CN108866068A - 芋螺毒素GeXXVIIA的基因、多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种芋螺毒素GeXXVIIA的基因、多肽及其应用，该芋螺毒素GeXXVIIA的基因来自中国南海将军芋螺，其编码的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽能够自发地形成同源二聚体，并且该同源二聚体的单体GeXXVIIA线性肽能够抑制乙酰胆碱受体，在用于制备抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种芋螺毒素GeXXVIIA的基因、多肽及其应用。
背景技术
芋螺毒素是一类由生活在热带或者亚热带海洋浅水区的软体动物芋螺在毒液管中分泌的小肽，能够快速且特异性地作用于神经系统，在临床上已显示了重要的应用价值。
芋螺毒素的表达序列(前肽)一般包括了信号肽。信号肽在进化上相对保守，根据其序列，将目前已知的芋螺毒素分为27个超家族，包括A-,B1-,B2-,B3-,C-,D-,E-,F-,G-,H-,I1-,I2-,I3-,J-,K-,L-,M-,N-,O1-,O2-,O3-,P-,S-,T-,V-,Y-(Q.Kaas,R.Yu,A.H.Jin,S.Dutertre and D.J.Craik,2012:ConoServer:updated content,knowledge,anddiscovery tools in the conopeptide database.Nucleic acids research,40,D325-330)和Q-超家族(A.Lu,L.Yang,S.Xu and C.Wang,2014:Various conotoxindiversifications revealed by a venomic study of Conus flavidus.Molecular&cellular proteomics:MCP,13,105-118)。成熟肽是芋螺毒素的活性序列，通常含有10-40个左右的氨基酸，且富含半胱氨酸。
一条芋螺毒素前肽可以通过不同的剪切方式形成多条成熟肽(A.Lu,L.Yang,S.Xuand C.Wang,2014:Various conotoxin diversifications revealed by a venomicstudy of Conus flavidus.Molecular&cellular proteomics:MCP,13,105-118)，但不同成熟肽的生物学功能差异仍不得而知。
目前已知功能的芋螺毒素生物活性强，能特异地作用于动物细胞膜上的受体和离子通道，对受体和离子通道的不同亚型具有很高的识别力(H.Terlau and B.M.Olivera,2004:Conus venoms:a rich source of novel ion channel-targetedpeptides.Physiological reviews,84,41-68)。根据其作用的受体与离子通道靶点的不同，目前已知功能的芋螺毒素又可分为12个不同的家族(Q.Kaas,R.Yu,A.H.Jin,S.Dutertre and D.J.Craik,2012:ConoServer:updated content,knowledge,anddiscovery tools in the conopeptide database.Nucleic acids research,40,D325-330)，包括alpha(α)，chi(χ)，delta(δ)，epsilon(ε)，gamma(γ)，iota(ι)，kappa(κ)，mu(μ)，omega(ω)，rho(ρ)，sigma(σ)和tau(τ)家族，同一超家族的芋螺毒素往往具有一个功能活性，少数具备多个家族的功能活性。
烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是动物界中普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的跨膜蛋白，是一类配体门控型离子通道受体，由不同的α亚基和β亚基组装成很多种亚型，每种亚型都有截然不同的药理学特征。
烟碱型乙酰胆碱受体大体可分为两类：肌肉型乙酰胆碱受体和神经型乙酰胆碱受体。其中，肌肉型乙酰胆碱受体一般由5个亚基构成，即含2个α1亚基、1个β亚基、1个δ亚基和1个γ或ε亚基，γ或ε亚基取决于其是胎儿的乙酰胆碱受体还是成体的乙酰胆碱受体。哺乳动物的神经型nAChRs亚型比肌肉型nAChRs亚型复杂得多，至少有8种α亚基、3种β亚基，分别为α2-α7、α9、α10(在雏鸡中存在α8)、以及β2-β4。其中α2,α3和α4可以分别同β2或者β4结合，形成功能性受体，比如α2β2、α3β2、α2β4等。此外，α7和α9可以形成同源多聚体。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物，要研究和阐明nAChRs不同亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。