CN116897202A

CN116897202A - Tigit工程化细胞及其组合物

Info

Publication number: CN116897202A
Application number: CN202280017000.5A
Authority: CN
Inventors: 李宗海; 石志敏
Original assignee: Keji Biomedical Shanghai Co ltd
Current assignee: Kaixing Life Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2022-02-24
Publication date: 2023-10-17
Also published as: WO2022179567A1

Abstract

用于开发在宿主生物体中具有更持久性和/或移植成活率高的用于免疫治疗的工程化免疫细胞的及其制备方法。一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞表达能识别TIGIT的第一蛋白，以及涉及增加第一免疫细胞在有宿主第二免疫细胞存在时的持久性和/或移植成活率的方法。

Description

TIGIT工程化细胞及其组合物

相关专利申请

本专利申请要求于2021年2月24日递交的申请号为202110205868.5的中国专利申请的优先权。

技术领域

本申请涉及一种具有抗移植排斥功能的细胞，还涉及抗移植免疫排斥的方法，特别是涉及一种抗NK细胞免疫排斥的方法。

背景技术

由于供体和受体之间的免疫遗传学差异，在进行外源供体移植时，作为外源移植物，供体也可能受到受体体内的免疫细胞识别和攻击，进而抑制或者清除外源移植物，产生宿主抗移植物反应(HVGR)。通过敲除移植物细胞中的MHC分子，能够有效抵抗宿主T细胞对移植物的排斥反应，但是可能会引起宿主内其他免疫细胞的排斥反应。如在异体细胞移植中，当异体细胞的MHC-I类分子的缺失，会导致宿主体内NK细胞排斥反应，增强对异体细胞的清除作用(Nat Biotechnol.2017；35(8):765-772.doi:10.1038/nbt.3860)。因此，如何有效防止宿主NK细胞的免疫排斥反应，对开发异体细胞移植治疗至关重要。

发明详述

本申请的目的在于提供一种抗移植免疫排斥的细胞及抗抑制排斥的方法。

在本申请的第一方面，提供一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞表达能识别TIGIT的第一蛋白。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白含有能够识别TIGIT的抗体，优选TIGIT的序列如SEQ ID No:10所示。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、T细胞抗原耦合器(TAC)或其组合。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白是CAR，所述CAR包括：

(i)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD3δ；

(ii)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iii)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iv)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ。

在一个具体的实施方式中，所述细胞包含：编码TIGIT蛋白的基因的敲除和/或内源性TIGIT分子低表达或不表达。

在一个具体的实施方式中，采用CRISPR/Cas9技术敲除所述细胞TIGIT基因，所使用的gRNA选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36所示序列中的任一种或其组合。

在一个具体的实施方式中，所述细胞选自T细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、NKT细胞、DNT细胞、NK92细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。

在一个具体的实施方式中，所述细胞为自体或同种异体T细胞、原代T细胞或来源于人的自体T细胞。

在一个具体的实施方式中，所述细胞包括，编码TCR蛋白的基因的敲除和/或内源性TCR分子低表达或不表达，和/或编码MHC蛋白的基因的敲除和/或内源性MHC低表达或不表达。

在一个具体的实施方式中，采用CRISPR/Cas9技术敲除内源性MHC分子B2M和内源性TCR。

在一个具体的实施方式中，敲除B2M所使用的gRNA包括SEQ ID NO:24、72、73和/或74所示序列，敲除TCR使用的gRNA包括SEQ ID NO:23、65、66、67、68、69、70和/或71所示序列。

在一个具体的实施方式中，所述识别TIGIT的抗体包括：

(i)SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2、SEQ ID NO：5所示的HCDR3、SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2、和/或SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或

(ii)SEQ ID NO：1所示的重链可变区和/或SEQ ID NO：2所示的轻链可变区；或

(iii)SEQ ID NO：78所示的scFv。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白还识别肿瘤和/或病原体；优选地，所述肿瘤表达包括BCMA、CD19、GPC3、CLDN18A2、EGFR或其组合。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白包含识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体，它们的连接方式包括：

(i)识别TIGIT的抗体的轻链/重链(或轻链可变区/重链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链/轻链(或重链可变区/轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的重链/轻链(或重链可变区/轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的轻链/重链(或轻链可变区/重链可变区)；

(ii)识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链(或重链可变区)—识别TIGIT的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的重链(或重链可变区)；和/或

(iii)识别TIGIT的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的重链(或重链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链(或重链可变区)，

其中，所述第一蛋白是CAR，所述CAR包括：

(i)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD3δ；

(ii)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iii)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iv)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ。

在一个具体的实施方式中，所述识别肿瘤抗原的抗体识别CLDN18A2，包括：

(i)SEQ ID NO：13所述的HCDR1、SEQ ID NO：14所述的HCDR2、SEQ ID NO：15所述的HCDR3、SEQ ID NO：16所述的LCDR1、SEQ ID NO：17所述的LCDR2、和/或SEQ ID NO：18所述的LCDR3；或

(ii)SEQ ID NO：11所述的重链可变区和/或SEQ ID NO：12所述的轻链可变区；或

(iii)SEQ ID NO：82所示scFv。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白包括SEQ ID NO：48、50、52、90或91所示的序列。

在一个具体的实施方式中，所述细胞还表达靶向识别肿瘤抗原、和/或病原体抗原的第二蛋白、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、降低PD-1表达的siRNA、阻断PD-L1与PD-1结合的蛋白、安全开关或其组合。

在一个具体的实施方式中，当所述细胞与宿主NK细胞共培养时，所述细胞能杀伤宿主NK细胞，或所述细胞能抵抗宿主NK细胞对所述细胞的杀伤，或所述细胞能抵抗活化的宿主NK细胞对所述细胞的杀伤。

在一个具体的实施方式中，所述细胞与增强其功能的药剂组合施用，优选地，与化疗药物联用；和/或

所述细胞与改善其相关的一种或多种副作用的药剂联合施用；和/或

所述细胞与表达识别与第一蛋白不同抗原的第二蛋白的细胞联合施用。

在一个具体的实施方式中，所述第二蛋白包括CAR，所述CAR包括：

(i)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD3δ；

(ii)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iii)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iv)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ。

在一个具体的实施方式中，所述表达第二蛋白的细胞包括：

(i)编码TIGIT蛋白的基因的敲除和/或内源性TIGIT分子低表达或不表达；或

(ii)编码TCR和/或MHC蛋白的基因的敲除和/或内源性TCR和/或MHC分子低表达或不表达；或

(iii)编码TIGIT、TCR和MHC蛋白的基因的敲除和/或内源性TIGIT、TCR和MHC分子低表达或不表达。

在一个具体的实施方式中，所述表达第二蛋白的细胞：

(i)采用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT分子；

(ii)采用CRISPR/Cas9技术敲除TCR和/或MHC分子B2M；或

(iii)采用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT、TCR和MHC分子B2M。

在一个具体的实施方式中，所述表达第二蛋白的细胞选自T细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、NKT细胞、DNT细胞、NK92细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。

根据本申请的第二方面，提供一种增加第一免疫细胞在有宿主第二免疫细胞存在时的持久性和/或移植成活率的方法，包括：

a)提供第一免疫细胞；

b)任选地，通过编码参与针对自体和非自体抗原识别的响应的多肽的至少一种内源基因表达、活性和/或信号传导被降低或抑制来修饰所述第一免疫细胞；

c)编码靶向TIGIT的第一蛋白的多核苷酸来修饰所述第一免疫细胞。

在一个具体的实施方式中，步骤b)中的所述多肽选自MHC、TCR、和/或TIGIT。

在一个具体的实施方式中，步骤b)包括：

(i)利用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT分子；

(ii)利用CRISPR/Cas9技术敲除TCR和/或MHC分子B2M；或

(iii)利用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT、TCR和MHC分子B2M。

在一个具体的实施方式中，步骤b)包括：

(i)敲除TIGIT分子所使用的gRNA选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和/或36所示序列；

(ii)敲除TCR使用的gRNA包括SEQ ID NO:23、65、66、67、68、69、70和/或71所示序列；和/或

(iii)敲除MHC分子B2M所使用的gRNA包括SEQ ID NO:24、72、73和/或74所示序列。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白包括：

(i)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(ii)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iii)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，CD28的共刺激信号结构域，CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iv)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，和CD3δ。

在一个具体的实施方式中，所述第一蛋白包括：

(i)SEQ ID NO：78所示的TIGIT的scFv；

(ii)SEQ ID NO：82所示的CLDN18A2的scFv；

(iii)SEQ ID NO：48、50或52所示的TIGIT抗体和CLDN18A2抗体串联序列；或

(iv)SEQ ID NO：9、54、56、58、90或91所示的第一蛋白。

在一个具体的实施方式中，还包括步骤d)编码靶向肿瘤抗原和/或病原体抗原和/或病毒抗原的第二蛋白、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、降低PD-1表达的siRNA、阻断PD-L1与PD-1结合的蛋白、或安全开关等非内源性的多核苷酸来修饰所述第一免疫细胞。

在一个具体的实施方式中，所述第一免疫细胞选自T细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、NKT细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。

在一个具体的实施方式中，所述第一免疫细胞为自体或同种异体T细胞、原代T细胞或来源于人的自体T细胞。

根据本申请的第三方面，提供一种工程化细胞，其通过上述本申请的方法制备的。

根据本申请的第四方面，提供一种多核苷酸，其是编码建构如上述本申请所述的细胞的核酸分子或编码施用上述本申请方法需要的核酸分子。

根据本申请的第五方面，提供一种载体，其包含如本申请所述的多核苷酸。

根据本申请的第六方面，提供一种包含本申请所述载体的病毒。

根据本申请的第七方面，提供一种组合物，其包含有效量的如本申请所述的细胞、如本申请所述的多核苷酸、如本申请所述的载体、如本申请所述的病毒。

根据本申请的第八方面，提供一种治疗炎性病症、病毒感染和/或肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者给予如本申请所述的细胞或如本申请所述的组合物。

本申请还涉及：

1.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞表达能识别TIGIT的第一蛋白；

优选地，所述TIGIT氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；

优选地，所述第一蛋白含有能够识别TIGIT的抗体或其功能片段；

优选地，所述第一蛋白含有SEQ ID NO：1所述的重链可变区和/或SEQ ID NO：2所述的轻链可变区；

优选地，所述第一蛋白包含识别TIGIT的抗体或其功能片段、识别肿瘤抗原或病原体抗原的抗体或其功能片段、跨膜区、及胞内域；

优选的，所述识别TIGIT的抗体或其功能片段和识别肿瘤抗原或病原体抗原的抗体通过连接肽相连。

2.如项1所述的细胞，其特征在于，所述细胞为免疫效应细胞或经人工改造的具有免疫效应细胞功能的细胞。

3.如项1或2所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞；

优选的，所述细胞来源于人的T细胞；

优选地，所述细胞为人原代T细胞；

更优选地，所述细胞是同种异体T细胞。

4.如项1-3任一项所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白还连接有细胞活化信号，

优选地，所述第一蛋白包含来自CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα或TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域。

5.如项1-4任一项所述的细胞，其特征在于，减少所述细胞中的MHC和/或内源性TCR表达、活性和/或信号传导；优选的，所述MHC为MHC I类分子；更优选地，所述MHC I类分子为HLA；更优选地，所述HLA为HLA-I；更优选地，所述HLA-I选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M中的一种或两种以上；最优选的，所述HLA-I包括HLA-A和/或B2M；优选地，所述内源性TCR包括TCR的α和β链中的一种或两种链；

优选地，所述被降低或抑制是通过使用TAL核酸酶、巨核酸酶、锌指核酸酶、Cas9和Argonaute来进行；

优选地，所述工程化T细胞包含靶向编码MHC的基因的抑制性核酸分子或gRNA；

优选地，所述抑制性核酸分子包含与所述编码MHC的基因和/或所述内源性TCR互补的序列；

优选地，所述抑制性核酸包含RNA干扰剂；

优选地，所述抑制性核酸包含siRNA、shRNA或miRNA；

优选地，所述gRNA序列含有SEQ ID NO：23和/或SEQ ID NO：24所示序列；

优选地，所述MHC和/或内源性TCR的表达、活性和/或信号传导减少是永久的、短暂的或可诱导的；

优选地，与未基因工程化的T细胞中MHC和/或内源性TCR的表达、活性和/或信号传导相比，所述工程化细胞中MHC和/或内源性TCR的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％；

优选地，利用免疫印迹测定和/或在流式检测，检测不到所述工程化细胞中表达的MHC和/或内源性TCR的表达。

6.如项1-5任一项所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白选自嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、T细胞抗原耦合器(TAC)、T细胞融合蛋白(TFP)或其组合；

优选地，所述第一蛋白包含有胞外域、跨膜区和胞内信号域。

7.如项1-6任一项所述细胞，其特征在于，所述第一蛋白包括：

(i)特异性识别TIGIT的抗体或其功能片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(ii)特异性识TIGIT的抗体或其功能片段、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iii)特异性识TIGIT的抗体或其功能片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iv)特异性识别TIGIT的抗体或其功能片段、CD28或CD8的跨膜区和CD3δ；

优选地，所述特异性识别TIGIT的抗体含有SEQ ID NO：1所述的重链可变区和/或SEQ ID NO：2所述的轻链可变区；

优选地，所述第一蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：9共有至少80％、优选90％、并且更优选95％的同一性。

8.如项1-7任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达靶向肿瘤抗原、和/或病原体抗原、和/或病毒抗原的第二蛋白、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、降低PD-1表达的siRNA、阻断PD-L1与PD-1结合的蛋白、安全开关或其组合；

