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CN116507636A - SARS-CoV-2蛋白、抗SARS-CoV-2抗体以及它们的使用方法 - Google Patents

SARS-CoV-2蛋白、抗SARS-CoV-2抗体以及它们的使用方法 Download PDF

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CN116507636A
CN116507636A CN202180050085.2A CN202180050085A CN116507636A CN 116507636 A CN116507636 A CN 116507636A CN 202180050085 A CN202180050085 A CN 202180050085A CN 116507636 A CN116507636 A CN 116507636A
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R·E·玛希
M·埃塞尔
P·麦克塔尼二世
卢悦明
R·M·瓦基
杜群
J·斯坦哈特
S·拉詹
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Abstract

本披露提供了SARS‑CoV‑2刺突蛋白和含有此类刺突蛋白的三聚体。本披露还提供了与SARS‑CoV‑2的刺突蛋白特异性结合的抗体及其抗原结合片段。这些蛋白质、三聚体和抗体可以用于例如检测从受试者获得的样品中的抗SARS‑CoV‑2抗体。

Description

SARS-CoV-2蛋白、抗SARS-CoV-2抗体以及它们的使用方法
1.技术领域
本披露涉及SARS-CoV-2刺突蛋白、与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的抗体及其抗原结合片段、以及它们的制备方法和例如在抗SARS-CoV-2抗体的检测中的使用方法。
1.1序列表
本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此通过援引以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年7月9日，名称为COVID-101-WO-PCT_SL.txt，并且大小为68,970字节。
2.背景技术
已经出现了由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒2019(COVID19)大流行。该病毒的死亡率目前尚不确定，但全球病例数和死亡数令人震惊：截至2020年7月，全球已确诊超过1400万例且死亡60万人。该病毒能够通过感染者咳嗽、打喷嚏或说话时从鼻子或口腔排出的小飞沫在人与人之间传播。潜伏期(从暴露到症状发作的时间)范围为0到24天，平均为3-5天，但是病毒在这段时间期间可能具有传染性。症状包括发烧、咳嗽和呼吸困难。在一些患者中，肺部感染很严重，导致严重的呼吸窘迫或甚至死亡。然而，许多感染该病毒的患者只有轻微症状或无症状。不幸的是，这些患者也可能能够将病毒传播给其他人。
目前，还没有获得批准的疫苗，也没有获得科学界和医学界广泛批准的特定治疗方法，但是正在研究几种疫苗和抗病毒方法。因此，防止SARS-CoV-2的传播是至关重要的。假设已经感染SARS-CoV-2并恢复的患者在恢复后可能不具有传染性。能够鉴定不会变得具有传染性的人将有助于防止SARS-CoV-2的传播。目前一些检测患者体内的抗SARS-CoV-2抗体的测定是可用的，但它们缺乏期望的灵敏度和特异性。因此，迫切需要可用于鉴定已经感染SARS-CoV-2的患者的试剂和测定。
3.发明内容
在一些方面，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)的抗体特异性结合SARS-CoV-2的刺突蛋白的相同表位，其中该VH和VL的氨基酸序列包含以下序列：(a)分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:64；(b)分别为SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:65；(c)分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:66；(d)分别为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:67；(e)分别为SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:68；(f)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:69；(g)分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:70；(h)分别为SEQID NO:62和SEQ ID NO:71；或者(i)分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:72。
在一些方面，本文提供了一种竞争性抑制参考抗体与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，其中该参考抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该VH和VL的氨基酸序列包含以下序列：(a)分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:64；(b)分别为SEQID NO:56和SEQ ID NO:65；(c)分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:66；(d)分别为SEQ IDNO:58和SEQ ID NO:67；(e)分别为SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:68；(f)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:69；(g)分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:70；(h)分别为SEQ ID NO:62和SEQID NO:71；或者(i)分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:72。
在一些方面，本文提供了一种与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的VH-CDR1-3和VLCDR1-3氨基酸序列：(a)分别为SEQ ID NO:1、2和3以及SEQ ID NO:28、29和30；(b)分别为SEQ ID NO:4、5和6以及SEQ ID NO:31、32和33；(c)分别为SEQ ID NO:7、8和9以及SEQ IDNO:34、35和36；(d)分别为SEQ ID NO:10、11和12以及SEQ ID NO:37、38和39；(e)分别为SEQID NO:13、14和15以及SEQ ID NO:40、41和42；(f)分别为SEQ ID NO:16、17和18以及SEQ IDNO:43、44和45；(g)分别为SEQ ID NO:19、20和21以及SEQ ID NO:46、47和48；(h)分别为SEQID NO:22、23和24以及SEQ ID NO:49、50和51；或者(i)分别为SEQ ID NO:25、26和27以及SEQ ID NO:52、53和54。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变重链(VH)氨基酸序列选自由以下项组成的组：(a)SEQ ID NO:55；(b)SEQID NO:56；(c)SEQ ID NO:57；(d)SEQ ID NO:58；(e)SEQ ID NO:59；(f)SEQ ID NO:60；(g)SEQ ID NO:61；(h)SEQ ID NO:62；以及(i)SEQ ID NO:63。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变轻链(VL)氨基酸序列选自由以下项组成的组：(a)SEQ ID NO:64；(b)SEQID NO:65；(c)SEQ ID NO:66；(d)SEQ ID NO:67；(e)SEQ ID NO:68；(f)SEQ ID NO:69；(g)SEQ ID NO:70；(h)SEQ ID NO:71；以及(i)SEQ ID NO:72。
在一些方面，本文提供了一种与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变重链(VH)氨基酸序列选自由以下项组成的组：(a)SEQ ID NO:55；(b)SEQ ID NO:56；(c)SEQID NO:57；(d)SEQ ID NO:58；(e)SEQ ID NO:59；(f)SEQ ID NO:60；(g)SEQ ID NO:61；(h)SEQ ID NO:62；以及(i)SEQ ID NO:63。
在一些方面，本文提供了一种与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变轻链(VL)氨基酸序列选自由以下项组成的组：(a)SEQ ID NO:64；(b)SEQ ID NO:65；(c)SEQID NO:66；(d)SEQ ID NO:67；(e)SEQ ID NO:68；(f)SEQ ID NO:69；(g)SEQ ID NO:70；(h)SEQ ID NO:71；以及(i)SEQ ID NO:72。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的可变重链(VH)氨基酸序列和可变轻链(VL)氨基酸序列：(a)分别为SEQ ID NO:55和SEQ IDNO:64；(b)分别为SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:65；(c)分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:66；(d)分别为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:67；(e)分别为SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:68；(f)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:69；(g)分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:70；(h)分别为SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:71；以及(i)分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:72。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV交叉反应。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区。在一些方面，该重链恒定区选自由人免疫球蛋白IgG和IgM组成的组。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区。在一些方面，该轻链恒定区是κ轻链恒定区。在一些方面，该轻链恒定区是λ轻链恒定区。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段是全长抗体。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。在一些方面，该抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、IgGΔCH2、微型抗体(minibody)、F(ab')3、四链抗体(tetrabody)、三链抗体(triabody)、双链抗体(diabody)、单结构域抗体、(scFv)2或scFv-Fc。
在一些方面，该抗体或抗原结合片段是分离的。在一些方面，该抗体或抗原结合片段是单克隆的。在一些方面，该抗体或抗原结合片段是重组的。
在一些方面，本文提供的抗体或抗原结合片段不中和SARS-CoV-2。在一些方面，本文提供的抗体或抗原结合片段不中和SARS-CoV-2的假病毒。
在一些方面，本文提供的抗体或其抗原结合片段进一步包含可检测标记。在一些方面，所述标记选自由酶标记、金颗粒、免疫荧光标记、化学发光标记、磷光标记、放射性标记、亲和素/生物素、有色颗粒和磁性颗粒组成的组。在一些方面，所述标记通过酶免疫测定、横向流测试、放射免疫测定、蛋白质印迹测定、免疫荧光测定、免疫沉淀测定、化学发光测定、细胞计量术或免疫组织化学测定来检测。
在一些方面，本文提供了一种多肽，该多肽包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些方面，该多肽是分离的。在一些方面，该多肽是重组产生的或化学合成的。在一些方面，本文提供了一种三聚体，该三聚体包含该多肽。在一些方面，该三聚体是分离的。在一些方面，本文提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码该多肽的核酸分子。
在一些方面，本文提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子和/或编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子。在一些方面，本文提供了一种分离的载体，该分离的载体包含本文提供的多核苷酸。
在一些方面，本文提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本文提供的多核苷酸、本文提供的载体或包含编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的第一载体和包含编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的第二载体。
在一些方面，本文提供了一种制备本文提供的抗体或其抗原结合片段或本文提供的蛋白质的方法，该方法包括(a)培养本文提供的细胞以及(b)从所培养的细胞中分离抗体或其抗原结合片段或者蛋白质。
