CN116332996B - L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗冠状病毒化合物及其制备方法和应用，其中，所述抗冠状病毒化合物的分子式为C28H37N6O8P，分子量为688.67，所述抗冠状病毒化合物的结构式为：和/或。本发明的抗冠状病毒化合物能够有效抑制冠状病毒的活性，可以作为莫努匹拉韦的替代药物，在与莫努匹拉韦抗病毒活性相当的前提下具有更小的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及一种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物及其制备方法和应用，属于药物化学技术领域。
背景技术
冠状病毒(英文名：Coronavirus)属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。此病毒在电子显微镜下可见如日冕般外围的冠状，因此被称为冠状病毒(Coronaviridae)。1975年，病毒命名委员会，正式命名冠状病毒科。包括鼻病毒、B814病毒、229E病毒、OC43株、以及会感染人类并引起严重呼吸系统疾病的，比如中东呼吸综合征(MERS)、严重急性呼合征(SARS，SARS是冠状病毒的一个变种，是引起非典型肺炎的病原体)以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等，其感染症状可从普通感冒到重症肺部感染。
新型冠状病毒肺炎COVID-19潜在靶标分为结构蛋白与非结构蛋白以及其他冠状病毒治疗相关靶标三大类，结构蛋白(structure protein)包括棘突蛋白(SurfaceGlycoprotein,Spike Protein)、E蛋白(Envelope protein,E Protein)、M蛋白(membraneprotein)和N蛋白(Nucleocapsid Phosphoprotein,N protein)，非结构蛋白包括复制酶多蛋白1ab、3C样蛋白酶(3C-like protease)、木瓜样蛋白酶(Papain-like protease)、NSP12(RDRP，RNA依赖性RNA聚合酶)、Helicase,Nsp13(RNA解旋酶)、Nsp14(Guanine-N7methyltransferase)、Nsp15(Uridylate-specific endoribonuclease)、Nsp16(2'-O-methyl transferase，2'-O-甲基转移酶)，其他冠状病毒治疗相关靶标主要是ACE2(血管紧张素转化酶2)。
新冠病毒治疗药物主要包括三种类型，各有不同的侧重方向和适用人群：小分子抗病毒药物可针对轻中重症患者、中和抗体主要针对轻中症患者、免疫调节药物基本只用于重症患者。目前，根据作用机制不同，新冠小分子抗病毒药物主要包括RNA聚合酶抑制剂、3CL蛋白酶抑制剂等。全球已获批的作用于新型冠状病毒聚合酶(RdRp)的新冠治疗小分子药物仅有4款，包括吉利德科学公司的瑞德西韦(Remdesivir)、默沙东和Ridgeback公司共同研制的莫努匹拉韦(Molnupiravir)、河南真实生物科技有限公司的阿兹夫定、以及上海旺实生物医药科技有限公司的氢溴酸氘瑞米德伟(VV116)。但是，截至目前为止，没有一款药物能够成为新冠病毒或者冠状病毒的特效药。
有鉴于此，确有必要提供一种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物及其制备方法和应用，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药效高、毒性低的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物，所述抗冠状病毒的化合物分子式为C28H37N6O8P，分子量为688.67，所述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的结构式为：
和/或
作为本发明的进一步改进，所述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物为白色固体。
本发明的又一目的在于提供一种具有上述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的药物组合物。
为实现上述目的，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的单位剂量形式的上述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物、立体异构体或其药物可接受的盐，及药学上可接受的载体或辅料。
本发明的又一目的在于提供上述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的应用。
为实现上述目的，本发明提供了上述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物在制备预防和/或治疗与冠状病毒有关的药物的应用。
作为本发明的进一步改进，所述冠状病毒包括2019-nCoV，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。
本发明的又一目的在于提供一种药效高、毒性低的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的制备方法。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种抗冠状病毒的化合物的制备方法，包括以下步骤：
在氮气保护条件下，化合物13溶在四氢呋喃和水的混合溶剂中，冷却后加三氟乙酸，然后室温下反应；经薄层色谱法和LCMS监测反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH7～8，浓缩，过C18反相柱，冻干得目标化合物1和目标化合物2，其中，目标化合物1和目标化合物2为手性化合物。
作为本发明的进一步改进，所述化合物13的制备方法包括以下步骤：
在氮气保护条件下，将化合物9溶在二甲基甲酰胺中，冷却后滴加t-BuMgCl的二甲基甲酰胺溶液进行反应，然后滴加化合物12的二甲基甲酰溶液后加热反应，经薄层色谱法和LCMS监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化铵溶液中，用乙酸乙酯进行萃取，有机相经干燥、浓缩、柱层析后得到化合物13，所述化合物13为黄色固体。
