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CN116406792A - 一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒在制备治疗结肠炎的功能性食品及药物中的应用 - Google Patents

一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒在制备治疗结肠炎的功能性食品及药物中的应用 Download PDF

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CN116406792A
CN116406792A CN202310289227.1A CN202310289227A CN116406792A CN 116406792 A CN116406792 A CN 116406792A CN 202310289227 A CN202310289227 A CN 202310289227A CN 116406792 A CN116406792 A CN 116406792A
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probiotic
fucoxanthin
vesicle
mice
colitis
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苏文涛
梁铎
钟旭
谭明乾
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Dalian Polytechnic University
Original Assignee
Dalian Polytechnic University
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Abstract

一种益生菌囊泡‑岩藻黄素复合纳米颗粒在制备治疗结肠炎的功能性食品及药物中的应用。本发明属于生物医药领域。本发明从可食用材料中分离的天然细胞外囊泡克服了合成纳米颗粒的局限性，所合成的纳米颗粒作为活性成分应用于治疗结肠炎的功能性食品及药物中时，可以相对自由地经由黏膜穿过上皮细胞被我们身体吸收，并调节所分布器官中的免疫和炎症反应，对结肠炎的治疗有明显的效果。

Description

一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒在制备治疗结肠炎 的功能性食品及药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒在制备治疗结肠炎的功能性食品及药物中的应用。
背景技术
结肠炎在过去150年中出现，被认为是一种相对较新的疾病。近几十年来，炎症性肠病已被视为一个全球性的健康问题，因为它的发病率在世界各地飙升，特别是在亚洲地区。该疾病的症状包括反复发作的腹痛、严重或血性腹泻、腹胀和呕吐，其发病机制与多种因素有关，包括遗传基因、上皮屏障缺陷、免疫反应失调和环境因素。目前，该疾病的治疗主要集中在免疫抑制和手术治疗。免疫抑制治疗法包括使用免疫抑制剂、全身性皮质类固醇和5-氨基水杨酸在内的药物治疗。疾病更严重的患者需通过手术切除结肠。虽然这些方法在短期内对炎症性肠病有效，但是这些方法对人体的副作用极大，因此炎症性肠病的治疗仍是现代医学面临的严峻挑战。因此，一种利用食物生物活性化合物进行营养干预已成为治疗结肠炎的一种有发展前景的长期治疗或预防策略。
纳米颗粒在过去几十年里被广泛的应用于人体内各种炎症的治疗，因此以纳米颗粒为基础的解决方案为炎症性肠病的治疗提供了新思路。广泛的研究表明，纳米粒子显著改善了药物治疗剂的药代动力学特征和化学稳定性，例如小分子药物、多肽等。
胞外囊泡(EVs)是从动物身体组织和体液中自然释放的纳米级膜囊泡。其结构类似于脂质体，是生物活性化合物纳米传递系统的理想载体，目前已进入多项临床试验。不同来源的细胞外囊泡具有不同的功能，目前，囊泡的合成来源是一些癌细胞系，限制了其在食品体系中的应用，因此，如何克服合成纳米颗粒的局限性是本领域亟待解决的技术难题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒在制备治疗结肠炎的功能性食品及药物中的应用。本发明从可食用材料中分离的天然细胞外囊泡克服了合成纳米颗粒的局限性，所合成的纳米颗粒作为活性成分应用于治疗结肠炎的功能性食品及药物中时，可以相对自由地经由黏膜穿过上皮细胞被我们身体吸收，并调节所分布器官中的免疫和炎症反应，对结肠炎的治疗有明显的效果。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
本发明的目的之一在于是提供一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒的应用，所述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒用于制备治疗结肠炎的功能性食品。
作为本发明应用的一种优选方案，其中：所述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒中岩藻黄素包封于益生菌囊泡内。
作为本发明应用的一种优选方案，其中：所述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒的制备方法如下：
S1：将益生菌培养后离心，收集益生菌细胞重悬于磷酸盐缓冲液，加入溶菌酶处理，然后离心，收集原生质体沉淀；