在一些方面，本文提供了一种用于检测样品中的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括使样品与本文提供的多肽或三聚体接触，任选地其中该方法进一步包括检测多肽或三聚体与抗体或其抗原结合片段之间的结合。在一些方面，该样品是生物样品。在一些方面，该检测方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一些方面，该检测方法是横向流测定。在一些方面，该样品来自人受试者。在一些方面，该样品含有IgG抗体或其抗原结合片段。在一些方面，该样品含有IgM抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，本文提供的方法包括使用本文提供的抗体或其抗原结合片段作为对照。
在一些方面，本文提供了一种试剂盒，该试剂盒包括(i)本文提供的SARS-CoV-2刺突蛋白、本文提供的三聚体或本文提供的多核苷酸，以及(ii)与SARS-CoV-2结合的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，该试剂盒包括本文提供的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，该试剂盒包括本文提供的抗体或其抗原结合片段以及SARS-Co-V2刺突蛋白抗原。在一些方面，该试剂盒包括反映批准使用或销售的通知。
4.附图说明
图1示出了患者在不同疾病阶段的病毒RNA和抗体阳性率的动力学。
图2示出了CV1-CV13和R347(对照)抗体与SARS2三聚体(左分图)和SARS受体结合结构域(RBD)(右分图)的结合。
图3示出了CV1-CV12抗体不中和假病毒。MEDI8897是一种抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体。血管紧张素转化酶-2(ACE2)是SARS-CoV-2的受体。
图4示出了CV7抗体的IgG和IgM形式在ELISA测定中始终产生阳性结果。
图5示出了ELISA对与刺突蛋白结合的IgG抗体的特异性。
图6示出了可以用于检测与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体的测定中的步骤。
5.具体实施方式
本文提供了SARS-CoV-2刺突蛋白，与该刺突蛋白特异性结合的抗体(例如，单克隆抗体)及其抗原结合片段，以及它们的制备、选择和使用方法。
5.1术语
术语“抗体”意指通过免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标(诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的融合蛋白、以及任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所希望的生物活性即可。抗体可以是以下五大类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于它们的重链恒定域的特性分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或缀合至其他分子如毒素、放射性同位素等等。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”或“抗原结合区”是指完整抗体的与抗原结合的一部分。抗原结合片段可以含有完整抗体的抗原决定区(例如，互补决定区(CDR))。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。抗体的抗原结合片段可以源自任何动物物种，诸如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人，或者可以人工产生。
术语“抗SAR2-CoV-2抗体”、“SARS-CoV-2抗体”和“与SARS-CoV-2结合的抗体”在本文中可互换使用，是指能够与SARS-CoV-2结合的抗体。SARS-CoV-2抗体与不相关的非SARS-CoV-2刺突蛋白的结合程度可以小于该抗体与SARS-CoV-2的结合的约10％，如例如使用ForteBio或Biacore所测量的。在本文提供的一些方面，SARS-CoV-2抗体也能够与SARS-1结合。在本文提供的一些方面，SARS-CoV-2抗体不与SARS-1结合。
术语“抗SAR2-CoV-2刺突蛋白抗体”、“SARS-CoV-2刺突蛋白抗体”和“与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的抗体”在本文中可互换使用，是指能够以足够的亲和力与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体，使得该抗体可在与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合中用作诊断试剂。例如使用ForteBio或Biacore所测量的，SARS-CoV-2刺突蛋白抗体与不相关的非SARS-CoV-2刺突蛋白的结合程度可以小于该抗体与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合程度的约10％。在本文提供的一些方面，SARS-CoV-2刺突蛋白抗体也能够与SARS-1的刺突蛋白结合。在本文提供的一些方面，SARS-CoV-2刺突蛋白抗体不与SARS-1的刺突蛋白结合。
“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体或其抗原结合片段群。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆”抗体或其抗原结合片段涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指以任何数目的方式(包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物)制备的此类抗体及其抗原结合片段。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，通常是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中氨基端约110至120个氨基酸或110至125个氨基酸以及成熟轻链中约90至115个氨基酸，该部分在抗体之间的序列广泛不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在一些方面，可变区是人可变区。在一些方面，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和人框架区(FR)。在一些方面，可变区是灵长类(例如，非人灵长类)可变区。在一些方面，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和灵长类(例如，非人灵长类)框架区(FR)。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变结构域中在序列上是高变的和/或形成结构上限定的环(高变环)和/或含有与抗原接触的残基的每个区域。抗体可包含六个CDR，例如VH中的三个和VL中的三个。
术语“VL”和“VL结构域”可互换用于指抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换用于指抗体的重链可变区。
术语“卡巴特(Kabat)编号”和类似术语在本领域中是公认的并且是指对抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在一些方面，可以根据卡巴特编号系统来确定CDR(参见例如Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci[纽约科学院年鉴]190:382-391以及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学相关蛋白序列],第五版,美国卫生与公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公开号91-3242)。使用卡巴特编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35(任选地可包括35位之后的一个或两个附加氨基酸(在卡巴特编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用卡巴特编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。
相反，乔西亚(Chothia)是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。乔西亚CDR-H1环的末端在利用卡巴特编号惯例编号时在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为卡巴特编号方案将插入放在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，那么环端点在32；如果只存在35A，那么环端点在33；如果35A和35B都存在，那么环端点在34)。AbM高变区表示卡巴特CDR和乔西亚结构环之间的折衷，并且被牛津分子(Oxford Molecular)AbM抗体建模软件使用。
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”是可互换的并且具有其在本领域中常见的含义。恒定区是抗体的一部分，例如轻链和/或重链的羧基端部分，该部分不直接涉及抗体与抗原的结合，但是可以表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。在一些方面，抗体或抗原结合片段包含对于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)而言足够的恒定区或其一部分。
如本文所用，术语“重链”在用于指抗体时可以基于恒定结构域的氨基酸序列指任何不同的类型，例如alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)，分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链氨基酸序列是本领域熟知的。在一些方面，重链是人重链。
如本文所用，术语“轻链”在用于指抗体时可以基于恒定结构域的氨基酸序列指任何不同的类型，例如，kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。在一些方面，轻链是人轻链。
术语“嵌合”抗体或其抗原结合片段是指其中氨基酸序列源自两个或更多个物种的抗体或其抗原结合片段。典型地，轻链和重链的可变区对应于源自具有所需特异性、亲和力和能力的一个物种的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体或其抗原结合片段的可变区，而恒定区同源于源自另一物种(通常为人)的抗体或其抗原结合片段中的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
术语“人源化”抗体或其抗原结合片段是指非人(例如鼠类)抗体或其抗原结合片段的形式，这些形式是含有最少的非人(例如，鼠类)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。典型地，人源化抗体或其抗原结合片段是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔子或仓鼠)的CDR的具有所希望特异性、亲和性和能力的残基替代(“CDR移植”)(Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然]332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学]239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被来自非人物种的具有所希望特异性、亲和性和能力的抗体或片段中的相应残基置换。人源化抗体或其抗原结合片段可以通过取代Fv框架区中和/或置换的非人残基内另外的残基来进一步修饰，以改进和优化抗体或其抗原结合片段特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体或其抗原结合片段将包含基本上所有至少一个(并且典型地两个或三个)可变结构域，该可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体或其抗原结合片段还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区或结构域的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]USA,91(3):969-973(1994)；以及Roguska等人，Protein Eng.[蛋白质工程]9(10):895-904(1996)。在一些方面，“人源化抗体”是表面重整抗体(resurfacedantibody)。
