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CN116516054A - 一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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CN116516054A CN202310644983.1A CN202310644983A CN116516054A CN 116516054 A CN116516054 A CN 116516054A CN 202310644983 A CN202310644983 A CN 202310644983A CN 116516054 A CN116516054 A CN 116516054A
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李宝
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Abstract

本发明属油菜遗传育种技术领域。具体涉及一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供的一种矮秆位点BnaA03g36950D的特异KASP分子标记KASP分子标记引物合，且本发明提供的KASP分子标记在大田BC1F1群体中能一一对应，避免实验过程中的误差。相对于表型鉴定和SSR标记鉴定，本发明提供的KASP标记分析方法具有成本低、准确性高、快速、操作自动化程度高等显著优点，为后续品种定向改良提供了高效的辅助选择分子标记。本发明还公开了一种开发矮秆基因位点BnaA03g36950D的特异KASP标记方法及其在观赏型油菜新品种改良中的应用。

Description

一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及油菜分子育种领域，具体涉及一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
油菜易于栽培管理，能在我国大部分地区顺利越冬；甘蓝型油菜品种花色鲜艳、花期较长，具有较高的观赏价值；盆栽型油菜在冬季可作为绿植，春季用于观花，为改善我国冬季城市景观单调乏味、缺少生机提供更多选择。然而一般的甘蓝型油菜株型较高容易倒伏、室内种植易形成高脚苗，且在开花期存在分枝和花稀疏等特征，不适合室内或阳台盆栽，急需选育具有紧缩株型，以及兼具叶片和花器官美观，分枝和花着生密集等其他适合阳台和城市绿化栽培观赏特征的品种。
杂交油菜株高整体增加，导致油菜抗倒伏能力下降，油菜倒伏后有效光合作用减少，籽粒灌浆受阻，产量和品质严重降低株高是植物的重要农艺性状，降低株高可以提高作物产量和收获指数。此外，Islam和Evans研究发现，甘蓝型油菜倒伏导致每果粒数下降17.5％，种子产量下降了16.2％。此外，倒伏后增加收获难度，致使损失更大。
在现有矮秆材料中，带有BnaA03g36950D基因位点的甘蓝型材料具有株型皱缩以及兼具叶片和花器官美观等特点，具有选育为盆栽观赏型油菜品种的潜力，但该材料存在抗病性差、自交结实率低等问题，因此需要进一步改良。
分子标记辅助选择是目前油菜育种的有效手段，育种家可以通过分子标记辅助选择实现对目标基因的选择，大大提高育种的准确度及缩短育种年限，而缺乏相关可高通量基因分型的分子标记在一定程度上限制了该位点在此类矮秆型甘蓝型油菜改良中的应用。
SNP芯片技术作为一种高通量、低成本的基因自动分型检测方法，目前已被广泛用于小麦和油菜等多倍体作物的育种学研究。利用SNP芯片可快速检测两个不同材料在目标区段的差异SNP位点。进一步将这些SNP位点与竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele-Specific PCR，KASP)结合，可实现目标位点的高效、低成本和高通量检测。甘蓝型油菜作为异源四倍体，受同源序列位点的干扰，仅根据目标位点附近的SNP分子标记进行KASP分子标记的开发难度大，成功率较低。
发明内容
为了提供一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的基于SNP的KASP标记，本发明提供以下技术方案：
一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A03号染色体的第17985410bp碱基处，多态性为A或G；或者位为SEQ ID NO.1所示序列的第61碱基处，多态性为A或G。
一种检测SNP分子标记的KASP分子标记引物，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A03号染色体的第17985410bp碱基处，多态性为A或G；或者位为SEQ ID NO.1所示序列的第61位碱基处，多态性为A或G。
优选地，所述KASP分子标记引物包括正向引物1、正向引物2和第一通用反向引物；
所述正向引物1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCG-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述正向引物2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCA-3’，如SEQ ID NO:4所示；
所述第一通用反向引物：
5’-ATCCATTGTTGTTCACTCTTTCCATT-3’，如SEQ ID NO:5所示。
优选地，所述正向引物1或者所述正向引物2的序列5’端还包括FAM和HEX荧光接头序列。
一种试剂盒，所述试剂盒包括根据甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记设计的KASP分子标记引物。
