CN116836814B - 一株内生真菌及其在提高紫花苜蓿铝耐受性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株内生真菌杂色曲霉菌及其在提高紫花苜蓿铝耐受性中的应用，内生真菌为杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6，保藏编号为GDMCC No：63473，本发明分离得到的内生真菌杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6能够增加紫花苜蓿龙牧801号铝胁迫耐受性，增加紫花苜蓿的生长，显著增加紫花苜蓿地上生物量和地下生物量。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株内生真菌杂色曲霉菌及其在提高紫花苜蓿铝耐受性中的应用。
背景技术
虽然苜蓿(Medicago Sativa L.)是一种具备重要社会经济价值的豆科牧草(Tianet al.2023)，但是苜蓿对土壤铝毒性较为敏感(Wang et al.2016,Liu et al.2017,Sunet al.2020)，酸性土壤加强了中国西南部(Jiang et al.2022)和整个热带和亚热带(Zhouet al.2015)铝毒性的影响。铝的毒性影响了全球约50％的耕地(Awasthi et al.2017,Shiet al.2022)，铝毒能够抑制根系的生长，植物的发育(Rahman et al.2018)，是全球酸性土壤上限制紫花苜蓿产量和持久性的主要生长约束(Campbell et al.1989,Cui etal.2013,Zhou et al.2014,Zhou et al.2015,Wang et al.2016,Awasthi et al.2017,Liu et al.2017,Buhaiov et al.2018,Charles G.Willis et al.2020,Sun etal.2020,Jiang et al.2022,Yu 2022)。土壤铝毒性是中国南方苜蓿产量的主要威胁。尽管铝毒性对苜蓿幼苗的影响已有研究，但铝是否改变了苜蓿种子的萌发仍不完全清楚。铝毒性是贵州乃至南方酸性土壤地区紫花苜蓿种植的主要限制因素(Xu and Ji 1998)。铝毒性显著降低根瘤菌的繁殖率和存活率，严重抑制紫花苜蓿的生长(Li et al.2005)导致难以大面积推行种植，严重制约着南方草地畜牧业的发展。我们进行的研究表明，品种和土壤铝浓度对紫花苜蓿发芽势、发芽率、指数和相对铝损伤有明显影响，土壤铝毒性对发芽的影响受紫花苜蓿品种的调控(Tian et al.2023)。
目前对于苜蓿耐铝性的研究，人们为降低土壤铝的毒性和提高植物对铝的耐受性进行了广泛的研究。传统上石灰用于缓解土壤铝毒性(Liu et al.2017,Zhang etal.2019)和提高土壤pH值(Haque et al.2020)。然而，该方法成本较高(Liu et al.2017)，而且由于石灰用于酸性土壤会产生无机碳排放(Zamanian et al.2018,Zamanian andKuzyakov 2019)，因此被认为对环境(Liu et al.2017)和气候不利。因为铝毒性可引发缺硼，添加硼也可减缓铝毒危害(Lenoble et al.1996,Zhou et al.2015,Yan et al.2021)。由于铝毒性影响植物对水分和养分的吸收(Rahman etal.2018)，磷、钙、镁、硫、硅以及激素、水杨酸、多胺、生物肥料和生物炭等物质的施用在缓解铝对植物的毒性方面发挥了重要作用(Pandey et al.2013,Rahman et al.2018,Rahman and Upadhyaya 2020)。由于铝毒也会抑制根瘤菌的生长，接种根瘤菌可以促进铝毒(Shi et al.2022)下苜蓿的生长。此外，铵态氮(Shi et al.2022)和硫化氢(Zhu et al.2018)可减轻铝对苜蓿的毒害作用，调节钾镁比至适当比例可增强苜蓿的耐铝性(Huang and Grunes 1992)。然而，长期、大量、广泛的添加是不现实的，一方面会增加成本，另一方面会产生新的环境和生态问题，也许通过改良土壤来降低铝的毒性是不可持续的。培育耐铝紫花苜蓿品种是克服这一限制的途径之一。世界上有200多个紫花苜蓿品种，但能适应铝毒性的品种很少(Jiang et al.2022)。
但目前对铝毒缓解的研究主要集中在苜蓿品种的选择、种子萌发和幼苗生长(Qiuet al.2010,Sun et al.2018)以及外源有机酸(Qiu 2010,Liu et al.2019)的缓解机制上。在很多的抗铝胁迫机制中，有机酸分泌是植物抗铝胁迫最重要的机制。有研究证明，锌、镁、磷可以缓解铝对紫花苜蓿幼苗的毒性。也有一些研究人员(Sun et al.2018)发现，铝浓度的提高能够降低紫花苜蓿根尖氧化酶活性。此外，从基因角度的研究发现，在铝毒性胁迫下，拟南芥中过表达苜蓿MsLEA2基因可以促进转基因株系的生长，保护植物的抗氧化酶系统，提高植物抵御铝毒性的能力(Liu et al.2019)。该基因在拟南芥中明显表现出促进拟南芥(Liu et al.2019)耐铝毒的功能。但是目前利用微生物来解决紫花苜蓿耐铝毒这方面的研究鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一株能提高紫花苜蓿铝耐受性的内生真菌及其应用。