术语“人”抗体或其抗原结合片段意指具有源自人免疫球蛋白基因座的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段，其中这种抗体或其抗原结合片段是使用本领域已知的任何技术制备的。人抗体或其抗原结合片段的这一定义包括完整抗体或全长抗体及其片段。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体或其抗原结合片段)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体或其抗原结合片段和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。亲和力可以以本领域中已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD是根据koff/kon的商计算的，而KA是根据kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体或其抗原结合片段与抗原的缔合速率常数，而koff是指例如抗体或其抗原结合片段与抗原的解离。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的技术来测定，诸如或KinExA。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语并且是指抗原中抗体或其抗原结合片段可以特异性结合的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可以例如一起来自一个或多个多肽的两个或更多个非连续区域(构象性、非线性、不连续或非连续的表位)。在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合的表位可以通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、氢/氘交换联合质谱法(例如，液相色谱-电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)。对于X射线晶体学，可以使用本领域中任何已知的方法来完成结晶(例如，GiegéR等人,(1994)Acta CrystallogrD Biol Crystallogr[结晶学报，D辑：生物结晶学]50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem[欧洲生物化学杂志]189:1-23；Chayen NE(1997)Structure[结构]5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem[生物化学杂志]251:6300-6303)。抗体/其抗原结合片段:抗原晶体可以使用熟知的X射线衍射技术研究并且可以使用计算机软件进行改进，诸如X-PLOR(耶鲁大学(Yale University),1992，由分子模拟公司(Molecular Simulations,Inc.)发行；参见，例如，Meth Enzymol[酶学方法](1985)第114和115卷,编辑Wyckoff HW等人；U.S.2004/0014194)、以及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr[晶体学报D辑：生物晶体学]49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)MethEnzymol[酶学方法]276A:361-423，编辑Carter CW；Roversi P等人,(2000)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr[结晶学报，D辑：生物结晶学]56(Pt 10):1316-1323)。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来完成诱变作图研究。对于诱变技术(包括丙氨酸扫描诱变技术)的描述，参见例如，Champe M等人,(1995)J Biol Chem[生物化学杂志]270:1388-1394以及Cunningham BC和Wells JA(1989)Science[科学]244:1081-1085。
与参考抗体“结合相同表位”的抗体是指与参考抗体结合相同氨基酸残基的抗体。抗体与参考抗体结合相同表位的能力可以通过氢/氘交换测定来确定(参见例如，Coales等人Rapid Commun.Mass Spectrom.[质谱学快报]2009；23:639-647)。
如本文所用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体或其抗原结合片段的上下文中是类似术语。这些术语指示抗体或其抗原结合片段经由其抗原结合结构域与表位结合并且指示结合需要抗原结合结构域与表位之间有某种互补性。因此，在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白“特异性结合”的抗体也可以与一种或多种相关病毒(例如SARS-1)的刺突蛋白结合和/或也可以与SARS-CoV-2刺突蛋白的变体结合，但例如使用ForteBio或Biacore测量的那样，与不相关的非SARS-CoV-2刺突蛋白的结合程度小于抗体与SARS-CoV刺突蛋白结合的约10％。
若抗体优先与该表位或重叠表位结合，其程度为在某种程度上阻断参考抗体与表位的结合，则将该抗体称为“竞争性抑制”参考抗体与给定表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法测定，例如竞争性ELISA测定。可以说某抗体竞争性地将参考抗体与给定表位的结合抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈自然界中发现形式的程度的那些。在一些方面，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
在文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本发明的多肽是基于抗体的，因此在一些方面，这些多肽可以作为单链或相关链出现。
“同一性百分比”是指两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性程度。可以通过比对两个序列，引入空位以最大化序列之间的同一性来测定同一性百分比。可以使用本领域已知的程序来产生比对。为了本文的目的，核苷酸序列的比对可以用设为默认参数的blastn程序进行，而氨基酸序列的比对可以用设为默认参数的blastp程序进行(参见万维网上的国家生物技术信息中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所用，具有疏水性侧链的氨基酸包括丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。具有脂族疏水性侧链的氨基酸包括丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)和缬氨酸(V)。具有芳族疏水性侧链的氨基酸包括苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
如本文所用，具有极性中性侧链的氨基酸包括天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
如本文所用，具有带电荷的侧链的氨基酸包括天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)。具有带电荷的酸性侧链的氨基酸包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。具有带电荷的碱性侧链的氨基酸包括精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)。
如本文所用，术语“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一些方面，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞以及这种细胞的后代或潜在后代。这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲代细胞不相同，例如由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或者核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其形式使得活性成分的生物活性是有效的，并且其不含对将施用该配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。配制品可以是无菌的。
如本文使用的，术语“受试者”和“患者”可互换地使用。受试者可以是动物。在一些方面，受试者是哺乳动物，例如非人动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠、猴或其他灵长类等)。在一些方面，受试者是人。
如在本披露内容和权利要求中所使用，单数形式“一种/个”和“该”包括复数形式，除非在上下文中的其他地方清楚地指出。
应当理解，无论在什么情况下在此用语言“包含”描述方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。在本披露中，“包含(comprises或comprising)”、“含有”和“具有”等可以意指“包括(includes或including)”等；“基本上由……组成(consisting essentially of或consists essentially)”是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术方面。
除非明确声明或从上下文显而易见，如本文所用的，术语“或”被理解为包括在内。如本文在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
如本文所用，术语“约”和“大约”在用于修饰数值或数值范围时，指示高于该数值或范围10％和低于该数值或范围10％的偏差仍在所叙述的值或范围的预期含义内。应当理解，在本文中无论在何处用语言“约”或“大约”数值或范围来描述各方面，也提供了指代特定数值或范围(没有“约”)的类似方面。
可以将本文提供的任何组合物或方法与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。
5.2SARS-CoV-2刺突蛋白
SARS-CoV-2中天然存在的刺突蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:100中提供：
SEQ ID NO:100的氨基酸1-12是刺突蛋白的信号肽。因此，SARS-CoV-2的刺突蛋白的成熟形式含有SEQ ID NO:100的氨基酸13-1273。SEQ ID NO:100的氨基酸13-1213对应于胞外结构域；氨基酸1214-1234对应于跨膜结构域；并且氨基酸1235-1273对应于胞质结构域。
本文提供了在检测抗SARS-CoV-2抗体中具有改善的特性(例如，改善的表达(例如，在细胞培养物中)和改善的功效)的刺突蛋白。在一个方面，SARS-CoV-2蛋白包含以下序列：
在一个方面，本文提供的蛋白质包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列。在一个方面，本文提供了一种三聚体，该三聚体包含含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的蛋白质。
5.3抗体及其抗原结合片段
在一个特定方面，本文提供了与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体(例如单克隆抗体，诸如人抗体)及其抗原结合片段。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段能够与包含SEQ ID NO:100中列出的氨基酸序列的刺突蛋白和/或包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白结合。在一些方面，抗体或其抗原结合片段能够与包含以下项的三聚体结合：包含SEQ ID NO:100中列出的氨基酸序列的刺突蛋白和/或包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白。
在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段能够与SARS2三聚体结合。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段能够与刺突蛋白的受体结合结构域(RBD，SEQ ID NO:100的氨基酸334-526)结合。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段能够与SARS2三聚体和刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)结合。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够与包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白结合。在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够与包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列(例如，包含各自具有SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的3个蛋白质)的SARS2三聚体结合。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，抗体的三个VH CDR和相同抗体的三个VLCDR)。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，表1中所列的抗体的三个VH CDR和表2中所列的相同抗体的三个VL CDR)，并且包含含有与表3中的相同抗体的VH序列至少85％相同的序列的VH和含有与表4中的相同抗体的VL序列至少85％相同的序列的VL。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，表1中所列的抗体的三个VH CDR和表2中所列的相同抗体的三个VL CDR)，并且包含含有与表3中的相同抗体的VH序列至少90％相同的序列的VH和含有与表4中的相同抗体的VL序列至少90％相同的序列的VL。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，表1中所列的抗体的三个VH CDR和表2中所列的相同抗体的三个VLCDR)，并且包含含有与表3中的相同抗体的VH序列至少95％相同的序列的VH和含有与表4中的相同抗体的VL序列至少95％相同的序列的VL。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，表1中所列的抗体的三个VH CDR和表2中所列的相同抗体的三个VL CDR)，并且包含含有与表3中的相同抗体的VH序列至少96％相同的序列的VH和含有与表4中的相同抗体的VL序列至少96％相同的序列的VL。在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，表1中所列的抗体的三个VH CDR和表2中所列的相同抗体的三个VLCDR)，并且包含含有与表3中的相同抗体的VH序列至少97％相同的序列的VH和含有与表4中的相同抗体的VL序列至少97％相同的序列的VL。在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，表1中所列的抗体的三个VH CDR和表2中所列的相同抗体的三个VL CDR)，并且包含含有与表3中的相同抗体的VH序列至少98％相同的序列的VH和含有与表4中的相同抗体的VL序列至少98％相同的序列的VL。在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，包含表1和表2中所列的抗体的六个CDR(即，表1中所列的抗体的三个VH CDR和表2中所列的相同抗体的三个VL CDR)，并且包含含有与表3中的相同抗体的VH序列至少99％相同的序列的VH和含有与表4中的相同抗体的VL序列至少99％相同的序列的VL。