S2：将原生质体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，在低温条件下，依次进行超声破碎和逐步离心，获得菌膜碎片沉淀；
S3：将菌膜碎片沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液中，得到菌膜碎片溶液；
S4：将岩藻黄素溶解于溶剂中，然后与菌膜碎片溶液混合，低温超声，得到混合液；
S5：将混合液离心去除溶剂，冻干，得到益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S1中益生菌为植物乳杆菌。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S1中溶菌酶为蛋清溶菌酶。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S1中溶菌酶的添加量为益生菌细胞重悬液的1-10mg/mL。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S1中加入溶菌酶，在35-40℃处理12-48h。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S1中溶菌酶处理后离心的参数为：3000-10000×g下离心5-20min。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S2中低温是指0-4℃。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S2中超声破碎5-30min。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S2中逐步离心具体过程：先于3000-10000×g下离心5-20min，然后于15000-25000×g下离心30-60min，最后在100000-200000×g下,离心30-120min。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S3中菌膜碎片溶液的浓度为1-10mg/mL。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S4中溶剂为极性溶剂或非极性溶剂中的一种。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S4中溶剂中岩藻黄素的浓度为1-20mg/mL。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S4中岩藻黄素与菌膜碎片的质量比为1:(1-10)。
作为本发明复合纳米颗粒制备方法的一种优选方案，其中：S5中离心为在100000-200000×g下离心30-120min。
本发明的目的之二在于是提供一种治疗结肠炎的功能性食品，所述功能性食品以益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒作为活性成分。
作为本发明功能性食品的一种优选方案，其中：所述功能性食品中还包含食品级助剂。
本发明的目的之三在于是提供一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒的应用，所述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒用于制备治疗结肠炎的药物。
本发明的目的之四在于是提供一种治疗结肠炎的口服药物，所述口服药物以上述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒作为活性成分。
本发明的目的之五在于是提供一种治疗结肠炎的注射药物，所述注射药物以上述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒作为活性成分，将其溶解于生理盐水制成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明以益生菌作为原料，使用溶菌酶处理以去除细胞壁，高效获得原生质体，利用超声与超速离心方法联用，获得质膜碎片，再通过超声自组装的原理，形成囊泡，这种制备方式极大的提高了益生菌衍生胞外囊泡的产量，将其用于制备包封岩藻黄素的复合纳米颗粒，克服了合成纳米颗粒的局限性。
(2)本发明制备的基于岩藻黄素的纳米颗粒作为活性成分应用于DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠，结果显示，纳米颗粒FX-MVs减轻了小鼠的结肠炎症状，包括体重减轻、结肠长度减少和DAI指数。同时，FX-MVs下调促炎细胞因子的表达，上调抗炎细胞因子的表达。此外，FX-MVs可以调节肠道微生物群的组成，并恢复SCFAs的产生。
附图说明
图1为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs治疗效果图；其中(A)为随时间的推移小鼠的体重变化趋势示意图，(B)为随时间的推移小鼠的平均体重改变示意图，(C)为随着时间推移小鼠疾病活动指数示意图，(D)为经过治疗结束的小鼠模型身体变化直观图；
图2为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移对小鼠结肠炎的干预效果；其中(A)为小鼠的结肠长度、出血程度的直观示意图，(B)为小鼠模型结肠长度的结果，(C)为小鼠结肠切片结果图；
