CN117004777A - 用于检测鳜鱼弹状病毒的rpa组合物及其应用、检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物及其应用、检测方法，涉及生物病毒检测技术领域。RPA组合物包括RPA引物和探针；所述PRA引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物的5’端连接生物素；所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示，且所述探针的5’端连接FAM，3’端连接C3spacer，其31位碱基被四氢呋喃取代。本发明的RPA组合物能够实现鳜鱼弹状病毒的RPA检测，能快速、简便、特异地检测鳜鱼弹状病毒，适用于养殖场现场快速检测。

Description

用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物及其应用、检测方法

技术领域

本发明涉及生物病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物及其应用、检测方法。

背景技术

随着人们生活品质的提高，鳜鱼(Siniperca chuatsi)因其肉质细嫩、味道鲜美、蛋白含量高等优点逐渐成为一种备受欢迎的名优鱼类，其养殖规模也在不断扩大，成为我国重要的淡水养殖品种之一。然而，近年来鳜鱼弹状病毒病(Siniperca chuatsirhabdovirus,SCRV)在我国鳜鱼主养区引起鳜鱼暴发性死亡，致死率可高达90％以上，且流行范围越来越广，给鳜鱼养殖业带来严重的经济损失，已成为限制鳜鱼养殖业发展的主要障碍之一。此种病毒对鳜鱼养殖业的危害极大，一旦发病，鳜鱼存活率极低，且无有效的治疗方法，给养殖户们造成极大的经济损失。该病流行广，在珠江三角洲普遍发生。鱼类感染SCRV后典型的病状是出血性败血症，影响多种器官功能，如眼球突出变黑，腹部膨胀，皮下出血。而弹状病毒主要感染鲈鱼、鳜鱼的苗种期，在苗种期病原呈低拷贝量的隐性带毒感染所以在十分重要，目前尚无针对该SCRV的有效治疗方法。因此，弹状病毒病的苗种期的病原监测和诊断显得尤为重要。

目前核酸检测是SCRV诊断的金标准，传统的检测方法如病毒分离、免疫荧光检测和ELISA等耗时费力，需要专业设备和技术人员。常规RT-PCR与RT-qPCR方法已广泛应用于SCRV核酸的检测，大多数PCR检测的目的是扩增保守的SCRV主要糖蛋白(G)基因。国内外学者建立了多种SCRV的PCR扩增技术。梁红茹等人基于鳜鱼弹状病毒N基因建立了可同时检测传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法以及TaqMan荧光定量PCR检测方法。但普通PCR的检测限通常在100copies/μL以上，很难在苗种期检测到低拷贝量的病原；而qPCR检测技术虽然很灵敏，但过于依赖高端荧光定量仪器，不适合用于基层单位和养殖场的苗种检疫，所以建立一种便捷、经济、灵敏度可媲美qPCR的检测方法极其重要。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温DNA扩增技术，与其他DNA扩增方法相比具有多项优势，特别是其可在非实验室环境下应用。重组酶聚合酶反应特异性强，可在37-45℃的恒温条件下反应15-30min即可实现特定寡核苷酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求极低，通过优化后，可以完全不需要大型或昂贵的硬件设备，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，具有灵活性好和实用性强等优点。目前尚未见SCRV的RPA-LFD检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于检测鳜鱼弹状病毒的引RPA组合物，其检测快速、灵敏、操作简便、设备要求低，并能够在储存和运输过程中保持稳定性、可靠性，实现鳜鱼弹状病毒核酸的快速检测分析。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物，包括RPA引物和探针；

所述PRA引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物的5’端连接生物素；

所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示，且所述探针的5’端连接FAM，3’端连接C3spacer，其31位碱基被四氢呋喃取代(具体为碱基T被四氢呋喃取代)。

相应的，本发明还公开了上述的用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物在(1)或(2)中的应用：

(1)检测鳜鱼弹状病毒；

(2)检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒。

相应的，本发明还公开了一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，其包括上述的用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物。

作为上述技术方案的改进，还包括阳性对照、阴性对照、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液；

其中，阳性对照为鳜鱼弹状病毒基因组RNA，阴性对照为双蒸水(ddH₂O)。

其中，反应体系缓冲液可为Tris-HCl、PEG水溶液(PEG可选用PEG2000，但不限于此)、二价阳离子溶液(如Mg²⁺、Zn²⁺等)、一价水离子溶液(如Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺)等，但不限于此。