表1：可变重链CDR氨基酸序列
表2：可变轻链CDR氨基酸序列
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与包含表3和表4中所列的抗体的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)的抗体特异性结合SARS-CoV-2的刺突蛋白的相同表位。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段竞争性抑制参考抗体与SARS-CoV-2抗体的刺突蛋白的结合，其中该参考抗体包含表3中所列的可变重链(VH)和/或表3和表4中所列的抗体的可变轻链(VL)。
表3：可变重链氨基酸序列
表4：可变轻链氨基酸序列
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表3中所列的抗体的VH。在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表4中所列的抗体的VL。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，并且包含表3和表4中所列的抗体的VH和VL(即，抗体的VH和相同抗体的VL)。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以通过其单独的VL结构域或其单独的VH结构域，或通过其单独的3个VL CDR或其单独的3个VH CDR来描述。参见例如RaderC等人，(1998)PNAS[美国国家科学院院刊]95:8910-8915，其通过援引以其全文并入本文，其描述了通过鉴定分别来自于人轻链或重链文库的互补轻链或重链来进行小鼠抗αvβ3抗体的人源化，产生具有与原始抗体亲和力一样高或更高的亲和力的人源化抗体变体。另请参见Clackson T等人，(1991)Nature[自然]352:624-628，其通过援引以其全文并入本文，描述了通过使用特定VL结构域(或VH结构域)并筛选文库中的互补可变结构域来产生结合特定抗原的抗体的方法。筛选产生了特定VH结构域的14个新配偶体和特定VL结构域的13个新配偶体，如通过ELISA所测定，它们是强结合剂。另请参见Kim SJ和Hong HJ,(2007)JMicrobiol[微生物学杂志]45:572-577，其通过援引以其全文并入本文，描述了通过使用特定VH结构域并筛选文库(例如，人VL文库)中的互补VL结构域来产生结合特定抗原的抗体的方法；所选择的VL结构域又可以用于指导对另外的互补(例如人)VH结构域的选择。
在一些方面，可以根据乔西亚编号方案确定抗体或其抗原结合片段的CDR，乔西亚编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如Chothia C和Lesk AM,(1987),J MolBiol[分子生物学杂志]196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol[分子生物学杂志]273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol[分子生物学杂志]227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol[分子生物学杂志]215(1):175-82；以及美国专利号7,709,226)。典型地，当使用卡巴特编号惯例时，乔西亚CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，乔西亚CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且乔西亚CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102处，而乔西亚CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，乔西亚CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且乔西亚CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。乔西亚CDR-H1环的末端在利用卡巴特编号惯例编号时在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为卡巴特编号方案将插入放在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，那么环端点在32；如果只存在35A，那么环端点在33；如果35A和35B都存在，那么环端点在34)。
在一些方面，本文提供了与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合并且包含含有表3和表4中所列的VH和VL序列(即，抗体的VH和相同抗体的VL)的抗体的乔西亚VH和VL CDR的抗体及其抗原结合片段。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段包含一个或多个CDR，其中乔西亚和卡巴特CDR具有相同的氨基酸序列。在一些方面，本文提供了与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合并且包含卡巴特CDR和乔西亚CDR的组合的抗体及其抗原结合片段。
在一些方面，可以根据如Lefranc M-P,(1999)The Immunologist[免疫学家]7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)Nucleic Acids Res[核酸研究]27:209-212中所述的IMGT编号系统来确定抗体或其抗原结合片段的CDR。根据IMGT编号方案，VH-CDR1处于位置26至35，VH-CDR2处于位置51至57，VH-CDR3处于位置93至102，VL-CDR1处于位置27至32，VL-CDR2处于位置50至52，并且VL-CDR3处于位置89至97。在一些方面，本文提供了与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合并且包含含有表3和表4中所列的VH和VL序列(即，抗体的VH和相同抗体的VL)的抗体的IMGT VH和VL CDR的抗体及其抗原结合片段，例如如Lefranc M-P(1999)同上和Lefranc M-P等人,(1999)同上中所述。
在一些方面，可以根据MacCallum RM等人,(1996)J Mol Biol[分子生物学杂志]262:732-745确定抗体或其抗原结合片段的CDR。另请参见例如Martin A.“ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析],”在Antibody Engineering[抗体工程]中，Kontermann和Dübel编辑，第31章，第422-439页，柏林斯普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin)(2001)。在一些方面，本文提供了与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合并且包含含有表4和表4中所列的VH和VL序列(即，抗体的VH和相同抗体的VL)的抗体的VH和VL CDR的抗体或其抗原结合片段，如通过MacCallum RM等人中的方法所确定的。
在一些方面，可以根据AbM编号方案确定抗体或其抗原结合片段的CDR，AbM编号方案是指代表卡巴特CDR和乔西亚结构环之间折衷的AbM高变区，并且被牛津分子的AbM抗体建模软件(牛津分子集团有限公司(Oxford Molecular Group,Inc.))使用。在一些方面，本文提供了与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合并且包含含有表3和表4中所列的VH和VL序列(即，抗体的VH和相同抗体的VL)的抗体的VH和VL CDR的抗体或其抗原结合片段，如通过AbM编号方案所确定的。
在一些方面，本文提供了包含重链和/或轻链的抗体。人恒定区序列的非限制性实例已在本领域中描述，例如参见美国专利号5,693,780和Kabat EA等人，(1991)同上。
关于重链，在一些方面，本文所述的抗体的重链可以是alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在一些方面，所述抗体的重链可包含人alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体包含重链，其中VH结构域的氨基酸序列包含表3中所列的氨基酸序列并且其中重链的恒定区包含人gamma(γ)重链恒定区(例如人IgG1重链恒定区)的氨基酸序列。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体包含重链，其中VH结构域的氨基酸序列包含表3中列出的氨基酸序列，并且其中重链的恒定区包含人IgM重链恒定区的氨基酸序列。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的本文所述的抗体包含重链，其中VH结构域的氨基酸序列包含表3中所列的序列，并且其中重链的恒定区包含本文所述的或本领域已知的人重链的氨基酸。
在一些方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段的轻链是人κ轻链或人λ轻链。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体包含轻链，其中VL结构域的氨基酸序列包含表4中所列的序列，并且其中轻链的恒定区包含人κ或λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中VL结构域的氨基酸序列包含表4中所列的序列，并且其中轻链的恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。
在一些方面，本文所述的抗体的轻链是λ轻链。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体包含轻链，其中VL结构域的氨基酸序列包含表4中所列的序列，并且其中轻链的恒定区包含人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体包含含有本文所述的任何氨基酸序列的VH结构域和VL结构域，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子或人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体包含含有本文所述的任何氨基酸序列的VH结构域和VL结构域，并且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。在一些方面，恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。
在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段不中和SARS-CoV-2。在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段不中和SARS-CoV-2的假病毒。
竞争结合测定可以用于确定两种抗体是否与重叠表位结合。竞争性结合可以在一种测定中确定，在该测定中，测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与常见抗原(诸如SARS-CoV-2的刺突蛋白或SARS-CoV-2)的特异性结合。已知许多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli C等人,(1983)Methods Enzymol[酶学方法]9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland TN等人,(1986)J Immunol[免疫学杂志]137:3614-9)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow E和Lane D,(1988)Antibodies:A LaboratoryManual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社])；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel GA等人,(1988)Mol Immunol[分子免疫学]25(1):7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung RC等人,(1990)Virology[病毒学]176:546-52)；以及直接标记RIA(Moldenhauer G等人,(1990)Scand J Immunol[斯堪的纳维亚免疫学杂志]32:77-82)。典型地，这种测定涉及使用与载有以下任一个的固体表面或细胞结合的纯化抗原：未标记的测试免疫球蛋白以及标记的参考免疫球蛋白。竞争性抑制可以通过在测试免疫球蛋白的存在下测定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争性抗体过量存在时，它将以至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更高抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。可以使用标记的抗原或标记的抗体以多种不同形式配置竞争结合测定。在该测定的常见形式中，将抗原固定在96孔板上。然后使用放射性标记或酶标记来测量未标记的抗体阻断标记的抗体与抗原结合的能力。更多详情，参见例如，Wagener C等人,(1983)J Immunol[免疫学杂志]130:2308-2315；WagenerC等人,(1984)J Immunol Methods[免疫学方法杂志]68:269-274；Kuroki M等人,(1990)Cancer Res[癌症研究]50:4872-4879；Kuroki M等人,(1992)Immunol Invest[免疫学研究]21:523-538；Kuroki M等人,(1992)Hybridoma[杂种瘤]11:391-407；以及Antibodies:ALaboratory Manual[抗体：实验室手册],Harlow E和Lane D编辑,同上,第386-389页。
