CN108118077A

CN108118077A - 一种酶法水解三文鱼胶原制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺

Info

Publication number: CN108118077A
Application number: CN201611076917.5A
Authority: CN
Inventors: 何海伦; 吴日帮; 杨兴昊; 刘丹; 武翠玲; 张姜; 黄嘉丰; 廖斌强
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2018-06-05

Abstract

本发明设计一种酶解胶原蛋白同时制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺，其方法是以三文鱼皮为原料提取胶原蛋白，利用Vibrio sp.SQS2‑3发酵所得的胞外蛋白酶粗酶液将其水解成短肽溶液，通过3000 Da超滤管4500×g离心超滤45min后获得具有保护肌球蛋白和减缓其Ca²⁺‑ATPase活性在反复冻融中下降作用的抗冻肽，通过Sephadex LH‑20凝胶过滤层析分离下层超滤组份后，获得具有清除DPPH自由基、羟自由基以及对DNA氧化损伤具有一定抑制的能力，并且在氧自由基吸收能力检测中显示出浓度依赖的抗氧化活性的抗氧化肽。LC‑MS技术鉴定出该抗氧化组分含有19条多肽。

Description

一种酶法水解三文鱼胶原制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺

技术领域

本发明涉及一种利用微生物蛋白酶酶解三文鱼皮胶原同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

我国海洋与淡水水域面积广阔，水产资源丰富，占世界水产品总量的36%。随着渔业的发展，水产品加工业的发展也得以推动。据统计，每年有大约两千万吨富含蛋白质的鱼类副产品，如鱼骨、鱼皮、鱼鳍和鱼鳞等，在加工过程中产生，它们大部分被直接掩埋丢弃或用于制作动物饲料、鱼粉等低值产品，不仅造成了严重的资源浪费，还直接导致环境污染。因此，开发出对水产加工业产生的废弃物进行高附加值利用的工艺，使其变废为宝，成为了缓解资源与环境的重要手段。

胶原蛋白广泛存在于动物的表皮和骨组织中，其组成单位为原胶原，每个原胶原分子有三条肽链组成，肽链为α-螺旋结构，以平行右手螺旋形式形成三股螺旋结构。胶原蛋白在氨基酸组成上最重要的特点是以“Gly-X-Y”的形成重复排列，即每隔两个氨基酸残基出现一个甘氨酸，X与Y为其它的氨基酸残基。传统上商业应用的胶原蛋白多来自于动物皮骨，但因疯牛症、口蹄疫等疾病，使人们对牲畜胶原制品安全性产生疑虑。同时由于宗教和习俗等因素，部分地区与群众拒绝使用牲畜胶原制品。许多水生生物中胶原含量非常丰富，也具有一些不同于哺乳动物源胶原蛋白的特点，水产动物胶原蛋白中羟脯氨酸的含量比陆地动物胶原蛋白低得多，这使得水产动物胶原的三螺旋结构的热稳定性更低，在低温下也更易溶于中性盐溶液或酸性溶液，更容易制得可溶性胶原，为胶原的提取和应用提供了有利条件。

近年来，国内外有研究报道利用副产品中的蛋白质成功制备出具有不同生物活性的肽类分子，成为食品、医药、护肤领域中的研究热点，其中包括抗氧化肽、降血压肽、抗菌肽、抗冻肽等。从自然界中发现的生物活性肽种类有限，且提取量少，难度大，难以实现工业化规模的生产，而大分子蛋白质中具有大量不同的氨基酸序列信息，通过生物技术使蛋白质和多肽断裂，释放出不同结构的肽段，这为大规模获得潜在的生物活性肽提供了新的研究思路。

胶原蛋白作为一种数量丰富、来源广泛的低值蛋白，结合生物酶工程技术，开发一种对胶原蛋白高值化综合利用的工艺，对胶原蛋白进行水解，获得介于蛋白质与氨基酸之间的低聚活性胶原肽，在医药、护肤、保健、食品领域有着巨大的潜在市场价值。

发明内容

本发明针对现有生物酶解制备活性肽技术的不足，提供了一种利用微生物胞外蛋白酶酶解从三文鱼皮中提取的胶原蛋白，从不同组份中同时制备分离出具有不同生物活性的胶原肽的工艺方法，使之达到资源综合利用的目的。