但总体来说，作为细胞膜上的变构膜蛋白nAChRs，介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放(TalyA,CorringerPJ,GuedinD,LestageP,ChangeuxJP.Nicotinicreceptors:allosteric transitions and therapeutic targetsin the nervous system.Nat Rev Drug Discov.2009,8(9):733-50)。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括疼痛、烟酒和毒品成瘾、智障、痴呆、精神分裂症、中枢神经紊乱、癫痫症、帕金森病、精神病、神经肌肉阻滞、重症肌无力、抑郁症、高血压、心率不齐、哮喘、肌肉松弛、中风、乳腺癌和肺癌等(Livett BG,SandallDW,KeaysD,DownJ,GaylerKR,SatkunanathanN,KhalilZ.Therapeuticapplicationsof conotoxins that target the neuronalnicotinic acetylcholine receptor.Toxicon,2006,48(7):810-829)。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性nAChR激动剂如烟碱，虽然可以缓解上述神经疾病的症状，但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用，且有成瘾性。因此，开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种来自于中国南海将军芋螺的芋螺毒素GeXXVIIA的基因及其编码的芋螺毒素GeXXVIIA前体肽和芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽。
本发明的另一个目的在于提供来自于中国南海将军芋螺的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种来自于中国南海将军芋螺的芋螺毒素GeXXVIIA基因，其碱基序列如SEQ IDNO：1所示。
一种由上述的芋螺毒素GeXXVIIA基因编码的芋螺毒素GeXXVIIA前体肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
一种由上述的芋螺毒素GeXXVIIA基因编码的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
上述的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽能够用于抑制乙酰胆碱受体。其中，乙酰胆碱受体可以为神经型乙酰胆碱受体，也可以为肌肉型乙酰胆碱受体。进一步地，神经型乙酰胆碱受体可以为α9α10乙酰胆碱受体亚型、α4β2乙酰胆碱受体亚型、α3β2乙酰胆碱受体亚型、α3β4乙酰胆碱受体亚型、α7乙酰胆碱受体亚型或α4β4乙酰胆碱受体亚型。肌肉型乙酰胆碱受体可以为α1β1δε乙酰胆碱受体亚型。
上述的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽可以用于制备能够抑制乙酰胆碱受体的试剂。其中，该试剂可以用于科学研究中对乙酰胆碱受体活性的抑制。
上述的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽可以用于制备能够抑制乙酰胆碱受体的药物。其中，该药物可以为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物、或者治疗癌症的药物。
上述的神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型；癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
进一步地，上述的神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；上述的成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；上述的中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；上述的炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码而成的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽在自然界中能够自发地形成同源二聚体，并且该同源二聚体的单体GeXXVIIA线形肽具有极高的抑制乙酰胆碱受体的能力，在用于制备抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2的芋螺毒素GeXXVIIA的洗脱曲线图。其中，横坐标表示时间(Time)，以分钟(min)为单位；纵坐标表示OD值(214nm)。