优选地，所述第二蛋白包括：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)、aTCR-T或其组合；

优选地，所述第二蛋白能够特异性识别Claudin18.2、GPC3、BCMA或CD19。

9.如项1-8任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达NK细胞抑制性受体的配体或抗体片段；

优选地，所述细胞还表达NKG2A结合分子；

优选地，所述NKG2A结合分子为细胞膜结合蛋白、分泌型蛋白；

优选地，所述NKG2A结合分子包含胞外域、跨膜区；或包含胞外域、跨膜区和胞内区；

优选地，所述NKG2A结合分子为结合在细胞膜上的NKG2A抗体或抗体片段。

10.如项1-9任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞内源性TIGIT表达、活性和/或信号传导被降低或抑制；

优选地，所述免疫细胞包含靶向编码TIGIT的基因的抑制性核酸分子或gRNA；

优选地，所述抑制性核酸分子包含与所述编码TIGIT的基因互补的序列；

优选地，所述抑制性核酸包含RNA干扰剂；

优选地，所述抑制性核酸包含siRNA、shRNA或miRNA；

优选地，所述TIGIT的表达、活性和/或信号传导减少是永久的、短暂的或可诱导的；

优选地，与未基因工程化的细胞中TIGIT的表达、活性和/或信号传导相比，所述工程化细胞中TIGIT的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％；

优选地，利用免疫印迹测定和/或在流式检测，检测不到所述细胞中表达的TIGIT的表达。

11.如项1-10任一项所述的细胞，其特征在于，当所述细胞与宿主NK细胞共培养时，所述细胞能杀伤宿主NK细胞。

12.如项1-11任一项所述的细胞，其特征在于，当所述细胞与宿主NK细胞共培养时，所述细胞能抵抗宿主NK细胞对所述细胞的杀伤；

优选地，所述细胞能抵抗宿主NK细胞中被细胞因子活化的NK细胞对所述细胞的杀伤；

优选地，所述细胞能抵抗表达NKG2A的宿主NK细胞对所述细胞的杀伤；

优选地，所述细胞能显著地抵抗低表达NKG2A的宿主NK细胞对所述细胞的杀伤。

13.如项1-12任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞与增强其功能的药剂组合施用，优选地，与化疗药物联用；

和/或所述细胞与改善其相关的一种或多种副作用的药剂联合施用。

14.增加同种异体免疫细胞在有宿主免疫细胞存在时的持久性和/或移植成活率的方法，包括：

a)提供同种异体细胞；

b)通过编码参与针对自体和非自体抗原识别的响应的多肽的至少一种内源基因表达、活性和/或信号传导被降低或抑制来修饰所述细胞；

c)编码靶向TIGIT的第一蛋白的多核苷酸来修饰所述细胞。

15.根据项14所述的方法，其特征在于，步骤b)中的所述多肽选自MHC和/或内源性TCR，所述MHC为MHC I类分子；更优选地，所述MHC I类分子为HLA；更优选地，所述HLA为HLA-I；更优选地，所述HLA-I选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M中的一种或两种以上；优选地，所述内源性TCR包括TCR的α和β链中的一种或两种链；更优选的，所述HLA-I包括HLA-A和/或B2M；

优选地，步骤b)通过B2M和TCR表达、活性和/或信号传导被降低或抑制来修饰所述细胞；

优选地，所述细胞包含靶向编码MHC的基因的抑制性核酸分子或gRNA；

优选地，所述抑制性核酸分子包含与所述编码MHC的基因互补的序列；

优选地，所述抑制性核酸包含RNA干扰剂；

优选地，所述抑制性核酸包含siRNA、shRNA或miRNA；

优选地，所述gRNA序列含有SEQ ID NO：23和/或24所示序列；

优选地，与未基因工程化的细胞中MHC和/或内源性TCR的表达、活性和/或信号传导相比，所述工程化细胞中MHC和/或内源性TCR的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％；

优选地，利用免疫印迹测定和/或在流式检测，检测不到所述细胞中表达的MHC的表达。

16.根据项14或15所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白选自嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、T细胞抗原耦合器(TAC)、T细胞融合蛋白(TFP)或其组合；

优选地，所述第一蛋白包含有胞外域、跨膜区和胞内信号域；

优选的，所述细胞通过胞内信号域传递信号介导对宿主的免疫效应细胞的抑制或杀伤；

优选地，所述第一蛋白包括：

17.如项14-16任一项所述的方法，其特征在于，还包括步骤d)编码靶向肿瘤抗原、和/或病原体抗原、和/或病毒抗原的第二蛋白、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、降低PD-1表达的siRNA、阻断PD-L1与PD-1结合的蛋白、或安全开关等非内源性的多核苷酸来修饰所述细胞；

18.如项14-17任一项所述的方法，其特征在于，还包括步骤e)编码NK细胞抑制性受体的配体或抗体片段的非内源性多核苷酸来修饰所述细胞；

优选地，还包括步骤e)编码所述免疫细胞NKG2A结合分子的非内源性多核苷酸来修饰所述细胞；

优选地，所述NKG2A结合分子仅包含胞外域、跨膜区；或包含胞外域、跨膜区和胞内区；

19.如项14-18任一项所述的方法，其特征在于，还包括步骤f)通过编码TIGIT表达、活性和/或信号传导被降低或抑制来修饰所述细胞；

优选地，所述细胞包含靶向编码TIGIT的基因的抑制性核酸分子或gRNA；

优选地，所述抑制性核酸包含RNA干扰剂；

优选地，所述抑制性核酸包含siRNA、shRNA或miRNA；

优选地，与未基因工程化的细胞中TIGIT的表达、活性和/或信号传导相比，所述工程化免疫细胞中TIGIT的表达、活性和/或信号传导减少大于或者大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％；

优选地，利用免疫印迹测定和/或在流式检测，检测不到所述免疫细胞中表达的TIGIT的表达。

20.如项14-19任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞；

优选的，所述细胞来源于人的T细胞；

优选地，所述细胞为人原代T细胞；

更优选地，所述细胞是同种异体T细胞。

21.如项14-20任一项所述的方法，其特征在于，当所述方法制备的细胞与宿主NK细胞共培养时，所述细胞能杀伤宿主NK细胞。

22.如项14-21任一项所述的方法，其特征在于，当所述方法制备的细胞与宿主NK细胞共培养时，所述细胞能抵抗宿主NK细胞对所述细胞的杀伤；

23.如项14-22任一项所述的方法，其特征在于，所述方法制备的细胞与增强其功能的药剂组合施用，优选地，与化疗药物联用；

或所述方法制备的细胞与改善其相关的一种或多种副作用的药剂联合施用。

24.一种工程化细胞，其通过如项14-23中任一项所述的方法产生。

25.一种双特异性抗体构建体，其包含结合到靶细胞表面上的人或猕猴TIGIT的第一结合结构域和结合到T细胞表面上的人CD3的第二结合结构域。

26.如项25所述的抗体构建体，其中所述第二结合结构域结合到人CD3ε和普通狨、棉顶狨或松鼠猴CD3ε；

优选地，所述抗体构建体选自以下的形式：(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双功能抗体和这些形式的寡聚物。

27.一种多核苷酸，其编码如项25或26所述抗体构建体或编码如项1-13任一项所述细胞的构建体或编码施用所述14-23任一项所述方法需要的构建体。

28.一种载体，其包含如项27所定义的多核苷酸。

29.一种感染如项28所述载体的病毒。

30.一种组合物，其包含有效量的如项1-13或24中任一项所述的工程化细胞，

优选地，还包含药学上可接受的载体；

优选地，所述载体是盐水溶液、右旋糖溶液或5％人血清白蛋白。

优选地，还包含冷冻保护剂。

31.一种试剂盒，其特征在于，包括如项1-13或24中任一项所述的工程化细胞或如项30所述的组合物以及用于治疗疾病的另外的药剂。

32.一种治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者给予如项1-13或24中任一项所述的工程化细胞或如项30所述的组合物或如项31所述的试剂盒，

优选地，在给予所述工程化细胞之前，通过根据项14-23中任一项所述的方法产生所述工程化细胞；

优选地，其还包括给予另外的药剂；

优选地，所述疾病选自炎性病症、感染和肿瘤；

优选地，所述受试者是人；

优选地，其中所述工程化细胞对于所述受试者是自体的或同种异体的T细胞。

应理解，在本申请范围内中，本申请的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了细胞因子对TIGIT+NK细胞比例的影响；

图2显示了活化NK细胞中TIGIT+NK细胞的百分比；

图3显示了TIGIT-Z CAR载体图；

图4显示了TIGIT-Z CAR-T细胞阳性率；

图5显示了TIGIT-UCAR-T细胞对NK细胞的抵抗功能；

图6显示了双靶向TIGIT&CLDN18A2的CAR1、CAR2、CAR3及仅靶向CLDN18A2的CAR的载体图；

图7显示了双靶向TIGIT&CLDN18A2的UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3及仅靶向CLDN18A2的CLDN18A2-UCAR-T细胞的阳性率；

图8显示了双靶向TIGIT&CLDN18A2的UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3及仅靶向CLDN18A2的CLDN18A2-UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果；

图9显示了U-UTD、双靶向TIGIT&CLDN18A2的UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3及仅靶向CLDN18A2的CLDN18A2-UCAR-T细胞的阳性率和TIGIT表达情况；

图10显示了U-UTD、双靶向TIGIT&CLDN18A2的UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3及仅靶向CLDN18A2的CLDN18A2-UCAR-T细胞与PBMC细胞共培养后T细胞和NK细胞比例的变化情况；

图11A显示了U-UTD、双靶向TIGIT&CLDN18A2的UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3及仅靶向CLDN18A2的CLDN18A2-UCAR-T细胞对HGC-27-CLDN18A2移植瘤的治疗效果；图11B显示了上述各组的外周血CD4+、CD8+T细胞存活情况；

图12显示了TIGIT的不同gRNA的敲除效率；

图13显示了CLDN18A2-UCAR-T、CLDN18A2-UCAR-T-TIGITKO、UCAR-T1-TIGIT KO、UCAR-T2-TIGIT KO、UCAR-T3-TIGIT KO细胞的CAR阳性率；

图14A显示了CLDN18A2-CAR-T、CLDN18A2-CAR-T-TIGIT KO细胞的CAR阳性率和TIGIT阳性细胞比例；图14B显示了CLDN18A2-CAR-T、CLDN18A2-CAR-T-TIGIT KO细胞对靶细胞的体外杀伤效果；

图15显示了U-UTD-TIGIT KO、CLDN18A2-UCAR-T、CLDN18A2-UCAR-T-TIGIT KO、UCAR-T1-TIGIT KO、UCAR-T2-TIGIT KO、UCAR-T3-TIGIT KO细胞对HGC-27-CLDN18A2移植瘤的治疗效果；

图16显示了靶向TIGIT的TIGIT-BBZ和TIGIT-28Z的载体图；

图17显示了TIGIT-BBZ-UCAR T细胞、TIGIT-28Z-UCAR细胞分别与NK细胞共培养后T细胞和NK细胞比例的变化情况。

具体实施方式

申请人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在免疫效应细胞或经人工改造的具有免疫效应细胞功能的细胞表面表达靶向TIGIT的嵌合抗原受体，可以破坏宿主体内大部分的NK细胞，从而很大程度上避免宿主NK细胞对同种异体免疫效应细胞或经人工改造的具有免疫效应细胞功能的细胞的攻击，延长同种异体T细胞在宿主体内的存活时间，提升抗肿瘤效果。在此基础上完成了本申请。

术语

除非专门定义，本文所用的所有技术和科学术语具有在基因治疗，生物化学、遗传学和分子生物学领域内的技术人员通常理解的相同含义。类似或等效于本文中描述的所有方法和材料都可以在本申请的实践或测试中使用，其中，本文描述的是合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其全部内容结合于本文中作为参考。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，除非另有规定，材料、方法和实施例仅是说明性的，而并非旨在进行限制。

除非另有说明，本申请的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术，这都属于本领域的技术范围。这些技术充分解释于文献中。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL，2000，WileyandsonInc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Third Edition，(Sambrooketal，2001，Cold Spring Harbor，NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是Vols.154和155(Wuetal.eds.)和Vol.185，“Gene Expression Technology”(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Hand book Of Experimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；和Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内，所述范围的上下限也属于请求保护的主题的范围。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。这适用而无关范围的宽度。

本文使用的术语约是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。本文中述及“约”值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的实施方式。例如，关于“约X”的描述包括“X”的描述。例如，“约”或“包含”可意指按照在该领域中的实际的标准偏差在1以内或多于1。或者“约”或“包含”可意指至多10％(即±10％)的范围。例如，约5uM可包括在4.5uM与5.5uM之间的任何数目。

除非另外指出，本文中所述任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括在所述范围内的任何整数，以及在合适情况下，其分数(例如整数的十分之一与百分之一)的数值。

为便于更好地理解本申请，对相关术语定义如下：

术语“TIGIT(T cell Ig and ITIM domain)”或“TIGIT抑制性受体”是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/Nectin家族的成员，基因登记号：201633，人TIGIT氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。它由细胞外免疫球蛋白可变区(IgV)结构域型跨膜区和具有经典免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白酪氨酸尾(ITT)基序的细胞内结构域组成。TIGIT在淋巴细胞中表达，特别是在效应和调节性CD4+T细胞，滤泡辅助CD4+T细胞，效应CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞中高表达(Eur.J.Immunol.2015.45:2886–2897)。由于CAR-T细胞在治疗肿瘤病人时，会分泌大量的细胞因子，本申请一些实施例采用不同组合的IL-2、IL-15以及IL-12细胞因子来处理NK细胞，检测TIGIT+NK细胞比例的变化。

