CN116813701A

CN116813701A - 靶向肌肉型乙酰胆碱受体的肽分子及其制备方法、用途

Info

Publication number: CN116813701A
Application number: CN202310198487.8A
Authority: CN
Inventors: 吴勇; 齐盼盼; 长孙东亭; 罗素兰; 朱晓鹏
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2043-03-03
Also published as: CN116813701B

Abstract

本发明属于生物、化学领域，具体涉及一种靶向肌肉型乙酰胆碱受体的肽分子及其制备方法、用途，特别涉及一种靶向肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的肽分子及其制备方法、用途。该肽分子的氨基酸结构具有如式Ⅰ所示的通式：X1‑X2‑X3‑X4‑X5‑X6‑X7‑X8‑X9‑X10，式Ⅰ。本发明提供的肽分子对肌肉型乙酰胆碱受体具有高选择性和阻断性，具有潜在的抗皱活性。

Description

靶向肌肉型乙酰胆碱受体的肽分子及其制备方法、用途

技术领域

本发明属于生物、化学领域，具体涉及一种靶向肌肉型乙酰胆碱受体的肽分子及其制备方法、用途，特别涉及一种靶向肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的肽分子及其制备方法、用途。

背景技术

皱纹是皮肤老化的明显标志，也是皮肤老化直观的表现形式之一。皮肤的衰老不仅影响美观，还会增加皮肤的发病率。皮肤衰老主要表现为皮肤组织的衰退，皮肤厚度随着年龄的增加而改变。正常情况下，20岁左右表皮层最厚，随着年龄的增长逐渐变薄。25岁以后，真皮干细胞及成纤维细胞的活性降低，真皮层逐渐变薄萎缩，皮下脂肪减少，最终导致弹力纤维、胶原纤维的流失，皮肤弹性和张力变差，产生皱纹、眼袋及面颊下坠等问题。现代医学研究认为，皮肤衰老是多种内源性和外源性因素长期作用下的必然结果，内源性衰老是主要因素，由遗传背景和年龄因素决定。外源性衰老则取决于外界的环境因素，如紫外线照射、吸烟、环境污染、生活习惯、内分泌紊乱、慢性消耗性疾病等。

简单来说，皱纹出现的原因除了上述的皮肤衰老还包括肌肉的过度收缩。肌肉的收缩是由神经递质乙酰胆碱引起的。从神经元传来的动作电位沿神经纤维传递至突触末稍后，引起去极化促使钙离子通道打开以增加膜内的钙离子浓度，使突触小泡向前移动并将神经递质(乙酰胆碱，ACh)释放到突触间隙，乙酰胆碱(ACh)与突触后膜上的肌肉型乙酰胆碱受体结合并开放阳离子通道，Na⁺与K⁺内流，引起肌肉纤维内钠离子浓度升高，并且在细胞膜上使动作电位沿着肌肉纤维纵向传导，动作电位去极化，引起钙离子从肌质网释放。钙离子直接发起肌肉肌肉收缩过程。形成的离子电流压差使终板膜发生去极化，产生终极电位，从而促使肌肉收缩。面部是身体中肌肉唯一紧贴在皮肤的部位，可以通过神经中枢系统调控面部肌肉收缩表达不同的情感，当表情肌收缩时，可以移动面部的皮肤，产生垂直于肌肉走行的皱纹及皱褶。由于面部表情肌的往复运动，皮肤会由于反复的机械作用而产生皱纹。此外，皮肤常处于缺水状况、面部表情过于生动、皮肤反复的折叠等均会加深皱纹，甚至最后演化成静态纹，如眼角纹、法令纹、表情纹等。

烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)是一类配体门控离子通道，可介导胆碱能神经传递。nAChR可分为神经型烟碱受体(neuron-type nAChR)和肌肉型烟碱受体(muscle-typenAChR)。神经型烟碱受体(neuron-type nAChR)主要分布于自主神经节突触后膜和中枢神经系统，与机体的认知、疼痛、学习、记忆等密切相关。肌肉型烟碱受体(muscle-typenAChR)主要位于神经-骨骼肌接头的终板膜上，主要作为电位调节器来调节神经肌肉的动作电位，在分子水平上由5个亚单位构成，在胚胎发育晚期肌肉型nAChR由胎儿型(α1β1δγ)转变为成年型(α1β1δε)。在成熟的肌肉中由成年型(α1β1δε)负责结合神经递质，成年型(α1β1δε)是神经肌肉接头处的主要神经递质受体，是许多麻痹毒素的首选靶标，会引起肌肉的收缩。因此成年型(α1β1δε)常被用作研发抗衰抗皱的作用靶点。

20世纪80年代，Olivera等人首次从海洋腹足纲软体动物芋螺中分离出了芋螺毒素，芋螺毒素的分子量较小，由10～40个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸和二硫键，能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠、钾等多种离子通道。据研究表明，迄今为止，大约700种掠食性芋螺的毒液正在被系统研究，但已发现和研究的芋螺毒素还未及总量的1％，仍有极大的探索空间。与其他天然肽类毒素相比，芋螺毒素由于功能独特、副作用小、靶向明确等优点，已成为药理学、生物医学等领域关注的重点。根据芋螺毒素基因及前体蛋白信号肽的保守性，可以把芋螺毒素分为多个超家族。每个超家族的成员均具有共同且保守的二硫键连接方式和信号肽序列。根据其作用靶点的不同，每个超家族又可进一步细分为α-、μ-、δ-、γ-等若干家族。

α-芋螺毒素是A-超家族芋螺毒素中分布最广、丰度最高的家族，由12～30个氨基酸组成，通常包含两个二硫键，采用CC-C-C框架。α-芋螺毒素是已知最小的毒液肽之一，能与神经肌肉接头处突触后膜上nAChR的α亚基结合，表现出高亲和力和显著的选择性，从而竞争性地抑制乙酰胆碱与受体结合，阻断神经-肌肉兴奋信号的传递，抑制肌肉收缩，最终达到预防和减少皱纹的效果。

目前，皱纹的改善和治疗主要通过局部注射肉毒杆菌素(BOTOX)，由肉毒杆菌产生，是典型的A-B型神经外毒素，针对动力性表情皱纹，特别是抬头纹、眼角纹、眉间纹、鼻背纹、木偶纹等有显著改善治疗效果，治疗原理是通过抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱囊泡释放，阻断神经肌肉接头处的冲动传导，引起肌肉麻痹，从而抑制面部表情肌的动态收缩功能，导致肌肉收缩张力减弱，产生抗皱纹效果。肉毒杆菌素引起的抑制效果可维持3～4个月左右，但肉毒杆菌素的主要缺点是注射后容易出现面部表情僵硬、呆板不自然的表现，操作不当容易造成眉下垂、睁眼乏力和面形不对称等现象，还会出现头晕、呼吸困难和肌肉乏力等症状，安全范围较小。因此需要开发新的化合物用于皱纹改善和治疗。

伴随分子生物学、生物化学等学科的进步，生物活性美容多肽在化妆品领域越来越受到重视，并显示出巨大的市场潜力。目前化妆品及医药公司研发得到的已知可以产生抗皱效果的短肽化合物包括类蛇毒血清蛋白(Syn-Ake)、乙酰基六肽-1(Munapsys^TM)、抗皱纹肽(Argireline)、维洛斯肽(Vialox)、棕榈酰五肽-4、六胜肽-30等。目前在具有抗皱功能的化妆品中广泛应用的蛇毒SYN-AKE是来源于蛇毒的三肽，主要作用于肌肉型nAChR的突触后膜，抑制神经肌肉收缩；运用在化妆品领域的芋螺毒素是来自μ家族的μ-conotoxinCnIIIC，它可以靶向阻断NaV1.4和Nav1.2通道，从而产生抗皱作用。前文提及芋螺毒素具有功能独特、副作用小、靶向明确等特点，是药理学、生物学、化学、医学等领域的关注重点。且芋螺毒素家族庞大，是多肽药物的丰富来源。因此在芋螺毒素中寻找针对肌肉型nAChRs的生物活性短肽对于开发新型抗皱美容肽具有至关重要的意义和应用价值。