作为本发明的进一步改进，所述化合物9的制备方法包括以下步骤：
步骤一：
在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有化合物1的甲醇溶液中，滴加浓硫酸进行反应，经薄层色谱层析监测反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7～8，经干燥，过滤，浓缩，柱层析得化合物2，其中所述化合物1有L-核糖，所述化合物2为黄色油状物；
步骤二：
在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有化合物2的二甲基甲酰胺溶液中，加入60％钠氢，然后滴加苄溴；待苄溴滴加完成后，在室温反应过夜。经薄层色谱层析监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化氨的冰水溶液，用乙酸乙酯进行萃取，其中，有机相经洗涤、干燥、过滤、浓缩、柱层析后得化合物3，其中，所述化合物3为黄色油状物3；
步骤三：
在氮气保护条件下，在溶有化合物3的乙酸溶液中，滴加盐酸后，进行加热反应；反应完成后，反应液减压浓缩,浓缩后用乙酸乙酯和水溶解，有机相经洗涤、干燥、过滤、浓缩后得到化合物4；
步骤四：
将化合物4浓缩后溶在干燥二甲基亚砜中，加乙酸酐,在氮气保护条件下，室温反应至完成后，反应液减压浓缩后溶在乙酸乙酯中，经洗涤、干燥、过滤、减压浓缩、柱层析后得到化合物5，所述化合物5为黄色油状物；
步骤五：
在氮气保护条件下，在溶有4-氨基-7-溴吡咯并[2,1-F][1,2,4]三嗪的干燥四氢呋喃溶液中，加三甲基氯硅烷后，室温进行反应，待反应液冷却至-78℃后，将n-BuLi正己烷溶液滴加到反应液中，然后将溶解在干燥的四氢呋喃中的化合物5滴加到反应液中反应，待反应完成后，加乙酸淬灭反应后，经减压浓缩后用二氯甲烷和水溶解，有机相洗涤、干燥、过滤、浓缩、柱层析后得到化合物6，所述化合物6为黄色固体；
步骤六：
在氮气保护条件下，把化合物6溶在干燥二氯甲烷溶液中，冷却后，加三甲基硅氰后，加三甲基硅三氟甲磺酸酯至反应液中进行反应，待反应完成后，加饱和碳酸氢钠溶液淬灭并进行搅拌，区分出有机相和水相后，对有机相进行干燥、过滤、浓缩、柱层析后得到化合物7，所述化合物7为黄色固体；
步骤七：
在氮气保护条件下，把化合物7溶在二氯甲烷溶液中，冷却后滴加含有BCl3的正己烷溶液，然后进行冷却反应，反应完成后，加入甲醇淬灭、减压浓缩、C18反相柱分离后得到化合物8，所述化合物8为淡黄色固体；
步骤八：
在氮气保护条件下，化合物8和2，2’-二甲氧基丙烷溶在丙酮中，加浓硫酸，加热反应，经薄层色谱法监测反应完成后，用碳酸氢钠中和至pH 7～8，经浓缩、柱层析后得到化合物9，所述化合物9为黄色固体。
作为本发明进一步地改进，所述化合物12的制备方法包括以下步骤：
步骤一：
在氮气保护条件下，化合物10和2-乙基-1-丁醇溶在甲苯中，加对甲苯磺酸后加热，用分水器分水后反应，经薄层色谱和LCMS检测反应完成后，浓缩、用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7～8、用二氯甲烷进行萃取，有机相经干燥、浓缩、柱层析后得到化合物11，其中，所述化合物10为2-甲基丙氨酸，所述化合物11为白色固体；
步骤二：
在氮气保护条件下，三氯氧磷和化合物11的对甲苯磺酸盐溶在二氯甲烷中，冷却后滴加三乙胺进行反应，再加入三乙胺和邻羟基苯甲酸乙酯的二氯甲烷溶液进行反应，再加三乙胺和对硝基苯酚进行反应。经薄层色谱和LCMS监测反应完成后，浓缩、过C18反相柱后得化合物12，其中，所述化合物11为2-甲基丙氨酸2-乙基丁酯，所述化合物12为黄色油状物。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物及其制备方法和应用，该L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物能够有效抑制冠状病毒的活性，可以作为为莫努匹拉韦的替代药物，在与莫努匹拉韦抗病毒活性相当的前提下具有更小的细胞毒性。
附图说明
图1是本发明的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的核磁图谱。
图2是本发明的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的LCMS谱图。
图3是目标化合物1的核磁图谱。
图4是目标化合物2的核磁图谱。
图5是化合物13的核磁图谱。
图6是化合物2的核磁图谱。
图7是化合物3的核磁图谱。
图8是化合物5的核磁图谱。
图9是化合物6的核磁图谱。
图10是化合物7的核磁图谱。
图11是化合物8的核磁图谱。
图12是化合物9的核磁图谱。
图13是化合物11的核磁图谱。
图14是化合物12的核磁图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
请参阅图所示，本发明提供了一种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物，所述抗冠状病毒的化合物分子式为C28H37N6O8P，分子量为688.67，所述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的结构式为：
和/或
进一步地，所述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物为手性化合物，包括目标化合物1和目标化合物2。即，L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物其呋喃糖环为L构型。
进一步地，L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物为白色固体，可以根据具体的施用方式被配制成各种本领域熟知的制剂形式，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂。