术语“CLDN18A2”是指密蛋白18(Claudin 18，CLD18)分子(Genbank登记号：剪接变体1(CLD18A1)：NP_057453、NM016369，以及剪接变体2(CLD18A2)：NM_001002026、NP_001002026)是分子量约为27,9/27,72kD的内在跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和内皮的紧密连接中的内在膜蛋白。紧密连接在相邻细胞之间组织膜内颗粒互联链的网。在紧密连接中，闭合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白组分。由于其强胞间粘附特性，它们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的一级屏障。形成紧密连接的蛋白质关键性地参与了组织上皮组织结构。

术语“移植免疫排斥”是指宿主进行同种异体的组织、器官、或细胞等移植物移植后，外源的移植物作为一种“异己成分”被宿主的免疫系统识别，并发起针对移植物的攻击、破坏和清除的免疫学反应。本申请提供一种抗移植免疫排斥的细胞及抗移植排斥的方法。

术语“移植物”是指来源于宿主之外的个体，用于植入宿主的生物材料或制剂。移植物可来自任何动物来源，如哺乳动物来源，优选来自人类。在一些实施方式中，所述的移植物可以是来自宿主，如来自宿主的细胞经体外培养、或改造再次植入宿主。在一些实施方式中，所述的移植物可以是来自同种异体的其他个体，如来自其他人的细胞经体外培养、或改造植入宿主。在一些实施方式中，所述的移植物可以是来自异种的个体，如来自其他种属(如鼠、猪、猴)的器官植入人。

术语“细胞”指人或非人的、来源于动物的细胞。

术语“宿主”是指接受移植物移植的受体，在一些实施方式中，可以是接受外源细胞植入的个体，如人。

术语“个体”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本申请的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。

术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，产生免疫效应的细胞，如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、树突细胞、CIK细胞、巨噬细胞、肥大细胞等。在一些实施方案中，所述的免疫效应细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞可以是自体T细胞、异种T细胞、同种异体T细胞。在一些实施方案中，所述的NK细胞可以是自体NK细胞或同种异体NK细胞。

术语“经人工改造的具有免疫效应细胞功能的细胞”是指不具有免疫效应的细胞或细胞系经人工改造或接受刺激物刺激后，该细胞获得了免疫效应细胞功能。如293T细胞，经人工改造，使其具有免疫效应细胞的功能；如干细胞，经体外诱导，使其分化成免疫效应细胞。

本文所述的“T细胞”可以是PBMC、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织和来自感染部位、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤组织中获取的天然的T细胞，还可以是经过分选等获得的具有特定表型特征的细胞群，或不同表型特征的混合细胞群体，如“T细胞”可以是包含至少一种T细胞亚群的细胞：记忆性干细胞样T细胞(stem cell-like memory T cells，Tscm细胞)、中心记忆T细胞(Tcm)、效应性T细胞(Tef、Teff)、调节性T细胞(tregs)和/或效应记忆T细胞(Tem)。在一些情况下，“T细胞”可以是某种特定亚型的T细胞，如γδT细胞。在某些情况下，可以使用任何本领域技术人员已知的技术，例如FicollTM分离和/或单采术(apheresis)，从个体收集的血液获得T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，可以是任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞，例如Th1和Th2细胞、CD8+T细胞(例如细胞毒T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、天真T细胞等。T细胞可能是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一个实施方案中，通过单采血获得来自个体的循环血液的细胞。单采制品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采采集收集的细胞以除去血浆分子并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的加工步骤。所述T细胞可以从健康供体，或者来自诊断患有癌症个体的衍生细胞。

术语“激活”和“活化”可互换使用，可以指细胞从静止状态转变为活性状态的过程。该过程可以包括对抗原、迁移和/或功能活性状态的表型或遗传变化的响应。例如，术语“激活”可以指T细胞逐步活化的过程。该活化过程受第一刺激信号和共刺激信号的共同调控。T细胞的活化是一个动态变化的过程，其持续时间和活化程度的强弱均受到外界条件刺激的影响。“T细胞活化”或“T细胞激活”指被刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞的状态。使用CD3/CD28磁珠，体外抗原刺激或者体内抗原刺激都会对T细胞的活化程度和持续时间造成影响。在一个实施例中，所述工程化T细胞与含特定靶抗原肿瘤细胞共孵育或病毒感染后活化。

术语“外周血单个核细胞”(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞等。

术语“多能干细胞”具有分化成三个胚层中的任一个的潜力：内胚层(例如，胃连接、胃肠道、肺等)，中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液，泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)。如本文所用，术语“多能干细胞”还涵盖“诱导多能干细胞”或“iPSC”，是来源于非多能细胞的一种多能干细胞。在一实施例中，所述多能干细胞来自于通过对体细胞进行重新编程转化而来具有多能干细胞特征的细胞。这样的“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调节基因的表达或通过外源施加某些蛋白质来产生。

术语“工程化”是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。在一个实施例中，所述工程化是指核酸的一个或多个改变，例如生物体基因组内的核酸。在一个实施例中，所述工程化是指基因的改变、添加和/或缺失。在一个实施例中，所述工程细胞或所述工程化细胞还可以指具有加入、缺失和/或改变的基因的细胞。

术语“遗传修饰”、“基因修饰”、“基因工程化”或“经修饰的”是指修饰细胞的方法，包括但不限于通过基因编辑的方法在基因编码或非编码区或其表达调控区；或通过核酸内切酶和/或反义RNA技术；或增加引入外源的蛋白和/或复合体、小分子抑制剂对基因的蛋白表达水平进行改变来造成基因缺陷。在一些实施方案中，经修饰的细胞为干细胞(例如，造血干细胞(HSC)或祖细胞、胚胎干细胞(ES)、诱导性多能干(iPS)细胞)，淋巴细胞(例如T细胞)，其可以是从受试者或供体获得。可以修饰细胞以表达外源构建体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，其可以整合到细胞基因组中。

术语“基因沉默”，是指由于各种原因，使基因不表达或低表达的现象。基因沉默可以是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默；也可以是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而是基因失活，包括反义RNA、共抑制、基因压抑、RNA干扰和微小RNA介导的翻译抑制等；也可以通过增加蛋白质的降解导致检测不到蛋白表达或低表达，包括PROTAC、LYTAC、AbTAC、ATTEC、AUTAC以及膜蛋白胞内滞留技术等。

所述“TCR沉默”是指内源性的TCR不表达或低表达。

所述“MHC沉默”是指内源性的MHC不表达或低表达。

本申请所述“低表达”是工程化细胞中的目标基因表达的蛋白质和/或RNA水平低于细胞工程化处理之前的表达水平。具体实施例中，B2M或TCR或TIGIT的低表达是指细胞中B2M或TCR或TIGIT的表达减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。可以通过本领域内已知的任何合适的方法，如ELISA、免疫组织化学、免疫印迹(Western Blotting)或流式细胞术使用B2M或TCR或TIGIT的特异性抗体测定细胞中蛋白的表达或含量。

术语“MHC”为组织相容性复合物，是所有编码生物相容复合体抗原的基因群的统称，MHC抗原表达于所有高等脊椎动物的组织，在人类细胞中称为HLA抗原，在移植反应中发挥重要作用，由对所植入的组织的表面上的组织相容性抗原产生反应的T细胞介导排异。MHC抗原分为NHC I类抗原和MHC II类抗原。

术语“人类白细胞抗原”(Human leukocyte antigen，HLA)是人类的主要组织相容性复合体的编码基因，位于6号染色体上(6p21.31)，与人类的免疫系统功能密切相关。HLA包括有I类、II类和III类基因部分。HLA的I类和II类基因所表达的抗原位于细胞膜上，为MHC-I(HLA-A、HLA-B、HLA-C位点编码)和MHC-II(HLA-D区编码)，HLA I类几乎分布于身体全部细胞表面，是一个异二聚体，由重链(α链)与β2微球蛋白组成(B2M)，II类主要是定位于巨噬细胞和B淋巴细胞表面的糖蛋白。

术语“B2M”为β-2微球蛋白，是MHC I类分子的轻链。在人类中，B2M由位于15号染色体上的b2m基因编码，与6号染色体上的作为基因簇定位的其他MHC基因相对。有研究表明，当B2M基因发生突变，来自缺乏正常细胞表面MHC I表达的小鼠的造血移植物被正常小鼠中的NK细胞排斥，说明MHC I分子的缺陷性表达使细胞易于被宿主免疫系统排斥(Bix et al.1991)。

术语“T细胞受体(T cell receptor，TCR)”介导T细胞对特异性主要组织相容性复合物(MHC)-限制性肽抗原进行识别，包括经典的TCR受体和优化的TCR受体。经典的TCR受体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等，其抗原特异性存在于V区，V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，在一个方面，表达经典的TCR的T细胞可以通过对T细胞采用如抗原刺激等方式，诱导T细胞的TCR对靶抗原的特异性。TCR分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条链组成，TCR2由α和β两条链组成。术语“TRAC”是指TCRα链的恒定区。

术语“基因编辑”，是指利用部位特异性核酸酶在生物体基因组中的特定位置进行DNA插入、敲除、修改或替换的基因工程技术，改变DNA序列。这种技术有时称作“基因剪辑”或“基因组工程”。基因编辑可以用来实现精确的、高效的基因敲除或者基因敲入。

核酸酶指导的基因组靶向修饰技术通常由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成，由DNA识别结构域识别靶位点，把核酸酶定位到需要进行编辑的基因组区域，然后由非特异性核酸内切酶切断DNA双链，引起DNA断裂自我修复机制，从而引发基因序列的突变和促进同源重组的发生。所述核酸内切酶可以是巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、MBBBD-核酸酶或TALEN-核酸酶。在优选的实施方式中，所述核酸内切酶是CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN-核酸酶。利用核酸酶进行基因敲除技术包括CRISPR/Cas9技术、ZFN技术、TALE技术和TALE-CRISPR/Cas9技术、Base Editor技术、引导编辑技术和/或归巢核酸内切酶技术。

术语“人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)”技术，是第一代核酸酶定点修饰技术，利用能够特异性识别三联体DNA片段的锌指基序(motif)而不是碱基作为识别特定DNA序列的基本单位。最经典的锌指核酸酶是将一个非特异性的核酸内切酶FokI与含有锌指的结构域进行融合，其目的自然是对特定序列进行切割。

术语“转录激活样效应因子(transcription activator-like effector,TALE)”，具有DNA结合特异性，具有能够特异性识别碱基的模块，操作简洁和方便。TALE-DNA结合结构域由串联重复单元组成，大部分单元含3 4个氨基酸，把单元的第12和13位氨基酸设计为可变区(repeat variable residues,RVD)。TALE的RVD识别DNA序列的4个碱基具有高度专一性，第13位氨基酸直接与DNA的碱基特异结合。能够根据DNA序列，在任意位点构建特异的TALEDN识别结合域，可以广泛用于基因序列突变修饰和基因打靶等。设定DNA靶序列，组装TALE-DNA结合域，融合Fok I内切酶的非特异性DNA切割域，组装成TALE核酸酶(tanscription activator-like effector nucleases，TALENs)。TALENs靶向结合DNA，产生DNA双链断裂(DNA double-srand breaks,DSBs)。

CRISPER/Cas9是第三代基因编辑技术。本申请一个实施例采用CRISPR/Cas9技术制备得到UCAR-T细胞。术语“CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)”是指规律成簇间隔短回文重复。术语“Cas9(CRISPRassociated nuclease)”是CRISPR相关核酸酶，是一种由RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。Cas9酶可以是野生型Cas9或人工改造Cas9。“CRISPER/Cas9系统”统称为转录物和涉及Cas9酶基因的表达或指导其活性的其他元件，包括编码Cas9基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔子(spacer)”，即gRNA)、或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。CRISPR系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为前间区)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补性不是必需的，条件是存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR复合物的形成。CRISPR复合物形成后在cas9酶的作用下可以对基因组特定位点进行切割，引入基因突变；也可以对基因的表达进行调控，如激活或抑制。一个靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。

一般而言，指导序列(gRNA)是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合的任何核糖核苷酸序列。本申请凡涉及gRNA的序列时，其可以为靶向的DNA序列，亦可以为所述DNA对应的核糖核苷酸与crRNA、TracrRNA形成的完整Cas9引导序列。gRNA用于引导、结合或者识别Cas酶。在一些实施例中，当使用适合的比对算法进行最佳比对时，在指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。可以使用用于比对序列的任何适合的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法、尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法、基于伯罗斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如伯罗斯-惠勒比对工具(Burrows Wheeler Aligner))、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司)、ELAND(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获得)、以及Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。术语“sgRNA”指短小的gRNA。

在一些实施例中，该CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除了该CRISPR酶之外的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到CRISPR酶上的蛋白质结构域的实例包括但不限于，表位标签、报告基因序列、以及具有下列活性的一个或多个蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。

在进行基因编辑时，給予的gRNA、tracr配对序列、及tracr序列可以单独给予，也可以一条完整的RNA序列给予。

Cas9蛋白与gRNA结合能够实现在特异位点处切割DNA，来源于Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas系统识别序列为23bp，并能靶向20bp,其识别位点最末3位NGG序列被称作PAM(protospacer adjacent motif)序列。