发明内容

鉴于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种靶向肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的肽分子，所述肽分子的氨基酸结构具有如式Ⅰ所示的通式：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10，式Ⅰ；

其中：X1为H或者不存在，X2为P或者不存在，X3为A或者不存在，X4为C或者不存在，X5为G或者P，X6为K或者R，X7为N、P或者H中的一种，X8为Y，X9为S，X10为C或者不存在。

优选地，所述肽分子具有如SEQ ID NO.1～12任一所示的氨基酸序列。

本发明第二方面，提供一种所述肽分子的制备方法，包括以下步骤：

将目标肽分子C端第一个氨基酸的羧基共价连接到树脂上；

以该氨基酸的氨基为合成起点，与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应，重复该步骤至得到目标肽分子；

将目标肽分子从树脂上切割下来，并脱去侧链保护基，即得靶向肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的肽分子。

本发明第三方面，提供一种所述肽分子在制备抑制肌肉型乙酰胆碱受体活性的产品中的用途。

优选地，所述肌肉型乙酰胆碱受体为肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型。

优选地，所述肽分子用于制备抗皱纹的产品。

优选地，所述产品包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～12任一所示的肽分子中的至少一种。

优选地，所述产品还包括化妆品领域可接受的辅料或载体。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供一种靶向肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的肽分子。经试验验证，该肽分子对乙酰胆碱受体具有选择性的阻断作用，其阻断率高达97.23％，具有消除皮肤皱纹的潜力。同时，该肽分子具有较短的序列及较小的分子量，能够透过肌肤屏障，并降低副作用及合成成本。

附图说明

图1是肽的固相合成合成原理及说明；

图2是SEQ ID NO.1所示肽的质谱图；

图3是SEQ ID NO.2所示肽的质谱图；

图4是SEQ ID NO.3所示肽的质谱图；

图5是SEQ ID NO.4所示肽的质谱图；

图6是SEQ ID NO.5所示肽的质谱图；

图7是SEQ ID NO.6所示肽的质谱图；

图8是SEQ ID NO.7所示肽的质谱图；

图9是SEQ ID NO.8所示肽的质谱图；

图10是SEQ ID NO.9所示肽的质谱图；

图11是SEQ ID NO.10所示肽的质谱图；

图12是SEQ ID NO.11所示肽的质谱图；

图13是SEQ ID NO.12所示肽的质谱图；

图14是SEQ ID NO.1所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图15是SEQ ID NO.2所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图16是SEQ ID NO.3所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图17是SEQ ID NO.4所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图18是SEQ ID NO.5所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图19是SEQ ID NO.6所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图20是SEQ ID NO.7所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图21是SEQ ID NO.8所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图22是SEQ ID NO.9所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图23是SEQ ID NO.10所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图24是SEQ ID NO.11所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图；

图25是SEQ ID NO.12所示肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体(α1β1δε)亚型的典型性电流图。

具体实施方式

如本文所用的，术语“包含”或其变化形式如“包括”或“含有”应理解为指示包含任何列举的特征，但不排除其他任何特征。因此，如本文所用的，术语“包含”是包含性的，并且不排除其他的、未列举的特征。在本文提供的任何组合物和方法的一些实施方案中，“包含”可以用“基本上由...组成”或“由...组成”代替。本文使用短语“基本上由...组成”来表示需要指定的特征以及实质上不影响请求保护的发明的特性或功能的那些特征。如本文所用的，术语“组成”用来指示单独存在所列举的特征。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