步骤如下：

（一）微生物胞外蛋白酶的制备：

1、将产胞外蛋白酶细菌Vibrio sp. SQS2-3菌株接种于液体种子培养基，在17°C水平摇床中震荡培养2-3天，转速为200 rpm，然后按2%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，在17°C水平摇床中震荡培养5天，转速为180 rpm，制得发酵液；

2、将发酵液倒入离心管中进行低温高速离心，离心条件为10000 × g，4°C，30 min，然后收集上清液，倒入新的离心管中，13000 × g，4°C离心15 min，重复2-3遍，直到上清沉淀较少；将上清液加入到分子截留量为8000-14000 Da的透析袋中，用透析袋夹密封，然后放置在浓度为20 mM，pH 7.8的Tris-HCl中冰浴透析2 h，然后更换新的Tris-HCl继续冰浴透析2 h，最后用新的Tris-HCl浸泡透析袋，并放置在4°C冰箱中透析24 h，获得粗酶液，酶液分装到1.5 ml Epperdof管中，置于-20°C冰箱中保存待用。

（二）鱼胶原蛋白的制备：

1、将新鲜三文鱼皮上的鱼肉剔除，把鱼皮切成长约4 cm宽约0.5 cm大小条状，用3倍体积4°C预冷超纯水冲洗鱼皮2-3遍；

2、取20 g鱼皮于100 ml离心管中，加入60 ml超纯水，然后放置在80°C水浴锅中静置水浴30 min，用四层砂布过滤，把滤液倒入新的100 ml离心管中，12000 × g，4°C离心15min，取上清液加入到分子截留量为8000-14000 Da的透析袋中，用透析袋夹密封，放置在4°C超纯水中静置透析2 h，然后更换新的超纯水，继续静置透析16 h；

3、透析后，把透析袋中液体倒入直径为12 cm的玻璃培养皿中，静置在-20°C冰箱中直到液体冻结，然后放置在预冷的真空冷冻干燥机中，设定冻干条件为-40°C，15 Pa，24 h，进行冷冻干燥，获得鱼皮胶原蛋白，用干燥的离心管密封保存在-20°C冰箱中待用。

（三）生物活性肽的制备与纯化鉴定：

1、根据酶与底物比例1：10 （ml/mg）将鱼皮胶原蛋白与粗酶液混合，置于37°C，100 rpm恒温水平摇床中酶解2 h；将酶解液置于95°C水浴锅中加热10 min使酶失活，冷却至室温后，10000 × g，4°C离心5 min去除变性大分子蛋白，收集上清，加入到分子截留量为3 kDa的超滤管中，4500 × g离心45 min，分别收集超滤管上下层滤液，上层滤液具有明显的抗冻效果；

2、使用Sephadex LH-20凝胶色谱柱对下层滤液进行分子筛层析：以两倍体积超纯水作为流动相平衡色谱柱（16 × 600 mm），按柱床体积3-5%上样，用超纯水洗脱3-4倍体积，流速为1 ml/min，检测波长为220 nm，收集活性峰；

3、将收集的活性峰组分放置在-20°C冰箱中直到液体冻结，然后放置在预冷的真空冷冻干燥机中，设定冻干条件为-40°C，15 Pa，24 h，进行冷冻干燥，获得纯度较高的胶原抗氧化肽。

上述步骤（一）中所述海洋细菌Vibrio sp. SQS2-3是从海南省海口市美兰区渠口镇的潮间带海水中分离鉴定所得。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的液体种子培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨0.5份，酵母粉0.1份，Fe₂(PO₄)₃0.001份人工海水100份，pH为7.8。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的发酵培养基组分如下，均为重量份：玉米粉1份，麸皮0.5份，豆粕1份，Na₂HPO₄0.05份，KH₂PO₄0.02份，CaCl₂ 0.05份，Na₂CO₃0.05份，人工海水50份，pH为7.5-8.0。