CRISPR/Cas转基因可以通过载体(例如AAV、腺病毒、慢病毒)、和/或粒子和/或纳米粒子、和/或电转来递送。

本申请同时敲除基因TRAC、B2M使得TCR和MHC分子功能失活，获得通用型T细胞或通用型CAR-T细胞。在一实施例中，分别对在B2M、TCR的α和β链中的一种或两种链的恒定区域的相应编码基因的外显子用CRISPER/Cas技术敲除。在一个实施例中，敲除内源性TCR使用的gRNA选自SEQ ID NO:23、65、66、67、68、69、70或71所示的序列。在一实施例中，采用CRISPR/Cas9技术敲除内源性B2M基因，使用的gRNA选自SEQ ID NO:24、72、73或74所示的序列。

在一个实施例中，敲除细胞TIGIT基因。示例性，采用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT基因，使用的gRNA选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36所示的序列。

“抑制”或“遏制”B2M或TCR或TIGIT的表达是指细胞中B2M或TCR或TIGIT的表达减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。可以通过本领域内已知的任何合适的方法，如ELISA、免疫组织化学、免疫印迹(Western Blotting)或流式细胞术使用B2M或TCR或TIGIT的特异性抗体测定细胞中蛋白的表达或含量。

术语“RNA干扰剂”被定义为通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因表达的任何制剂。此类RNA干扰剂包括但不限于与靶基因或其片段同源的RNA分子的核酸分子、短干扰RNA(siRNA)、shRNA或miRNA和通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因的表达的小分子。

本申请在一实施例中，先构建表达特异性CAR-T细胞，再利用CRISPER/Cas9技术敲除CAR-T细胞内源性TRAC、B2M和/或TIGIT构建对应的UCAR-T。在一个实施例中，先利用CRISPER/Cas9技术敲除内源性TRAC、B2M和/或TIGIT构建通用型T细胞，再表达特异性CAR构建UCAR-T细胞。在一个实施例中，CRISPER/Cas9技术敲除内源性TRAC,B2M和/或TIGIT和表达特异性CAR同时操作构建UCAR-T细胞。

术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。

术语“核酸分子编码”、“编码DNA序列”和“编码DNA”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或顺序。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。

当用于指核苷酸序列时，本文所用的术语“序列”可以包括DNA或RNA，并且可以是单链或双链。

本文使用的术语序列“同一性”通过在比较窗口(例如至少20个位置)上比较两个经最佳匹配的序列来确定同一性百分比，其中比较窗口中多核苷酸或多肽序列的部分可以包含添加或缺失(即间隙)，例如对于最佳匹配的两个序列而言与参考序列(其不包含添加或缺失)相比20％或更少的间隙(例如5至15％、或10至12％)。通常通过确定在两个序列中发生相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目来计算百分比，以产生正确匹配的位置的数目，将正确匹配位置的数目除以参考序列中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100，以产生序列同一性的百分比。

本文所用的术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达调控序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件(cis-acting elements)；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域所有已知的那些，如质粒、病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本文使用的术语“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。还可以包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。

术语“外源”指的是一个核酸分子或多肽、细胞、组织等没有在生物体自身内源性表达，或表达水平不足以实现过表达时具有的功能。

术语“内源”是指一个核酸分子或多肽等来自生物体自身。

术语“抗体”在本文中以最广义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和其可特异性结合抗原或抗原决定簇的抗体片段，只要其显示所需的抗原结合活性即可。本发明提供了表达包含识别TIGIT的抗体的第一蛋白的T细胞。在具体实施例中，本发明还提供了表达包含识别TIGIT和肿瘤抗原的串联抗体的第一蛋白的T细胞。在具体实施例中，本发明还提供了表达包含识别TIGIT和病原体抗原的串联抗体的第一蛋白的T细胞。

“抗体片段”是指可特异性结合抗原或抗原决定簇的抗体的片段，非限制性的抗体片段包括Fab、F(ab')2、Fv、CDR、ScFv。

术语“可变区或可变结构域”是指参与抗体抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中各结构域包含四个保守的FR和三个CDR。在具体实施例中，本申请提供了表达包含串联抗体的第一蛋白的T细胞，所述串联抗体识别TIGIT和肿瘤抗原、或TIGIT和病原体抗原，串联形式包括：

(iii)识别TIGIT的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体的抗体的重链(或重链可变区)—识别肿瘤和/或病原体的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链(或重链可变区)。

术语“高变区”或“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变结构域中序列高变和/或形成结构确定的环(“高变环”)和/或含有与抗原接触的残基(“抗原触点”)的各区域。通常，抗体包含六个CDR：VH中的三个(HCDR1，HCDR2，HCDR3)和VL中的三个(LCDR1，LCDR2，LCDR3)。示例性的，本申请识别TIGIT的抗体或其功能片段含有重链可变区，重链可变区包含3个CDR，SEQ ID NO:3所示的重链CDR1、SEQ ID NO:4所示的重链CDR2、SEQ ID NO:5所示的重链CDR3。本申请识别TIGIT的抗体或其功能片段含有轻链可变区，轻链可变区包含3个CDR，SEQ ID NO:6所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:7所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:8所示的轻链CDR3。本申请识别TIGIT的抗体或其功能片段含有SEQ ID NO:1所示的重链可变区和/或SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。示例性的，本申请识别CLDN18A2的抗体或其功能片段含有重链可变区，重链可变区包含3个CDR，SEQ ID NO:13所示的重链CDR1、SEQ ID NO:14所示的重链CDR2、SEQ ID NO:15所示的重链CDR3。本申请识别CLDN18A2的抗体或其功能片段含有轻链可变区，轻链可变区包含3个CDR，SEQ ID NO:16所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:17所示的轻链CDR2、SEQ ID NO:18所示的轻链CDR3。本申请识别CLDN18A2的抗体或其功能片段含有SEQ ID NO:11所示的重链可变区和/或SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。

术语“嵌合受体”，即用基因重组技术将不同来源的DNA片段或蛋白质相应的cDNA连接而成的融合分子，包括胞外域、跨膜区和胞内域。嵌合受体包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、T细胞抗原耦合器(TAC)。

术语“嵌合T细胞受体”，由一个TCR亚基与一个抗原结合结构域(如抗体结构域)结合组成，其中，TCR亚基包括至少部分TCR胞外结构域、跨膜区(或称为跨膜结构域)、TCR胞内信号结构域的刺激结构域；该TCR亚基和该抗体结构域有效连接。在具体实施例中，所述TCR亚基的胞外、跨膜、胞内信号结构域来源于CD3ε、CD3γ、CD3z、TCR的α链、或TCR的β链，并且，该嵌合T细胞受体能与T细胞上表达的TCR/CD3形成复合物。

术语“T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)”，包括三个功能结构域：(1)抗原结合结构域，包括单链抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein，DARPin)或其他靶向基团；(2)胞外域，与CD3结合的单链抗体，从而使得TAC受体与TCR受体靠近；(3)跨膜结构域和CD4共受体的胞内区，其中，胞内区连接蛋白激酶LCK，催化TCR复合物的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)磷酸化作为T细胞活化的初始步骤。

在一些实施方案中，本申请第一蛋白嵌合受体是嵌合抗原受体(CAR)。

本申请提供了一种能抵抗自体或同种异体NK细胞杀伤的T细胞。具体而言，本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR-T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR且内源性TIGIT敲除的T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR，且内源性TCR和B2M敲除的通用型T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR，且内源性TIGIT、TCR和B2M敲除的通用型T细胞。

本申请还提供了一种不仅能抵抗自体或同种异体NK细胞杀伤、还能显著杀伤肿瘤细胞的T细胞。具体而言，本申请提供了表达包含识别TIGIT和肿瘤抗原双靶点的CAR的T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT和病原体抗原双靶点的CAR，且敲除了内源性TIGIT的T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT和病原体抗原双靶点的CAR，且敲除了内源性TCR和B2M的通用型T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT和病原体抗原双靶点的CAR，且敲除了内源性TIGIT、TCR和B2M的通用型T细胞。

上述识别双靶点的CAR的抗原结合区中识别TIGIT和肿瘤抗原的抗体的连接方式包括：

(i)识别TIGIT的抗体的轻链/重链(或轻链可变区/重链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链/轻链(或重链可变区/轻链可变区)—识别肿瘤抗原的抗体的重链/轻链(或重链可变区/轻链可变区)—识别肿瘤抗原的抗体的轻链/重链(或轻链可变区/重链可变区)；

(ii)识别肿瘤抗原的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链(或重链可变区)—识别TIGIT的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别肿瘤抗原的抗体的重链(或重链可变区)；和/或

(iii)识别TIGIT的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别肿瘤抗原的抗体的重链(或重链可变区)—识别肿瘤抗原的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链(或重链可变区)。

本申请还提供了一种不仅能抵抗自体或同种异体NK细胞杀伤、还能显著杀伤肿瘤细胞的T细胞。具体而言，本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR和识别肿瘤抗原的CAR的T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR和识别肿瘤抗原的CAR，且敲除了内源性TIGIT的T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR和识别肿瘤抗原的CAR，且敲除了内源性TCR和B2M的通用型T细胞。本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR和识别肿瘤抗原的CAR，且敲除了内源性TIGIT、TCR和B2M的通用型T细胞。

本申请还提供了本申请所提供了的能抵抗自体或同种异体NK细胞杀伤的T细胞与表达识别肿瘤抗原的第二蛋白(如CAR)的T细胞的联用。本申请所提供的能抵抗自体或同种异体NK细胞杀伤的T细胞能促进表达识别肿瘤抗原的第二蛋白(如CAR)的T细胞在有自体或同种异体免疫细胞存在时的存活。在具体实施例中，所述表达识别肿瘤抗原的第二蛋白(如CAR)的T细胞的内源性TIGIT被敲除。在具体实施例中，所述表达识别肿瘤抗原的第二蛋白(如CAR)的T细胞为内源性TCR和B2M被敲除的通用型T细胞。在具体实施例中，所述表达识别肿瘤抗原的第二蛋白(如CAR)的T细胞为内源性TIGIT、TCR和B2M敲除的通用型T细胞。

术语“嵌合抗原受体”(CAR)包括胞外域、跨膜区和胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域包括刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域(分别称为胞内信号传导结构域和共刺激信号结构域)，在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的δ链；在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种共刺激性分子的功能性信号传导结构域，例如4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。在某些实施例中，多肽组彼此连接。示例性，靶向TIGIT的CAR包含SEQ ID NO：9所示的序列，靶向CLDN18A2的CAR包含SEQ ID NO：21、75、76或77所示的序列。同时靶向TIGIT和CLDN18A2的CAR包含SEQ ID NO：48、50或52所示的抗原结合域；或者包含SEQ ID NO：54、56或58所示的CAR。在具体实施例中，同时靶向TIGIT和CLDN18A2的工程化T细胞包含SEQ ID NO：54、56或58所示的氨基酸序列；或包含SEQ ID NO：53、55或57所示的核苷酸序列。

术语“初级信号域”以刺激性方式调节TCR复合物的初始活化。一方面，初级信号域由例如TCR/CD3复合物与加载了肽的MHC分子的结合而引发，由此介导T细胞反应(包括但不限于，增殖、活化、分化等)。以刺激性方式起作用的初级信号域可以包含免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。在本申请中尤其有用的包含ITAM的初级信号域的例子包括但不限于，源自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d的序列，在特例的本申请CAR中，在任何一个或多个本申请CAR中胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如CD3ξ的初级信号域。

术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分、或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。

术语“共刺激分子”指与细胞刺激信号分子，例如TCR/CD3结合，组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。为T细胞上的关连结合性配偶体，其特异性结合共刺激配体，由此介导T细胞的共刺激反应，包括但不限于细胞增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的、非抗原受体的细胞表面分子或其配体。共刺激分子包括但不限于，MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。

细胞内信号传导结构域(或称为结构区)可以选自表1的任何一个共刺激结构域。在一些实施例中，可以修饰结构域，使得与参考结构域的同一性可以为约50％至约100％。可以修饰表1的任何一个结构域，使得修饰形式可以包含约50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或至多约100％的同一性。表1.共刺激结构域

在某些情况下，胞内信号传导结构域可被设计成包含若干可能的共刺激信号结构域，可以包含单个共刺激结构域，例如δ链(第一代CAR)，或其可以进一步包含一个共刺激结构域，例如δ链与CD28或4-1BB(第二代CAR)，或其可以进一步包含两个共刺激结构域，例如δ链与CD28/OX40或CD28/4-1BB(第三代CAR)。这些共刺激分子使用的信号传导途径均能与主T细胞受体激活信号协同作用。这些共刺激信号传导区提供的信号可以与源自一个或多个ITAM基序(例如CD3zeta信号转导域)的主效应激活信号协同作用，并且可以完成T细胞激活的要求。示例性，靶向TIGIT、靶向CLDN18A2和/或双靶向TIGIT和CLDN18A2的CAR的信号传导结构域包括CD3δ。在具体实施例中，CD3δ为人CD3δ分子，包含SEQ ID NO:46所示序列。示例性，靶向TIGIT、靶向CLDN18A2和/或双靶向TIGIT和CLDN18A2的CAR的信号传导结构域包括CD28胞内域。在具体实施例中，CD28胞内域包含SEQ ID NO:44所示序列。

术语“CD3ξ(也称为CD3Zeta)”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质、或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。“CD3ξ结构域”定义为来自ξ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。一方面，ξ的胞质结构域包含GenBan登录号BAG36664.1的残基52至164、其功能性直向同源物—来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。CD3ξ也称为T细胞受体T3δ链或CD247。该结构域是T细胞受体-CD3复合物的一部分，并且在将几种细胞内信号转导途径的抗原识别与T细胞的主效应激活相结合方面起重要作用。如本文所用，CD3δ主要是指人类CD3δ及其同种型，如从Swissprot条目P20963所知的，包括具有基本相同序列的蛋白质。作为嵌合抗原受体的一部分，不需要全T细胞受体T3δ链，并且其包含T细胞受体T3δ链的信号结构域的任何衍生物都是合适的，包括其任何功能等同物。在本申请中“CD3δ”与“CD3z”及“CD3Z”可互换使用。