图3a为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内炎症因子COX-2检测图；
图3b为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内炎症因子TNF-α检测图；
图3c为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内炎症因子IL-6检测图；
图3d为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内炎症因子IL-10检测图；
图3e为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内炎症因子NO检测图；
图3f为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内炎症因子MPO检测图；
图3g为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内抗氧化指标T-AOC检测图；
图3h为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠体内抗氧化指标GSH检测图；
图4为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠结肠中巨噬细胞极化情况分析；
图5a为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠结肠内容物中短链脂肪酸乙酸含量变化示意图；
图5b为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠结肠内容物中短链脂肪酸丁酸含量变化示意图；
图5c为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠结肠内容物中短链脂肪酸丙酸含量变化示意图；
图5d为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠结肠内容物中短链脂肪酸异丁酸含量变化示意图；
图5e为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠结肠内容物中短链脂肪酸戊酸含量变化示意图；
图5f为DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠口服FX-MVs后随时间的推移小鼠结肠内容物中短链脂肪酸异戊酸含量变化示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例
本实施例的益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
S1：先配制MRS液体培养基，灭菌后按1％接入植物乳酸菌，37℃培养24h。然后将植物乳杆菌悬浮液以8000×g离心10分钟，收集益生菌细胞重悬于10mL磷酸盐缓冲液溶液中，加入40mg的蛋清溶菌酶，35℃处理24小时，除去细胞壁，然后将混合液以80000×g离心10分钟，原生质体沉淀；
S2：将200mg S1得到的原生质体沉淀重悬于40mL磷酸盐缓冲液中，在0℃下，先超声破碎30分钟，然后进行逐步离心，获得菌膜碎片沉淀；所述逐步离心具体是：先在3500×g下离心10分钟，收集上清液A。将上清液A在20000×g条件下离心30分钟，收集上清液B。最后将上清液B在100000×g条件下，离心60分钟；
S3：将40mg S2得到的菌膜碎片沉淀重悬于5mL无菌磷酸盐缓冲液中，得到菌膜碎片溶液；
S4：将5mg岩藻黄质(FX)溶解于0.5mL乙醇中，然后与5mL步骤S3得到的菌膜碎片溶液混合，在0℃条件下超声30分钟，得到混合液；
S5：将混合液在100000×g条件下，离心60分钟，收集沉淀，冻干后，得到益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒，记为FX-MVs。
SyMVs的制备与实施例的区别之处在于：省略S4中省略岩藻黄质的乙醇溶液的加入，直接将S3的菌膜碎片溶液在0℃条件下超声30分钟，然后进行S5的操作。
实施例制备的益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒(FX-MVs)作为制备治疗结肠炎的药物中的活性成分，对于治疗结肠炎效果的验证试验如下：
(一)动物实验过程：
(1)小鼠分组：
SPF级6周龄BALB/c雄性小鼠购自于沈阳长生生物科技有限公司。动物饲养环境温度为20±2℃，相对湿度为60±5％，光照环境和黑暗环境每隔12h循环交替进行。
雄性BALB/c小鼠适应环境一周后，随机分配5组，每组10只：空白对照组(Control)、DSS(葡聚糖硫酸钠盐)对照组(DSS)、岩藻黄质对照组(FX)、囊泡对照组(SyMVs)和益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒治疗组(FX-MVs)。
(2)处理：
整个实验周期为期23天，前14天时，接受样品处理的小鼠以每只小鼠体重计按2mg/kg的剂量灌胃口服样品。
第15天起，DSS对照组、FX对照组、SyMVs对照组和FX-MVs治疗组的小鼠给予4％葡聚糖硫酸钠盐(w/w)饮用水，并继续接受样品灌胃，持续一周。
实验期间每天记录各组小鼠体重的变化情况，观察小鼠粪便形态，检查粪便中隐血情况。实验进行至第21天时，停止样品灌胃，自由引用纯净水直至第23天时，处死小鼠，收集所有小鼠的血清、结肠组织和肠道内容物，并在-80℃保存，部分结肠组织固定在4％多聚甲醛/PBS(v/v)中用于进一步分析。