在一些方面，使用表面等离振子共振例如通过“串联方法”，诸如Abdiche YN等人,(2009)Analytical Biochem[分析生物化学]386:172-180描述的方法来进行竞争测定，从而将抗原固定在芯片表面，例如CM5传感器芯片上，然后使抗体或抗原结合片段在芯片上运行。为了确定抗体或其抗原结合片段是否和与如本文所述的SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体竞争，首先使抗体或其抗原结合片段在芯片表面上运行以达到饱和，然后添加潜在的竞争性抗体。然后可以相对于非竞争性对照确定和定量竞争性抗体或其抗原结合片段的结合。
在另一方面，本文提供了竞争性抑制(例如，以剂量依赖性方式)所述抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白或与SARS-CoV-2的结合的抗体，如使用本领域技术人员已知的或本文所述的测定(例如，ELISA竞争性测定或悬浮阵列或表面等离振子共振测定)所确定的。
在一些方面，与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的如本文所述的抗原结合片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2和scFv组成的组，其中Fab、Fab'、F(ab')2或scFv包含与SARS-CoV-2的刺突蛋白或与SARS-CoV-2特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列和轻链可变区序列。Fab、Fab'、F(ab')2或scFv可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生，包括但不限于本文中讨论的那些技术。
可以将与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段与可检测标记或物质融合或缀合(例如，共价或非共价连接)。可检测标记或物质的实例包括酶标记物，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，诸如鲁米诺；以及荧光标记，诸如荧光素和若丹明，以及生物素。此类标记的抗体或其抗原结合片段可以用于检测SARS-CoV-2的刺突蛋白或SARS-CoV-2或与SARS-CoV-2结合的抗体，如本文别处所讨论的。
5.4蛋白质和抗体产生
与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的刺突蛋白和抗体及其抗原结合片段可以通过本领域已知的用于合成蛋白和抗体及其抗原结合片段的任何方法产生，例如通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有说明，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内相关领域的常规技术。这些技术例如在本文引用的参考文献中有描述并且在文献中对其进行了充分解释。参见例如，Sambrook J等人,(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY[纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社]；Ausubel FM等人，CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]，约翰·威利父子公司(JohnWiley&Sons)(1987年和年度更新)；Current Protocols in Immunology[免疫学实验指南],约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)(1987年和年度更新)Gait(编辑)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach[寡核苷酸合成：实用方法],IRL出版社(IRL Press)；Eckstein(编辑)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A PracticalApproach[寡核苷酸和类似物：实用方法],IRL Press[IRL出版社]；Birren B等人(编辑)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual[基因组分析：实验室手册],Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]。
在一些方面，本文提供了一种制备包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白的方法，该方法包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在一些方面，本文提供了一种制备包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白的方法，该方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如，包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)该蛋白。在一些方面，该细胞是分离的细胞。在一些方面，已经将外源多核苷酸引入细胞中。在一些方面，该方法进一步包括分离或纯化从细胞、宿主细胞或培养物获得的蛋白质的步骤。
在一些方面，本文提供了制备与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在一些方面，本文提供了制备与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如，包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)该抗体或其抗原结合片段。在一些方面，该细胞是分离的细胞。在一些方面，已经将外源多核苷酸引入细胞中。在一些方面，该方法进一步包括分离或纯化从细胞、宿主细胞或培养物获得的抗体或抗原结合片段的步骤。
用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如，Short Protocols inMolecular Biology[精编分子生物学实验指南],(2002)第5版,Ausubel FM等人编辑,JohnWiley and Sons,New York[纽约的约翰·威利父子公司]中的第11章)。
可以使用本领域已知的多种多样的技术来制备单克隆抗体或其抗原结合片段，这些技术包括使用杂交瘤、重组以及噬菌体展示技术、基于酵母的呈递技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体或其抗原结合片段，这些杂交瘤技术包括本领域已知的并且例如在以下文献中教导的那些技术：Harlow E和Lane D,Antibodies:A LaboratoryManual[抗体：实验室手册],(Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],1988年第2版)；Hammerling GJ等人，在：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas[单克隆抗体和T细胞杂交瘤]563 681(纽约爱思唯尔出版社(Elsevier,N.Y.),1981)，或如Kohler G和Milstein C(1975)Nature[自然]256:495中所述。可用于选择和生成本文所述的抗体的基于酵母的呈递方法的实例包括例如WO 2009/036379A2、WO 2010/105256和WO 2012/009568中披露的那些，将其各自通过援引以其全文并入本文。
在一些方面，单克隆抗体或抗原结合片段是由克隆细胞(例如，产生重组抗体或抗原结合片段的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合，如例如通过ELISA或本领域已知的其他抗原结合测定(诸如横向流测定)或在本文提供的实例中所确定的。在一些方面，单克隆抗体或其抗原结合片段可以是人抗体或其抗原结合片段。在一些方面，单克隆抗体或其抗原结合片段可以是Fab片段或F(ab’)2片段。本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过如Kohler G和Milstein C(1975)Nature[自然]256:495中所述的杂交瘤方法制备，或者可以例如使用如本文所述的技术从噬菌体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体及其抗原结合片段的其他方法是本领域熟知的(参见例如在：Short Protocols inMolecular Biology[精编分子生物学实验指南](2002)第5版中第11章,Ausubel FM等人,同上)。
本文所述的抗体的抗原结合片段可以通过本领域技术人员已知的任何技术生成。例如，本文所述的Fab和F(ab’)2片段可以通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生F(ab’)2片段)对免疫球蛋白分子进行蛋白水解裂解来产生。Fab片段对应于四聚抗体分子的两条相同臂之一，并且含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab’)2片段含有四聚抗体分子的两条抗原结合臂，这两条抗原结合臂通过铰链区中的二硫键连接。
此外，还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示和/或基于酵母的呈递方法来生成本文所述的抗体或其抗原结合片段。在噬菌体展示方法中，将蛋白质展示在噬菌体颗粒的表面上，这些颗粒携带对其进行编码的多核苷酸序列。具体地说，编码VH和VL结构域的DNA序列是从动物cDNA文库(例如，受感染组织的人或鼠类cDNA文库)来扩增。通过PCR将编码这些VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起，并且克隆至噬粒载体中。将该载体以电穿孔转至大肠杆菌中，并且用辅助噬菌体对该大肠杆菌进行感染。这些方法中所使用的噬菌体典型地是包括fd和M13的丝状噬菌体，并且VH和VL结构域通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达与特定抗原结合的抗体或其抗原结合片段的噬菌体可以用抗原来选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或结合或捕获于固体表面或珠粒上的抗原。可以用于制备本文所述的抗体或片段的噬菌体展示方法的实例包括在以下文献中披露的那些：BrinkmanU等人，(1995)J Immunol Methods[免疫学方法杂志]182:41-50；Ames RS等人，(1995)JImmunol Methods[免疫学方法杂志]184:177-186；Kettleborough CA等人，(1994)Eur JImmunol[欧洲免疫学杂志]24:952-958；Persic L等人，(1997)Gene[基因]187:9-18；Burton DR和Barbas CF(1994)Advan Immunol[高级免疫学]57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/001134；国际公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108。
5.4.1多核苷酸
在一些方面，本文提供了多核苷酸，这些多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的刺突蛋白的核苷酸序列。
在一些方面，本文提供了多核苷酸，这些多核苷酸包含编码与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如，可变轻链区和/或可变重链区)的核苷酸序列；以及载体，例如包含此类多核苷酸以在宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)和哺乳动物细胞)中重组表达的载体。
在一些方面，本文提供了多核苷酸，这些多核苷酸包含编码与SARS-CoV-2的刺突蛋白免疫特异性结合并且包含如本文所述的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段以及与此类抗体或抗原结合片段竞争结合SARS-CoV-2(例如，以剂量依赖性方式)或结合与此类抗体或抗原结合片段相同的表位的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
在一些方面，本文提供了多核苷酸，这些多核苷酸包含编码表5中所列的重链可变区(VH)的核酸分子和/或编码表6中所列的轻链可变区(VL)的核酸分子。
表5：可变重链核苷酸序列
表6：可变轻链核苷酸序列
本文还提供了多核苷酸，这些多核苷酸编码SEQ ID NO:101的刺突蛋白或编码与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段，这些多核苷酸例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换和消除mRNA不稳定元件而得以优化。通过引入密码子改变(例如，由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸的密码子改变)和/或消除mRNA中的抑制区来生成优化核酸以用于重组表达的方法可以通过相应调整例如以下美国专利号中所述的优化方法来进行：5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；以及6,794,498。