一种基因芯片，所述基因芯片包括根据甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记设计的KASP分子标记引物。
一种SNP分子标记或所述KASP分子标记引物或所述试剂盒或所述基因芯片在油菜品种转育中的应用。
一种SNP分子标记或所述KASP分子标记引物或所述试剂盒或所述基因芯片在油菜分子标记辅助选择育种中的应用。
优选地，所述油菜为具有矮秆性状的甘蓝型油菜。
本发明的有益效果：
本发明公开一种SNP分子标记，及其根据SNP分子标记设计的KASP分子标记引物，具有快速、特异性强、灵敏度高的显著优点，且本发明提供的KASP分子标记引物在大田BC1F1群体中能一一对应，避免实验过程中的误差，可应用于筛选、鉴定或改良甘蓝型油菜株高或具有观赏性的紧凑型矮秆品种。本发明基于SNP技术开发出一种观赏型甘蓝型油菜矮秆基因位点BnaA03g36950D的KASP分子标记设计方法，实现快速、准确地检测油菜的株型位点，同时开发的KASP分子标记可实现目标位点的高效、低成本、高通量的鉴定，简化及加快观赏型矮秆油菜选育的过程。
附图说明
图1是实施例1中BN900084.K01分子标记的开发示意图；
图2是实施例2中BN900084.K01分子标记群体验证示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A03号染色体的第17985410bp碱基处，多态性为A或G；或者位为SEQ ID NO.1所示序列的第61碱基处，多态性为A或G，所述SNP分子标记核苷酸序列为：GAGAGAGGGAGAAAGAAGAGAGAGCATGGGGTGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAA GGC[A]GCATGTATAAATGGAAAGAGTGAACAACAATGGATGACCAAAGAGAGATTTTAT TTACAA(SEQ ID NO.1)；或GAGAGAGGGAGAAAGAAGAGAGAGCATGGGGTGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAA GGC[G]GCATGTATAAATGGAAAGAGTGAACAACAATGGATGACCAAAGAGAGATTTTAT TTACAA(SEQ ID NO.2)。
一种基于矮秆基因BnaA03g36950位点的KASP分子标记引物，包含分子标记KASP分子标记引物，该KASP分子标记引物包括：正向引物1、正向引物2和第一通用反向引物，具体是：
正向引物1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCG-3’，如SEQ ID NO:1；
正向引物2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCA-3’，如SEQ ID NO:4；
第一通用反向引物：
5’-ATCCATTGTTGTTCACTCTTTCCATT-3’，如SEQ ID NO:5；
上述KASP分子标记引物的获取方式如下：
一、差异与矮秆性状共分离的差异SNP获得，具体是：
1、分离群体构建：以纯合的甘蓝型矮秆油菜品种FL1号为父本，以待转育油菜品系20B为母本，进行杂交获得F1，进一步将F1与20B回交获得BC1F1群体。
2、DNA提取，详情如下：①取约2段1.5cm长叶片或种子至1.3mL的96孔板中，将96孔板置于-80℃冰箱4小时或以上；②将1.3mL96孔板至于烘箱中，65℃烘干10小时或以上，烘干结束后，取出1.3mL96孔板，向1.3mL 96孔板每孔中加入2颗4mm钢珠；③迅速封上硅胶膜，置于genogrinder 2010中，转速调至1500rpm并研磨1分钟，效果不好时可适当延长研磨时间，研磨后置于深孔板离心机中瞬离，将磨碎组织离心到孔底；④取出96孔板，小心撕开硅胶板，每孔加含Tris-HCl的提取液500uL，随后盖上新的硅胶板并将1.3mL96孔板置于漩涡振荡器上适当振荡；⑤将96孔板置于调温至75℃的烘箱中温浴约40分钟；⑥温浴结束后取出96孔板，将其于深孔板冷冻离心机中，转速调至4000rpm温度调至室温，离心10分钟；⑦离心结束后，取出96孔板，抽取上清液190uL至另一块预加190uL异丙醇的0.8mL 96孔板，并封上硅胶膜，于漩涡振荡器上振荡数次，后将其置于-20℃冰箱沉淀1小时或以上；⑧取出96孔板置于深孔板冷冻离心机中，转速调至4000rpm温度调至4℃并离心10分钟；⑨去掉上清液并将96孔板置于65℃烘箱中30分钟将其烘干；⑩取出96孔板，每孔加500uL超纯水，盖上硅胶盖，于漩涡振荡器上振荡数次，后置于室温下过夜，隔夜即可使用。
3、纯合的甘蓝型油菜矮秆位点的差异SNP标记的获取，具体是：
以20B、ZS11等高秆甘蓝型油菜为对照，通过50K油菜专用型芯片与矮秆材料FL1进行分析比对：将样本在37℃进行扩增，DNA片段化与纯化，95℃变性，48℃杂交，单碱基延伸，扫描并获取基因型。HiScan扫描获取图片后，使用GenomeStudio软件(Illumina Inc.,SanDiego,CA,USA)获取基因型数据并进一步分析。
得到基因型数据后，利用Excel(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)的IF函数进行多态性SNP筛选。筛选的标准为：(1)在2个常规高秆甘蓝型油菜中基因型一致；(2)矮秆FL1与高秆20B之间存在多态性差异；(3)以与矮秆基因位点BnaA03g36950位置为标准，筛选位于该位点上下游120Kb左右的SNP。根据以上标准，筛选到8个有差异SNP，详见表1：
表1 8个差异SNP标记统计表
名称 染色体 位置 FL1 20B ZS11
Bn-A03-p16079386 chrA03 15178485 AA CC CC