本发明另外提供了一种具有上述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的药物组合物。该药物组合物包含治疗有效量的单位剂量形式的上述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物、立体异构体或其药物可接受的盐，及药学上可接受的载体或辅料。
本发明另外提供了上述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的应用。该L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物在制备预防和/或治疗与冠状病毒有关的药物的应用。
进一步地，所述冠状病毒包括2019-nCoV，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中2019-nCoV能够引发新型冠状病毒肺炎COVID-19，SARS-CoV能够引发重症急性呼吸综合征，MERS-CoV能够引发中东呼吸综合征。
进一步地，该L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物与也用于制备预防和/或治疗与冠状病毒的变异病毒株有关的药物。
本发明另外提供了一种药效高、毒性低的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的制备方法，该制备方法条件温和，易于合成，适合于工业生产。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种抗冠状病毒的化合物的制备方法，包括以下步骤：
在氮气保护条件下，化合物13溶在四氢呋喃(THF)和水的混合溶剂中，冷却后加三氟乙酸，然后室温下反应；经薄层色谱法(TLC)和LCMS监测反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7～8，浓缩，过C18反相柱，冻干得目标化合物1和目标化合物2，其中，目标化合物1和目标化合物2为手性化合物，且目标化合物1和目标化合物2均为白色固体。
优选地，在氮气保护条件下，化合物13(550mg，0.755mmol，1.0eq)溶在混合溶剂(5.5mL，THF/H2O＝10：1)中，冷却至0℃，加入4.5mL三氟乙酸，然后室温反应24小时。通过薄层色谱法(TLC)和LCMS监测反应过程。其中，TLC的展开剂为二氯甲烷(DCM)和甲醇(MeOH)，并且DCM：MeOH＝10：1，在UV254nm下进行检测。待反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7～8，浓缩、过C18反相柱(MeCN/H2O 0～100％)、冻干得目标化合物1和目标化合物2的混合物，该混合物为白色固体。
在本实施例中，该混合物的重量为385mg。在其他实施例中，由于采用的化合物的剂量不同等原因，其得到的混合物的重量也不同。
优选地，在本实施例中，经过反应得到的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物为目标化合物1和目标化合物2的混合物，命名为β-L-1-氰基-2-甲基瑞媛药，其分子量为689.3，核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.35–8.01(d,J＝57.5Hz,3H),7.98–7.94(s,1H),7.77–7.71(d,J＝7.7Hz,1H),7.58–7.45(m,2H),7.30–7.23(m,1H),6.97–6.93(s,1H),6.89–6.84(dd,J＝7.5,3.4Hz,1H),5.83–5.76(d,J＝9.5Hz,1H),4.68–4.63(d,J＝4.9Hz,1H),4.32–4.23(qd,J＝7.0,3.5Hz,4H),4.23–4.14(dt,J＝10.5,5.4Hz,1H),4.00–3.92(m,1H),3.89–3.85(dt,J＝5.4,2.4Hz,2H),1.42–1.36(m,1H),1.34–1.30(d,J＝3.3Hz,6H),1.30–1.20(qd,J＝8.7,7.9,4.7Hz,8H),0.82–0.76(tt,J＝7.6,2.1Hz,6H)。
该混合物的核磁图谱和LCMS图谱见图1和图2。
该混合物经过分离可以具体得到目标化合物1和目标化合物2。
目标化合物1的分子量为689.3，核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01–7.83(s,3H),7.77–7.70(d,J＝7.5Hz,1H),7.56–7.45(m,2H),7.30–7.21(m,1H),6.92–6.87(d,J＝4.5Hz,1H),6.87–6.82(d,J＝4.5Hz,1H),6.34–6.28(d,J＝6.0Hz,1H),5.81–5.74(d,J＝9.5Hz,1H),5.42–5.31(s,1H),4.70–4.63(m,1H),4.35–4.13(m,5H),3.98–3.92(t,J＝5.8Hz,1H),3.92–3.83(m,2H),1.45–1.36(p,J＝6.2Hz,1H),1.36–1.19(m,12H),0.84–0.75(td,J＝7.5,2.4Hz,6H)。
目标化合物2的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01–7.79(s,3H),7.77–7.71(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.58–7.50(ddd,J＝8.8,7.3,1.8Hz,1H),7.50–7.44(d,J＝8.3Hz,1H),7.31–7.23(t,J＝7.4Hz,1H),6.91–6.86(d,J＝4.5Hz,1H),6.86–6.80(d,J＝4.5Hz,1H),6.34–6.28(d,J＝6.1Hz,1H),5.81–5.74(d,J＝9.5Hz,1H),5.40–5.34(d,J＝5.7Hz,1H),4.71–4.64(m,1H),4.34–4.21(q,J＝7.1Hz,4H),4.21–4.12(dd,J＝10.8,5.6Hz,1H),4.01–3.93(q,J＝5.6Hz,1H),3.92–3.84(m,2H),1.45–1.36(p,J＝6.2Hz,1H),1.35–1.18(m,13H),0.83–0.74(td,J＝7.5,1.6Hz,6H)。
目标化合物1和目标化合物2的核磁图谱见图3和图4。