可以使用本领域熟知的方法(例如PCR和其他分子克隆方法)从来自合适的来源(例如杂交瘤)的核酸生成编码本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸。例如，使用可与已知序列的3'和5'末端杂交的合成引物进行的PCR扩增可以使用从产生目标抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA进行。此类PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的序列的核酸。此类PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体或其抗原结合片段的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。可将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达并进一步克隆，例如以生成嵌合抗体和人源化抗体或其抗原结合片段。
本文提供的多核苷酸可以例如呈RNA的形式或呈DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，并且DNA可以是双链的或单链的。如果是单链的，则DNA可以是编码链或非编码(反义)链。在一些方面，多核苷酸是缺少一个或多个内源内含子的cDNA或DNA。在一些方面，多核苷酸可以是非天然存在的多核苷酸。在一些方面，多核苷酸是重组产生的。在一些方面，多核苷酸是分离的。在一些方面，多核苷酸是基本上纯的。在一些方面，多核苷酸是从天然组分中纯化的。
5.4.2细胞和载体
在一些方面，本文提供了载体(例如，表达载体)，这些载体包含含有编码刺突蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，该刺突蛋白包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列以在宿主细胞中(例如，哺乳动物细胞中)重组表达。本文还提供了细胞(例如，宿主细胞)，这些细胞包含用于重组表达刺突蛋白或刺突蛋白的三聚体的此类载体。在一个特定方面，本文提供了用于产生包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的刺突蛋白或其三聚体的方法，这些方法包括在宿主细胞中表达这种蛋白。
在一些方面，本文提供了载体(例如，表达载体)，这些载体包含含有编码结合刺突蛋白的抗体及其抗原结合片段或其结构域的核苷酸序列的多核苷酸以在宿主细胞中(例如，在哺乳动物细胞中)重组表达。本文还提供了细胞(例如，宿主细胞)，这些细胞包含此类载体以重组表达结合刺突蛋白的本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，人抗体或其抗原结合片段)。在一个特定方面，本文提供了用于产生本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法，这些方法包括在宿主细胞中表达这种抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的刺突蛋白的重组表达涉及含有编码刺突蛋白的多核苷酸的表达载体的构建。一旦已经获得编码包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的刺突蛋白的多核苷酸，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术生产用于产生其蛋白质的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码刺突蛋白的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。
在一些方面，与刺突蛋白特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如，本文所述的重链或轻链)的重组表达涉及含有编码该抗体或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸的表达载体的构建。一旦获得了编码本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如，重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，就可以通过重组DNA技术，使用本领域熟知的技术来产生用于产生该抗体或其抗原结合片段的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如，轻链或重链)的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。
可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码蛋白质或抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如，轻链或重链)的序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。还提供了可复制的载体，这些载体包含编码本文所述的蛋白质或抗体或其抗原结合片段、重链或轻链、重链或轻链可变结构域或者重链或轻链CDR的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至启动子。此类载体可以例如包括编码抗体或其抗原结合片段的恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036；以及美国专利号5,122,464)，并且可以将抗体或其抗原结合片段的可变结构域克隆到这种载体中以用于表达整个重链、整个轻链或者整个重链和轻链两者。
可以通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如，宿主细胞)中，然后可以通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的蛋白质或抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1-4中提供的抗体的六个CDR、VH、VL、VH和VL、重链、轻链或者重链和轻链的抗体或其抗原结合片段)或其结构域(例如，表3和表4中提供的抗体的VH、VL、VH和VL、重链或轻链)。因此，本文提供了宿主细胞，这些宿主细胞含有编码本文所述的蛋白质或抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1-4中提供的抗体的六个CDR、VH、VL、VH和VL、重链、轻链或者重链和轻链的抗体或其抗原结合片段)或其结构域(例如，表3和表4中提供的抗体的VH、VL、VH和VL、重链或轻链)的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至启动子以在宿主细胞中表达此类序列。在一些方面，为了表达双链抗体或其抗原结合片段，可以在宿主细胞中共表达单独编码重链和轻链两者的载体以表达整个免疫球蛋白，如下所详述。在一些方面，宿主细胞含有包含编码本文所述的抗体的重链和轻链两者(例如，表1-4中提供的抗体的重链和轻链)或其结构域(例如，表3-4中提供的抗体的VH和VL)的多核苷酸的载体。在一些方面，宿主细胞含有两种不同的载体，即包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸的第一载体和包含编码本文所述的抗体(例如，包含表1和表2中提供的抗体的六个CDR的抗体)的轻链或轻链可变区或其结构域的多核苷酸的第二载体。在一些方面，第一宿主细胞包含含有编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸的第一载体，并且第二宿主细胞包含含有编码本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1和表2中提供的抗体的六个CDR的抗体或其抗原结合片段)的轻链或轻链可变区的多核苷酸的第二载体。在一些方面，由第一细胞表达的重链/重链可变区与第二细胞的轻链/轻链可变区缔合以形成本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1和表2中提供的抗体的六个CDR的抗体或其抗原结合片段)。在一些方面，本文提供了一种宿主细胞群，该宿主细胞群包含这种第一宿主细胞和这种第二宿主细胞。
在一些方面，本文提供了一种载体群，该载体群包含含有编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的轻链/轻链可变区的多核苷酸的第一载体和含有编码本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1和表2中提供的抗体的CDR的抗体或其抗原结合片段)的重链/重链可变区的多核苷酸的第二载体。替代性地，可以使用编码重链多肽和轻链多肽两者并且能够表达这两者的单个载体。
在一些方面，本文提供了一种载体，该载体包含编码包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的刺突蛋白的多核苷酸例如以用于在宿主细胞中(例如，哺乳动物细胞中)重组表达。
可以利用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的蛋白质和抗体及其抗原结合片段(例如，包含表1和表2中提供的抗体的CDR的抗体或其抗原结合片段)(参见例如，美国专利号5,807,715)。此类宿主表达系统代表可以通过其产生目标编码序列并且随后进行纯化的媒介物，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述的蛋白质或抗体或其抗原结合片段的细胞。这些包括但不限于微生物，诸如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)转化的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或者带有含有源自哺乳动物基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)。在一些方面，用于表达本文所述的蛋白质或抗体及其抗原结合片段(例如，包含表1中提供的抗体的CDR的抗体或其抗原结合片段)的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SystemTM(龙沙(Lonza))的CHO细胞。在一些方面，用于表达本文所述的蛋白质或抗体及其抗原结合片段的细胞是人细胞，例如人细胞系。在一些方面，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一些方面，尤其用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞(诸如大肠杆菌)或真核细胞(例如，哺乳动物细胞)用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，与载体诸如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件相结合是抗体的有效表达系统(Foecking MK和Hofstetter H(1986)Gene[基因]45:101-105；以及Cockett MI等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8:662-667)。在一些方面，本文所述的蛋白质或抗体或其抗原结合片段是由CHO细胞或NS0细胞产生的。
另外，可选择调节所插入序列的表达、或以所希望的特定方式来修饰并且加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)可有助于蛋白质的功能。为此，可以使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源产生任何免疫球蛋白链的鼠类骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在一些方面，在哺乳动物细胞诸如CHO细胞中产生与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的本文所述的抗体或其抗原结合片段。
一旦已经通过重组表达产生本文所述的蛋白质或抗体或其抗原结合片段，就可以通过本领域已知的用于纯化蛋白质或免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法(特别是通过对于蛋白质A后的特异性抗原的亲和力)和尺寸排阻色谱法)、离心、差别溶解度，或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，可以将本文所述的蛋白质或抗体或其抗原结合片段融合至本文所述或本领域中另外已知的异源多肽序列以便促进纯化。
在一些方面，分离或纯化本文所述的蛋白质(例如，包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白)或抗体或其抗原结合片段。通常，分离的蛋白质或抗体或其抗原结合片段是基本上不含具有与分离的抗体或其抗原结合片段不同的抗原特异性的其他蛋白质或抗体或其抗原结合片段的蛋白质或抗体或其抗原结合片段。例如，在一些方面，本文所述的蛋白质(例如，包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白)或抗体或其抗原结合片段的制剂基本上不含细胞材料和/或化学前体。
5.5检测和诊断用途
本文所述的与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的蛋白质(例如，包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白)(参见例如第6.2节)和/或抗体或其抗原结合片段(参见例如第6.3节)可以用于使用本领域技术人员已知的经典方法(包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定生物样品中抗SARS-CoV-2抗体的蛋白质水平。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包括酶标记，诸如葡萄糖氧化酶。此类标记可以用于标记本文所述的抗体或其抗原结合片段或者标记测试样品(例如，从受试者获得的样品)中的抗体或其抗原结合片段。替代性地，可以标记识别本文所述的与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段或者识别测试样品(例如，从受试者获得的样品)中的抗体或其抗原结合片段的第二抗体或其抗原结合片段，并且使用该第二抗体或其抗原结合片段来检测抗SARS-CoV-2抗体。
