐增长趋势。实施例1中1:4配比的丁香花+肉桂皮复方精油对变形链球菌保持持续的杀灭作用，随时间的延长杀灭的细菌越多，随时间延长杀菌作用略有增强。
测试例4对变形链球菌的抑菌机理测试
1.对变形链球菌产酸能力的影响
以实施例1的组合物为研究对象，测定MIC、1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC浓度下对变形链球菌产酸能力的影响测试，将不同浓度的精油加入到2mL含1％葡萄糖浓度为1×107CFU/mL变形链球菌菌悬液中。先用pH计测定初始pH1，在37℃恒温箱中厌氧培养24h后，再次测定pH2，两次pH的差值△pH即为对产酸的影响，每组进行三次重复实验，结果如表3所示。每种浓度有3个平行对照。
表3不同浓度的复方精油对变形链球菌产酸能力的影响
实验组 组合物浓度 pH1 pH2 △pH
1 MIC 7.04±0.00 6.99±0.02 0.05±0.02
2 1/2MIC 7.04±0.00 7.01±0.03 0.03±0.03
3 1/4MIC 7.04±0.00 7.01±0.01 0.03±0.01
4 1/8MIC 7.04±0.00 5.39±0.06 1.65±0.06
对照组 0μL/mL 7.04±0.00 4.75±0.03 2.29±0.03
通过测定pH值的变化来确定不同浓度的复方精油是否抑制了1％蔗糖浓度下的变形链球菌的产酸性。培养24h后，未添加复方精油的空白对照组的pH值从7.04降低4.75。MIC、1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC浓度的丁香花精油+肉桂皮精油组合物对pH值的下降均有显著的抑制作用。
2.对变形链球菌生物膜的影响
(1)番红染色法观察生物膜的形态学
通过番红染色来测量生物膜的形成，并用肉眼进行观察并拍照。在35mm聚苯乙烯培养皿，实施例1的1:4配比的丁香花+肉桂皮复方精油为研究对象，将不同浓度的精油添加到含1％蔗糖的BHI肉汤中。用变形链球菌种子培养物(2.0×107CFU/mL)接种肉汤，培养24h。培养后，去除上清液，用蒸馏水冲洗培养皿。
(2)结晶紫染色观察生物膜形成量的影响
将菌悬液与配制好的不同浓度的各组药液按1:1(v/v)的比例混合接种于96孔板中各100μL，每个浓度5个复孔。用无菌吸管轻轻吹吸使其混合均匀后，将96孔板置于恒温细菌培养箱中37℃厌氧培养。只接种细菌不含精油的BHI液体培养基作为对照组。培养24h后将96孔板取出，吸去混合液，无菌水漂洗两次，0.4％的结晶紫0.1mL染色15min。无菌水冲洗三次，每孔置100μL 95％乙醇溶液，震荡脱色，于紫外分光光度计540nm处测定OD值。根据公式计算抑制率，结果如表4所示。
抑制率＝(1-OD实验组/OD对照组)*100％
测定MIC、1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC浓度下1:4配比的丁香花+肉桂皮复方精油对变形链球菌生物膜的影响。通过番红染色和结晶紫染色来观察到培养皿表面变形链球菌形成的生物膜如图3所示。结果表明，在MIC时生物膜结构被破坏，表层细菌死亡脱落，降低了S.mutans生物膜的活性，且有浓度依赖性。
表4不同浓度的复方精油对变形链球菌生物膜的影响
实验组 组合物浓度(μL/mL) OD值 抑制率(％)
1 MIC 0.26 86.41
2 1/2MIC 0.45 76.54
3 1/4MIC 0.56 70.48
4 1/8MIC 0.82 56.76
对照组 0μL/mL 1.90 -
3.对变形链球菌毒力因子的影响
3.1RNA提取方法
(1)收集生长至对数期的变形链球菌，制备浓度为105CFU/mL的变形链球菌菌悬液；
(2)向其中加入实施例1复方精油的1/8MIC、1/4MIC和1/2MIC三种不同浓度的精油；
(3)37℃条件下培养24h，5000r/min离心5min；
(4)用PBS清洗，并将菌转移到无RNA酶离心管中，5000r/min离心5min，随后小心移除上清液；
(5)将样品置于液氮中进行研磨捣碎，加入1mL Transzol，枪头吹打均匀使细胞完全破碎后，放置5min后，加入氯仿去蛋白质，静置5-10min，10000g，4℃，离心15min，随后取上清于新无RNA酶离心管中，加入等量乙醇，加到无RNA酶柱中过柱，12000g，4℃，离心30秒，弃下清液；