Bn-A03-p16405269 chrA03 15546889 AA CC CC
Bn-A03-p16444510 chrA03 15580412 GG AA AA
Bn-A03-p17985410 chrA03 16992552 GG AA AA
Bn-A03-p18762984 chrA03 17780298 GG AA AA
Bn-A03-p18770617 chrA03 17789072 AA GG GG
Bn-A03-p19198939 chrA03 18147813 GG AA AA
Bn-A03-p19252196 chrA03 18215419 AA CC CC
二、KASP分子标记开发
选取SNP所示，为：SNP：Bn-A03-p17985410，位于染色体chrA03上16992552位置处，[G/A]，BN900084。
以上进行KASP分子标记开发，得到特异性引物，然后在特异性引物5’端分别加上FAM和HEX荧光接头序列，选择PAGE或者iPAGE的纯化方式，最终获得KASP分子标记引物A和KASP分子标记引物B。
本实施例在KASP标记开发过程中，利用17份FL1、10份20B和4份ZS11，以及FL1与20B进行杂交的F2后代，验证标记Assay分型情况，具体是：
按照表2说明进行KASP反应检测使用：
表2KASP反应检测条件
Touchdown PCR反应条件为：
①94℃，15m；②95℃，20s；③65℃-56℃，60s；(第②和第③两个步骤进行10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃)④94℃，20s；⑤57℃，60s。(第④和第⑤两个步骤进行30个循环)。
三、分离群体大田种植与株高鉴定
应用本实施例的KASP分子标记引物进行大田验证，具体操作如下：
将亲本材料FL1、20B及其构建的F2代分离群体种植于湖南省农业科学院作物研究所马坡岭试验田内，苗期取新鲜叶片对KASP标记BN900084进行验证(详见图1)，以结荚后大田株高测量结果作为对照，检测的94个样品，纯合G:G位点的17个单株平均株高102cm，纯合A:A位点单株株高171.3cm，杂合G:A位点的平均株高134.5cm，无检测值3株。亲本FL1平均株高100.4cm，20B平均株高180.5cm，检测结果与株高一一对应。
表3BN900084及对照亲本的检测结果
实施例2：
采用如实施例1中所述的KASP分子标记KASP分子标记引物(BN900084.K01)，对亲本材料FL1、20B及其以20B为回交亲本构建的回交1代分离群体在青海省农科院试验大田进行验证。共检测了120个单株且在成熟期测量株高，并进行一一比对，其中获得纯合A：A位点单株67株，平均株高139.0cm，杂合G：A位点45株，平均株高96.6cm，无检测值2株。当地亲本FL1株高79.5cm，20B株高145cm，检测结果与株高性状一一对应。
表4BN900084的检测结果与成熟期株高性状
实施例3：
采用如实施例1、实施例2中所述KASP分子标记引物在矮秆观赏型甘蓝型油菜育种改良中的应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种与甘蓝型油菜矮秆性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于甘蓝型油菜基因组Brassica napus V4.1版本的A03号染色体的第17985410bp碱基处，多态性为A或G；或者所述SNP分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种检测权利要求1所述的SNP分子标记的KASP分子标记引物。
3.根据权利要求2所述的KASP分子标记引物，其特征在于，所述KASP分子标记引物包括正向引物1、正向引物2和第一通用反向引物；
所述正向引物1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCG-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述正向引物2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAAAATTAGGTATGATGAGAAGGCA-3’，如SEQ ID NO:4所示；
所述第一通用反向引物：
5’-ATCCATTGTTGTTCACTCTTTCCATT-3’，如SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要3所述的KASP分子标记引物，其特征在于，所述正向引物1或者所述正向引物2的序列5’端还包括FAM和HEX荧光接头序列。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2-4任一所述的KASP分子标记引物。
6.一种基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括如权利要求2-4任一所述的KASP分子标记引物。
7.权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2-4任一所述的KASP分子标记引物或权利要求5所述试剂盒或权利要求6所述的基因芯片在油菜品种转育中的应用。
8.权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2-4任一所述的KASP分子标记引物或权利要求5所述试剂盒或权利要求6所述的基因芯片在油菜分子标记辅助选择育种中的应用。
9.根据权利要7或8所述的应用，其特征在于，所述油菜为具有矮秆性状的甘蓝型油菜。
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