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CN116814824A - 大豆疫霉抗性鉴定的kasp分析标记及应用 - Google Patents

大豆疫霉抗性鉴定的kasp分析标记及应用 Download PDF

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CN116814824A
CN116814824A CN202210310440.1A CN202210310440A CN116814824A CN 116814824 A CN116814824 A CN 116814824A CN 202210310440 A CN202210310440 A CN 202210310440A CN 116814824 A CN116814824 A CN 116814824A
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soybean
fluorescent
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郭娜
樊兴杏
孙睿东
赵晋铭
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Nanjing Agricultural University
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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体公开了一种用于大豆抗疫霉根腐病抗性鉴定的KASP分子标记及应用。所述KASP分子标记引物序列如上游引物SEQ ID No.1(连接FAM荧光标签)、上游引物SEQ ID No.2(连接VIC荧光标签)和通用下游引物SEQ ID No.3所示，该KASP分子标记能够实现对大豆疫霉根腐病抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型，鉴定检测有效性高达98.55％，准确度达到84.80％。

Description

大豆疫霉抗性鉴定的KASP分析标记及应用
技术领域
本发明属于农业生物学技术领域，特别涉及大豆疫霉根腐病抗性鉴定的KASP分子标记及应用。
背景技术
大豆起源于中国，又称黄豆，素有“田中之肉”、“绿色牛乳”之名，是主要的饲料和粮油作物，大豆的深加工产品深受人们的喜爱。大豆疫霉根腐病，又称大豆疫病，是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)引起的严重危害大豆生产的毁灭性土传病害之一。大豆疫霉根腐病在我国黄淮海地区、长江流域等均有发生，可引起大豆根茎部腐烂、幼苗死亡，田间缺苗断垄，豆荚发育不良，空荚、瘪荚较多，种皮、胚和子叶均可带菌。
目前，防治大豆疫霉根腐病的方法，主要有：利用抗性大豆品种、喷施真菌杀菌剂、改良土壤排水状况、更改耕作栽培方式及使用含钙化合物等措施。其中，培育和种植抗性大豆品种是最有效、环保的防治措施。因此，筛选抗性资源、发掘新的抗病基因、阐明大豆疫霉根腐病抗性的遗传与分子机制十分必要。
传统的表型鉴定存在一定的局限性：耗时长，易受环境的影响，并且由于该菌的土传特性不能在大田中进行直接接种鉴定等缺点。鉴于目前大豆对大豆疫霉菌抗性表型鉴定的不足，开发新型的与疫霉根腐病抗性高通量筛选大豆抗性种质的分子标记，指导大豆的抗性育种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于大豆疫霉根腐病抗性鉴定的KASP分子标记及应用，从而实现对大豆疫霉根腐病抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型，能够在大豆苗期筛选具有大豆疫霉根腐病抗性的植株，从而加速育种进程。
为实现上述目的，本发明提供与大豆疫霉根腐病抗性紧密相关的KASP分子标记引物对，所设计的KASP分子标记引物对包括连接第一荧光标签的上游引物SEQ ID No.1、连接第二荧光标签的上游引物SEQ ID No.2和通用下游引物SEQ ID No.3。
本发明所述的第一荧光标签和第二荧光标签可以选择荧光PCR领域常用的荧光标签，确保二者不同即可，例如在一些实施例中，第一荧光标签为FAM荧光标签，第二荧光标签为VIC荧光标签；或者在另一些实施例中，第一荧光标签为VIC荧光标签，第二荧光标签为FAM荧光标签。
本发明还提供所述的KASP分子标记引物对在鉴定大豆疫霉根腐病抗性或易感性种质中的应用；仅检测到连接SEQ ID No.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接SEQ ID No.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。
本发明还提供所述的KASP分子标记引物对在大豆疫霉根腐病抗性或易感性早期鉴定和筛选的分子育种中的应用；仅检测到连接SEQ ID No.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性品种；仅检测到连接SEQ ID No.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性品种。
另一方面，本发明还提供了一种鉴定大豆疫霉根腐病抗性的方法，通过提取大豆基因组DNA，用连接第一荧光标签的SEQ ID No.1、连接第二荧光标签的SEQ ID No.2和SEQID No.3所示的KASP标记引物对提取的基因组DNA进行竞争性等位基因特异性PCR扩增；荧光PCR仅检测到连接SEQ ID No.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性品种；仅检测到连接SEQ ID No.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性品种。所述的第一荧光标签和第二荧光标签如前所述。
本发明所采用的PCR扩增方法可以按照本领域的常规方法，在一些实施例中，本发明所述PCR扩增方法为：
PCR反应体系：DNA2.5μL(浓度在10ng/μL左右)、SEQ 2X PCR mix 0.5μL、SEQ FLu-Arms 2X PCR Mix 5μL、ddH2O 2μL。
PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s、61-55℃梯度PCR，每次循环60s，每次降低0.6℃，共计10个循环；95℃复性20s、55℃复性及扩增60s，共35个循环。
所述的KASP 2X PCR mix包括上游引物SEQ ID No.1(连接FAM荧光标签)、上游引物SEQ ID No.2(连接VIC荧光标签)和通用下游引物SEQ ID No.3。
进一步，所述KASP 2X PCR mix的配制：所设计的上游引物SEQ ID No.1、上游引物SEQ ID No.2和通用下游引物SEQ ID No.3用TE(pH 8.0)溶解至50μM，然后按照SEQ IDNo.1：SEQ ID No.2：SEQ ID No.3＝1:1:3的比例混合后上机，每10μL反应体系加0.5μLKASP 2X PCR mix。