(6)加入500μL CB9溶液，12000g离心1min，重复1次；
(7)加入500μL WB9溶液，12000g离心1min，重复1次；
(8)空转离心2min，12000g；
(9)将无RNA酶柱放入新无RNA酶离心管中，室温干燥10min后，加入20μL Rnase-free水静置2min，12000g，离心1min。
3.2反转录
表5为反转录反应体系。
表5反转录反应体系
试剂添加完成后，将离心管放入PCR仪中37℃，反应5min。
cDNA的合成：按照表6添加试剂后，将离心管放入PCR仪中进行反应37℃反应15min；50℃反应5min；98℃反应5min。
表6反转录反应体系
3.3实时荧光定量
引物的合成与设计：从GenBank获得各目的基因mRNA全长序列，用软件Primer 5.0设计引物。目的基因所用引物及内参基因16S rRNA的引物序列如7所示。
表7目的基因所用引物及内参基因16S rRNA的引物序列
RT-PCR：按照表8，将表中的各种物质分别加到200μL的离心管中，混合均匀后放入PCR仪中，设置：95℃预变性2min；95℃变形30s；57℃退火30s；72℃延伸30s；×38循环；72℃延伸2min的反应条件进行反应。
表8荧光定量PCR反应体系
注：荧光染料包括10×buffer，Green 1，Taq酶，dNTPs。
以实施例1的复方精油为研究对象，用亚最低抑菌浓度(1/8-1/2MIC)的精油组合物和阴性对照组(氯已定1％)处理变形链球菌培养24h，采用实时荧光定量PCR方法检测复方精油对变形链球菌毒力因子表达的影响。如图4-7所示，用复方精油处理后，brpA、gbpB、gtfB、gtfC、gtfD、vicR、spaP和relA基因的mRNA表达量显著降低。
结果表明，实施例1的复方精油浓度为1/2MIC时，细菌数量减少，细菌之间的群体效应减弱，毒力因子的表达下降。通过抑制gtfB、gtfC、gtfD和vicR来抑制生物膜的形成，通过抑制brpA和relA的表达来抑制酸的产生。spaP、gbpB在变形链球菌黏附在牙齿表面中起着关键作用。
本发明提供一种丁香花精油和肉桂皮精油复合精油组合物。最终优选丁香花精油和肉桂皮精油的配比为1：1-4，具体实施配比分别为1:4、2:3、1:1，最优配比为1:4。丁香花精油的有效成分丁香酚72.88％和石竹烯16.98％。肉桂皮精油的有效成分包括(E)-肉桂醛60.98％和乙酸肉桂酯10.95％。所述丁香花精油和肉桂皮精油通过水蒸馏回收的。
丁香花精油和肉桂皮精油组合物对变形链球菌表现出良好的抑菌作用，两者有明显的协同作用；本发明中的精油组合物对变形链球菌的生长、产酸能力、生物膜形成能力和粘附能力均有明显的抑制作用，因此本发明的精油组合物有潜力用于预防由变形链球菌引起的龋齿。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种复合精油组合物，其特征在于，所述组合物的原料包括丁香花精油和肉桂皮精油。
2.根据权利要求1所述的精油组合物，其特征在于，所述丁香花精油和肉桂皮精油的体积比为1:0.8-10。
3.根据权利要求1所述的精油组合物，其特征在于，所述丁香花精油和肉桂皮精油的体积比为1：1-4。
4.根据权利要求1所述的精油组合物，其特征在于，按质量百分比计，所述丁香花精油的有效成分包括丁香酚72％-73％和石竹烯16％-18％。
5.根据权利要求1所述的精油组合物，其特征在于，按质量百分比计，所述肉桂皮精油的有效成分包括(E)-肉桂醛55％-65％和乙酸肉桂酯9％-11％。
6.根据权利要求1所述的精油组合物，其特征在于，所述丁香花精油和肉桂皮精油均通过水蒸馏回收的。
7.一种权利要求1-6任一项所述组合物的制备方法，其特征在于，将所述丁香花精油和肉桂皮精油混合即得。
8.一种权利要求1-6任一项所述的组合物或权利要求7所述的制备方法制得的组合物在制备抑制口腔细菌的药物或口腔护理品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述口腔细菌包括变形链球菌，所述组合物能够治疗龋齿。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物或护理品能够抑制变形链球菌的生长、产酸、生物膜形成和/或粘附能力。
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