(二)实验效果检测：
(1)对DSS诱导结肠炎小鼠的缓解效果(溃疡性结肠炎最常见的临床指标是体重减轻、粘液、脓和血便)：
在整个实验过程中，所有小鼠的体重变化趋势明显(图1A)，可以看出，空白对照组的体重逐渐增加，而DSS组的体重急剧下降。此外，用FX、SyMVs和FX-MVs治疗分别减轻了小鼠的体重减轻(图1B)。同时，FX、SyMVs和FX-MVs处理组小鼠的疾病活动指数(DAI)低于DSS处理的小鼠的DAI(图1C)。
此外，DSS组小鼠结肠出现充血、水肿和明显缩短。相比之下，空白对照组结肠组织的颜色和长度正常，没有充血、水肿和与周围组织的粘连。在FX、SyMVs和FX-MVs处理的小鼠中，结肠缩短和组织水肿的症状减轻，并且FX-MVs治疗组的效果最好(图2A)。FX-MVs治疗缓解了结肠长度变短(图2B)。此外，H&E染色显示对照组小鼠结肠组织柱状上皮致密，肠隐窝完整，粘膜层和粘膜下层之间有清晰的夹层。相反，DSS处理引起结肠结构的严重损伤，包括不规则上皮和隐窝中的结构变形，而病理学特征通过FX-MVs得到改善(图2C)。这些结果表明，FX-MVs可以有效地减轻DSS诱导的结肠炎小鼠结肠的病理变化。
(2)对结肠炎小鼠炎症因子及抗氧化指标测定结果
如图3所示，结肠组织中T-AOC和GSH水平被认为是衡量抗氧化能力的重要因素。DSS组中的T-AOC和GSH水平显著降低，而FX-MVs组中的T-AOC和GSH水平可以维持在接近对照组的水平。值得注意的是，FX组的抗氧化能力显著高于SyMVs组，因为FX增强细胞抗氧化能力的功能与其多种细胞途径的调节功能密切相关。与DSS组相比，使用FX-MVs显著降低了DSS诱导的结肠炎小鼠中NO、MPO和COX-2的水平，但是在FX组的小鼠之间没有观察到显著差异。与空白对照组相比，在补充SyMVs和FX-MVs后，DSS组中血清中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌显著降低。此外，还检测了结肠组织中抗炎细胞因子IL-10的浓度。在治疗SyMVs和FX-MVs后，抗炎细胞因子IL-10的水平显著增加。
(3)对小鼠结肠巨嗜细胞极化的影响。
在这项研究中，对小鼠结肠组织的CD86和CD163蛋白进行荧光染色，分别作为M1和M2巨噬细胞的标记。如图4所示，在DSS组的结肠中有大量红色荧光(CD86)。而在SyMVs和FX-MVs治疗后，结肠中CD163(绿色荧光)的表达显著上调，而CD86的表达急剧下调。这些变化表明，SyMVs和FX-MVs表现出增加M2巨噬细胞的数量，减少M1巨噬细胞的数量的能力，有助于阻碍结肠炎的发展。
(4)对小鼠结肠短链脂肪酸含量的影响。
小鼠结肠测定小鼠结肠内容物中的SCFAs(图5)。与对照组相比，DSS组小鼠结肠中乙酸、丁酸、丙酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的含量降低。除丙酸和异丁酸外，DSS组和FX组的其他SCFAs差异显著。值得注意的是，FX-MVs组中所有检测到的SCFAs水平显著高于DSS组。这些结果表明，FX-MVs治疗可以恢复肠道微生物群的平衡和短链脂肪酸的产生，从而延缓结肠炎的发展。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒的应用，其特征在于，它用于制备治疗结肠炎的功能性食品。
2.一种益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒的应用，其特征在于，它用于制备治疗结肠炎的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒中岩藻黄素包封于益生菌囊泡内。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒的制备方法如下：
S1：将益生菌培养后离心，收集益生菌细胞重悬于磷酸盐缓冲液，加入溶菌酶处理，然后离心，收集原生质体沉淀；
S2：将原生质体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，在低温条件下，依次进行超声破碎和逐步离心，获得菌膜碎片沉淀；
S3：将菌膜碎片沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液中，得到菌膜碎片溶液；
S4：将岩藻黄素溶解于溶剂中，然后与菌膜碎片溶液混合，低温超声，得到混合液；
S5：将混合液离心去除溶剂，冻干，得到益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S1中益生菌为植物乳杆菌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S1中溶菌酶为蛋清溶菌酶。
7.一种治疗结肠炎的功能性食品，其特征在于，它以权利要求3中所述的益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒作为活性成分。
8.根据权利要求7所述的功能性食品，其特征在于，其中还包含食品级助剂。
9.一种治疗结肠炎的口服药物，其特征在于，它以权利要求3中所述的益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒作为活性成分。
10.一种治疗结肠炎的注射药物，其特征在于，它以权利要求3中所述的益生菌囊泡-岩藻黄素复合纳米颗粒作为活性成分，将其溶解于生理盐水制成。
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