在本申请中，一方面，CAR包含胞外域、跨膜区、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自刺激分子的功能信号传导结构域。一方面，CAR包含胞外域、跨膜区、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含胞外域、跨膜区和胞内传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR在CAR蛋白的氨基酸包含可选的前导序列。一方面，CAR在胞外域的N端还包含前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞加工和定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切下。在一实施例中，前导序列包含SEQ ID NO:38所示序列。

本申请提供了嵌合抗原受体，其包含本文所述的胞外域、跨膜区和胞内域。常见地， CAR的胞外域来源于小鼠或人源化或人的单克隆抗体。

嵌合抗原受体可以设计多种抗原结合区,包括衍生自抗体的单链可变片段(scFv)、选自文库的片段抗原结合区(Fab)、单结构域片段或与接合其同源受体的自然配体。在一些实施例中，胞外域可以包含scFv、Fab或天然配体，以及它们的任何衍生物。胞外域可以指除完整抗体之外的分子，其可以包含完整抗体的一部分并且可以与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例可以包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体、线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。胞外域，例如scFv、Fab或天然配体，可以是确定抗原特异性的CAR的一部分。胞外域可以结合任何互补靶。胞外域可以衍生自已知可变区序列的抗体。胞外域可以从获自可获得的小鼠杂交瘤的抗体序列中得到。或者，可以从肿瘤细胞或原代细胞例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的全外切割测序获得胞外域。

在一些实施例中，CAR的胞外域的结合特异性可以通过互补决定区或CDR，如轻链CDR或重链CDR来确定。在许多情况下，结合特异性可以通过轻链CDR和重链CDR来确定。本申请提供了表达包含识别TIGIT的CAR-T细胞。在具体实施例中，本申请还提供了表达包含识别TIGIT和肿瘤抗原双靶点的CAR-T细胞。在具体实施例中，本申请还提供了表达包含识别TIGIT和病原体抗原双靶点的CAR-T细胞。

在一些实施例中，CAR的胞外域包括抗原结合区和连接片段(也称为铰链、间隔区或连接体)。连接片段可被认为是用于向胞外域提供柔性的CAR的一部分。在一些情况下，连接片段不同可导致细胞表面上的CAR能不能被靶抗原激活、或者被激活的程度很低、或者激活后T细胞会发生显著衰竭而功能丧失，可能原因是胞外域的抗体或抗体片段所形成的空间结构与靶抗原空间结构的互补性程度不同。例如，衍生自免疫球蛋白的连接片段的长度是否需要优化，取决于胞外域靶向靶抗原表位的位置。

CAR多肽的连接片段的组成和长度都是可调的。T细胞和靶细胞之间的免疫突触结合的空间构象限定了靶分子上的膜远端表位不能与CAR进行功能桥接的距离，即使用短连接片段的CAR也不能使突触距离达到信号能够传导的近似值。同样，膜近端CAR靶抗原表位仅在长连接片段CAR的背景下观察到信号输出。可以根据所使用的胞外域来调节连接片段。连接片段可以是任何长度的。示例性，在本申请的一个实施例中，CAR包括一个铰链域，是CD8α铰链，优选地，CD8α铰链域包括SEQ ID NO:40的氨基酸。

CAR的跨膜(TM)结构域(或称为结构区)可以将CAR锚定在细胞的质膜上。CD28的天然跨膜部分可用于CAR。在其他情况下，也可以在CAR中使用CD8α的天然跨膜部分。“CD8”可以是与NCBI参考号：NP_001759或其具有刺激活性的片段具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的蛋白质。“CD8核酸分子”可以是编码CD8多肽的多核苷酸，在某些情况下，跨膜结构域可以是CD28的天然跨膜部分，“CD28”可以指与NCBI参考号：NP_006130或其具有刺激活性的片段具有至少85、90、95、96、97、98、99或100 ％同一性的蛋白质。“CD28核酸分子”可以是编码CD28多肽的多核苷酸。在一些实施例中，跨膜部分可以包含CD8α区。示例性，在本申请的一个实施例中，TM是CD28跨膜区。在优选实施例中，为人CD28跨膜区。优选地，CD28跨膜区包含SEQ ID NO:42的氨基酸。

关于药物组合物，药学上可接受的载体可以是常规使用的载体之一，并且仅受化学物理考虑的限制，例如溶解度和不与活性剂反应，以及给药途径。本文描述的医药上可接受载体，例如佐剂、辅料和稀释剂，是本领域技术人员熟知的，并且易于公众使用。优选的，药物上可接受的载体是在使用条件下无害、无毒副作用的载体。本申请的药物组合物有多种合适的剂型。制备可给药(例如，肠外给药)组合物的方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的。

本申请的工程化细胞可以任何适当的方式给予受试者。优选地，通过注射(例如，皮下、静脉内、肿瘤内、动脉内、肌肉内、皮内、腹膜间或鞘内)施用本申请的CAR材料。优选地，本申请的CAR材料经静脉投与。用于本申请注射用CAR材料的合适的医药上可接受的载体可包括任何等渗载体，例如，生理盐水(水中约0.90％w/v NaCl，水中约300mOsm/L NaCl，或每升水约9.0g NaCl)，常温或电解质溶液。在一个实施例中，医药上可接受的载体补充有人血清蛋白。

“有效量”或“治疗有效量”是指足以预防或治疗个体疾病(癌症)的剂量。治疗性或预防性使用的有效剂量取决于所治疗疾病的阶段和严重程度、受试者的年龄、体重和一般健康状况以及处方医生的判断。剂量的大小还取决于所选择的活性物质、给药方法、给药时间和频率、可能伴随特定活性物给药的不良副作用的存在、性质和程度以及所需的生理效应。根据处方医生或本领域技术人员判断可能需要一轮或多轮、或多次给与本申请CAR材料。作为示例且不是限制本申请，当本申请的CAR材料是宿主细胞时，宿主细胞的示范剂量可为至少一百万个细胞(1×10 ⁶个细胞/剂量)。

本申请的实施例还包括在施用本申请的CAR材料之前去除哺乳动物的淋巴细胞，包括但不限于非清髓性淋巴耗竭化疗、清髓性淋巴耗竭化疗、全身照射等。

术语“治疗”是指在试图改变疾病过程的干预措施，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。在具体实施例中，本申请提供的工程化T细胞能抑制肿瘤细胞增殖、和/或体内抑制肿瘤细胞增殖、肿瘤体积增加。

术语“预防”是指在试图在疾病(如细胞移植产生的排斥反应)产生前进行的干预措施。

本申请提供了用于治疗或预防肿瘤的本申请的细胞、核酸、表达载体、宿主细胞、或组合物。

本申请的所提供的工程化T细胞可用于治疗、预防或改善自身免疫性疾病或炎性疾病，特别是自身免疫疾病相关的的炎症疾病，诸如关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronicaprogrediente)和变形性关节炎)和风湿性疾病，包括牵涉骨损失、炎症性疼痛的炎性病况和风湿性疾病、脊椎关节病变(包括强直性脊柱炎)、赖特尔综合征、反应性关节炎、银屑病关节炎、幼年型特发性关节炎和肠病性关节炎、起止点炎、超敏反应(包括气道超敏反应和皮肤超敏反应)和过敏。本申请所提供的工程化T细胞用于治疗及预防包括自身免疫性血液学障碍(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肌肉疾病(皮肌炎)、牙周炎、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、史蒂芬约翰逊综合征、自发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合症)、内分泌性眼病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化、系统性硬化病、纤维变性疾病、原发性胆汁性肝硬化、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎、干燥性角结膜炎和春季角结膜炎、间质性肺纤维化、假体周围骨溶解、肾小球肾炎(有和无肾病综合症，例如包括特发性肾病综合征或微小病变性肾病)、多发性骨髓瘤、其他类型的肿瘤、皮肤和角膜的炎性疾病、肌炎、骨植入物的松动、代谢紊乱(诸如肥胖、动脉粥样硬化和其它心血管疾病，包括扩张型心肌病、心肌炎、II型糖尿病和血脂异常)和自身免疫性甲状腺疾病(包括桥本甲状腺炎)、中小血管原发性血管炎、大血管血管炎包括巨细胞性动脉炎、化脓性汗腺炎、视神经脊髓炎、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、特应性和接触性皮炎、细支气管炎、炎性肌肉疾病、自身免疫性外周神经病、免疫性肾脏、肝脏和甲状腺疾病、炎症和动脉粥样硬化、自身炎症发热综合征、免疫血液学紊乱以及皮肤和粘膜的大疱性疾病。

本申请所提供的工程化T细胞可用于治疗、预防或改善哮喘、支气管炎、细支气管炎、特发性间质性肺炎、尘肺、肺气肿以及气道的其它阻塞性或炎性疾病。

可将本申请的工程化T细胞作为唯一的活性成分或与其它药物例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂或其它细胞毒性剂或抗癌剂结合(例如作为其佐剂或与其组合)施用，例如以治疗或预防免疫紊乱相关疾病。例如，可将本申请的抗体与如下药物组合使用：DMARD，例如金盐、柳氮磺吡啶、抗疟药、甲氨蝶呤、D-青霉胺、硫唑嘌呤、麦考酚酸、他克莫司、西罗莫司、二甲胺四环素、来氟米特、糖皮质激素；钙调神经磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A或FK 506；淋巴细胞再循环的调节剂，例如FTY720和FTY720类似物；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，40-O-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制性质的子囊霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；来氟米特；咪唑立宾；吗替麦考酚酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物；免疫抑制单克隆抗体，例如，针对白细胞受体，例如，MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40。CD45、CD58、CD80、CD86或其配体的单克隆抗体；其它免疫调节化合物。

本申请所述肿瘤可以是任何肿瘤，包括急性淋巴细胞癌、急性髓系白血病、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌(例如髓母细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛肠癌、眼癌，肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌、头颈部癌(如头颈部鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴细胞白血病、B-前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、前B细胞前体急性淋巴细胞白血病(BCP-ALL)、B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)，伯基特淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌。优选地，所述肿瘤以BCMA表达为特征，并且更优选地是以BCMA表达为特征的多发性骨髓瘤。

“肿瘤抗原”指的是过度增生性疾病发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原。在某些方面，本申请的过度增生性病症是指癌症。

本申请所述的肿瘤抗原可以是实体瘤抗原，也可以是血液瘤抗原。

本申请的肿瘤抗原包括但不限于：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD 138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体，血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，CLDN18A2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa light chain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoHglycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G 蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。优选的，所述肿瘤抗原为CLDN18A2、GPC3、BCMA或者CD19。

病原体抗原选自：病毒、细菌、真菌、原生动物，或寄生虫的抗原；病毒抗原选自：巨细胞病毒抗原、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、人类免疫缺陷病毒抗原,或流感病毒抗原。

本文提供了一种自体或同种异体细胞，例如T细胞，被基因工程化表达TIGIT-CAR用于抵抗NK细胞杀伤，从而提供了增加自体或同种异体的第一免疫细胞在有宿主的第二免疫细胞存在时的持久性和/或移植成活率的方法。为明确，所述“宿主”为“第一免疫细胞”的接受者，例如受试者、患者等；所述“第一免疫细胞”在经过工程化改造并移植入宿主之后，宿主体内除“第一免疫细胞”以外的其他免疫细胞中的任一种均称为“第二免疫细胞”。所述“第一免疫细胞”与所述“第二免疫细胞”可以为来自同一个体的细胞，也可以为同种异体细胞。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化以表达TIGIT-CAR。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达TIGIT-CAR,且利用基因编辑技术敲除内源性TIGIT。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达TIGIT-CAR,且利用基因编辑技术敲除内源性B2M和TCR。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达TIGIT-CAR,且利用基因编辑技术敲除内源性TIGIT、B2M和TCR。

在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达TIGIT-CAR，所述细胞也被基因工程化表达至少一个非靶向TIGIT的嵌合受体(CAR、修饰的TCR、TFP、TAC、aTCR或其组合)。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达TIGIT-CAR,所述细胞也被基因工程化表达至少一个非靶向TIGIT的嵌合受体(CAR、修饰的TCR、TFP、TAC、 aTCR或其组合)，且利用基因编辑技术敲除内源性TIGIT。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达TIGIT-CAR,所述细胞也被基因工程化表达至少一个非靶向TIGIT的嵌合受体(CAR、修饰的TCR、TFP、TAC、aTCR或其组合)，且利用基因编辑技术敲除内源性B2M和TCR。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达TIGIT-CAR,所述细胞也被基因工程化表达至少一个非靶向TIGIT的嵌合受体(CAR、修饰的TCR、TFP、TAC、aTCR或其组合)，且利用基因编辑技术敲除内源性TIGIT、B2M和TCR。

在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达识别TIGIT和肿瘤抗原的双靶点的CAR。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达识别TIGIT和肿瘤抗原的双靶点的CAR，且利用基因编辑技术敲除内源性IGIT。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达识别TIGIT和肿瘤抗原的双靶点的CAR，且利用基因编辑技术敲除内源性B2M和TCR。在一些实施方案中，第一免疫细胞被基因工程化表达识别TIGIT和肿瘤抗原的双靶点的CAR，且利用基因编辑技术敲除内源性TIGIT、B2M和TCR。