发明的优点和积极效果

本发明的优点在于将未开发应用的细菌胞外蛋白酶应用与蛋白质酶解工艺上，并通过单酶解即可获得两种具有不同生物活性的肽组份。具体体现在：

1、运用本发明所述方法制备的细菌胞外蛋白酶为本实验室自行发酵制备、鉴定，属于非商业酶类，可以作为创新性新型蛋白酶，减少了酶制剂在生产工艺上的成本；

2、运用本发明所述方法鱼皮胶原蛋白的提取率更高，且方法更简便，成本更低，适合运用于大批量制备蛋白酶解底物；

3、运用本发明所述方法分离生物活性肽只需要进行超滤与凝胶过滤层析即分别可获得两种生物活性组份；

4、运用本发明所述方法制备纯化出的抗冻肽成分能够有效保护肌球蛋白在反复冻融中的活性，在肉类食品保藏、蛋白质制品保存上具有开发和应用价值；

5、运用本发明所述方法制备纯化出的抗氧化肽具有较强的DPPH自由基、羟自由基、过氧自由基清除能力，同时具有保护DNA防止氧化损伤的能力。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述海洋细菌Vibrio sp. SQS2-3是从海南省海口市美兰区渠口镇的潮间带海水中分离鉴定所得。

DPPH、AAPH、荧光素钠购自美国Sigma公司，1,10-邻菲罗啉购自阿拉丁试剂（上海）有限公司，维生素C购自生工生物工程（上海）股份有限公司，NaCl、MgSO₄·7H₂0、KCl、MgCl₂·6H₂0、CaCl₂·H₂0、Fe₂(PO₄)₃购自国药集团化学试剂有限公司，蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司，发酵培养基的配制原料及鱼皮、提取的肌球蛋白所用料可从市场购得。

实施例1：

一种利用Vibrio sp. SQS2-3胞外蛋白酶酶解三文鱼皮胶原制备抗冻肽与抗氧化肽的方法，步骤如下：

1、将细菌Vibrio sp. SQS2-3菌株接种于液体种子培养基，在17°C水平摇床中震荡培养2-3天，转速为200 rpm，然后按2%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，在17°C水平摇床中震荡培养5天，转速为180 rpm，制得发酵液；

上述种子培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨0.5份，酵母粉0.1份，Fe₂(PO₄)₃0.001份，人工海水100份，pH为7.8；

上述发酵培养基组分如下，均为重量份：玉米粉1份，麸皮0.5份，豆粕1份，Na₂HPO₄0.05份，KH₂PO₄0.02份，CaCl₂ 0.05份，Na₂CO₃0.05份，人工海水50份，pH为7.5-8.0。

2、将发酵液倒入离心管中进行冷冻超速离心，离心条件为10000 × g，4°C，30min，然后收集上清，倒入新的离心管中，12000 × g，4°C离心15 min，重复2-3遍，直到上清沉淀较少；收集上清液加入到分子截留量为8000-14000 Da的透析袋中，用透析袋夹密封，然后放置在浓度为20 mM，pH 7.8的Tris-HCl中冰浴透析2 h，然后更换新的Tris-HCl继续冰浴透析2 h，最后用新的Tris-HCl浸泡透析袋，并放置在4°C冰箱中透析24 h，获得粗酶液；

3、将新鲜鲮鱼皮上的鱼肉剔除，把鱼皮切成长约4 cm宽约0.5 cm大小条状，用3倍体积4°C预冷超纯水冲洗鱼皮2-3遍；

4、取20 g脱脂鱼皮于100 ml离心管中，加入60 ml超纯水，然后放置在80°C水浴锅中静置水浴30 min，用四层砂布过滤，把滤液倒入新的100 ml离心管中，12000 × g，4°C离心15min，取上清液加入到分子截留量为8000-14000 Da的透析袋中，用透析袋夹密封，放置在4°C超纯水中静置透析2 h，然后更换新的超纯水，继续静置透析16 h，透析完成后进行冷冻，并放置在预冷的真空冷冻干燥机中，设定冻干条件为-40°C，15 Pa，24 h，进行冷冻干燥，获得鱼皮胶原蛋白；

5、根据酶与底物比例1：10（ml/mg）将鱼皮胶原蛋白与粗酶液混合，置于37°C，100 rpm恒温水平摇床中酶解分别30、60、90、120、150 min；将酶解液置于95°C水浴锅中加热10 min使酶失活，冷却至室温后，10000 × g，4°C离心5 min去除变性大分子蛋白，收集上清；