需要知道的是，制备L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物所需的化合物13可以通过自行制备而得到，也可以通过购买等途径得到，本发明对此不予限制。
进一步地，在本实施例中，化合物13为自行研发制备。其中，化合物13的制备方法包括以下步骤：
在氮气保护条件下，将化合物9溶在二甲基甲酰胺中，冷却后滴加t-BuMgCl的二甲基甲酰胺溶液进行反应，然后滴加化合物12的二甲基甲酰溶液后加热反应，经薄层色谱法和LCMS监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化铵溶液中，用乙酸乙酯进行萃取，有机相经干燥、浓缩、柱层析后得到化合物13，所述化合物13为黄色固体。
优选地，在氮气保护条件下，化合物9(500mg，1.51mmol,1.0eq)溶在6mL的干燥二甲基甲酰胺(DMF)中，冷却至0℃，滴加1M t-BuMgCl的DMF溶液(3.0mL，3.0mmol，2.0eq)，然后在0℃条件下反应30分钟，然后滴加化合物12(1.62g，3.02mmol，2.0eq)的DMF溶液,最后加热至50℃反应2小时。TLC(DCM：MeOH＝10：1,UV254nm)和LCMS监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化铵溶液中，用乙酸乙酯萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、柱层析(MeOH/DCM 0～20％)得到化合物13，所述化合物13为黄色固体，分子量为729.3，在本实施例中的重量为600mg。
化合物13的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05–7.85(s,3H),7.76–7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.53–7.48(m,1H),7.46–7.41(d,J＝8.3Hz,1H),7.30–7.22(t,J＝7.1Hz,1H),6.92–6.88(dd,J＝4.6,1.9Hz,1H),6.87–6.83(t,J＝4.9Hz,1H),5.87–5.78(dd,J＝12.8,9.5Hz,1H),5.43–5.31(dd,J＝22.5,6.5Hz,1H),5.02–4.90(m,1H),4.59–4.50(d,J＝3.2Hz,1H),4.29–4.20(dd,J＝7.1,4.0Hz,2H),4.20–4.14(t,J＝6.3Hz,2H),4.12–4.06(d,J＝5.2Hz,1H),3.89–3.84(dd,J＝5.8,3.3Hz,2H),1.67–1.61(s,3H),1.38–1.33(s,4H),1.33–1.28(d,J＝3.2Hz,7H),1.28–1.22(d,J＝1.7Hz,7H),0.82–0.75(dd,J＝7.3,1.1Hz,6H)。
化合物13的核磁图谱见图5。
需要知道的是，制备化合物13所需要的化合物9和化合物12可以通过自行制备而得到，也可以通过购买等途径得到，本发明对此不予限制。
在本实施例中，化合物9和化合物12均为自行研发制备。
进一步地，所述化合物9的制备方法包括以下步骤：
步骤一：
在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有化合物1的甲醇溶液中，滴加浓硫酸进行反应，经薄层色谱层析监测反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7～8，经干燥，过滤，浓缩，柱层析得化合物2，其中所述化合物1为L-核糖，所述化合物2为黄色油状物。
优选地，在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有L-核糖(26g，0.173mol，1.0eq)的干燥甲醇(260mL)溶液中，滴加浓硫酸(3.0mL，57.09mmol，0.33eq)。浓硫酸滴加完成后，在室温反应5小时。TLC(PE：EA＝5：1，UV254nm)监测反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH7～8，干燥、过滤、浓缩、柱层析(EA/PE 0～50％)得化合物2，化合物2为黄色油状物，其分子量为332.1，在本实施例中的重量为29.65g。
化合物2的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.77–4.72(m,1H),4.06–4.00(m,1H),4.00–3.95(dd,J＝12.4,3.8Hz,1H),3.95–3.91(m,1H),3.75–3.69(dd,J＝11.7,3.5Hz,1H),3.57–3.51(dd,J＝11.8,6.4Hz,1H),3.37–3.34(s,3H)。
化合物2的核磁图谱见图6。
步骤二：
在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有化合物2的二甲基甲酰胺溶液中，加入60％钠氢，然后滴加苄溴；待苄溴滴加完成后，在室温反应过夜。经薄层色谱层析监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化氨的冰水溶液，用乙酸乙酯进行萃取，其中，有机相经洗涤、干燥、过滤、浓缩、柱层析后得化合物3，其中，所述化合物3为黄色油状物3。
在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有化合物2(26g，0.158mol,1.0eq)的干燥DMF(260mL)溶液中，60％钠氢(31.6g，0.79mmol，5.0eq)分三批加入其中，然后滴加苄溴(108.01g,0.632mol，4.0eq)。苄溴滴加完成后，在室温反应过夜。TLC(PE：EA＝5：1,UV254nm)监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化氨的冰水溶液，用乙酸乙酯萃取三次。有机相用盐水洗涤、用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩、柱层析(EA/PE 0～30％)得化合物3，化合物3为黄色油状物3，其分子量为452.34，在本实施中的重量为43.29g。