本发明的技术方案为：一株杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6，于2023年5月17日保藏于广州市先烈中路100号的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63473。
含有杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6的菌剂。
上述所述的杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6或含有杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6的菌剂在提高龙牧801号紫花苜蓿铝耐受性上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明分离得到的内生真菌杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6能够增加紫花苜蓿龙牧801号铝胁迫耐受性，增加紫花苜蓿的生长，显著增加紫花苜蓿地上生物量和地下生物量。
保藏信息：
杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6于2023年5月17日保藏于广州市先烈中路100号的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63473。
附图说明
图1分离的内生菌平板菌落形态；
图2铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿死亡数的影响；
图3铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿存活数的影响；
图4铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿地上生物量的影响；
图5铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿高度的影响；
图6铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿根重的影响；
图7铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿根体积的影响；
图8铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿长度的影响；
图9铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿根表面积的影响
图10铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿单位根体积的根长度的影响；
图11铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿根尖数的影响；
图12铝胁迫处理下接种内生菌对紫花苜蓿根分叉数的影响。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1耐铝毒紫花苜蓿种子内生菌筛选
(1)耐铝毒紫花苜蓿种子内生细菌分离及纯化
将表面已经消毒过的紫花苜蓿种子放置于铺了吸水滤纸的培养皿上，待自然风干后转入无菌的研磨钵中进行粉碎，从中称取1g种子粉末，每克粉末加入9ml无菌水，充分混匀。接着取匀浆液进行稀释，制备种子悬浮液，取100、10-1、10-2、10-3和10-4五个稀释梯度。取10ul打点于LB培养基上，培养箱28℃培养，每隔6h观察一次，培养2-4天。由于种子内生细菌分布不均匀，不同次的检查结果变化较大，重复上述操作15次，共称取15g。
表面消毒后的种子匀浆在LB平板28℃恒温培养箱中黑暗培养2-5天，每隔24h观察菌落生长情况。将培养得到的细菌进行纯化，从LB平板中挑出形态和颜色不同的代表单菌落进行划线纯化，6个重复，筛选出可培养内生细菌。
(2)耐铝毒紫花苜蓿种子内生真菌的分离及纯化
称取1g紫花苜蓿种子进行表面灭菌。采用组织分离法，将表面消毒的紫花苜蓿种子切成两段，然后将其半埋于PDA培养基上，25℃培养5-7天，待组织块边缘有菌丝长出，用接种针挑取菌丝尖端转接到新的PDA平板上进行纯化培养。
(3)通过形态学观察，筛选出具有代表性的5株细菌和2株真菌，分别记为B1、B7、B9、B10、B14和F1、F6(图1)。
表1紫花苜蓿种子可培养内生细菌的菌落形态特征
F1：菌落粉状或绒状，橄榄绿色，反面黑绿色，分生孢子顶生或侧生，形成分枝的孢子链，椭圆形、圆柱形、柠檬形、近球形、淡褐色，平滑，0-1个隔膜，大多数无隔膜。初步形态鉴定为枝孢菌属。
F6：绒状、絮状或两者兼有,颜色变化范围相当广泛,在不同菌株的菌落上,有时局部会出现淡绿、灰绿、浅黄或粉红等颜色，而菌落反面则近乎无色、黄橙色或玫瑰色；有的菌落上会形成无色至紫红色的液滴。分生孢子头呈疏松的放射状，无色或者略黄。初步形态鉴定为曲霉属。
实施例2分离的种子源可培养微生物对紫花苜蓿生长的影响
1、菌剂的制备
将所筛选出来的内生菌进行培养扩大，细菌生长于LB培养基，真菌生长于PDA培养基。
(1)细菌悬浮液的制备：将所纯化筛选得到的细菌单菌落挑取10ul接种到灭菌的50ml的LB培养液中，置于摇床培养箱中37℃180r/min，摇床培养直至有浑浊出现。
(2)真菌孢子悬浮液的制备：参照方中达的方法在PDA平板上接种将4株真菌分别接种在PDA固体培养基上，25℃下避光培养7天；待长满整个平板后，用无菌铲将平板中的孢子轻轻刮下，转移至盛有5mL无菌水及玻璃珠的50mL锥形瓶中，置于37℃、180rpm的摇床中振荡1h，使菌丝打碎，而后将锥形瓶中的液体用无菌滤纸过滤至锥形瓶中，即得到真菌的孢子悬液。