6、取50 μl不同水解时间的酶解产物溶液，加入100 μl茚三酮-柠檬酸钠溶液，90°C加热20 min，取50 μl反应液，加入100 μl 50%正丙醇，混匀后在570 nm下检测OD值，以不同浓度的亮氨酸溶液作为标准品绘制茚三酮法测定游离氨基的标准曲线，并把所测OD值换算成游离氨基浓度；

结果如图1所示。三文鱼胶原蛋白在Vibrio sp. SQS2-3的蛋白酶酶解作用下，随着作用时间延长，游离氨基的浓度不断上升，说明蛋白质水解程度越来越高，并在120 min后达到相对稳定的程度。

7、取不同酶解时间的胶原酶解产物20 μl，分别加入100 μl DPPH的95%乙醇溶液，然后在室温下密封避光反应1小时，在517 nm处检测吸光度A _i，以20 μl去离子水代替样品作为空白对照管，以100 μl 95%乙醇代替DPPH溶液加入20 μl不同浓度滤液作为样品参比管，DPPH清除率计算公式如下：

DPPH清除率 = 1－(A _i－A _j)/A ₀× 100%

所得结果如图2所示，产物的DPPH自由基清除能力随着酶解时间的延长而上升，并在120 min后达到相对稳定的活性。

8、取120 min酶解时长的胶原酶解产物溶液，加入到分子截留量为3000 Da的超滤管中，4500 × g离心45 min，分别收集超滤管上下层滤液；

9、使用Sephadex LH-20凝胶色谱柱对下层滤液进行分子筛层析：以两倍体积超纯水作为流动相平衡色谱柱（16 × 600 mm），按柱床体积3-5%上样，用超纯水洗脱3-4倍体积，流速为1 ml/min，检测220 nm吸光度，收集各组分峰，并进行真空冷冻干燥，用去离子水将各冻干组分配成200 μM。液相色谱结果如图3所示，下层滤液有7个主要的多肽组份；

10、分别取各分离组分20 μl于200 μl离心管中，然后加入100 μl DPPH的95%乙醇溶液，然后在室温下密封避光反应1小时，在517 nm处检测吸光度A _i，以20 μl去离子水代替样品作为空白对照管，以100 μl 95%乙醇代替DPPH溶液加入20 μl不同浓度滤液作为样品参比管，DPPH清除率计算公式如下：

DPPH清除率 = 1－(A _i－A _j)/A ₀× 100%

结果如图4所示，组份F5的DPPH自由基清除活性最强，达到73.29 ± 1.03%。

11、分别取80 μl于200 μl离心管中，加入40 μl 2 mM FeSO₄, 40 μl 2 mM 邻菲罗啉，充分混匀后加入40 μl 0.03% H₂O₂启动反应，并在37°C水浴锅中反应1小时，在536 nm出检测吸光度A_s，以去离子水代替样品作为阴性组，以去离子水代替H₂O₂作为空白组，吸光度分别为A_n、A_b，羟自由基清除率计算公式如下：

羟自由基清除率 = (A_s– A_n) / (A_b– A_n) × 100%

结果如图5所示，组份F5的羟自由基清除活性最强，达到72.73 ± 3.34%。

12、取20 μl活性组份F5与96孔板中，加入150 μl 96 nM的荧光素钠，在37°C水浴锅中预热5 min后，加入30 μl 320 mM的AAPH溶液，并把96孔板放置在37°C预热的多功能酶标仪中，持续扫描各样品的荧光强度，激发波长为485 nm，检测发射波长为538 nm，时间间隔1 min，持续120 min。

所得结果如图6所示，组份F5具有清除自由基，保护荧光素钠被破坏的能力，使得荧光衰减有所减缓，随着组份浓度的升高，荧光衰减越缓慢。

13、取4 μl组份F5，加入8 μl pET-22b质粒DNA，3 μl 2mM的FeSO₄，轻轻混匀后加入4 μl 0.03 mM的H₂O₂启动反应，37°C水浴锅中孵育10 min，然后用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，电泳条件为130 V，30 min，然后用溴乙锭染色15 min，并在凝胶成像系统中检测DNA。以去离子水代替组份F5作为损伤组。