现代研究发现芋螺毒素的阻断率很高，还可以保留部分神经肌肉电流传递，避免脸部瘫痪和皮肤僵硬，从而达到自然祛皱的效果。因此本发明着重从芋螺毒素出发，寻找可以选择性抑制肌肉型乙酰胆碱受体的短肽抑制剂。

本发明在深入研究α-芋螺毒素时发现，其片段也对肌肉型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)具有特异性，并显示出显著的阻断活性，具有用于皮肤老化疗、抗皱纹的潜力。1980年，Gray等人从地纹芋螺(C.geographus L.)毒液中分离得到的α-芋螺毒素GI，序列为：ECCNPACGRHYSC，由13个氨基酸组成，含有两对二硫键，是3/5亚家族芋螺毒素，是活性很强的肌肉型nAChRs的竞争性拮抗剂，IC50为20nM。α-芋螺毒素MI是从幻芋螺中发现的具有14个氨基酸的肌肉型nAChRs竞争性拮抗剂，半阻断剂量(IC₅₀)仅有400pmol·L^-1，序列为：GRCCHPACGKNYSC。但是它们的安全范围小、序列较长、分子量大、难以透过肌肤屏障。

本发明证实了从α-芋螺毒素GI、MI中提取的氨基酸片段，当只选取其部分残基时，依旧具有一定的乙酰胆碱受体抑制活性，例如：序列为PACGRHYSC的肽依旧对乙酰胆碱受体具有选择性的阻断作用，其阻断率高达97.23％，具有消除皮肤皱纹的潜力。紧接着我们对有活性的片段进行了进一步的缩短以及氨基酸突变从而筛选并设计合成了12种新的肽，这些新的肽具有5到10个氨基酸残基不等。之后使用电生理的方法检测了它们针对肌肉型乙酰胆碱受体的作用，研究了它们针对在非洲爪蟾卵母细胞中表达的肌肉型乙酰胆碱受体由乙酰胆碱引发的电流的抑制能力(筛选浓度为10^-4mol/L)。本发明逐步缩短了肽的氨基酸序列，尽可能减小了肽的分子量，降低了合成成本，并且使其在改造后维持高的抑制活性。总的来说，本发明探讨了这些短肽对肌肉型乙酰胆碱受体的抑制作用及其应用前景，旨在为开发新型抗皮肤皱纹产品提供参考，并且解决芋螺毒素及其来源的短肽在美容抗皱领域贡献不足的问题。

本发明提供的肽分子氨基酸结构中的字母分别表示：H-组氨酸，P-脯氨酸，A-丙氨酸，C-半胱氨酸，G-甘氨酸，K-赖氨酸，R-精氨酸，N-天冬氨酸，Y-酪氨酸，S-丝氨酸

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1

本实施例通过Fmoc固相多肽合成技术进行肽的合成，肽的固相合成是一个反复添加氨基酸的过程，顺序从多肽C端到N端。采用RinkMBHA树脂(取代度为0.53)以20％碱性哌啶脱去Fmoc保护基，HATU和DIPEA作为偶联试剂。实验验过程如下：

首先将目标多肽C端第一个氨基酸的羧基共价连接到树脂上，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应，形成肽键。不断重复至目标多肽合成完毕。使用三氟乙酸将多肽从树脂上切割掉，并脱去侧链保护基。本实施例以SEQ ID NO.1：CGRHYSC的化学合成为例，具体合成过程如下：

在15mL EP管中加入96mg Rink MBHA树脂(负载量为0.56mmol/g)、3mL二氯甲烷及3mL DMF，振荡10分钟，溶胀树脂；

将树脂转移入多肽合成管，抽干溶剂，加入3mL 20％哌啶/DMF溶液，振荡5分钟，脱去Fmoc保护基。抽干后，用DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、DCM(二氯甲烷)、DMF依次分别洗涤树脂3次(每次约5mL)，重复以上操作两次；