其中，链置换DNA聚合酶可为本领域常见的Taq或pfu，但不限于此。

需要说明的是，上述缓冲液、重组酶、聚合酶、单链DNA结合蛋白可单独提供，也可以预混液的方式提供。

作为上述技术方案的改进，所述上游引物、所述下游引物的浓度为0.4μM，所述荧光探针的浓度为0.12μM；

所述反应体系缓冲液选用质量浓度为10％的聚乙二醇溶液和280mM的乙酸镁水溶液。

相应的，本发明还公开了一种鳜鱼弹状病毒的检测方法，其包括以下步骤：

提取待检测样品RNA；

以待检测样品RNA为扩增模板，采用如权利要求1所述的RPA组合物进行RPA扩增，得到扩增产物；

对所述扩增产物进行分析。

其中，待检测样品为鳃粘液、肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织，但不限于此。具体的，当待检测样品为肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织时，将组织剪碎后，用研磨钵进一步处理，通过使用RNA提取试剂盒进行核酸抽提。

作为上述技术方案的改进，对所述扩增产物进行分析的步骤包括：

使用侧向层析试纸条对扩增产物进行分析；

若试纸条质控线和检测线同时出现条带，则待测样品为含有鳜鱼弹状病毒；

若试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带，则待测样品不含有鳜鱼弹状病毒或包含其他感染源。

需要说明的是：本发明中的RPA组合物不仅可适用于侧向层析试纸检测，还可用于荧光检测、电泳检测等，但不限于此。

作为上述技术方案的改进，所述其他感染源包括鲤疱疹病毒Ⅱ型、锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒、罗湖病毒、传染性脾肾坏死病毒、大鲵虹彩病毒中的一种或多种。

作为上述技术方案的改进，RPA扩增温度为39～43℃，反应时间为5～30min。

作为上述技术方案的改进，RPA扩增温度为39℃，反应时间为20～30min。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明根据SRCV的L基因保守序列设计出一对引物和探针，并建立了一种方便快速、特异性强和灵敏度极高的SCRV RPA-LFD检测方法，检测限可低至6.20copies/μL，其灵敏度可与最常用的qPCR媲美，远远高于普通PCR及其他RPA-LFD检测方法，非常适用于基层单位和养殖现场快速检测和筛查鳜鱼、鲈鱼等鱼体感染和携带SCRV情况。

此外，本发明采用RPA技术结合侧向层析试纸条(LFD)，只需在39～43℃下反应5～30min，插入LFD试纸条，5min左右即可肉眼观察到实验结果，无需凝胶电泳，就可直观判定结果，操作非常简便，适用于野外、现场检测和大规模筛选。

附图说明

图1为实施例1中引物的筛选结果图，其中，1～3分别为RPAB1F/R、RPA B2F/R、RPAB3F/R等3对引物对的扩增结果；

图2为实施例3中不同反应温度下扩增结果图；其中，1～5分别为反应温度为37℃、39℃、41℃、43℃、45℃，6为阴性；

图3为实施例3中不同反应时间下扩增结果图；其中，1为阴性，2～7分别为反应温度为5min、10min、15min、20min、25min、30min；

图4是实施例4中特异性实验结果图；其中，1～8分别是SCRV、CYHV-2、KHV、SVCV、TiLV、ISKNV、GSIV、阴性；

图5是实施例4中敏感性实验结果图；其中，1～8分别为质粒拷贝数为6.2×10⁶copies/μL、6.2×10⁵copies/μL、6.2×10⁴copies/μL、6.2×10³copies/μL、6.2×10²copies/μL、6.2×10¹copies/μL、6.2×10⁰copies/μL、6.2×10^-1copies/μL，9为阴性；

图6是实施例4中重复性实验结果图，其中，1～5为6.2×10³fg/μL五次重复结果，6～10为6.2×10¹fg/μL五次重复结果；

图7是实施例4中重复性实验的另一结果图；其中，11～15为样品1五次重复结果，16～20为样品2五次重复结果，21～25为样品3五次重复结果。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中的所用技术手段是本领域技术人员所熟知的常规技术手段。

本发明中所采用的主要实验材料、仪器、试剂等如下：

1主要仪器及耗材

实时荧光定量PCR仪QuantStudio^TM5购自美国Applied Biosystems公司；电泳仪和凝胶成像分析系统购自美国BIO-RAD公司；台式高速冷冻型微量离心机、台式冷冻高速离心机购自BIOBASE公司；各种规格的移液枪购自大龙兴创实验仪器(北京)股份公司，无菌0.2mL、0.5mL、1mL以及1.5mL离心管购自上海科进生物技术有限公司。

2主要试剂

RT-RPA核酸扩增试剂(试纸条型)试剂盒购自安普未来(常州)生物科技有限公司，总RNA提取试剂(OMEGA)盒购自广州飞扬生物工程有限公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；其他所需试剂由本实验室提供。