所得结果如图7所示，与损伤组对比，加入组份F5后质粒DNA的损伤程度有所降低。

14、通过LC-MS技术对组分F5进行分析鉴定，获得19条多肽的氨基酸序列，序列如氨基酸序列表所示。

15、取新鲜猪瘦肉切碎，放入匀浆机中，加入两倍体积的去离子水，用12,000rpm转速匀浆2min，取出匀浆液，以12,000×g，4℃离心15min，弃去上清液，加入一倍体积的1.2MKCl溶液，用12,000rpm转速匀浆2min，取出匀浆液，以12,000×g，4℃离心15min，取上清获得肌球蛋白溶液。以1:1的溶液体积比例肌球蛋白溶液与胶原酶解产物的上层超滤液，通过-20℃冷冻15min与37℃融化15min的冻融方式分别处理3,6,9个循环，取反复冻融后的溶液25μl，加入15μl Tris-malatate(pH 7.0)，25μl 0.1M CaCl₂，172.5μl去离子水，漩涡震荡混匀后，加入12.5μl 20mM ATP，充分混匀，室温下反应10min，加入125μl100g/L的TCA终止反应。去50μl反应液，加入80μl 2.5％钼酸铵，摇匀后，加入20μl新配1％氯化亚锡，定容至1ml，25℃反应10min，在720nm处检测吸光度A_n(n＝冻融次数)。肌球蛋白Ca²⁺-ATPase活性计算如下：

Ca²⁺-ATPase活性＝A_n/A₀×100％

结果如图8所示，肌球蛋白随着冻融次数的增加下降Ca²⁺-ATPase活性不断下降，加入胶原酶解产物的上层超滤液后，Ca²⁺-ATPase活性下降明显减慢。

综上所述，细菌Vibrio sp. SQS2-3分泌的胞外蛋白酶酶解120 min后的三文鱼胶原，通过超滤的方式可获得具有抗冻活性的上层大分子组份以及具有抗氧化活性的下层小分子组分。使用分子筛层析的方法对小分子组分进行进一步分离纯化后可获得高活性多肽组份，实现了胶原蛋白的综合利用。

附图说明

图1. 胶原蛋白水解程度与酶解时间的关系；

图2. 不同酶解程度的胶原酶解产物的DPPH清除能力；

图3. 凝胶过滤层析分离酶解产物3 kD以下组份的色谱图；

图4. 凝胶过滤层析各组份的DPPH清除能力；

图5. 凝胶过滤层析各组份的羟自由基清除能力；

图6. 活性组份F5的氧自由基吸收能力；

图7. 活性组份F5对氧化介导损伤的DNA的保护作用；

图8. 胶原酶解产物3 kD以上组分的抗冻活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> 一种酶法水解三文鱼胶原同时制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺

<130> 1

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 1

Pro Met Arg Gly Gly Gly Gly Tyr His Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> Salmo salar

<400> 2

Pro His Thr Gly Ile Phe Asn Val Pro Met Glu Gly His Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Salmo salar

<400> 3

Pro Gly Thr Ile Val Gly Ser Ala Ala Phe Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 4

Val Gly Lys Val Thr Asn Gly Gly Tyr His

1 5 10

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> Oncorhynchus keta

<400> 5

Gly Ile Thr Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro His Gly

1 5 10 15

Pro Pro Gly Lys Asp Gly Arg Ala Gly Gly His

20 25

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 6

Gly Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Ala

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 7

Gly Ile Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Ala

1 5 10 15

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 8

Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 9

Ala Gly Ala Arg Ser Gly Ala Asp Val Asp Glu Gly Met Glu

1 5 10

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> Oncorhynchus keta

<400> 10

Gly Ala Arg Gly Ala Asp Gly Ser Thr Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly

1 5 10 15

Pro Leu

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 11

Leu Gly Phe Thr Gln Gly Ser Ala Ala Ala Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 12

Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Pro Val Gly

1 5 10 15

Pro Pro Gly Pro Ala

20

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 13

Gly Glu Gly Leu Leu Ala Val Gln Ile Thr Asp Pro Glu Gly Lys

1 5 10 15

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 14

Gly Leu Asn Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Pro His Gly Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> Oncorhynchus keta