再一方面，上述的大豆疫霉抗性鉴定的KASP分子标记在大豆疫霉抗性鉴定中的应用。
进一步，所述鉴定方法如下：
(1)获得待测样品基因组DNA
(2)以基因组DNA为模板，利用权力要求1所述的KASP分子标记引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；
(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而鉴定出待测个体的疫霉抗性。
另一方面，上述的大豆疫霉抗性鉴定的KASP分子标记在辅助大豆育种中的应用。
与现有的技术相比，本发明具有如下改进之处：
1、在抗性基因附近开发紧密连锁的KASP分子标记。该标记应用到高通量技术可以实现大豆的疫霉抗性高效率、快速的鉴定及基因分型。在大豆苗期就能够及早鉴别大豆疫霉抗性植株。
2、通过对224份来源于中国大豆微核心种质资源，具有较高的遗传变异和较高的代表性，进行KASP基因分型，成功分型的个体有204个，鉴定准确的个体有173个，疫霉抗性鉴定检测有效性达98.55％，准确度达到84.80％，检测成功率高，抗性鉴定准确度高，对大豆疫霉抗性鉴定具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
1、遗传群体构建：利用抗W210疫霉菌株南农10-1与对W210疫霉菌株表现感病的Williams该组合的F1种子自交产生F2种子，F2通过自交并单株收获得到相应的F2:3家系。按顺序选取其中167个F2:3家系接种与JS12毒力公式相同的大豆疫霉菌株W210(vir.1a，1b，1c，1d，1k，2，3a，3b，3c，4，5，6，7)后，41个鉴定为抗病家系，80个为抗、感分离的杂合家系，46个为感病家系。通过卡平方检验，符合1:2:1的期望分离比，表明南农10-1对大豆疫霉W210的抗性是由一个显性单基因控制，与先前接种大豆疫霉菌株JS12的结果一致。选择18号染色体已经公布的多态性SSR标记，和基于亲本间全基因组重测序鉴定和开发的多态性KASP标记，用这些标记鉴定167个F2:3家系的基因型。对167个F2:3家系的表型和基因型结果进行连锁分析表明抗疫霉病基因定位在标记KASP1和KASP2之间，与RpsJS为同一个基因。利用KASP1和KASP2，对分离群体的1893个F2单株进行基因分型，共获得12个重组单株。进一步在定位区间内等距离开发标记KASP3、4、5、6、7并对重组体进行基因分型，结合表型鉴定结果将RpsJS精细定位KASP5与KASP6之间，物理距离22.8kb处。
实施例2
1、在精细定位后的物理距离为22.8kb的范围设计紧密连锁的分子标记，开发出能成功用于基因分型的KASP分子标记，具体过程及引物序列信息如下：
KASP标记：5’末端连上FAM荧光标签接头序列的SEQ ID NO.1(GTAGAAATTGATATGCAATGTAAACCTAC)和5’末端连上VIC荧光标签接头序列的SEQ ID NO.2(AAGTAGAAATTGATATGCAATGTAAACCTAT)，作为其KASP FAM上游引物(FAM Forwardprimer,5’-3’)和VIC上游引物(VIC Forwardprimer,5’-3’)。通用下游引物(Reverse primer,5’-3’)序列为SEQ ID NO.3(TCCATGTAGAGGAGATTGCCATAAACATT)
2、224份待测微核心大豆种质每份取12粒种子播种于以蛭石为基质的塑料杯中，25℃、14h光照/10h黑暗培养。待大豆生长至第一对真叶平展，选取1cm2左右的嫩叶，利用DNA提取试剂盒提取样本DNA并编号保存，同时选取长势一致的幼苗用于接种。用消毒后的手术刀在大豆下胚轴下方1cm处轻划一伤口，在培养7d左右的菌株菌落外缘割取带有菌丝体的培养基嵌入伤口中，接种后保湿24h，后转入温室培养，恢复正常条件生长。接种后第7d左右进行病情调查，试验以Williams作为感病对照，重复鉴定3次。
3、分子标记检测：(1)PCR反应体系：DNA2.5μL(浓度在10ng/μL左右)、KASP2X PCRmix 0.5μL、GUDE FLu-Arms 2X PCR Mix(广州固德生物技术有限公司)5μL、ddH2O 2μL。所述KASP 2X PCR mix的配制：所设计的上游引物SEQ ID No.1、上游引物SEQ ID No.2和通用下游引物SEQ ID No.3用TE(pH 8.0)溶解至50μM，然后按照上游引物SEQ ID No.1：上游引物SEQ ID No.2：通用下游引物SEQ ID No.3＝1:1:3的比例混合后上机，每10μL反应体系加0.5μL KASP 2X PCR mix。(2)PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s、61-55℃梯度PCR，每次循环60s,每次降低0.6℃，共计10个循环；95℃复性20s、55℃复性及扩增60s，共35个循环。(3)分子标记检测步骤：用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒提取抗病南农10-1和感病Williams以及224份微核心种质资源的基因组DNA，以每个材料样本基因组DNA为模板，将样品DNA浓度调至同一浓度(约500ng/μL)取2.5μL分装到PCR96孔板相应位置设置空白对照，对96孔PCR反应板进行封膜，震荡，离心，保证反应体系混合均匀。以KASP标记引物进行PCR扩增，PCR结束后，读取PCR数据(所用荧光定量PCR仪为CFX ConnectTM Real-TimeSystem，由BIO-RAD公司生产)。
4、利用软件Bio Rad CFX Maestro进行数据分析，在图像坐标上，被FAM荧光序列标签的等位基因数据聚合在接近Y轴的位置，而被VIC荧光序列标签的等位基因数据聚合在接近X轴的位置，其中靠近X轴的位置基因分型为TT，为大豆疫霉根腐病易感性品种，接近Y轴的位置的基因分型为CC，为大豆疫霉根腐病抗性品种，获得的结果见表1，Undetermined表示检测失败，NA表示数据或材料缺失。
表1：标记分型及大豆疫霉根腐病抗性鉴定结果
由表1可知通过基因分型对大豆疫霉根腐病抗性预测，并通过试验结果验证，224份个体成功分型的个体有204个，鉴定准确的个体有173个，疫霉抗性鉴定检测有效性达98.55％，准确度达到84.80％，检测成功率高，抗性鉴定准确度高。
综上所述，本发明的大豆疫霉根腐病抗性鉴定的KASP分子标记对大豆疫霉根腐病抗性鉴定及基因分型高效、准确、低成本。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 大豆疫霉抗性鉴定的KASP分析标记及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtagaaattg atatgcaatg taaacctac 29
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtagaaat tgatatgcaa tgtaaaccta t 31
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccatgtaga ggagattgcc ataaacatt 29