3主要菌毒株

鳜鱼弹状病毒(SCRV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CYHV-2)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、罗湖病毒(TiLV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)的DNA或RNA均由本实验室制备并保存。

实施例1引物、探针的设计

根据genebank中登录的SCRV的L基因序列(NC_008514.1)，参照RPA指导说明，进行重组酶特有引物和探针设计。RPA核酸扩增技术对于引物设计与常规PCR引物设计有一定的区别，有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30～35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出。探针设计序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46～52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有四个修饰位点，距离5’端的≥35nt的中部位置标记一个四氢呋喃(THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基闭，两个基团的间距为2～4nt；THF距离3’末端≥l5nt，并且3’末端标记一个修饰基团，且下游引物5’端标记生物素。

参照RPA引物探针的设计原则，设计并合成RPA引物及RPA-nfo探针，所有引物和探针由上海生物工程技术服务有限公司合成。本次研究经分析筛选出3对引物和1条探针，参见表1。采用水为模板进行检测，结果见图1，从图中可以看出，引物对RPA-B1F/R、RPA-B2F/R均在检测线存在条带，表明其存在非特异性扩增。故筛选最佳引物对为RPA-B3F、RPA-B3R。

表1 RPA-LFD引物和探针序列

实施例2检测方法的建立

一、待测样品的准备及RNA模板提取

(1)待检测样品的采集与预处理：待检测样品为鳃粘液、肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织。当待检测样品为肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织时，将组织剪碎后，用研钵进一步处理，通过使用RNA提取试剂盒进行核酸抽提。

(2)RNA模板的提取：取预处理后的待检测组织样品，用RNA提取试剂盒(OMEGA)提取病毒核酸备用。

二、检测

(1)引物及荧光探针

所采用的上游引物如表1的RPA-B3F，下游引物如表1所示的RPA-B3R，荧光探针如表1的RPA-Probe。

(2)标准阳性对照品的构建

参照PCR引物设计原则，设计了一对PCR引物(PCR-F、PCR-R)，参见表1；用于构建质粒标准品。

以SCRV核酸为模板，扩增其L基因的保守序列，引物序列为PCR-F:5’-AGACTATCAGAGGTGTGT-3’，PCR-R:5’-TGTCCCATGGTTGGATGA-3’。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min。扩增产物胶回收连接pMD19-T载体，克隆转化至大肠杆菌感受态细胞中，提取质粒，并将其命名为pMD19-T-SCRV-L。经PCR鉴定及双酶切鉴定正确后，利用核酸蛋白仪测定质粒标准品浓度，根据公式计算拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒碱基数×660)。

(3)RPA-LFD扩增

具体的反应体系如下表所示：

表2荧光RT-RPA扩增体系

在反应管中加入ABuffer(10％PEG)、ddH₂O，上游引物，下游引物，探针，RNA模板，将B Buffer(280mM乙酸镁)加到管盖上，充分混匀后，将反应EP管放入恒温仪器或水浴锅中，在39℃下反应20～30min，得到扩增产物。

(4)分析判断：

取10μL扩增产物，用无酶水稀释20倍，混匀后吸取80μL加样到LFD(安普未来)立即观察。

若试纸条质控线和检测线同时出现条带，则待测样品为含有鳜鱼弹状病毒；

若试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带，则待测样品不含有鳜鱼弹状病毒或包含其他感染源。

实施例3RPA-LFD反应体系及条件优化

为了确定RPA-LFD的最佳反应温度，在不同温度下孵育30min，温度设定为37℃、39℃、41℃、43℃、45℃，结果如图2所示。从图中可以看出，当扩增温度为37℃、45℃时，检测结果为阴性，不准确。当检测温度为39℃、41℃、43℃时，检测结果为阳性，检测结果准确；且在检测温度为39℃时条带最为清晰，故最优选择39℃作为反应温度。

确定最佳反应温度后，将反应管置于39℃水浴锅中，分别孵育5、10、15、20、25和30min，观察结果确定最佳的反应时间。结果如图3所示。从图中可以看出，当反应时间为5～30min时，检测结果均为阳性，检测结果准确，故可选择5～30min作为检测时间。进一步的，当反应时间为20～30min时，条带更为清晰。故优选20～30min为检测时间。