表2种子源可培养微生物菌剂的菌株浓度(CFU/ml，用细胞计数仪测定)测定结果
2、实验材料
选择紫花苜蓿渝苜1号(简称：MS_YM1)和龙牧801号(简称：MS_LM801)作为实验材料。
3、实验方法
(1)将需要的材料花盆及罩子和酸性土壤用钴-60伽马射线灭菌2天。
(2)将灭菌的种子置于培养皿中发芽，9天后统一移栽。
(3)移栽前将幼苗的根浸泡在培养好的细菌悬浮液或真菌孢子悬浮液中，黑暗处理6个小时。
(4)将处理好的幼苗移栽到小花盆中，盆里盛有250g土壤及120ml无菌水，同一菌种浸泡过的苗移栽了之后单独由一个罩子罩住。每个品种6个重复，把他们放在一个无菌的室温环境中进行培养光照16小时，黑暗8小时。
(5)5天后给移栽的幼苗添加铝胁迫(铝胁迫的具体方法：用六水合氯化铝溶液模拟土壤铝浓度100ppm，每盆用20ml的无菌注射器交叉往复均匀注入20ml)处理，每天观察记录幼苗的成长状态。
4、采样
1)铝胁迫14天后统一采样，取整株植物的根部和地上部分，迅速用1×PBS漂洗掉根上的泥土；
2)用吸水纸吸掉多余水分，将根装入在离心管中；
3)于4℃冰箱重保存；
4)在取样过程中量取记录株高、根重以及茎重；
5)将取好洗净的根于Epson Perfection V800 Photo扫描仪下进行扫描，然后利用WinRHIZO Pro2015软件分析根系形态各项指标。
5、结果与分析
在铝胁迫下进行接菌处理，发现接种的内生细菌可能是有害的，因为它们与对照组CK(有铝胁迫)相比死亡数显著增高，存活数明显降低；而可培养内生真菌F1的接种与对照相比MS_YM1的死亡数与存活数无明显差异(p>0.05)，但是与对照CK相比，可培养内生真菌F1和F6的接种使MS_LM801的死亡数显著降低(p<0.05)，明显低于空白对照CK0(无铝胁迫)，存活数显著增加(p<0.05)，明显高于空白对照CK0，见图2和图3。
种子源可培养内生细菌对铝胁迫下地上生物量具有显著的影响(p<0.05)。铝胁迫下，与对照CK相比，接种内生细菌能显著降低地上生物量和高度(p<0.05)，而接种真菌F1能显著降低MS_YM1的地上生物量(p<0.05)，接种真菌F6能显著增加MS_YM1的高度(p<0.05)，但是接种真菌F1和F6显著提高MS_LM801的地上生物量和高度(p<0.05)，而且接种真菌F6使得MS_LM801的地上生物量和高度明显高于空白对照CK0(p<0.05)，见图4和图5。
种子源可培养微生物对铝胁迫下根生物量具有显著的影响(p<0.05)。铝胁迫下，与对照CK相比，接种内生细菌的两个品种的根生物量显著降低(p<0.05)，但是接种内生真菌F1和F6显著提高MS_LM801的根生物量(p<0.05),接种内生真菌F6使得MS_LM801的根生物量明显超过了空白对照CK0，但接种内生真菌F1显著降低MS_YM1的根生物量(p<0.05)，而接种内生真菌F6对MS_YM1的根生物量(p<0.05)没有显著影响(p>0.05)，如图6所示。
种子源可培养微生物对铝胁迫下根系形态具有明显差异(p<0.05)。铝胁迫下，与对照CK相比，接种内生细菌处理显著降低MS_LM801和MS_YM1的根体积、长度、表面积、单位根体积根长度、根尖数和根分叉数(p<0.05)，而接种内生真菌F1和F6明显增加了MS_LM801的根体积、长度、表面积、单位根体积根长度、根尖数和根分叉数(p<0.05)，接种内生真菌F6明显增加了MS_YM1的根体积、长度、表面积、单位根体积根长度、根尖数和根分叉数(p<0.05)，如图7、图8、图9、图10、图11和图12所示。
由此可见，本发明分离得到的内生真菌菌株F1和F6，特别是菌株F6，能够明显增加紫花苜蓿龙牧801号(MS_LM801)铝胁迫耐受性，增加紫花苜蓿的生长，显著增加紫花苜蓿地上生物量和地下生物量。
实施例3内生真菌菌株F6的鉴定和保藏
(1)内生真菌菌株F6的分子鉴定
对菌株F6的ITS1测序，测序的前引物序列CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，后引物序列为GCTGCGTTCTTCATCGATGC。菌株F6的ITS1序列如SEQ ID No.1所示。
依据BLAST软件与GenBank数据库中的已知菌株序列对菌株F6的ITS序列进行同源性比对，结果表明，菌株F6与多株Aspergillus versicolor一致性达到99.81％，结合形态学将菌株F6确定为Aspergillus versicolor。
(2)内生真菌菌株F6的保藏：
将杂色曲霉菌(Aspergillus versicolor)F6于2023年5月17日保藏于广州市先烈中路100号的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：63473。
Claims (3)
1.一株杂色曲霉菌（Aspergillus versicolor）F6，于2023年5月17日保藏于广州市先烈中路100号的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63473。
2. 含有权利要求1所述的杂色曲霉菌（Aspergillus versicolor）F6的菌剂。
3. 权利要求1所述的杂色曲霉菌（Aspergillus versicolor）F6或权利要求2所述的菌剂在提高龙牧801号紫花苜蓿铝耐受性上的应用。
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