抗SARS-CoV-2抗体的测定包括直接地(例如，通过确定或估计绝对蛋白质水平)或相对地(例如，通过与第二生物样品中的水平进行比较)定性或定量测量或估计生物样品中的抗SARS-CoV-2抗体。
如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者、细胞系、组织或可能含有抗SARS-CoV-2抗体的其他来源获得的任何生物样品。用于从动物(例如，人)获得组织活检物和体液的方法是本领域熟知的。
本文所述的与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段可以携带可检测或功能性标记。当使用荧光标记时，可以利用当前可用的显微镜术和荧光激活细胞分选分析(FACS)或本领域已知的两种程序的组合来鉴定和定量特异性结合成员。本文所述的与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段可以携带荧光标记。示例性荧光标记包括例如反应性探针和缀合探针，例如氨基香豆素、荧光素和德克萨斯红、Alexa Fluor染料、Cy染料和DyLight染料。与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段可以携带放射性标记，诸如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。当使用放射性标记时，可以利用本领域已知的当前可用的计数程序来鉴定和定量与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段的特异性结合。在标记是酶的情况下，可以通过本领域已知的目前利用的比色、分光光度、荧光分光光度、安培或气体定量技术中的任何一种来完成检测。这可以通过在允许抗体或抗原结合物与SARS-CoV-2的刺突蛋白之间形成复合物的条件下，使样品或对照样品和与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段接触来实现。抗体或抗原结合片段与SARS-CoV-2的刺突蛋白之间形成的任何复合物都在样品中被检测到并且进行比较(任选地和对照进行比较)。鉴于本文所述的与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段对SARS-CoV-2的特异性结合，可以使用这些抗体或其抗原结合片段来特异性检测抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段(例如，在受试者中)。
在一些方面，受试者已经暴露于SARS-CoV-2。在一些方面，受试者还没有暴露于SARS-CoV-2。在一些方面，受试者有暴露于SARS-CoV-2的风险。
本文还包括一种测定系统，该测定系统可以以测试试剂盒的形式制备以定量分析例如抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段的存在程度。该系统或测试试剂盒可以包含标记的组分，例如标记的抗体或抗原结合片段，以及一种或多种其他免疫化学试剂。有关试剂盒的更多信息，参见例如下文第6.6节。
在一些方面，本文提供了用于体外检测样品中的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段的方法，这些方法包括使样品与包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白或包含含有SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白的三聚体接触。本文所述的抗体或其抗原结合片段也可在测定中例如用作阳性对照。
在一些方面，本文提供了一种包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白或包含含有SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白的三聚体，以用于检测(例如，体外)样品中的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段。检测可以使用进一步包括使用本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，作为阳性对照)的测定来进行。
在一个方面，本文提供了一种包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白或包含含有SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白的三聚体，以用作诊断。检测可以使用进一步包括使用本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，作为阳性对照)的测定来进行。
在一些方面，受试者是人。
使用包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白、包含含有SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白的三聚体和/或本文提供的抗体或其抗原结合片段来检测样品中的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段的测定可以包括使刺突蛋白或刺突蛋白三聚体(任选地其中刺突蛋白包含SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列或其中三聚体包含含有SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列的刺突蛋白)与测试样品接触。测试样品可以是从患者获得的样品。测试样品可以是从体液获得的样品。测试样品可以是含有从受试者获得的抗体和/或其抗原结合片段的组合物。测试样品可以含有IgG抗体或其抗原结合片段。测试样品可以含有IgM抗体或其抗原结合片段。测试样品可以含有IgG或IgM抗体或其抗原结合片段。该测定可以进一步包括检测样品中任何抗体或其抗原结合片段与刺突蛋白和/或三聚体的结合。
在一些方面，检测样品中任何抗体或其抗原结合片段与刺突蛋白和/或三聚体的结合包括使用第二抗体或其抗原结合片段。第二抗体或其抗原结合片段可以是与抗体或其抗原结合片段的Fc区结合的抗体或其抗原结合片段。第二抗体或其抗原结合片段可以用可检测标记(例如，本文提供的可检测标记)标记。可检测标记的存在可以指示测试样品中与刺突蛋白和/或三聚体结合的抗体或抗原结合片段的存在。
在一些方面，检测样品中任何抗体或其抗原结合片段与刺突蛋白和/或三聚体的结合包括使用本文提供的抗体或其抗原结合片段例如作为对照。在这种情况下，第二抗体或其抗原结合片段(任选地被标记)可以与本文提供的抗体或其抗原结合片段结合并且可以与样品中的抗体或抗原结合片段结合。
5.6试剂盒
本文提供了试剂盒，这些试剂盒包括本文所述的一种或多种蛋白质、三聚体或抗体或其抗原结合片段或其缀合物。
本文还提供了可以在诊断方法中使用的试剂盒。在一些方面，试剂盒在一个或多个容器中包括包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的刺突蛋白或包含含有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的蛋白质的三聚体。在一些方面，试剂盒在一个或多个容器中包括本文所述的抗体或其抗原结合片段，优选纯化的抗体或其抗原结合片段。在一些方面，本文所述的试剂盒含有本文提供的基本上分离的SARS-CoV-2刺突蛋白或三聚体和/或例如可以用作对照的本文提供的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段。在一些方面，本文所述的试剂盒进一步包括不与SARS-CoV-2刺突蛋白抗原反应的对照抗体或其抗原结合片段。在一些方面，本文所述的试剂盒含有一种或多种用于检测抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合以及抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段的要素(例如，抗体或其抗原结合片段可以缀合至可检测底物(诸如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物)，或者识别第一抗体或其抗原结合片段的第二抗体或其抗原结合片段可以缀合至可检测底物)。在一些方面，本文提供的试剂盒可以包括重组产生或化学合成的SARS-CoV-2刺突蛋白和/或SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体。试剂盒中提供的SARS-CoV-2刺突蛋白和/或三聚体也可以附接至固体支持物。在一些方面，上述试剂盒的检测装置包括SARS-CoV-2刺突蛋白或三聚体所附接的固体支持物。这种试剂盒还可以包括未附接的报告因子标记的抗人抗体或其抗原结合片段或抗小鼠/大鼠抗体或其抗原结合片段。在这方面，可以通过报告因子标记的抗体或其抗原结合片段的结合来检测与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的结合。
以说明的方式而不是以限制的方式提供以下实例。
6.实例
该实例章节(即，第6节)中的实例是以说明的方式而不是以限制的方式提供的。
6.1实例1：与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体
确定人体内是否存在SARS-CoV-2的PCR测试是可用的。阴性PCR测试结果表明在获得PCT测试中使用的样品时人没有被感染。然而，它不会区分尚未被感染的人(因此将来可能被感染和具有传染性)以及以前被感染且现在已经恢复的人(因此将来可能不具有传染性)。测试人体中抗SARS-CoV-2的存在的测定可以区分这两种类型的人。图1示出了患者在不同疾病阶段的病毒RNA和抗体阳性率的动力学。在疾病早期(例如，在症状最初发作后0-5天)，人可能更有可能在PCR测定中测试出SARS-CoV-2阳性并且不太可能具有抗SARS-CoV-2抗体。在疾病后期(例如，在症状最初发作后超过15天)，人可能不再在PCR测定中测试出SARS-CoV-2阳性，但是可能已经产生抗SARS-CoV-2抗体。因此，开发了用于确定抗SARS-CoV-2抗体的存在的测定。
这些测定集中在SARS-CoV-2的刺突蛋白上，因为与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体可以中和病毒。开发了横向流测试(LFT)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。为了测试LFT的性能，产生了抗SARS-CoV-2抗体作为阳性和阴性对照。测定了抗体CV1-CV13(表1-4中提供的序列)与SARS2三聚体和SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)结合的能力。结果在图2中示出。抗体CV7在与三聚体和RBD两者结合方面特别有效。
6.2实例2：抗体不中和SARS-CoV-2假病毒
还测定了抗体中和SARS-CoV-2假病毒的能力。
图3证明了CV1、CV2、CV4、CV6、CV7、CV9、CV10、CV11和CV12抗体不中和SARS-CoV-2假病毒。
6.3实例3：抗体在横向流测试中有效
CV7以IgG形式和IgM形式表达，两种形式均在LFT中被测试出。如图4所示，LFT使用两种CV7形式始终产生精确的结果。
6.4实例4：抗体在酶联免疫吸附测定中有效
为了测试该测定的特异性，在ELISA测定中测试了2019年12月之前从健康志愿者中采集的126份血浆样品(大流行前样品)。结果在图5中示出。该测定的特异性为98％，并且该测定的灵敏度为100％。
6.5实例5：用于检测抗SARS-CoV-2抗体的测定
用于检测抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段的示例性测定在图6中提供。在这种示例性测定中，将黑色384孔Greiner高结合板用每孔20μl的3μg/ml的PBS中的包含SEQID NO:101的氨基酸序列的刺突蛋白三聚体包被。将板在4℃下孵育过夜。然后使板达到室温，并且将其用PBST洗涤三次。然后在室温下添加80μl 1％酪蛋白封闭物保持1小时，之后将板用PBST洗涤三次。然后在室温下添加20μl在1％酪蛋白封闭物中稀释的测试样品(例如，IgG测试样品)保持1.5小时。测试样品可以是从患者(例如，人患者)获得的样品。作为对照，可以将类似的含有对照抗体(例如，CV07)的20μl样品添加到孔中。然后将板用PBST洗涤三次。然后在室温下添加20μl在1％酪蛋白中稀释至50ng/ml的抗人Fc HRP保持1小时，并且将板用PBST再次洗涤三次。然后添加20μl TMB或QuantaBlu底物。对于QuantaBlue，在30分钟后添加20μl终止溶液以终止反应，并且将板在multidrop上振荡20秒。在整个方案中，每次添加后将板以300g离心1分钟。孔中HRP的存在(例如，以与具有对照抗体诸如CV07的孔中HRP的水平相似的水平)表明该孔中的样品含有与SARS-CoV-2的刺突蛋白三聚体结合的抗体或其抗原结合片段。

Claims (46)

1.一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段与包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)的抗体特异性结合SARS-CoV-2的刺突蛋白的相同表位，其中该VH和VL的氨基酸序列包含以下序列：
(a)分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：64；
(b)分别为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：65；
(c)分别为SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：66；
(d)分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：67；