图2为本发明实施例3的芋螺毒素GeXXVIIA的完整cDNA序列图。
图3为本发明实施例4的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体GeXXVIIA的四个同分异构体的洗脱曲线图。其中，横坐标表示洗脱时间(Time)，以分钟(min)为单位；纵坐标表示OD值(214nm)。
图4为本发明实施例5的芋螺毒素GeXXVIIA单体线性肽及其截短片段的制备流程示意图。
图5为本发明实施例5的衍生物GeXXVIIA线形肽(左图)及其截短片段(右图)的洗脱曲线图。其中，横坐标表示洗脱时间(Time)，以分钟(min)为单位，纵坐标表示OD值(214nm)。
图6为本发明实施例6的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体的不同异构体抑制不同亚型乙酰胆碱受体的活性测定图。其中，横坐标表示不同的乙酰胆碱亚型，纵坐标为相对于没有毒素条件下的电流幅度。
图7为本发明实施例6的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的单体衍生物及截短片段抑制乙酰胆碱受体的活性测定图。其中，横坐标表示不同的乙酰胆碱亚型，纵坐标表示相对于没有毒素条件下的电流幅度。
图8为本发明实施例6的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的单体线性肽及N端截短片段抑制乙酰胆碱受体α9α10亚型和α1β1δε亚型的剂量依赖曲线图。其中，横坐标是所加毒素的浓度对数值，纵坐标表示相对于没有毒素条件下的电流幅度。
具体实施方式
本发明提供了一种来自于中国南海将军芋螺的芋螺毒素GeXXVIIA基因、由该基因编码的芋螺毒素GeXXVIIA前体肽和芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽以及该GeXXVIIA成熟肽的应用。
<芋螺毒素GeXXVIIA基因>
本发明的芋螺毒素GeXXVIIA基因是从中国南海将军芋螺(Conusgeneralis)中获得的，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该芋螺毒素GeXXVIIA基因至少有425bp。
<芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的前体肽>
由上述的芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的前体肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共含有74个氨基酸。
<芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的成熟肽>
芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的前体肽经过剪切后成为成熟肽，该成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，共含有41个氨基酸。
发明人在研究中发现：本发明的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的单体GeXXVIIA能够抑制乙酰胆碱受体的活性。该成熟肽对于肌肉型乙酰胆碱受体亚型α1β1δε和神经型乙酰胆碱受体的α9α10和α4β2亚型具有很强的抑制作用，对于神经型乙酰胆碱的α3β2、α3β4、α7和α4β4亚型则表现出了中度的抑制作用。
发明人在研究中还发现：芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码成熟肽的单体GeXXVIIA以线性肽的形式极强地抑制人源神经型乙酰胆碱受体α9α10亚型的活性，且半抑制浓度达到了16.2纳摩尔；与此同时，芋螺毒素GeXXVIIA单体的线性肽对肌肉型乙酰胆碱受体亚型α1β1δε也表现出了较高的抑制活性，达到了16.2微摩尔的水平；而相对于单体的线性肽的活性，芋螺毒素GeXXVIIA的不同折叠方式的单体对于这两种亚型的乙酰胆碱受体的抑制活性则降低了几倍到十几倍。考虑到芋螺毒素GeXXVIIA单体的氨基酸序列中含有较多的碱性氨基酸残基，因此将单体的线性肽酶切分成两个片段，结果显示这两个片段对于人源神经型乙酰胆碱受体α9α10和肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δε亚型的抑制活性均大幅低于全长的线性肽，说明芋螺毒素GeXXVIIA单体的线性肽的完整序列对于高效抑制乙酰胆碱受体的活性是十分重要的，并且这种高抑制活性是不依赖于半胱氨酸维持的空间结构的。目前为止发现的作用于乙酰胆碱受体的芋螺毒素中，没有不依赖于半胱氨酸维持的空间结构的。
<芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的成熟肽的应用>