化合物3的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.42–7.22(m,15H),4.95–4.90(s,1H),4.71–4.60(q,J＝11.9Hz,2H),4.59–4.52(m,3H),4.49–4.42(d,J＝11.8Hz,1H),4.39–4.32(m,1H),4.06–3.99(dd,J＝7.1,4.7Hz,1H),3.88–3.82(m,1H),3.65–3.59(dd,J＝10.6,3.7Hz,1H),3.56–3.49(dd,J＝10.6,5.8Hz,1H)。
化合物3的核磁图谱见图7。
步骤三：
在氮气保护条件下，在溶有化合物3的乙酸溶液中，滴加盐酸后，进行加热反应；反应完成后，反应液减压浓缩,浓缩后用乙酸乙酯和水溶解，有机相经洗涤、干燥、过滤、浓缩后得到化合物4。
优选地，在氮气保护条件下，在溶有化合物3(43.29g,99.62mmol,1.0eq)的乙酸(430mL)溶液中，滴加1M盐酸(109.6mL，109.6mmol，1.1eq)。滴加完成后，反应液加热到80℃反应4小时。反应完成后，反应液减压浓缩,浓缩后用乙酸乙酯和水溶解，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤、饱和食盐水洗涤、用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩、得到粗品化合物4，直接用于下一步。
步骤四：
将化合物4浓缩后溶在干燥二甲基亚砜(DMSO)中，加乙酸酐,在氮气保护条件下，室温反应至完成后，反应液减压浓缩后溶在乙酸乙酯中，经洗涤、干燥、过滤、减压浓缩、柱层析后得到化合物5，所述化合物5为黄色油状物。
将化合物4浓缩后溶在220mL干燥的DMSO中，加乙酸酐(132mL,1.045mol,1.5eq),在氮气保护条件下，室温反应过夜。反应完成后，反应液减压浓缩、溶在乙酸乙酯中，用水洗、碳酸氢钠溶液洗、饱和食盐水洗、干燥、过滤、减压浓缩、柱层析(EA/PE 0～100％，UV254nm)得到化合物5。化合物5为黄色油状物，其分子量为436.3，在本实施例中的重量为33.63g。
化合物5的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.42–7.18(m,15H),4.77–4.55(m,6H),4.51–4.46(s,2H),4.33–4.27(d,J＝5.4Hz,1H),3.70–3.65(d,J＝3.4Hz,2H)。
化合物5的核磁图谱见图8。
步骤五：
在氮气保护条件下，在溶有4-氨基-7-溴吡咯并[2,1-F][1,2,4]三嗪的干燥四氢呋喃溶液中，加三甲基氯硅烷(TMSCl)后，室温进行反应，待反应液冷却至-78℃后，将n-BuLi正己烷溶液滴加到反应液中，然后将溶解在干燥的四氢呋喃中的化合物5滴加到反应液中反应，待反应完成后，加乙酸淬灭后，经减压浓缩后用二氯甲烷和水溶解，有机相洗涤、干燥、过滤、浓缩、柱层析后得到化合物6，所述化合物6为黄色固体。
优选地，在氮气保护条件下，在溶有4-氨基-7-溴吡咯并[2,1-F][1,2,4]三嗪(17.4g,81.67mmol,1.0eq)的干燥四氢呋喃(175mL)溶液中，加TMSCl(19.52g，179.67mmol，2.2eq)。加完后，反应室温反应20分钟，然后，反应液冷却至-78℃，1.6M的n-BuLi正己烷溶液滴加到反应液中反应10分钟，化合物5(34.18g，81.67mol，1.0eq)溶在干燥的四氢呋喃中滴加到反应液中。滴加完成后，反应在-78℃反应4小时。反应完成后，加乙酸淬灭并在-78℃反应10分钟、减压浓缩,浓缩后用二氯甲烷和水溶解，有机相用饱和食盐水洗涤、用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩、柱层析(乙酸乙酯/石油醚0～100％，UV254nm)得到化合物6，化合物6为黄色固体，分子量为553.3，在本实施例中的重量为7.36g。
化合物6的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.12–8.00(s,2H),8.00–7.96(s,1H),7.79–7.76(s,2H),7.74–7.61(d,J＝22.5Hz,4H),7.60–7.57(dd,J＝2.6,1.6Hz,2H),7.37–7.22(m,13H),7.18–7.11(m,3H),7.02–6.97(dd,J＝7.4,2.2Hz,2H),6.95–6.92(d,J＝4.8Hz,1H),6.87–6.83(dd,J＝4.3,1.6Hz,2H),6.62–6.57(dd,J＝4.3,2.6Hz,2H),5.42–5.35(d,J＝6.0Hz,1H),5.07–5.01(d,J＝5.2Hz,1H),4.60–4.54(dt,J＝11.7,2.5Hz,2H),4.48–4.43(m,3H),3.95–3.90(dd,J＝6.0,4.4Hz,1H),3.72–3.66(dd,J＝10.1,3.5Hz,1H),3.51–3.43(dd,J＝10.1,6.4Hz,1H)。
化合物6的核磁图谱见图9。
步骤六：
在氮气保护条件下，把化合物6溶在干燥二氯甲烷溶液中，冷却后，加三甲基硅氰(TMSCN)后，加三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)至反应液中进行反应，待反应完成后，加饱和碳酸氢钠溶液淬灭并进行搅拌，区分出有机相和水相后，对有机相进行干燥、过滤、浓缩、柱层析后得到化合物7，所述化合物7为黄色固体。
优选地，在氮气保护条件下，把化合物6(7.75g，14.02mmol，1.0eq)溶在干燥二氯甲烷(75mL)溶液中，冷却至-78℃，加TMSCN(5.38g，54.23mmol，3.87eq)。加完后，反应10分钟，然后加TMSOTf(11.5mL，63.09mmol，4.5eq)到反应液中，反应2小时。反应完成后，加饱和碳酸氢钠溶液淬灭并搅拌10分钟、分出有机相、水相用二氯甲烷萃取三次，合并的有机相用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩、柱层析(甲醇/二氯甲烷0～20％，UV254nm)得到化合物7，化合物7为黄色固体，其分子量为562.3，在本实施例中的重量为2.90g。