本申请包括，例如中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、CN104140974A、CN 108884459A、CN107893052A、CN108866003A、CN108853144A、CN109385403A、CN109385400A、CN109468279A、CN109503715A、CN 109908176A、CN109880803A、CN 110055275A、CN110123837A、CN 110438082A、CN 110468105A国际专利申请公开号WO2017186121A1、WO2018006882A1、WO2015172339A8、WO2018/018958A1、WO2014180306A1、WO2015197016A1、WO2016008405A1、WO2016086813A1、WO2016150400A1、WO2017032293A1、WO2017080377A1、WO2017186121A1、WO2018045811A1、WO2018108106A1、WO 2018/219299、WO2018/210279、WO2019/024933、WO2019/114751、WO2019/114762、WO2019/141270、WO2019/149279、WO2019/170147A1、WO 2019/210863、WO2019/219029中公开的那些CAR-T细胞及其制备方法。

构建CAR-T细胞时，在TRAC和B2M基因双敲除T细胞上同时表达靶向NK细胞表面抑制性受体TIGIT的嵌合抗原受体。这种策略可以避免宿主NK细胞对TRAC和B2M基因双敲除的T细胞的攻击，延长通用型T细胞在宿主体内的存活时间。

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实施例1、细胞因子活化导致TIGIT+NK细胞比例上升

利用Ficoll-Paque(GE bioscience)进行密度梯度离心，从供体外周血中分离出PBMC，用NK细胞分离试剂盒(购自美天旎)分离出NK细胞。利用流式细胞仪采用APC-TIGIT(Invitrogen)抗体检测到36％NK细胞表面表达TIGIT(见图1A)。

表2

在体外按表2将IL-2(250U/ml)、IL-15(150U/ml)、IL-12(10ng/ml)分别或联合加入上述分离的NK细胞培养基中孵育24小时后，采用APC-TIGIT(Invitrogen)抗体检测TIGIT+NK细胞的百分比。

流式细胞术检测结果如图1显示，单个细胞因子IL-12、IL-15作用下TIGIT+NK细胞比例分别为35.5％(见图1B)、37.5％(见图1C)；单个细胞因子IL-2或两两组合或三种细胞因子组合都能显著提高TIGIT+NK细胞的比例，其对应的TIGIT+NK细胞比例如图1D-1H所示，分别为69.7％(IL-2)、68.9％(IL-15+IL-12)、67.1％(IL-2+IL-12)、74.5％(IL-2+IL-15)和67.5％(IL-2+IL-15+IL-12)。

利用Ficoll-Paque(GE bioscience)进行密度梯度离心，从5个供体外周血中分离出PBMC，用NK细胞分离试剂盒(购自美天旎)分离出NK细胞。将IL-2(500U/ml)和IL-15(150U/ml)联合加入NK细胞培养基中培养，培养10天后利用流式细胞仪采用APC-TIGIT(Invitrogen)抗体检测TIGIT+NK细胞的百分比。

流式细胞术检测结果如图2显示，经细胞因子活化后的5例供体的NK细胞中TIGIT+NK细胞的百分比分别为86.1％、76.2％、74.1％、38.3％和55％。5例中有3例TIGIT+NK细胞的比例超过70％。

上述结果提示：TIGIT蛋白在静息NK细胞和活化NK细胞上表达。

实施例2.CAR-T细胞的制备

1.TIGIT-CAR-T细胞制备

构建了包含靶向TIGIT的CAR的工程化T细胞，观察其对NK细胞的抵抗能力。

采用本领域常规分子生物学方法构建表达载体(图3)。设计并构建包含CD8α信号肽 (SEQ ID NO：38)，抗TIGIT的单链抗体(VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，CD8α铰链区(氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示)，CD28跨膜区(氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示)，T细胞激活因子CD3δ(氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示)的嵌合抗原受体的载体TIGIT-CAR，并将其包装形成的慢病毒命名为PRRL-TIGIT。

利用Ficoll-Paque(GE bioscience)进行密度梯度离心，从人外周血中分离出单个核细胞(PBMC)，加入抗CD3/CD28的磁珠体外进行活化得到T细胞。将上述慢病毒PRRL-TIGIT感染T细胞并培养扩增至需要的数量，得到TIGIT CAR-T细胞。

2.靶向TIGIT的TRAC和B2M双阴性的CAR-T细胞的制备

(1)基因敲除细胞的制备

体外扩增TIGIT CAR-T细胞48小时后，调整细胞密度至2*10^7/mL。对TIGIT CAR-T细胞进行TRAC和B2M双基因敲除。按照试剂说明书(GeneArt ^TM Precision gRNA Synthesis Kit，Thermo Tisher)体外合成靶向TRAC和B2M的sgRNA序列。Cas 9酶(购自NEB)和sgRNA按1：4比例进行室温孵育10分钟，得到RNP复合物，其中，TRAC-gRNA(用于靶向敲除TRAC的gRNA)的核酸序列如SEQ ID NO：23所示，B2M-gRNA(用于靶向敲除B2M的gRNA)的核酸序列如SEQ ID NO：24所示。将1*10^6个TIGIT CAR-T细胞与RNP复合物进行混合(Cas 9酶的终浓度为2μM)，利用maxcyte电转仪将包含TRAC-gRNA和B2M-gRNA的RNP复合物导入到TIGIT CAR-T细胞中。电转后第4天，利用流式细胞术检测基因的敲除情况。

按照上述方法，对UTD细胞(未转染病毒的T细胞)分别进行TRAC单基因敲除、TRAC和B2M双基因敲除。

(2)TRAC阴性细胞或TRAC/B2M双阴性细胞的筛选和鉴定

体外扩增单敲除TRAC的UTD细胞、双敲除B2M和TRAC的TIGIT CAR-T细胞、双敲除B2M和TRAC的UTD细胞，于电转后第4天调整细胞密度至1*10^7/mL，用抗PE-HLA-ABC抗体(Invitrogen)和PE-B2M抗体(Invitrogen)对细胞进行标记，标记后的细胞用抗PE的磁珠经分选柱分选后，收集TRAC阴性的细胞、TRAC和B2M双阴性的细胞(分选试剂盒购自美天旎)，即得到99％以上的TRAC缺失的TRAC-/-UTD细胞、TRAC和B2M双缺失的TIGIT CAR-T细胞(TIGIT-UCAR-T细胞)、TRAC和B2M双缺失的UTD细胞(U-UTD细胞)。

采用Biotin标记的羊抗人Fab抗体(Jackson)标记CAR-T细胞，再用PE-Streptavidin二抗进行标记，采用流式细胞术检测TIGIT-UCAR-T细胞的CAR表达情况，实验结果如图4所示，阳性率可达到80％以上。

抗TIGIT的scFv是全人抗的，可以被通用的抗人Fab抗体所标记。为了分选 TIGIT-UCAR-T细胞，我们采用了Biotin标记的羊抗人Fab抗体(Jackson)标记CAR阳性T细胞。再用PE-Streptavidin二抗进行标记，标记后的细胞用抗PE的磁珠经分选柱分选后，收集TIGIT-UCAR-T细胞。筛选后的TIGIT-UCAR-T细胞阳性比例达到95％以上。

实施例3.体外TIGIT-UCAR-T细胞对NK细胞的抵抗作用检测

利用Ficoll-Paque(GE bioscience)进行密度梯度离心，从供体的外周血中分离出PBMC，用NK细胞分离试剂盒(购自美天旎)分离PBMC细胞中NK细胞，调整细胞密度为1*10^6/ml或2*10^6/ml。选取实施例2构建的U-UTD细胞、TRAC-/-UTD细胞分别作为阴性和阳性对照，调整细胞浓度至1*10^6/ml。按NK细胞与T细胞数量比例1：1或2：1接种于24孔板内，于培养箱中分别共孵育0hr,24hr和48hr。NK细胞+TRAC-/-UTD组利用APC-CD56(Invitrogen)抗体标记NK细胞，其他混合培养组采用APC-HLA-ABC抗体(Invitrogen)标记NK细胞，分别检测共孵育不同时间点T细胞和NK细胞所占比例和数目的变化。

实验结果如图5所示，与NK细胞共培养时，U-UTD细胞比例随时间延长逐渐降低，TIGIT-UCAR-T细胞的比例逐渐上升。在NK:T比例为2:1和1:1时，相较于U-UTD细胞，TIGIT-UCAR-T细胞均具有更高的存活比例和存活数目。

上述结果表明，靶向TIGIT的CAR-T细胞能够有效抵抗NK细胞的杀伤。

实施例4 靶向TIGIT及肿瘤抗原的双靶点UCAR-T细胞制备

为了观察靶向TIGIT的CAR-T细胞能否增强其在NK细胞存在条件下的抗肿瘤活性，我们以靶向肿瘤抗原CLDN18A2为例，构建了同时靶向TIGIT和CLDN18A2的CAR-T细胞，观察其对抗肿瘤活性的影响(靶向肿瘤抗原，例如CLDN18A2)以及对NK细胞清除的影响(靶向非肿瘤抗原,例如TIGIT)。

根据双靶向抗原的抗体串联方式以及铰链域连接方式的不同(见表3)，我们构建了三种不同形式的TIGIT及CLDN18A2双靶点的CAR载体。

表3

示例性，CLDN18A2的单链抗体(VH序列如SEQ ID NO：11所示，VL序列如SEQ ID NO： 12所示，HCDR1序列如SEQ ID NO：13所示，HCDR2序列如SEQ ID NO：14所示，HCDR3序列如SEQ ID NO：15所示，LCDR1序列如SEQ ID NO：16所示，LCDR2序列如SEQ ID NO：17所示，LCDR3序列如SEQ ID NO：18所示)，TIGIT的单链抗体(VH序列如SEQ ID NO：1所示，VL序列如SEQ ID NO：2所示，HCDR1序列如SEQ ID NO：3所示，HCDR2序列如SEQ ID NO：4所示，HCDR3序列如SEQ ID NO：5所示，LCDR1序列如SEQ ID NO：6所示，LCDR2序列如SEQ ID NO：7所示，LCDR3序列如SEQ ID NO：8所示)，G4S(SEQ ID NO：60),(G4S)3(SEQ ID NO：62),linker1(SEQ ID NO：64)。

采用本领域常规分子生物学方法，将串联片段1(SEQ ID NO：48)、串联片段2(SEQ ID NO：50)、串联片段3(SEQ ID NO：52)(见表3)分别与CD8α信号肽(SEQ ID NO：38)、CD8铰链区(SEQ ID NO：40)、CD28跨膜区(SEQ ID NO：42)和胞内域(SEQ ID NO：44)、以及T细胞激活因子CD3δ(SEQ ID NO：46)构建成的CAR1片段(SEQ ID NO：54)、CAR2片段(SEQ ID NO：56)、CAR3片段(SEQ ID NO：58)，然后分别插入载体PRRLsin，构建了载体PRRLsin-CAR1、PRRLsin-CAR2、PRRLsin-CAR3(图6)，并分别包装形成慢病毒PRRL-CAR1、PRRL-CAR2、PRRL-CAR3。

构建表达CLDN18A2的嵌合抗原受体的慢病毒质粒PRRLsin-CLDN18A2-CAR(图6)，包含CLDN18A2的单链抗体(SEQ ID NO：11、12)，CD8α信号肽(SEQ ID NO：38)，CD8铰链区(SEQ ID NO：40),CD28跨膜区(SEQ ID NO：42)和胞内域(SEQ ID NO：44)，T细胞激活因子CD3δ(SEQ ID NO：46)；包装形成慢病毒PRRL-CLDN18A2-CAR。

参照实施例2所述方法制备靶向CLDN18A2的CLDN18A2-CAR-T；双靶向TIGIT和CLDN18A2的CAR-T1(表达CAR1)、CAR-T2(表达CAR2)、CAR-T3(表达CAR3)细胞。参照实施例2所述方法制备TRAC和B2M双敲除的细胞：作为阴性对照的U-UTD(仅敲除TRAC和B2M的T细胞)，仅靶向CLDN18A2的CLDN18A2-UCAR-T，双靶向TIGIT和CLDN18A2的UCAR-T1(表达CAR1)、UCAR-T2(表达CAR2)、UCAR-T3(表达CAR3)细胞。

取1×10 ⁶上述各UCAR-T细胞，加PE标记的抗抗CLDN18A2scFv的抗体进行染色。采用流式细胞术检测各UCAR-T细胞阳性率(图7)。CLDN18A2-CAR、CAR1、CAR2、CAR3在T细胞上的平均荧光强度分别为21520、13355、15973和5338。

实施例5靶向TIGIT和肿瘤抗原的双靶点UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤检测

利用常规分子生物学技术分别通过慢病毒将人CLDN18A2(SEQ ID NO:19、20)分别转染内源性CLDN18A2不表达的胰腺癌细胞BXPC-3(美国ATCC)、胃癌细胞HGC-27(中科院细胞库)，通过有限稀释法挑选阳性单克隆，构建表达CLDN18A2的BXPC-3-A2、HGC-27-A2稳转细胞系。

在96孔板中分别接种75μL 2×10 ⁵/mL BXPC-3-A2、HGC-27-A2细胞(靶细胞)；按效靶比3:1、1:1或1:3分别加效应细胞U-UTD、CLDN18A2-CAR-T、CLDN18A2-UCAR-T，UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3细胞，并设置效应细胞自发LDH对照孔、靶细胞自发LDH对照孔、靶细胞最大LDH对照孔、体积校正对照孔以及培养基背景对照，各4个复孔；18h后采用Cytotoxicity Detection Kit(LDH，Roche)检测LDH释放，并计算各组细胞对靶细胞的杀伤(图8)。

结果显示，三种不同形式的TIGIT&CLDN18A2双靶点UCAR-T细胞(UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3)对靶细胞的杀伤相比CLDN18A2-UCAR-T无显著性差异，双靶点CAR-T细胞并不会降低对靶细胞的杀伤。