因为芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的成熟肽的单体GeXXVIIA能够抑制乙酰胆碱受体，故可以被用来生产乙酰胆碱受体的抑制剂。能够被抑制的乙酰胆碱受体包括神经型乙酰胆碱受体或肌肉型乙酰胆碱受体。其中，神经型乙酰胆碱受体为α9α10乙酰胆碱受体亚型、α4β2乙酰胆碱受体亚型、α3β2乙酰胆碱受体亚型、α3β4乙酰胆碱受体亚型、α7乙酰胆碱受体亚型或α4β4乙酰胆碱受体亚型。肌肉型乙酰胆碱受体为α1β1δε乙酰胆碱受体亚型。
进一步地，因为芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的成熟肽的单体肽具有抑制乙酰胆碱受体的作用，所以可以被用来制成抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂，如制成治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物，或者治疗癌症的药物等。
神经系统疾病特指与乙酰胆碱受体相关的神经系统疾病，例如：神经痛型的神经系统疾病、成瘾症型的神经系统疾病、智障型的神经系统疾病、痴呆型的神经系统疾病、精神分裂症型的神经系统疾病、中枢神经紊乱型的神经系统疾病、癫痫症型的神经系统疾病、帕金森病型的神经系统疾病、精神病型的神经系统疾病、神经肌肉阻滞型的神经系统疾病、中毒型的神经系统疾病、重症肌无力型的神经系统疾病、抑郁症型的神经系统疾病、高血压型的神经系统疾病、高血脂型的神经系统疾病、炎症型的神经系统疾病、麻疯病型的神经系统疾病、心率不齐型的神经系统疾病、哮喘型的神经系统疾病、过敏症型的神经系统疾病、肌肉松弛型的神经系统疾病、糖尿病型的神经系统疾病、硬化症型的神经系统疾病、带状疱疹型的神经系统疾病、或中风型的神经系统疾病等。
其中，神经痛型的神经系统疾病表现为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛等症状。
成瘾症型的神经系统疾病表现为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾等症状。
中毒型的神经系统疾病表现为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒等。
炎症型的神经系统疾病表现为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎等。
癌症特指与乙酰胆碱受体相关的癌症，例如：乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤等。
以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：天然芋螺毒素GeXXVIIA的粗毒提取
天然的芋螺毒素GeXXVIIA提取自中国南海中收集到的将军芋螺(Conusgeneralis)，其粗毒提取方法包括如下步骤：
(1)、分离活体将军芋螺的毒液管组织，置于培养皿中；
(2)、用手术剪刀将毒液管剪碎(该操作在冰上进行)，加入25mL 0.1％TFA(纯水中含质量分数为0.1％的TFA)，将培养皿中被剪碎的毒液管冲洗至100mL小烧杯中；
(3)、将小烧杯放在冰上磁力搅拌30分钟，之后在4℃和12000g的条件下离心15min，收集上清液到500mL冻干瓶中，将沉淀用25mL 20％的乙腈(含0.1％TFA)抽提一次，然后在4℃和12000g的条件下离心15min，收集上清液并合并到500mL冻干瓶中，沉淀用同样的方法继续抽提三次，三次抽提所用到抽提液依次为30％的乙腈(含0.1％TFA)、40％的乙腈(含0.1％TFA)和50％的乙腈(含0.1％TFA)，每次抽提所获得的上清液均合并到500mL冻干瓶中；
(4)、冷冻干燥所得的上清液，用0.1％TFA溶解并分装到EP管中，冻存于-20℃备用。
实施例2：天然芋螺毒素GeXXVIIA的分离纯化
天然芋螺毒素GeXXVIIA的分离纯化方法包括如下步骤：取冻存于-20℃的粗毒样品，于4℃和12000g的条件下离心15min以去除沉淀，取上清液用高效液相色谱仪，疏水反相柱ZORBAX 300SB-C18(9.4×250mm)分离。分离纯化中使用的试剂及程序设定为：Buffer A由0.1％TFA与纯水配制，Buffer B由0.1％TFA与纯乙腈配制，检测波长为214nm和280nm，50分钟内Buffer B浓度从5％到55％，收集各组分并冷冻干燥。之后，收集到的组分会进一步经分析型ZORBAX 300SB-C18(4.6×250mm)反相柱纯化，得到纯的样品冻干备用。分离的结果如图1所示。如图1所示，ZORBAX 300SB-C18半制备反相柱，检测波长为214nm，流速为0.5mL/min，洗脱梯度：0-50min，5-55％Buffer B(Buffer A：0.1％TFA in water，BufferB：0.1％TFA in ACN)。图中‘★’表示GeXXVIIA的出峰位置。