实施例4方法学验证

1.特异性试验

为了确定该方法的特异性，选取CYHV-2、KHV、SVCV、TiLV、ISKNV和GSIV共6种鱼类常见病原的RNA或者的DNA为模板与SCRV同时进行扩增反应，用量为5μL，进行RPA-LFD检测，评价该方法的特异性，同时设立灭菌的ddH₂O为阴性对照，试验结果见图4。通过图4可见，RPA-LFD仅能检测出SCRV-L目的基因，并且与其他病毒无交叉反应。表明，建立的RPA-LFD方法具有良好的特异性。

2.敏感性试验

为了确定RPA-LFD方法的最小检出量，根据SCRV-L基因构建了重组质粒为标准品，按十倍倍比稀释至八个浓度，即6.2×10⁶～6.2×10^-1copies/μL。利用最佳反应条件进行检测，使用低拷贝10⁰-10²每份稀释液重复评价8次，并用于评价SCRV RPA-LFD试验的检测限。

结果如图5所示，RPA-LFD方法可在可在10min内检测出SCRV，使用低拷贝10^-1-10¹每份稀释液重复评价8次，并用于评价SCRV RPA-LFD试验的检测限。结果表示RPA-LFD方法在6.2×10⁰copies/μL和6.2×10¹copies/μL，均能检测出SCRV，低于6.2×10⁰则不能检测到SCRV，可以判定其检测限为6.20copies/uL。

3.重复性试验

为验RPA-LFD检测结果的可重复性，选取6.2×10³fg/μL、6.2×10¹fg/μL的核酸样本、以及三个临床阳性样本，以50μL体系重复扩增5次，试验结果如图6和图7所示，表明该方法重复性良好。

实施例5荧光RT-RPA和实时荧光PCR对临床样品的检测比较

本实验于2022年在广东佛山鳜鱼养殖场收集了70份鳜鱼临床组织样品进行盲检。采用RPA-LFD、qPCR(梁红茹等，鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用，中国预防兽医学报，2019年)对这70份样品同时进行鉴定，比较两种方法的检测效果。由表3可以看出，70份临床样品中RPA-LFD检出SCRV阳性的样品为22份，阳性率为31.43％，结果与qPCR一致。实时RPA-LFD与荧光定量PCR相比，诊断敏感性分别为100％，诊断特异性均为100％。由此可见，本发明RPA-LFD方法检测结果可靠、用时最短，操作最简单。

表32种方法对临床样品检测结果

实施例5检测试剂盒的制备

该试剂盒的制作和操作流程是基于RPA检测技术。试剂盒含有特异性扩增引物和探针，其中引物序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，探针序列为SEQ IDNo:3。引物的终浓度分别为0.4μM，探针的终浓度为0.12μM，试剂盒还有相应的RT-RPA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液，如10％PEG，乙酸镁溶液，重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白的冻干酶制剂，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的。另外还可以有阳性对照品和阴性对照，阳性对照品应当在扩增过程中能够完全扩增出引物对应的靶向基因片段；阴性对照品为ddH₂O。此试剂盒的价值在于样本包括鱼的鳃粘液、肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织。

以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物，包括RPA引物和探针；

所述PRA引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物的5’端连接生物素；

所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示，且所述探针的5’端连接FAM，3’端连接C3spacer，其31位碱基被四氢呋喃取代。

2.如权利要求1所述的用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物在(1)或(2)中的应用：

(1)检测鳜鱼弹状病毒；

(2)检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒。

3.一种用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于检测鳜鱼弹状病毒的RPA组合物。

4.如权利要求3所述的用于检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照、阴性对照、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液；

其中，所述阳性对照为鳜鱼弹状病毒基因组RNA，所述阴性对照为双蒸水。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、所述下游引物的浓度为0.4μM，所述荧光探针的浓度为0.12μM；

所述反应体系缓冲液选用质量浓度为10％的聚乙二醇溶液和280mM的乙酸镁水溶液。

6.一种鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待检测样品RNA；

以待检测样品RNA为扩增模板，采用如权利要求1所述的RPA组合物进行RPA扩增，得到扩增产物；

对所述扩增产物进行分析。

7.如权利要求6所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，对所述扩增产物进行分析的步骤包括：

使用侧向层析试纸条对扩增产物进行分析；

若试纸条质控线和检测线同时出现条带，则待测样品含有鳜鱼弹状病毒；

若试纸条质控线出现条带，但检测线没有条带，则待测样品不含有鳜鱼弹状病毒或包含其他感染源。

8.如权利要求7所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，所述其他感染源包括鲤疱疹病毒Ⅱ型、锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒、罗湖病毒、传染性脾肾坏死病毒、大鲵虹彩病毒中的一种或多种。

9.如权利要求6所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，RPA扩增温度为39～43℃，反应时间为5～30min。

10.如权利要求6所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，RPA扩增温度为39℃，反应时间为20～30min。