称取36mg Fmoc-Cys(Trt)-OH、63.9mg HATU，加入5mL EP管，加3mL DMF溶解，用移液枪加入57.8μL DIPEA，混匀后加入合成管，振荡15分钟。用DMF、DCM、DMF依次分别洗涤3次。使用茚三酮检测反应是否完全，检测后加入3mL 20％哌啶/DMF溶液，振荡5分钟。抽干后，用DMF、DCM、DMF依次分别洗涤3次，再加入3mL 20％哌啶/DMF溶液，振荡5分钟。用DMF、DCM、DMF依次分别洗涤3次。重复以上实验操作步骤，依次分别加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH。反应完成后将TFA∶TIPS∶H₂O∶DODT＝92.5∶2.5∶2.5∶2.5(体积比)的切割试剂3mL，加入合成管，40℃反应35分钟，将多肽从树脂上切割下来，并且脱去侧链保护基团。溶液转移至50ml离心管，加入冰乙醚，离心乙醚洗涤3次(10000rpm/min，15分钟)，弃上清液，留沉淀，将离心管敞口置于通风橱内，待乙醚自然挥发，得到粗肽固体。使用HPLC对粗肽进行鉴定(检测波长：214nm；含0.05％TFA的水/90％乙腈梯度洗脱45min)。

该肽含有一对二硫键，采用空气自由氧化，将处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下(pH值6.5～10)，反应24小时以上，得到目标多肽。

该肽通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅰ所示，分子量鉴定结果如图2所示，其分子量为822.43。

实施例2

SEQ ID NO.2：ACGRHYSC所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH。该肽含有两个半胱氨酸，一对二硫键，采用空气自由氧化反应24小时以上，得到目标多肽。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅱ所示，分子量鉴定结果如图3所示，其分子量为895.49。

实施例3

SEQ ID NO.3：PACGRHYSC所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH。该肽含有两个半胱氨酸，一对二硫键，采用空气自由氧化反应24小时以上，得到目标多肽。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅲ所示，分子量鉴定结果如图4所示，其分子量为922.62。

实施例4

SEQ ID NO.4：GKNYS所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH。该肽不含二硫键，不需进行氧化折叠。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅳ所示，分子量鉴定结果如图5所示，其分子量为567.36。

实施例5

SEQ ID NO.5：CGKNYS所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH。该肽不含二硫键，不需进行氧化折叠。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅴ所示，分子量鉴定结果如图6所示，其分子量为771.22。

实施例6

SEQ ID NO.6：ACGKNYSC所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH。该肽含有两个半胱氨酸，一对二硫键，采用空气自由氧化反应24小时以上，得到目标多肽。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅵ所示，分子量鉴定结果如图7所示，其分子量为843.52。

实施例7

SEQ ID NO.7：PACGKNYSC所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH。该肽含有两个半胱氨酸，一对二硫键，采用空气自由氧化反应24小时以上，得到目标多肽。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅶ所示，分子量鉴定结果如图8所示，其分子量为939.37。

实施例8

SEQ ID NO.8：HPACGKNYSC所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。该肽含有两个半胱氨酸，一对二硫键，采用空气自由氧化反应24小时以上，得到目标多肽。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅷ所示，分子量鉴定结果如图9所示，其分子量为1078.54。

实施例9

SEQ ID NO.9：PRHYS所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH。该肽不含二硫键，不需进行氧化折叠。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅸ所示，分子量鉴定结果如图10所示，其分子量为658.37。

实施例10

SEQ ID NO.10：PRPYS所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH。该肽不含二硫键，不需进行氧化折叠。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅹ所示，分子量鉴定结果如图11所示，其分子量为618.45。

实施例11

SEQ ID NO.11：PRNYS所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH。该肽不含二硫键，不需进行氧化折叠。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅺ所示，分子量鉴定结果如图12所示，其分子量为635.41。