实施例6靶向TIGIT和肿瘤抗原的双靶点UCAR-T细胞对PBMC细胞的抵抗作用

靶向TIGIT及肿瘤抗原的双靶点UCAR-T细胞与异体PBMC细胞共培养，观察其是否可以抵抗PBMC细胞中的NK细胞的杀伤。

按实施例4制备TIGIT及CLDN18A2双靶点UCAR-T细胞，并检测CAR-T细胞阳性率和TIGIT表达情况(图9)。部分U-UTD、CLDN18A2-UCAR-T细胞表面表达TIGIT蛋白，UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3细胞检测不到TIGIT蛋白。取1×10 ⁶U-UTD、CLDN18A2-UCAR-T，UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3细胞分别与5×10 ⁶PBMC细胞共培养，采用PE-anti-HLA-ABC抗体(标记U-UTD和UCAR-T细胞)和APC-anti CD56抗体(标记PBMC细胞中的NK细胞)检测共培养0h、24h和48h时U-UTD、CLDN18A2-UCAR-T，UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3细胞的比例以及NK细胞的比例(图10)。

结果显示，三种形式的TIGIT及CLDN18A2双靶点UCAR-T细胞与PBMC细胞共培养48h后所占的比例要高于U-UTD、CLDN18A2-UCAR-T所占的比例；而共培养后UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3组中NK细胞所占的比例则要低于U-UTD、CLDN18A2-UCAR-T组。结果表明TIGIT及CLDN18A2双靶点UCAR-T细胞可以有效抵抗PBMC细胞中的NK细胞杀伤，且UCAR-T2对NK细胞的抵抗效果最好。

实施例7靶向TIGIT和肿瘤抗原的双靶点UCAR-T细胞对移植瘤的治疗效果

靶向TIGIT及肿瘤抗原的双靶点UCAR-T可以抵抗异体NK细胞从而保持较高的存活率。进一步我们检测了双靶点UCAR-T细胞在体内的抗肿瘤效果。

在免疫缺陷小鼠NPG上皮下接种HGC-27-A2移植瘤(记为D0)，每只小鼠接种5×10 ⁶HGC-27-A2细胞，第15天测量瘤体积大小并进行分组，移植瘤体积约为90mm3，分5组(U-UTD、CLDN18A2-UCAR-T，UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3)，每组5只；尾静脉分别注射1×10 ⁶U-UTD、CLDN18A2-UCAR-T、UCAR-T1、UCAR-T2、UCAR-T3细胞。注射后，每周2次测量体重(包括分组给药及安乐死当天)，并用游标卡尺测量记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，比较各组间肿瘤生长曲线的差异(肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径 ²)。(图11A)。

结果显示，UCAR-T2和UCAR-T1治疗组对移植瘤的治疗效果相较于U-UTD均具有显著性差异。

UCAR-T细胞治疗后14天，取小鼠外周血并检测小鼠外周血中人CD4+、CD8+T细胞的密度。

结果如图11B所示，CLDN18A2-UCAR-T细胞治疗组人CD4+、CD8+T细胞密度高于TIGIT&CLDN18A2双靶点UCAR-T细胞治疗组。这种结果可能是由于部分UCAR-T细胞自身也表达TIGIT蛋白，导致双靶点UCAR-T细胞对自身的杀伤，从而在一定程度上降低了人CD4+、CD8+T细胞的数量，所以抗肿瘤效果有所下降

实施例8 TIGIT gRNA筛选

由于部分T细胞也表达TIGIT，为了避免CAR-T细胞对自身CAR-T细胞的杀伤，在TRAC/B2M双敲除的基础上进一步敲除了CAR-T细胞的TIGIT基因。针对TIGIT基因，我们设计了12对靶向TIGIT基因的gRNA1-12(SEQ ID NO：25-36)。并按照试剂说明书(GeneArt ^TM Precision gRNA Synthesis Kit，Thermo Tisher)体外合成靶向TIGIT的sgRNA序列。

采用CD3-CD28抗体包被磁珠活化T细胞，对活化第5天的T细胞采用Maxcyte电转仪进行电转。电转体系为0.5μMCas9+2μM TIGIT sgRNA。电转后第4天，采用APC-TIGIT抗体检测各gRNA敲除效率。具体实验操作参照实施例2所述。

结果如图12所示：gRNA6和gRNA10的敲除效率最高，敲除效率分别为76％和72％。而gRNA11、5、7、8也能实现对TIGIT的敲除。

为了避免TIGIT&CLDN18A2双靶点UCAR-T对自身细胞的杀伤，需要在TRAC/B2M敲除的基础上再敲除UCAR-T细胞的TIGIT基因。第0天采用CD3-CD8抗体包被磁珠活化T细胞，48小时后分别感染慢病毒PRRL-CLDN18A2-CAR、PRRL-CAR1、PRRL-CAR2、PRRL-CAR3。24小时后离心换液。继续培养至第6天，采用Maxcyte电转仪双敲除TRAC&B2M或三敲除TRAC&B2M&TIGIT基因，电转体系分别为1μM cas9(凯佧生物)+2μM TRAC sgRNA+2μM B2M sgRNA、2.5μM Cas9(凯佧生物)+2μM TRAC sgRNA+2μM B2M sgRNA+6μM TIGIT sgRNA；其中TIGIT sgRNA的核酸序列如SEQ ID NO：30所示，TRAC-gRNA的核酸序列如SEQ ID NO：23所示，B2M-gRNA的核酸序列如SEQ ID NO：24所示。从而制备了TRAC和B2M双基因敲除的CLDN18A2-UCAR-T细胞，TRAC&B2M&TIGIT基因三敲除的细胞U-UTD-TIGIT KO、CLDN18A2-UCAR-T-TIGIT KO、UCAR-T1-TIGIT KO、UCAR-T2-TIGIT KO、UCAR-T3-TIGIT KO细胞。具体实验操作参照实施例2所述。

采用PE标记的抗抗CLDN18A2scFv的抗体对上述CAR-T细胞进行染色，采用流式细胞术检测各CAR-T细胞阳性率。CAR-T细胞阳性率如图13所示。其中UCAR-T1-TIGIT KO、UCAR-T2-TIGIT KO、UCAR-T3-TIGIT KO细胞TIGIT基因的敲除效率分别为84.3％、85.2％、84.7％。

实施例9 TIGIT基因敲除对CAR-T细胞体外杀伤活性的影响

敲除内源性TIGIT基因可能会影响CAR-T细胞对靶细胞的杀伤。为了评估敲除TIGIT基因对CAR-T体外杀伤活性的影响，我们比较了CLDN18A2-CAR-T、CLDN18A2-CAR-T-TIGIT KO细胞对靶细胞的体外杀伤活性。

采用CD3-CD28抗体包被磁珠活化T细胞，48小时后对活化后T细胞进行PRRL-CLDN18A2-CAR慢病毒感染。MOI＝10。感染24小时后离心换液。继续培养至第6天，采用Maxcyte电转仪电转CLDN18A2-CAR-T细胞，电转体系为1.5μMCas9+6μM TIGIT sgRNA，其中TIGIT sgRNA核酸序列如SEQ ID NO：30所示，得到了CLDN18A2-CAR-T-TIGIT KO细胞。电转72小时后，取1×10 ⁶细胞，采用PE-抗抗CLDN18A2scFv的抗体和APC-TIGIT抗体分别检测CAR-T细胞阳性率和TIGIT阳性细胞比例(图14A)。具体实验操作参照实施例2所述。

结果显示CLDN18A2-CAR-T和CLDN18A2-CAR-T-TIGIT KO细胞的阳性率分别为80.6％和82.1％。CLDN18A2-CAR-T-TIGIT KO细胞的TIGIT敲除效率为83％。

在96孔板中分别接种75μL 2×10 ⁵/mL的BXPC-3-A2、HGC-27-A2细胞(靶细胞)；按效靶比3:1、1:1或1:3分别加效应细胞UTD、CLDN18A2-CAR-T、CLDN18A2-CAR-T-TIGIT KO细胞，并设置效应细胞自发LDH对照孔、靶细胞自发LDH对照孔、靶细胞最大LDH对照孔、体积校正对照孔以及培养基背景对照，各4个复孔；18h后采用Cytotoxicity Detection Kit(LDH，Roche)检测LDH释放，并计算各组细胞对靶细胞的杀伤(图14B)。

结果显示，敲除内源性TIGIT基因不影响CAR-T细胞对靶细胞的杀伤。

实施例10靶向TIGIT和肿瘤抗原的双靶点UCAR-T-TIGIT KO细胞对移植瘤的治疗效果

为了探讨内源性TIGIT表达是否影响实施例7中双靶点UCAR-T对肿瘤治疗效果，我们参照实施例9操作敲除了UCAR-T细胞中的TIGIT基因来观察TIGIT敲除情况下双靶点UCAR-T对移植瘤的治疗效果。

第0天在NPG小鼠皮下接种HGC-27-A2移植瘤，每只小鼠接种5×10 ⁶HGC-27-A2细胞。第20天测量瘤体积大小并进行分组，移植瘤体积约为200mm3，分6组(U-UTD-TIGIT KO、CLDN18A2-UCAR-T、CLDN18A2-UCAR-T-TIGIT KO、UCAR-T1-TIGIT KO、 UCAR-T2-TIGIT KO、UCAR-T3-TIGIT KO)，每组5只；尾静脉给予2×10 ⁶U-UTD-TIGIT KO、CLDN18A2-UCAR-T、CLDN18A2-UCAR-T-TIGIT KO、UCAR-T1-TIGIT KO、UCAR-T2-TIGIT KO、UCAR-T3-TIGIT KO细胞。注射后，每周2次测量体重(包括分组给药及安乐死当天)，并用游标卡尺测量记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，比较各组间肿瘤生长曲线的差异(肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径 ²)。(图15)。

结果显示，相对于对照组，内源性TIGIT敲除的UCAR-T3-TIGIT KO对移植瘤的治疗效果具有显著提高。

由于敲除TIGIT基因，避免了UCAR-T细胞对自身UCAR-T细胞的杀伤，显著提高了其抗肿瘤效果。并且，UCAR-T3-TIGIT KO相对于对照组对HGC-27-A2移植瘤的治疗效果要明显优于实施例7中相对于对照组的治疗效果。

实施例11靶向TIGIT和肿瘤抗原的双靶点U-CAR T-TIGIT KO细胞增强NK细胞存在条件下对移植瘤的治疗效果

为了探讨TIGIT及肿瘤抗原双靶点U-CAR T细胞在NK细胞存在条件下的体内抗肿瘤效果，我们比较了CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+NK、UCAR-T1-TIGIT KO+NK、UCAR-T2-TIGIT KO+NK以及UCAR-T3-TIGIT KO对HGC-27-A2移植瘤的治疗效果。

第0天NPG小鼠皮下接种HGC-27-A2，每只接种5×10 ⁶细胞。第13天，测量HGC-27-A2移植瘤体积约100mm ³并分6组，其中第1，3，4，5，6组给予5×10 ⁶PBMC细胞。第14天，第1组尾静脉注射5×10 ⁵U-UTD-TIGIT KO细胞，第2组尾静脉注射5×10 ⁵CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO，第3组尾静脉注射5×10 ⁵CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO、第4组尾静脉注射5×10 ⁵U-CAR-T1-TIGIT KO细胞，第5组给予5×10 ⁵UCAR-T2-TIGIT KO细胞，第6组尾静脉给予5×10 ⁵UCAR-T3-TIGIT KO细胞。注射后，每周2次测量体重(包括分组给药及安乐死当天)，并用游标卡尺测量记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，比较各组间肿瘤生长曲线的差异(肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径 ²)。

结果显示在NK细胞存在条件下UCAR-T1-TIGIT KO、UCAR-T2-TIGIT KO和UCAR-T3-TIGIT KO对HGC-27-A2移植瘤的治疗效果优于CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO。

上述实验数据表明在NK细胞存在条件下，靶向TIGIT及肿瘤抗原的双靶点CAR-T细胞抗肿瘤效果比单独靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞抗肿瘤效果更好。

实施例12靶向TIGIT的CAR-T细胞对NK细胞的抵抗作用

1.制备TIGIT-BBZ-CAR T、TIGIT-28Z-CAR T细胞参照实施例2构建TIGIT-BBZ、 TIGIT-28Z的CAR载体。分别插入表4所示的片段用于构建靶向TIGIT的CAR-T细胞。

表4嵌合抗原受体

其中CD8α信号肽(SEQ ID NO：38)，抗TIGIT的单链抗体(VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，CD8α铰链区(氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示)，CD8跨膜区(氨基酸序列如SEQ ID NO：86所示)或CD28跨膜区(氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示)，CD28胞内域(氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示)或CD137胞内域(氨基酸序列如SEQ ID NO：88所示)、T细胞激活因子CD3δ(氨基酸序列如SEQ ID NO：46所示)

在慢病毒载体中分别插入表4中的TIGIT-BBZ、TIGIT-28Z的核酸片段，构建成慢病毒质粒PRRL-TIGIT-BBZ、PRRL-TIGIT-28Z(见图16),再分别转入转染293T细胞，包装得到慢病毒TIGIT-BBZ、TIGIT-28Z,分别感染T细胞得到靶向TIGIT的TIGIT-BBZ-CAR T细胞、TIGIT-28Z-CAR T细胞。