<400> 15

Asp Gly Arg Ala Gly Gly His Gly Ala Ile Gly Pro Val Gly His

1 5 10 15

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss

<400> 16

Ile Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> Oncorhynchus keta

<400> 17

Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro His Gly Pro Pro Gly

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Oncorhynchus keta

<400> 18

Gly Ser Val Gly Ile Ala Gly Gly Pro Gly His Gln Gly Pro Gly

1 5 10 15

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> Oncorhynchus keta

<400> 19

Ala Gly Gly Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Gly Tyr Asp

1 5 10

Claims

1.一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：其以三文鱼皮为原料提取胶原蛋白，利用微生物发酵所得的胞外蛋白酶将胶原蛋白水解成短肽，经过分离后获得抗氧化肽与抗冻肽组份。

2.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的胶原蛋白提取方法为利用80°C水浴处理新鲜去肉三文鱼皮30 min，通过透析与冷冻干燥得到胶原蛋白固体。

3.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的微生物为从海南省海口市美兰区渠口镇的潮间带海水中分离鉴定所得Vibrio sp. SQS2-3。

4.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的微生物胞外蛋白酶制备方法为将细菌Vibrio sp. SQS2-3菌株接种于液体种子培养基，在17°C水平摇床中震荡培养2-3天，转速为200 rpm，然后按2%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，在17°C水平摇床中震荡培养5天，转速为180 rpm，制得发酵液；将发酵液倒入离心管中进行冷冻超速离心，离心条件为10000 × g，4°C，30 min，然后收集上清，倒入新的离心管中，12000 × g，4°C离心15 min，重复2-3遍，直到上清沉淀较少；收集上清液加入到分子截留量为8000-14000 Da的透析袋中，用透析袋夹密封，然后放置在浓度为20 mM，pH 7.8的Tris-HCl中冰浴透析2 h，然后更换新的Tris-HCl继续冰浴透析2 h，最后用新的Tris-HCl浸泡透析袋，并放置在4°C冰箱中透析24 h，获得粗酶液。

5.根据权利要求4所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的种子培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨0.5份，酵母粉0.1份，Fe₂(PO₄)₃0.001份，人工海水100份，pH为7.8。

6.根据权利要求4所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的发酵培养基组分如下，均为重量份：玉米粉1份，麸皮0.5份，豆粕1份，Na₂HPO₄0.05份，KH₂PO₄0.02份，CaCl₂ 0.05份，Na₂CO₃0.05份，人工海水50份，pH为7.5-8.0。

7.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的短肽制备方法为根据酶与底物比例1：10（ml/mg）将三文鱼皮胶原蛋白与粗酶液混合，置于37°C，100 rpm恒温水平摇床中酶解120 min；将酶解液置于95°C水浴锅中加热10 min使酶失活，冷却至室温后，10000 × g，4°C离心5 min去除变性大分子蛋白，收集上清，获得胶原短肽。

8.根据权利要求1所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的抗氧化肽与抗冻肽组份分离方法如下

a. 取权利要求7中获得的胶原短肽加入到分子截留量为3 kDa的超滤管中，4500 × g离心45 min，分别收集超滤管上下层滤液，上层为抗冻肽组份；

b. 取上述下层滤液，使用Sephadex LH-20凝胶色谱柱对下层滤液进行分子筛层析：以两倍体积超纯水作为流动相平衡色谱柱（16 × 600 mm），按柱床体积3-5%上样，用超纯水洗脱3-4倍体积，流速为1 ml/min，检测220 nm吸光度，收集活性峰，并进行真空冷冻干燥，获得抗氧化肽组份。

9.根据权利要求1或8所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的抗氧化肽具有清除DPPH自由基、羟自由基以及对DNA氧化损伤具有一定抑制的能力，并且在氧自由基吸收能力检测中显示出剂量效应。

10.根据权利要求1或8所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的抗氧化肽组分LC-MS结果显示具有19条多肽。

11.根据权利要求10所述的19条多肽，其特征在于：所述的多肽氨基酸序列如说明书氨基酸序列附件所示。

12.根据权利要求1或8所述的一种同时制备抗氧化肽与抗冻肽的方法，其特征在于：所述的抗冻肽具有保护肌球蛋白，减缓其Ca²⁺-ATPase活性在反复冻融中的下降的作用。