实施例12

SEQ ID NO.12：GRNYS所示的肽分子合成，其与实施例1中SEQ ID NO.1所示的肽分子的合成过程的不同仅在于：按照实施例1的制备过程分别依次加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH。该肽不含二硫键，不需进行氧化折叠。

该肽分子通过ESI-MS进行鉴定，其结构式如式Ⅻ所示，分子量鉴定结果如图13所示，其分子量为595.35。

实验例1

短肽作用于肌肉型乙酰胆碱受体的活性

将健康的成年雌性非洲蟾冰浴麻醉1h，待其完全麻痹，将爪蟾腹部朝上放在冰台上，使用碘酒以及质量分数75％的医用酒精消毒，在蛙的腹部中心线横向切至边缘的1/3处，取出部分卵母细胞团置于培养皿中。将取下卵叶剪成相似的小块，使用胶原酶溶液将卵母细胞小块酶解为单个细胞，挑选出大小均一、动植物极分明、饱满有弹性的卵母细胞，在含有庆大霉素100μg/ml、青霉素10μg/ml及链霉素10μg/ml的ND96溶液中17℃恒温培养。使用可吸收缝合线逐层缝合非洲爪蟾的肌肉筋膜和皮肤，并单独饲养在盛有0.5％的NaCl和青霉素的盐溶液中。每只非洲爪蟾在6周内手术不超过1次。

将α1β1δε亚基cRNA按2∶1∶1∶1的浓度比例混合均匀后，按50.6nL/cell的体积注入到卵母细胞中，17℃恒温培养，24h后利用双电级电压钳分别检测SEQ ID NO.1～12所示的短肽对肌肉型乙酰胆碱受体的活性。将卵母细胞放到含有ND96的细胞槽中，钳制电压为-70mV，在IC模式下电极入液调零后，观测两侧电极电阻是否在0.5～2MΩ。然后两侧电极同时斜着45度刺入卵母细胞膜，并转入TEVC模式，按照仪器已经设定好的程序进行细胞电流的检测：处于静息状态的卵母细胞，1分钟之内，给予2秒钟的含10μmol/L乙酰胆碱和0.1mg/ml牛血清蛋白(BSA)的ND96溶液进行乙酰胆碱刺激，其通道流速为2ml/min，若卵母细胞此时产生电流则说明受体表达成功。剩余时间使用含有0.1mg/ml牛血清蛋白(BSA)的ND96缓冲液进行冲洗，通道流速为2ml/min，卵母细胞重新恢复静息状态。ND96与非洲爪蟾卵母细胞孵育5min，记录10μmol/LACh诱导所产生的电流作为基础空白对照。在细胞槽中加入浓度为10^-4mol/L的多肽，孵育5min。记录卵母细胞针对ACh诱导所产生的电流，与对照电流进行比较。计算相应的阻断率。

SEQ ID NO.1～12所示的多肽阻断肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的典型性电流图分别如图14～25所示。

SEQ ID NO.1～12所示多肽的阻断率分别为：89.37％、65.63％、97.23％、5.71％、4.70％、0.39％、11.26％、15.35％、89.5％、60.18％、76.1％、79.9％。

虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims

1.一种靶向肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的肽分子，其特征在于，所述肽分子的氨基酸结构具有如式Ⅰ所示的通式：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10，式Ⅰ；

2.根据权利要求1所述的肽分子，其特征在于，所述肽分子具有如SEQ ID NO.1～12任一所示的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述的肽分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将目标肽分子C端第一个氨基酸的羧基共价连接到树脂上；

4.一种权利要求1或2所述的肽分子在制备抑制肌肉型乙酰胆碱受体活性的产品中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肌肉型乙酰胆碱受体为肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肽分子用于制备抗皱纹的产品。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述产品包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～12任一所示的肽分子中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述产品还包括化妆品领域可接受的辅料或载体。