Claims (10)

1.与大豆疫霉根腐病抗性紧密相关的KASP分子标记引物对，其特征在于包括连接第一荧光标签的上游引物SEQ ID No.1、连接第二荧光标签的上游引物SEQ ID No.2和通用下游引物SEQ ID No.3。
2.根据权利要求1所述的分子标记引物对，其特征在于第一荧光标签为FAM荧光标签，第二荧光标签为VIC荧光标签。
3.根据权利要求1所述的分子标记引物对，其特征在于第一荧光标签为VIC荧光标签，第二荧光标签为FAM荧光标签。
4.权利要求1～3任一项所述的KASP分子标记引物对在鉴定大豆疫霉根腐病抗性或易感性中的应用；仅检测到连接SEQ ID No.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接SEQ ID No.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。
5.权利要求1～3任一项所述的KASP分子标记引物对在大豆疫霉根腐病抗性或易感性早期鉴定和筛选的分子育种中的应用；仅检测到连接SEQ ID No.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接SEQ ID No.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。
6.一种鉴定大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于：提取大豆基因组DNA，用连接第一荧光标签的SEQ ID No.1、连接第二荧光标签的SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的KASP分子标记引物对提取的基因组DNA进行竞争性等位基因特异性PCR扩增；荧光PCR仅检测到连接SEQ ID No.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接SEQID No.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。
7.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于：第一荧光标签为FAM荧光标签，第二荧光标签为VIC荧光标签。
8.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于：第一荧光标签为VIC荧光标签，第二荧光标签为FAM荧光标签。
9.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于，PCR反应体系：浓度在8～12ng/μL的DNA 2.5μL、KASP 2X PCR mix 0.5μL、GUDE FLu-Arms 2X PCR Mix 5μL、ddH2O 2μL；上游引物SEQ ID No.1：上游引物SEQ ID No.2：通用下游引物SEQ ID No.3按照1:1:3的比例混合而成，每10μL反应体系加0.5μL KASP 2X PCR mix。
10.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于，PCR反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s、61-55℃梯度PCR，每次循环60s，每次降低0.6℃，共计10个循环；95℃复性20s、55℃复性及扩增60s，共35个循环。
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