2.靶向TIGIT的TRAC和B2M双阴性的CAR-T细胞的制备及其对NK细胞抵抗作用检测

参照实施例2分别敲除TIGIT-BBZ-CAR T细胞、TIGIT-28Z-CAR T细胞中的TRAC和B2M，制备TRAC和B2M双阴性TIGIT-BBZ-UCAR T细胞和TIGIT-28Z-UCAR T细胞。对UTD细胞(未转染病毒的T细胞)进行TRAC单基因敲除制备TRAC-/-UTD作为阳性对照。TRAC和B2M双缺失的UTD细胞(U-UTD细胞)作为阴性对照。

调整细胞浓度至1*10^6/ml。按NK细胞与T细胞数量比例1：1接种于24孔板内，于培养箱中分别共孵育0hr,24hr和48hr。NK细胞+TRAC-/-UTD组利用APC-CD56(Invitrogen)抗体标记NK细胞，其他混合培养组采用APC-HLA-ABC抗体(Invitrogen)标记NK细胞，分别检测共孵育不同时间点T细胞和NK细胞所占比例变化。

结果如图17所示，与NK细胞共培养时，TIGIT-BBZ-UCAR T细胞和TIGIT-28Z-UCAR T细胞比例随共培养时间延长逐渐升高，而NK细胞比例则逐渐下降。这表明靶向TIGIT的CAR-T细胞能够有效抵抗NK细胞的杀伤。

3.TIGIT基因敲除的TIGIT-BBZ-UCAR T-TIGIT KO细胞、TIGIT-28Z-UCAR T-TIGIT KO细胞的制备

参照实施例9操作分别敲除TIGIT-BBZ-UCAR T细胞、TIGIT-28Z-UCAR T细胞中的 TIGIT基因，制备了TIGIT-BBZ-UCAR T-TIGIT KO细胞、TIGIT-28Z-UCAR T-TIGIT KO细胞。

实施例13 靶向TIGIT的CAR-T细胞增强靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞对NK细胞的抵抗作用及其抗肿瘤活性

以靶向肿瘤抗原CLDN18A2的CAR T细胞为例，我们体外检测了靶向TIGIT的CAR-T细胞能否增强在NK细胞存在的条件下靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞的存活及其抗肿瘤活性。

调整CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO、TIGIT-BBZ-UCAR-TIGIT KO、TIGIT-28Z-UCAR-TIGIT KO细胞、NK细胞以及HGC-27-A2细胞密度为1×10 ⁶/ml。按照下列配比行共培养,每种细胞加500μl。共培养时间为0hr、24hr和48hr。

HGC-27-A2+CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+U-UTD-TIGIT KO+NK

HGC-27-A2+CLDN18A2-UCART-TIGIT KO+TIGIT-BBZ-UCAR-TIGITKO+NK

HGC-27-A2+CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+TIGIT-28Z-UCAR-TIGIT KO+NK

检测上述共培养体系HGC-27-A2肿瘤细胞、CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO细胞比例和数目的变化。结果显示：与对照组(1)相比，共培养体系(2)和(3)中CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO细胞比例和细胞数更高，而HGC-27-A2细胞比例和细胞数显著下降。

上述实验结果表明靶向TIGIT的CAR-T细胞能显著提高靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞在NK细胞存在的条件下的存活，从而提高其抗肿瘤活性。

实施例14靶向TIGIT的CAR-T细胞增强靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞对NK细胞的抵抗作用及其体内抗肿瘤活性

为了确定联合靶向TIGIT-UCAR T-TIGIT KO可以增强在NK细胞存在条件下通用型CAR T细胞抗肿瘤效果，以靶向CLDN18A2的CAR T为例，比较了CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO、CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+NK、CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+TIGIT-BBZ-UCAR-TIGIT KO+NK、CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+TIGIT-28Z-UCAR-TIGIT KO+NK对HGC-27-A2移植瘤的治疗效果。

第0天NPG小鼠皮下接种HGC-27-A2，每只接种5×10 ⁶细胞。第13天，测量HGC-27-A2移植瘤体积约100mm ³并分5组，其中第1、3、4、5组分别给予5×10 ⁶PBMC细胞。第14天，第1组尾静脉注射5×10 ⁵U-UTD-TIGIT KO细胞，第2组尾静脉注射5×10 ⁵CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO、第3组尾静脉注射5×10 ⁵CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+5×10 ⁵U-UTD-TIGIT KO细胞，第4组给予5×10 ⁵CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+5×10 ⁵TIGIT-BBZ-UCAR-TIGIT-KO细胞，第5组尾静脉给予5×10 ⁵CLDN18A2-UCAR T-TIGIT KO+5×10 ⁵TIGIT-28Z-UCAR-TIGIT-KO细胞。注射后，每周2次测量体重(包括分组给药及安乐死当天)，并用游标卡尺测量记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，比较各组间肿瘤生长曲线的差异(肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径 ²)。

结果显示：第4，第5组对HGC-27-A2移植瘤的治疗效果显著优于第3组，表明靶向TIGIT的CAR-T细胞能够增强NK细胞存在下靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞的体内抗肿瘤功能。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列：

Claims

一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞表达能识别TIGIT的第一蛋白。
如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白含有能够识别TIGIT的抗体，优选TIGIT的序列如SEQ ID No:10所示。
如权利要求1或2所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、T细胞抗原耦合器(TAC)或其组合。
如权利要求1-3任一所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白是CAR，所述CAR包括：

(i)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD3δ；

(ii)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iii)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iv)识别TIGIT的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ。
如权利要求1-4任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含：编码TIGIT蛋白的基因的敲除和/或内源性TIGIT分子低表达或不表达。
如权利要求5所述的细胞，其特征在于，采用CRISPR/Cas9技术敲除所述细胞TIGIT基因，所使用的gRNA选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36所示序列中的任一种或其组合。
如权利要求1-6任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自T细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、NKT细胞、DNT细胞、NK92细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。
如权利要求1-7任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞为自体或同种异体T细胞、原代T细胞或来源于人的自体T细胞。
如权利要求1-8任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括，

编码TCR蛋白的基因的敲除和/或内源性TCR分子低表达或不表达，和/或

编码MHC蛋白的基因的敲除和/或内源性MHC低表达或不表达。
如权利要求9所述的细胞，其特征在于，采用CRISPR/Cas9技术敲除内源性MHC分子B2M和内源性TCR。
如权利要求10所述的细胞，其特征在于，敲除B2M所使用的gRNA包括SEQ ID NO:24、72、73和/或74所示序列，敲除TCR使用的gRNA包括SEQ ID NO:23、65、66、67、68、69、70和/或71所示序列。
如权利要求2-11任一所述的细胞，其特征在于，所述识别TIGIT的抗体包括：

(i)SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2、SEQ ID NO：5所示的HCDR3、SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2、和/或SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或

(ii)SEQ ID NO：1所示的重链可变区和/或SEQ ID NO：2所示的轻链可变区；或

(iii)SEQ ID NO：78所示的scFv。
如权利要求1-12任一所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白还识别肿瘤和/或病原体；优选地，所述肿瘤表达包括BCMA、CD19、GPC3、CLDN18A2、EGFR或其组合。
如权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白包含识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体，它们的连接方式包括：

(i)识别TIGIT的抗体的轻链/重链(或轻链可变区/重链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链/轻链(或重链可变区/轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的重链/轻链(或重链可变区/轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的轻链/重链(或轻链可变区/重链可变区)；

(ii)识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链(或重链可变区)—识别TIGIT的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的重链(或重链可变区)；和/或

(iii)识别TIGIT的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的重链(或重链可变区)—识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体的轻链(或轻链可变区)—识别TIGIT的抗体的重链(或重链可变区)，

其中，所述第一蛋白是CAR，所述CAR包括：

(i)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD3δ；

(ii)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iii)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iv)识别TIGIT的抗体和识别肿瘤和/或病原体抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ。
如权利要求13或14所述的细胞，其特征在于，所述识别肿瘤抗原的抗体识别CLDN18A2，包括：

(i)SEQ ID NO：13所述的HCDR1、SEQ ID NO：14所述的HCDR2、SEQ ID NO：15所述的HCDR3、SEQ ID NO：16所述的LCDR1、SEQ ID NO：17所述的LCDR2、和/ 或SEQ ID NO：18所述的LCDR3；或

(ii)SEQ ID NO：11所述的重链可变区和/或SEQ ID NO：12所述的轻链可变区；或

(iii)SEQ ID NO：82所示scFv。
如权利要求13-15任一所述的细胞，其特征在于，所述第一蛋白包括SEQ ID NO：48、50、52、90或91所示的序列。
如权利要求1-16任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达靶向识别肿瘤抗原、和/或病原体抗原的第二蛋白、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、降低PD-1表达的siRNA、阻断PD-L1与PD-1结合的蛋白、安全开关或其组合。
如权利要求1-17任一所述的细胞，其特征在于，当所述细胞与宿主NK细胞共培养时，所述细胞能杀伤宿主NK细胞，或所述细胞能抵抗宿主NK细胞对所述细胞的杀伤，或所述细胞能抵抗活化的宿主NK细胞对所述细胞的杀伤。
如权利要求1-18任一所述的细胞，其特征在于，所述细胞与增强其功能的药剂组合施用，优选地，与化疗药物联用；和/或

所述细胞与改善其相关的一种或多种副作用的药剂联合施用；和/或

所述细胞与表达识别与第一蛋白不同抗原的第二蛋白的细胞联合施用。
如权利要求19所述细胞，其特征在于，所述第二蛋白包括CAR，所述CAR包括：

(i)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD3δ；

(ii)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iii)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iv)识别肿瘤和/或病原体的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3δ。
如权利要求19或20所述的细胞，其特征在于，所述表达第二蛋白的细胞包括：

(i)编码TIGIT蛋白的基因的敲除和/或内源性TIGIT分子低表达或不表达；或

(ii)编码TCR和/或MHC蛋白的基因的敲除和/或内源性TCR和/或MHC分子低表达或不表达；或

(iii)编码TIGIT、TCR和MHC蛋白的基因的敲除和/或内源性TIGIT、TCR和MHC分子低表达或不表达。
如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述表达第二蛋白的细胞：

(i)采用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT分子；

(ii)采用CRISPR/Cas9技术敲除TCR和/或MHC分子B2M；或

(iii)采用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT、TCR和MHC分子B2M。
如权利要求19-22任一所述的细胞，其特征在于，所述表达第二蛋白的细胞选自T 细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、NKT细胞、DNT细胞、NK92细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。
如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞为自体或同种异体T细胞、原代T细胞或来源于人的自体T细胞。
增加第一免疫细胞在有宿主第二免疫细胞存在时的持久性和/或移植成活率的方法，包括：

a)提供第一免疫细胞；

b)任选地，通过编码参与针对自体和非自体抗原识别的响应的多肽的至少一种内源基因表达、活性和/或信号传导被降低或抑制来修饰所述第一免疫细胞；

c)编码靶向TIGIT的第一蛋白的多核苷酸来修饰所述第一免疫细胞。
如权利要求25所述的方法，其特征在于，步骤b)中的所述多肽选自MHC、TCR、和/或TIGIT。
如权利要求26所述方法，其特征在于，步骤b)包括：

(i)利用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT分子；

(ii)利用CRISPR/Cas9技术敲除TCR和/或MHC分子B2M；或

(iii)利用CRISPR/Cas9技术敲除TIGIT、TCR和MHC分子B2M。
如权利要求27所述的方法，其特征在于，步骤b)包括：

(i)敲除TIGIT分子所使用的gRNA选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和/或36所示序列；

(ii)敲除TCR使用的gRNA包括SEQ ID NO:23、65、66、67、68、69、70和/或71所示序列；和/或

(iii)敲除MHC分子B2M所使用的gRNA包括SEQ ID NO:24、72、73和/或74所示序列。
如权利要求25-28任一所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白包括嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、T细胞抗原耦合器(TAC)或其组合。
如权利要求25-29任一所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白包括：

(i)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，CD28的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(ii)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；和/或

(iii)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，CD28的共刺激信号结构域，CD137的共刺激信号结构域和CD3δ；

(iv)识别TIGIT的抗体、任选地识别肿瘤和/或病原体的抗体，CD28或CD8的跨膜区，和CD3δ。
如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一蛋白包括：

(i)SEQ ID NO：78所示的TIGIT的scFv；

(ii)SEQ ID NO：82所示的CLDN18A2的scFv；

(iii)SEQ ID NO：48、50或52所示的TIGIT抗体和CLDN18A2抗体串联序列；或

(iv)SEQ ID NO：9、54、56、58、90或91所示的第一蛋白。
如权利要求25-31任一所述的方法，其特征在于，还包括步骤d)编码靶向肿瘤抗原和/或病原体抗原和/或病毒抗原的第二蛋白、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、降低PD-1表达的siRNA、阻断PD-L1与PD-1结合的蛋白、或安全开关等非内源性的多核苷酸来修饰所述第一免疫细胞。
如权利要求25-32任一所述的方法，其特征在于，所述第一免疫细胞选自T细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、NKT细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。
如权利要求25-33任一所述的方法，其特征在于，所述第一免疫细胞为自体或同种异体T细胞、原代T细胞或来源于人的自体T细胞。
一种工程化细胞，其通过如权利要求25-34任一所述的方法制备。
一种多核苷酸，其是编码建构如权利要求1-24、35任一所述细胞的核酸分子或编码施用所述25-34任一所述方法需要的核酸分子。
一种载体，其包含如权利要求36所述的多核苷酸。
一种包含如权利要求37所述载体的病毒。
一种组合物，其包含有效量的如权利要求1-24、35中任一所述的细胞、权利要求36所述的多核苷酸、权利要求37所述的载体、权利要求38所述的病毒。
一种治疗炎性病症、病毒感染和/或肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者给予如权利要求1-24或35中任一所述的细胞或如权利要求39所述的组合物。