实施例3：天然芋螺毒素GeXXVIIA的完整cDNA序列的制备
天然芋螺毒素GeXXVIIA的完整cDNA序列的制备方法为：从-80℃冰箱中取出将军芋螺的毒液管，迅速放入液氮预冷过的研钵中，并在液氮中小心研磨成粉末状，期间不断加入液氮；随后参照Trizol Total RNA Isolation Reagent Kit推荐的方法抽提总RNA，再通过3'-RACE和5’-RACE克隆出GeXXVIIA的完整cDNA序列。完整cDNA序列克隆的方法具体步骤如下：取两只0.5mL EP管(用DEPC水处理过)，加入8μl Rnase-free水，再加入2μl抽提所得的总RNA，加入1μl通用引物AP，在Superscript II逆转录酶的作用下进行第一链cDNA的合成，具体操作步骤参照Invitrogen 3’-RACE试剂盒推荐的方法。
设计引物
GSP1：5’-ATGTCNACNGGNACNAAYTAY-3’(Y：T/C,N：A/T/C/G)(“/”表示“或”)，3’-RACE上游简并引物1，对应于测序得到的N端序列MSTGTNY；
GSP2：5’-ATGAGYACNGGNACNAAYTAY-3’(Y：T/C,N：A/T/C/G)，3’-RACE上游简并引物2，对应于测序得到的N端序列MSTGTNY；
GSP3：5’-GCNYTNATGTCNACNGGNACN-3’，3’-RACE上游简并引物3，对应于测序得到的N端序列ALMSTGT；
GSP4：5’-GCNYTNATGAGYACNGGNACN-3’，3’-RACE上游简并引物4，对应于测序得到的N端序列ALMSTGT；
GSP5：5’-ACNGGNACNAAYTAYCGNYT-3’，3’-RACE上游简并引物5，对应于测序得到的N端序列TGTNYRL；
GSP6：5’-ACNGGNACNAAYTAYAGRYT-3’(Y：T/C,R：G/A,N：A/T/C/G)，3’-RACE上游简并引物6，对应于测序得到的N端序列TGTNYRL；
GSP7：5’-YTNCCNCCNACNACNTGY-3’，3’-RACE上游简并引物7，对应于测序得到的N端序列LPPTTC；
GSP8：5’-YTNCCNCCNACNAARTGY-3’，3’-RACE上游简并引物8，对应于测序得到的N端序列LPPTKC；
GSP9：5’-GCNYTRATGTCNACNGGNACNAAYTAY-3’，3’-RACE上游简并引物9，对应于测序得到的N端序列ALMSTGTNY；
GSP10：5’-GCNYTRATGAGYACNGGNACNAAYTAY-3’，3’-RACE上游简并引物10，对应于测序得到的N端序列ALMSTGTNY；
GSP11：5’-CACAGGTATGGATGACTCAGG-3’，根据3’-RACE得到的3’端cDNA设计的基因特异性反义引物1，对应于3’-非翻译区的一段基因序列CCTGAGTCATCCATACCTGTG；
GSP12：5’-CCAGCTCTATACGCACGCATCC-3’，根据3’-RACE得到的3’端cDNA设计的基因特异性反义引物2，对应于芋螺肽的C端序列DACV；
AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’，3’-RACE下游通用引物；
Signal primer：5’-CATCGTCAAGATGAAACTGACG-3’，Mik41的信号肽对应的一段基因序列。
3’-RACE步骤：使用以上合成的多条简并引物中靠近N端的外侧引物GSP9/10与TaKaRa3’-RACE试剂盒提供的Outer primer进行第一轮PCR反应，退火温度为55℃。如果第一轮PCR反应未能得到目的产物，再使用上游内围引物GSP1/2与试剂盒中的Inner primer配对以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，退火温度为52℃，最终得到芋螺毒素GeXXVIIA对应基因的3’-端序列。
由于芋螺毒素中同家族的信号肽非常保守，我们利用已知的MiK41的信号肽序列对应的引物与3’-端特异性反义引物配对进行PCR扩增，最终得到芋螺毒素GeXXVIIA完整的cDNA序列。
芋螺毒素GeXXVIIA的完整cDNA序列如图2所示。图2中阴影部分显示的是信号肽序列，带下划线的为成熟肽，中间部分为Pro区，终止密码子用星号(*)表示。
实施例4：芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体的体外氧化折叠
发明人在研究中发现：在自然界中，芋螺毒素GeXXVIIA基因所编码的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽可以自发地形成含有5对二硫键的同源二聚体，且每个单体含有5个半胱氨酸残基。然而天然的GeXXVIIA在毒液中所占的比重极小，无法满足结构与功能的研究，必须借助化学合成线性GeXXVIIA并在体外氧化折叠的方法。