(e)分别为SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：68；
(f)分别为SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：69；
(g)分别为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：70；
(h)分别为SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：71；或者
(i)分别为SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：72。
2.一种竞争性抑制参考抗体与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合的抗体或其抗原结合片段，其中该参考抗体包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该VH和VL的氨基酸序列包含以下序列：
(a)分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：64；
(b)分别为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：65；
(c)分别为SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：66；
(d)分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：67；
(e)分别为SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：68；
(f)分别为SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：69；
(g)分别为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：70；
(h)分别为SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：71；或者
(i)分别为SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：72。
3.一种与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的VH-CDR1-3和VL CDR1-3氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：1、2和3以及SEQ ID NO：28、29和30；
(b)分别为SEQ ID NO：4、5和6以及SEQ ID NO：31、32和33；
(c)分别为SEQ ID NO：7、8和9以及SEQ ID NO：34、35和36；
(d)分别为SEQ ID NO：10、11和12以及SEQ ID NO：37、38和39；
(e)分别为SEQ ID NO：13、14和15以及SEQ ID NO：40、41和42；
(f)分别为SEQ ID NO：16、17和18以及SEQ ID NO：43、44和45；
(g)分别为SEQ ID NO：19、20和21以及SEQ ID NO：46、47和48；
(h)分别为SEQ ID NO：22、23和24以及SEQ ID NO：49、50和51；或者
(i)分别为SEQ ID NO：25、26和27以及SEQ ID NO：52、53和54。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变重链(VH)氨基酸序列选自由以下项组成的组：
(a)SEQ ID NO：55；
(b)SEQ ID NO：56；
(c)SEQ ID NO：57；
(d)SEQ ID NO：58；
(e)SEQ ID NO：59；
(f)SEQ ID NO：60；
(g)SEQ ID NO：61；
(h)SEQ ID NO：62；以及
(i)SEQ ID NO：63。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变轻链(VL)氨基酸序列选自由以下项组成的组：
(a)SEQ ID NO：64；
(b)SEQ ID NO：65；
(c)SEQ ID NO：66；
(d)SEQ ID NO：67；
(e)SEQ ID NO：68；
(f)SEQ ID NO：69；
(g)SEQ ID NO：70；
(h)SEQ ID NO：71；以及
(i)SEQ ID NO：72。
6.一种与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变重链(VH)氨基酸序列选自由以下项组成的组：
(a)SEQ ID NO：55；
(b)SEQ ID NO：56；
(c)SEQ ID NO：57；
(d)SEQ ID NO：58；
(e)SEQ ID NO：59；
(f)SEQ ID NO：60；
(g)SEQ ID NO：61；
(h)SEQ ID NO：62；以及
(i)SEQ ID NO：63。
7.一种与SARS-CoV-2的刺突蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中该可变轻链(VL)氨基酸序列选自由以下项组成的组：
(a)SEQ ID NO：64；
(b)SEQ ID NO：65；
(c)SEQ ID NO：66；
(d)SEQ ID NO：67；
(e)SEQ ID NO：68；
(f)SEQ ID NO：69；
(g)SEQ ID NO：70；
(h)SEQ ID NO：71；以及
(i)SEQ ID NO：72。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的可变重链(VH)氨基酸序列和可变轻链(VL)氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：64；
(b)分别为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：65；
(c)分别为SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：66；
(d)分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：67；
(e)分别为SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：68；
(f)分别为SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：69；
(g)分别为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：70；
(h)分别为SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：71；以及
(i)分别为SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：72。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与SARS-CoV交叉反应。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含重链恒定区。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中该重链恒定区选自由人免疫球蛋白IgG和IgM组成的组。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区。
13.如权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中该轻链恒定区是κ轻链恒定区。
14.如权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中该轻链恒定区是λ轻链恒定区。
15.如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段是全长抗体。
16.如权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。
17.如权利要求16所述的抗原结合片段，其中该抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、单链Fv(scFv)、二硫键连接的FV、V-NAR结构域、IgNar、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab′)3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单结构域抗体、(scFv)2或scFv-Fc。
18.如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段是分离的。
19.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段是单克隆的。
20.如权利要求1-19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段是重组的。
21.如权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不中和SARS-CoV-2。
22.如权利要求1-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段不中和SARS-CoV-2的假病毒。
23.如权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段进一步包含可检测标记。
24.如权利要求23所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述标记选自由酶标记、金颗粒、免疫荧光标记、化学发光标记、磷光标记、放射性标记、亲和素/生物素、有色颗粒和磁性颗粒组成的组。
25.如权利要求24所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述标记通过酶免疫测定、横向流测试、放射免疫测定、蛋白质印迹测定、免疫荧光测定、免疫沉淀测定、化学发光测定、细胞计量术或免疫组织化学测定来检测。
26.一种多肽，该多肽包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
27.如权利要求26所述的多肽，其中该多肽是分离的。
28.如权利要求26或27所述的多肽，其中该多肽是重组产生的或化学合成的。
29.一种三聚体，该三聚体包含如权利要求27或28所述的多肽，任选地其中该三聚体是分离的。
30.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码如权利要求26或27所述的多肽的核酸分子。
31.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子和/或编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子。
32.一种分离的载体，该分离的载体包含如权利要求30或31所述的多核苷酸。
33.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求30或31所述的多核苷酸、如权利要求32所述的载体或包含编码如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的第一载体和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的第二载体。
34.一种制备如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者如权利要求27-27中任一项所述的蛋白质的方法，该方法包括(a)培养如权利要求33所述的细胞；以及(b)从所培养的细胞中分离该抗体或其抗原结合片段或者该蛋白质。
35.一种用于检测样品中的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括使该样品与如权利要求26-28中任一项所述的多肽或如权利要求29所述的三聚体接触，任选地其中该方法进一步包括检测该抗体或抗原-抗原结合片段与该多肽或该三聚体之间的结合。
36.如权利要求35所述的方法，其中该样品是生物样品。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中该检测方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
38.如权利要求35或36所述的方法，其中该检测方法是横向流测定。
39.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中该样品来自人受试者。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中该样品含有IgG抗体或其抗原结合片段。
41.如权利要求36-40中任一项所述的方法，其中该样品含有IgM抗体或其抗原结合片段。
42.如权利要求35-41中任一项所述的方法，该方法包括使用如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段作为对照。
43.一种试剂盒，该试剂盒包括(i)如权利要求26-28中任一项所述的SARS-CoV-2刺突蛋白、如权利要求29所述的三聚体或如权利要求30所述的多核苷酸，以及(ii)与SARS-CoV-2结合的抗体或其抗原结合片段。
44.如权利要求43所述的试剂盒，其中该抗体或其抗原结合片段是如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
45.一种试剂盒，该试剂盒包括如权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及SARS-Co-V2刺突蛋白抗原。
46.如权利要求43-45中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包括反映批准使用或销售的通知。
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