化合物7的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01–7.82(d,J＝19.5Hz,3H),7.37–7.22(m,15H),6.88–6.85(d,J＝4.6Hz,1H),6.77–6.74(d,J＝4.6Hz,1H),4.92–4.89(d,J＝5.0Hz,1H),4.87–4.82(d,J＝11.7Hz,1H),4.79–4.74(d,J＝11.7Hz,1H),4.56–4.51(dd,J＝9.0,3.9Hz,2H),4.51–4.48(d,J＝3.7Hz,2H),4.14–4.09(m,1H),3.72–3.66(dd,J＝11.1,3.6Hz,1H),3.61–3.56(dd,J＝11.0,4.7Hz,1H)。
化合物7的核磁图谱见图10。
步骤七：
在氮气保护条件下，把化合物7溶在二氯甲烷溶液中，冷却后滴加含有BCl3的正己烷溶液，然后进行冷却反应，反应完成后，加入甲醇淬灭、减压浓缩、C18反相柱分离后得到化合物8，所述化合物8为淡黄色固体。
优选地，在氮气保护条件下，把化合物7(2.8g，4.99mmol，1.0eq)溶在干燥二氯甲烷(30mL)溶液中，冷却至-20℃，滴加1M BCl3的正己烷溶液(29.81mL，29.81mmol，6.0eq)。加完后，冷却至-78℃，反应2小时。反应完成后，在-78℃加甲醇淬灭、减压浓缩、C18反相柱分离(乙腈/水0～100％，UV254nm)得到化合物8，化合物8为淡黄色固体，其在本实施例中的重量为0.99g。
化合物8的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04–7.80(d,J＝5.2Hz,3H),6.94–6.86(m,2H),6.14–6.06(d,J＝6.3Hz,1H),5.22–5.15(d,J＝5.3Hz,1H),4.95–4.88(dd,J＝6.3,5.2Hz,1H),4.67–4.62(dd,J＝6.3,5.1Hz,1H),4.08–4.03(m,1H),3.98–3.93(q,J＝5.3Hz,1H),3.68–3.60(ddd,J＝12.2,5.2,3.4Hz,1H),3.54–3.47(ddd,J＝12.2,6.3,4.5Hz,1H)。
化合物8的核磁图谱见图11。
步骤八：
在氮气保护条件下，化合物8和2，2’-二甲氧基丙烷溶在丙酮中，加浓硫酸，加热反应，经薄层色谱法监测反应完成后，用碳酸氢钠中和至pH 7～8，经浓缩、柱层析后得到化合物9，所述化合物9为黄色固体。
优选地，在氮气保护条件下，化合物8(500mg，1.72mmol，1.0eq)和2，2’-二甲氧基丙烷(0.95mL，7.74mmol，4.5eq)溶在丙酮(10mL)中，加浓硫酸(0.12mL，2.24mmol，1.3eq),加热至50℃反应1小时。TLC(DCM：MeOH＝10：1,UV254nm)监测反应完成后，用碳酸氢钠中和至pH 7～8，浓缩、柱层析(MeOH/DCM 0～20％)得化合物9，化合物9为黄色固体，分子量为332.2，在本实施例中的重量为520mg。
化合物9的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06–7.82(d,J＝12.9Hz,3H),6.93–6.87(m,2H),5.40–5.34(d,J＝6.6Hz,1H),5.03–4.98(t,J＝5.7Hz,1H),4.91–4.86(dd,J＝6.6,3.1Hz,1H),4.33–4.28(td,J＝5.3,3.0Hz,1H),3.59–3.45(dtd,J＝17.4,11.6,5.6Hz,2H),1.68–1.57(s,3H),1.41–1.32(s,3H)。
化合物9的核磁图谱见图12。
进一步地，所述化合物12的制备方法包括以下步骤：
步骤一：
在氮气保护条件下，化合物10(2-甲基丙氨酸)和2-乙基-1-丁醇溶在甲苯中，加对甲苯磺酸后加热，用分水器分水后反应，经薄层色谱和LCMS检测反应完成后，浓缩、用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7～8、用二氯甲烷进行萃取，有机相经干燥、浓缩、柱层析后得到化合物11，其中，所述化合物10为2-甲基丙氨酸，所述化合物11为白色固体。
优选地，在氮气保护条件下，2-甲基丙氨酸(20g,194mmol,1.0eq)和2-乙基-1-丁醇(29.7g,291mmol,1.5eq)溶在甲苯(200mL)中，加对甲苯磺酸(37g,213.4mmol,1.1eq)，加热至130℃并用分水器分水，反应16小时。TLC(DCM：MeOH＝10：1，UV254nm/I2)和LCMS检测反应完成后，浓缩、用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7～8、用二氯甲烷萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩得粗品。粗品柱层析(MeOH/DCM 0～20％)得到化合物11。该化合物11为白色固体，分子量为188.3，在本实施例中的重量为28g，产率为40.2％。
化合物11的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.54–7.47(m,2H),7.13(d,J＝8.0Hz,2H),4.05(d,J＝5.5Hz,2H),2.30(s,3H),1.52(p,J＝6.1Hz,1H),1.38(s,6H),1.35–1.27(m,4H),0.85(dt,J＝13.2,7.4Hz,6H)。
化合物11的核磁图谱见图13。
步骤二：
在氮气保护条件下，三氯氧磷和化合物11的对甲苯磺酸盐溶在二氯甲烷中，冷却后滴加三乙胺进行反应，再加入三乙胺和邻羟基苯甲酸乙酯的二氯甲烷溶液进行反应，再加三乙胺和对硝基苯酚进行反应。经薄层色谱和LCMS监测反应完成后，浓缩、过C18反相柱后得化合物12，其中，所述化合物11为2-甲基丙氨酸2-乙基丁酯，所述化合物12为黄色油状物。