在本发明中，通过对化学合成的GeXXVIIA的体外氧化折叠条件的摸索，最终确定氧化折叠条件为：在含有50mMTris-HCl,pH 8.0,400mM arginine,0.02mM DTT和0.3mM氧化型DTT的缓冲液中，加入20μM合成的GeXXVIIA，于4℃反应一周，得到芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体的4种已折叠的同分异构体，即m1、m2、m3和m4。所得到的GeXXVIIA单体肽的4种同分异构体的洗脱曲线如图3所示。图3中，m1、m2、m3和m4分别表示不同的同分异构体。图3的横坐标表示洗脱时间(time)，纵坐标表示OD值(214nm)。
实施例5：芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的单体肽衍生物的制备
发明人在研究中发现：芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体的4种同分异构体(GeXXVIIAm1-m4)对乙酰胆碱受体的抑制活性十分相似，例如，它们均可较强地抑制神经型α9α10和肌肉型α1β1δγ乙酰胆碱受体亚型，这说明芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体中的二硫键可能不参与到与受体的相互作用过程中。因此，有必要将单体中的半胱氨酸用修饰剂保护起来进而检测其对于受体的活性。
在本发明中，将合成的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体中的5个半胱氨酸全部用10μM碘乙酰胺(IAA)修饰，使得它们无法自发的形成二硫键，得到Cys封闭的GeXXVIIA-L。同时，考虑到芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽单体的序列中包含多个碱性氨基酸，因此使用Asp-N酶将GeXXVIIA-L酶切成为两个片段，分别为GeXXVIIA-L-Nter和GeXXVIIA-L-Cter，并使用高效液相色谱进行分离纯化，最后得到这两个酶切后的片段。酶切后的两个片段如图4和图5所示。
实施例6：芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的单体和衍生物的生物学活性测定
为了精确测定芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的单体GeXXVIIAm和衍生物GeXXVIIA-L、GeXXVIIA-L-Nter/Cter对乙酰胆碱受体亚型(nAChR subtype)的选择性，本发明采用电生理实验测试二者对爪蟾卵母细胞表达的神经型乙酰胆碱受体α9α10亚型、α7亚型、α3β2亚型、α3β4亚型、α4β2亚型、α4β4亚型和肌肉型乙酰胆碱受体α1β1δγ的作用。
电生理实验的具体步骤如下所示：将乙酰胆碱受体的不同亚型分别表达在非洲爪蟾的卵母细胞表面，用双电极电压钳方法纪录加入乙酰胆碱时引起的乙酰胆碱受体开放所产生的电流。加入不同浓度的芋螺毒素GeXXVIIA单体和线形肽衍生物GeXXVIIA-L、GeXXVIIA-L-Nter/Cter时，乙酰胆碱受体产生的电流会受到不同程度的抑制。将抑制程度对不同的芋螺毒素的浓度作图，用以下方程拟合即可得到半抑制浓度IC50：
Ex＝EmaxXnH/(XnH+IC50 nH)
电生理实验的测试结果如表1和图6、图7、图8所示。图中的纵坐标表示Relativecurrent amplitude。
表1电生理实验的测试结果表
表1的h表示human，即乙酰胆碱受体为人源，r表示rat，即乙酰胆碱受体为大鼠源。由表1的数据可知，芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽的单体衍生物GeXXVIIA-L可以与多种乙酰胆碱受体亚型相互作用，其中对神经型乙酰胆碱受体亚型α9α10具有极强的拮抗作用，IC50可以达到纳摩尔每升水平；对肌肉型乙酰胆碱受体亚型α1β1δγ的作用较强，达到了微摩尔每升水平；对α4β2亚型的作用适中；对α3β2、α3β4、α7和α4β4的作用较弱。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 同济大学 伍伦贡大学
<120> 芋螺毒素GeXXVIIA的基因、多肽及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 425
<212> DNA
<213> Conusgeneralis
<400> 1
catcgtcaag atgaaactga cgtgcgtgtt gatcatcacc gtgctgttcc tgacggcctg 60
tcaactcact acagctgtga cttactccag aggtgagcat aagcatcgtg ctctgatgtc 120
aactggcaca aactacaggt tgctcaagac atgccgtggt tccggtcgtt attgtcgctc 180
accttatgat tgccgcagaa gatattgcag acgcatttcg gatgcgtgcg tatagagctg 240
gtctggcgtc tgatattccc cttctgtgct ctatcccctt ttgcctgagt catccatacc 300
tgtgagtgat catgaaccac tcaataccta ctgctctgga ggcttcagag gaactacatt 360
gaaataaaac cgcattgcaa tgaaaaaaaa aaacctatag tgaaatcact agtggaggat 420
ccgcg 425
<210> 2
<211> 74
<212> PRT
<213> Conusgeneralis
<400> 2
Met Lys Leu Thr Cys Val Leu Ile Ile Thr Val Leu Phe Leu Thr Ala
1 5 10 15
Cys Gln Leu Thr Thr Ala Val Thr Tyr Ser Arg Gly Glu His Lys His
20 25 30
Arg Ala Lys Met Ser Thr Gly Thr Asn Tyr Arg Leu Leu Lys Thr Cys
35 40 45
Arg Gly Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Cys Arg Arg Arg
50 55 60
Tyr Cys Arg Arg Ile Ser Asp Ala Cys Val
65 70
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> Conusgeneralis
<400> 3
Ala Lys Met Ser Thr Gly Thr Asn Tyr Arg Leu Leu Lys Thr Cys Arg
1 5 10 15
Gly Ser Gly Arg Tyr Cys Arg Ser Pro Tyr Asp Cys Arg Arg Arg Tyr
20 25 30
Cys Arg Arg Ile Ser Asp Ala Cys Val
35 40
Claims (10)
1.一种来自于中国南海将军芋螺的芋螺毒素GeXXVIIA基因，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种由权利要求1所述的芋螺毒素GeXXVIIA基因编码的芋螺毒素GeXXVIIA前体肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种由权利要求1所述的芋螺毒素GeXXVIIA基因编码的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求3所述的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽在抑制乙酰胆碱受体中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述乙酰胆碱受体为神经型乙酰胆碱受体或肌肉型乙酰胆碱受体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述神经型乙酰胆碱受体为α9α10乙酰胆碱受体亚型、α4β2乙酰胆碱受体亚型、α3β2乙酰胆碱受体亚型、α3β4乙酰胆碱受体亚型、α7乙酰胆碱受体亚型或α4β4乙酰胆碱受体亚型；或者，所述肌肉型乙酰胆碱受体为α1β1δε乙酰胆碱受体亚型。
7.如权利要求3所述的芋螺毒素GeXXVIIA成熟肽在制备用于抑制乙酰胆碱受体的药物或试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述用于抑制乙酰胆碱受体的药物为治疗神经系统疾病的药物、预防神经系统疾病的药物或治疗癌症的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述神经系统疾病为神经痛型、成瘾症型、智障型、痴呆型、精神分裂症型、中枢神经紊乱型、癫痫症型、帕金森病型、精神病型、神经肌肉阻滞型、中毒型、重症肌无力型、抑郁症型、高血压型、高血脂型、炎症型、麻疯病型、心率不齐型、哮喘型、过敏症型、肌肉松弛型、糖尿病型、硬化症型、带状疱疹型、或中风型；或者，所述癌症为乳腺癌、肺癌、或骨髓瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述神经痛型为坐骨神经痛、三叉神经痛、淋巴神经痛、多点运动神经痛、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、或复合神经痛；或者，所述成瘾症型为酒精成瘾、毒品成瘾、烟碱成瘾、吗啡成瘾、或可卡因成瘾；或者，所述中毒型为酒精中毒、药物中毒、或工业污染中毒；或者，所述炎症型为脉管炎、血管炎、肝炎、莱姆关节炎、或感觉神经束膜炎。
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| GR01 | Patent grant | ||
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