在氮气保护条件下，三氯氧磷(1.0g，6.52mmol，1.0eq)和2-甲基丙氨酸2-乙基丁酯对甲苯磺酸盐(2.46g，6.85mmol，1.05eq)溶在干燥二氯甲烷(10mL)中，冷却至-70℃，滴加三乙胺(1.38g，13.69mmol，2.1eq)后反应三小时，再加三乙胺(0.69g，6.85mmol，1.05eq)和邻羟基苯甲酸乙酯(1.14g，6.85mmol，1.05eq)的二氯甲烷溶液反应三小时，再加三乙胺(1.50g，14.62mmol，1.05eq)和对硝基苯酚(2.03g，14.62mmol，1.05eq)室温反应过夜。TLC(PE：EA＝3：1，UV254nm)和LCMS监测反应完成后，浓缩、过C18反相柱(MeCN/H2O 0～100％)，得到化合物12，该化合物12为黄色油状物，其分子量为537.17，在本实施例中的重量为1.49g，产率为42.6％。
化合物12的核磁数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.35–8.26(m,2H),7.79–7.72(dt,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.67–7.58(ddd,J＝8.9,7.3,1.9Hz,1H),7.58–7.51(d,J＝8.7Hz,1H),7.51–7.44(m,2H),7.37–7.28(t,J＝7.5Hz,1H),6.60–6.53(d,J＝10.1Hz,1H),4.27–4.14(qt,J＝7.1,3.6Hz,2H),3.89–3.83(d,J＝5.6Hz,2H),1.45–1.38(d,J＝2.1Hz,6H),1.38–1.29(p,J＝6.3Hz,1H),1.29–1.18(td,J＝7.2,4.4Hz,8H),0.86–0.73(m,6H)。
化合物12的核磁图谱见图14。
需要知道的是，在本实施例中，各个化合物均为自行制备得到，在其他实施例中，各个化合物也可以通过购买等途径得到，本发明对此不予限制。而且，上述化合物的制备步骤也不是必须的，可以根据实际实验需要进行增加或者删减或者调整反应顺序，本发明对此不予限制。另外，由于采用的化合物的剂量不同等原因，所得到的化合物的重量也不同，本领域技术人员可根据实际操作进行调整。
本发明进一步针对该冠状病毒化合物进行了抗冠状病毒活性及细胞毒性测试。
以本发明制备的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物(包括目标化合物1、目标化合物2及目标化合物1和目标化合物2的混合物)为试验样品，以已上市的莫努匹拉韦(Molnupiravir)为对照药，应用在含有冠状病毒的Bel7402细胞株上(厦门大学提供)，进行抗冠状病毒活性及细胞毒性测试。其中，莫努匹拉韦(Molnupiravir)是美国默沙东和Ridgeback公司共同研制的美国仅有的两款已批准上市的小分子核苷类抗新冠病毒抑制剂之一，并正式被中国引进和批准使用。
细胞毒性测试步骤：
96孔板接种Bel7402细胞(1.5*104/孔)，培养24h。吸去培养液后，加入100μL/孔的待测药物溶液，即，L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物溶液(目标化合物1、目标化合物2及目标化合物1和目标化合物2的混合物)和莫努匹拉韦溶液，每个浓度设2个复孔，正常对照组加入等体积培养液。在37℃、5％CO2的孵箱孵育Bel7402细胞48h后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液15μL，继续孵育4h。吸去上清液，每孔加入100μL DMSO，低速振荡溶解，在490nm处测定OD值，与正常组细胞做对比，计算细胞存活率(药物组平均OD值–空白OD值)/(正常对照组平均OD值-空白OD值)×100％。
抗冠状病毒活性测试步骤：
96孔板接种Bel7402细胞(2.5*104/孔)，培养24h。吸去上清液，药物实验组和病毒对照组加入10-2HCoV病毒液100μL/孔，37℃、5％CO2培养箱吸附5h。吸去培养液，药物实验组加入100μL/孔的待测药物溶液，每个浓度设2个复孔，正常对照组和病毒对照组加入等体积维持培养液。37℃，5％CO2孵箱孵育72h后，MTT法测定细胞活性(方法同上)，计算细胞存活率(药物组平均OD值–空白OD值)/(正常对照组平均OD值-空白OD值)×100％。
具体结果见表1。
表1抗冠状病毒活性和细胞毒性试验结果
由表1结果可知，在细胞毒性试验中，在药物浓度低于125μM时，在没有感染背景的情况下，三种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物，即目标化合物1、目标化合物2、目标化合物1和目标化合物2的混合物(其中，混合物中目标化合物1和目标化合物2的比例为1：1)的细胞存活率都高于对照药莫努匹拉韦的细胞存活率，即，三种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的细胞毒性均不明显，且三种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的毒性比对照药莫努匹拉韦的毒性均更低。尤其在31.25μM的浓度下，三种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的细胞存活率分别达到了96.5％、99.0％、97.8％，而对照药莫努匹拉韦的细胞活性分别为70.5％，即，试验样品的细胞存活率均高于对照药莫努匹拉韦，也就是说，本发明的三种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物与已上市的莫努匹拉韦相比，细胞毒性较低，对人体伤害较小。
在抗冠状病毒活性药效试验中，在目前高攻毒背景下，三种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物在0.04μM浓度下仍具有一定的抗病毒活性，细胞活性分别为72.9％、75.9％、74.4％，高于病毒对照的60％，且与对照药莫努匹拉韦的抗病毒活性相当，具备进一步研究的价值，可以有效替代莫努匹拉韦，且本发明的三种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的制备方法简单、温和、价格低廉，为治疗冠状病毒的药物开发提供了方向。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物，其特征在于，所述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的结构式为：
和/或。
2.根据权利要求1所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物，其特征在于：所述L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物为白色固体。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的单位剂量形式的权利要求1~2任一项所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物或其药物可接受的盐，及药学上可接受的载体或辅料。
4.一种如权利要求1~2任一项所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物在制备预防和/或治疗与冠状病毒有关的药物的应用。
5.根据权利要求4所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物在制备预防或治疗与冠状病毒有关的药物的应用，其特征在于，所述冠状病毒包括2019-nCoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV 和MERS-CoV。
6.一种L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的制备方法，其特征在于，应用于权利要求1~2任一项所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物，包括以下步骤：
；
在氮气保护条件下，化合物13溶在四氢呋喃和水的混合溶剂中，冷却后加三氟乙酸，然后室温下反应；经薄层色谱法和LCMS监测反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7~8，浓缩，过C18反相柱，冻干得目标化合物1和目标化合物2，其中，目标化合物1和目标化合物2为手性化合物。
7.根据权利要求6所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的制备方法，其特征在于：所述化合物13的制备方法包括以下步骤：
；
其中，化合物12为：
；
在氮气保护条件下，将化合物9溶在二甲基甲酰胺中，冷却后滴加t-BuMgCl 的二甲基甲酰胺溶液进行反应，然后滴加化合物12的二甲基甲酰溶液后加热反应，经薄层色谱法和LCMS监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化铵溶液中，用乙酸乙酯进行萃取，有机相经干燥、浓缩、柱层析后得到化合物13，所述化合物13为黄色固体。
8.根据权利要求7所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物9的制备方法包括以下步骤：
步骤一：
；
在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有化合物1的甲醇溶液中，滴加浓硫酸进行反应，经薄层色谱层析监测反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7~8，经干燥，过滤，浓缩，柱层析得化合物2，其中所述化合物1为L-核糖，所述化合物2为黄色油状物；
步骤二：
；
在氮气保护和冰水浴条件下，在溶有化合物2的二甲基甲酰胺溶液中，加入60%钠氢，然后滴加苄溴；待苄溴滴加完成后，在室温反应过夜；经薄层色谱层析监测反应完成后，反应液倒入饱和氯化氨的冰水溶液，用乙酸乙酯进行萃取，其中，有机相经洗涤、干燥、过滤、浓缩、柱层析后得化合物3，其中，所述化合物3为黄色油状物3；
步骤三：
；
在氮气保护条件下，在溶有化合物3的乙酸溶液中，滴加盐酸后，进行加热反应；反应完成后，反应液减压浓缩, 浓缩后用乙酸乙酯和水溶解，有机相经洗涤、干燥、过滤、浓缩后得到化合物4；
步骤四：
；
将化合物4浓缩后溶在干燥二甲基亚砜中，加乙酸酐, 在氮气保护条件下，室温反应至完成后，反应液减压浓缩后溶在乙酸乙酯中，经洗涤、干燥、过滤、减压浓缩、柱层析后得到化合物5，所述化合物5为黄色油状物；
步骤五：
；
在氮气保护条件下，在溶有4-氨基-7-溴吡咯并[2 ,1-F][1 ,2 ,4]三嗪的干燥四氢呋喃溶液中，加三甲基氯硅烷后，室温进行反应，待反应液冷却至-78℃后，将n-BuLi正己烷溶液滴加到反应液中，然后将溶解在干燥的四氢呋喃中的化合物5滴加到反应液中反应，待反应完成后，加乙酸淬灭反应后，经减压浓缩后用二氯甲烷和水溶解，有机相洗涤、干燥、过滤、浓缩、柱层析后得到化合物6，所述化合物6为黄色固体；
步骤六：
；
在氮气保护条件下，把化合物6溶在干燥二氯甲烷溶液中，冷却后，加三甲基硅氰后，加三甲基硅三氟甲磺酸酯至反应液中进行反应，待反应完成后，加饱和碳酸氢钠溶液淬灭并进行搅拌，区分出有机相和水相后，对有机相进行干燥、过滤、浓缩、柱层析后得到化合物7，所述化合物7为黄色固体；
步骤七：
；
在氮气保护条件下，把化合物7溶在二氯甲烷溶液中，冷却后滴加含有BCl3的正己烷溶液，然后进行冷却反应，反应完成后，加入甲醇淬灭、减压浓缩、C18反相柱分离后得到化合物8，所述化合物8为淡黄色固体；
步骤八：
；
在氮气保护条件下，化合物8和2，2’-二甲氧基丙烷溶在丙酮中，加浓硫酸，加热反应，经薄层色谱法监测反应完成后，用碳酸氢钠中和至pH 7~8，经浓缩、柱层析后得到化合物9，所述化合物9为黄色固体。
9.根据权利要求7所述的L-呋喃核糖型抗冠状病毒化合物的制备方法，其特征在于：所述化合物12的制备方法包括以下步骤：
步骤一：
；
在氮气保护条件下，化合物10和2-乙基-1-丁醇溶在甲苯中，加对甲苯磺酸后加热，用分水器分水后反应，经薄层色谱和LCMS 检测反应完成后，浓缩、用饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7~8、用二氯甲烷进行萃取，有机相经干燥、浓缩、柱层析后得到化合物11，其中，所述化合物10为2-甲基丙氨酸，所述化合物11为白色固体；
步骤二：
；
在氮气保护条件下，三氯氧磷和化合物11的对甲苯磺酸盐溶在二氯甲烷中，冷却后滴加三乙胺进行反应，再加入三乙胺和邻羟基苯甲酸乙酯的二氯甲烷溶液进行反应，再加三乙胺和对硝基苯酚进行反应；经薄层色谱和LCMS监测反应完成后，浓缩、过C18反相柱后得化合物12，其中，所述化合物11为2-甲基丙氨酸2-乙基丁酯，所述化合物12为黄色油状物。
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