CN116218932A

CN116218932A - 利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法及其发酵残余物的应用

Info

Publication number: CN116218932A
Application number: CN202211637743.0A
Authority: CN
Inventors: 赵峰; 董梅
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Qufu Normal University
Priority date: 2022-12-20
Filing date: 2022-12-20
Publication date: 2023-06-06

Abstract

本发明提供一种利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法及其发酵残余物的应用。以豆腐、豆浆等豆制品的加工副产物豆渣为营养基质，添加适量的无机盐、水、秸秆制成固态培养基；接种CGMCC NO.26136枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）种子液，在一定温度下固态发酵生产脂肽生物表面活性剂。发酵结束后，利用溶剂浸提固态发酵培养物，经浸出液收集、pH调节、低温静置、离心等过程获得脂肽生物表面活性剂；脂肽提取后剩余的固态发酵残余物用于开发微生物肥料。本发明生产脂肽生物表面活性剂的产量高、工艺绿色，且发酵过程中无泡沫产生。本发明既实现豆渣的髙附加值资源化利用，又降低脂肽生物表面活性剂的生产成本。

Description

利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法及其发酵残余物的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法及其发酵残余物的应用。

背景技术

豆腐和豆浆等豆制品加工残渣（豆渣）是豆制品加工过程中产生的主要副产物。中国有着悠久的大豆食品生产历史，豆腐和豆浆的产销量大，豆渣的产量也很大。豆渣的主要成分是水、蛋白质、多糖、纤维素、脂肪酸、氨基酸等。豆渣营养丰富、便宜易得，具有很大的应用潜力。目前主要用作畜禽饲料，限制了豆渣的髙值转化利用，造成资源的极大浪费。随着科学技术的发展，人们逐渐认识到应通过多种途径充分利用豆渣这一资源。豆渣可以作为微生物生长代谢的优良底物。微生物转化豆渣有望生产出许多高附加值产品。

脂肽类生物表面活性剂主要由枯草芽孢杆菌等安全菌株合成，在食品、农业、医药卫生、提高石油采收率和环境修复等方面具有巨大的应用潜力。然而，高昂的生产成本限制了脂肽的商业化生产和应用。在脂肽的生产成本中，发酵底物成本占很大一部分。除了原料成本高外，与其他生物表面活性剂一样，脂肽的液态发酵也面临着严重的泡沫问题。发酵过程中泡沫的产生增加了染菌风险和脂肽产物的损失，严重影响脂肽的生产效率，并且泡沫控制又进一步增加了脂肽的生产成本。

固态发酵可以大大降低生物表面活性剂发酵过程中的泡沫产生，是一种无泡沫发酵生产脂肽的替代方法。廉价、适宜的固态营养基质是影响脂肽固态发酵技术发展的重要因素。此外，固态发酵残余物的合理处置也是固态发酵技术中亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法及其发酵残余物的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法及其发酵残余物的应用，利用豆腐和豆浆等豆制品加工残渣（豆渣）为基质、以农作物秸秆为支撑物制备固态发酵培养基，以保藏编号为CGMCC NO. 26136的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为发酵菌种，通过固态发酵生产脂肽类生物表面活性剂；脂肽提取后的固态发酵残余物用于开发微生物肥料。

固态发酵培养基由豆渣、农作物秸秆和无机盐水溶液按比例混合搅拌而成；豆渣为豆腐、豆奶等豆制食品的加工副产物，秸秆为小麦秸秆或水稻秸秆；无机盐包括NH₄Cl、KH₂PO₄、K₂HPO₄⋅3H₂O、MgSO₄⋅7H₂O、CaCl₂⋅2H₂O、NaCl、KCl。

利用豆渣固态发酵生成脂肽的方法，具体步骤如下：

1）固体培养基制备：固态发酵培养基由豆渣、农作物秸秆和无机盐水溶液按1~2kg:0.1~0.2kg:0.3~1L的比例混合搅拌而成；无机盐水溶液组成：4.0 g/L NH₄Cl、4.0 g/LKH₂PO₄、5.0 g/L K₂HPO₄⋅3H₂O、0.8 g/L MgSO₄⋅7H₂O、0.2 g/L CaCl₂⋅2H₂O、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L KCl，余量为水。按比例混合后的固态发酵培养基在115℃灭菌30min，备用。

2）发酵菌种种子液制备：液体LB培养基在115℃灭菌30min，冷却后，将枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136接种至液体LB培养基中，在30~40℃、120~220rpm 转速下培养8~12h，制备发酵菌种的种子液。

3）固态发酵：将将枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136的种子液以1%~6%（mL/100g固态培养基）的比例接种到豆渣固态培养基中，固态发酵生产脂肽，发酵时间为4~8天，发酵温度为30℃~40℃。

4）脂肽产物的提取：发酵结束后，利用pH 8.5~9.5的NaOH水溶液在60℃~80℃下浸提固态发酵培养物20~40min，过滤、离心收集浸出液，调节浸出液pH至1.5~2.0，低温沉降4~6h，离心、干燥得到脂肽。

豆渣固态残余物的应用，将提取脂肽后的固态发酵残余物，经离心等处理进一步脱水后，计数其中的枯草芽孢杆菌，活菌数达到10⁸~10¹⁰ cfu/g，开发成微生物肥料。

本发明方法在低成本、无泡沫发酵生产脂肽和豆渣高附加值资源化利用中的应用，所述方法通过固态发酵能够将豆渣转化为高附加值的脂肽类生物表面活性剂，固态发酵残余物用于开发高含枯草芽孢杆菌的微生物肥料。

本发明的有益效果在于：

豆腐、豆奶等豆制食品的加工副产物（豆渣）具有营养丰富、廉价易得等特点，是枯草芽孢杆菌生长代谢的优良底物。本发明以豆渣为经济性发酵原料，以农业有益菌枯草芽孢杆菌为发酵菌种，通过固态发酵工艺生产脂肽，既降低脂肽的生产成本，还能解决脂肽发酵生产中的泡沫问题。固态发酵残渣中枯草芽孢杆菌活菌数高，可用作微生物肥料。本发明将豆渣这一农产品副产物转化为高价值的脂肽生物表面活性剂，并将发酵残渣开发成高含枯草芽孢杆菌的微生物肥料，实现对豆渣的髙附加值资源化利用。

菌种保藏信息

保藏时间：2022年11月11日；

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

保藏编号： CGMCC NO. 26136；

保藏单位地址：保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

分类命名：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

具体实施方式

结合下述具体实施例对本发明进行详细的说明，使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在如下实施例中，如无特殊说明，所用的材料和试剂均可从生化试剂材料公司购买到。

本发明的发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），已于2022年11月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO. 26136。

实施例1

用于制备种子液的培养基为液态LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl10 g/L，余量为水，pH 7.0。

用于固态发酵生产鼠李糖脂的培养基：豆渣10 g，小麦秸秆1g，无机盐水溶液5mL。无机盐水溶液组成：4.0 g/L NH₄Cl、4.0 g/L KH₂PO₄、5.0 g/L K₂HPO₄⋅3H₂O、0.8 g/LMgSO₄⋅7H₂O、0.2 g/L CaCl₂⋅2H₂O、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L KCl，余量为水。

用电子天平分别称量上述材料或试剂，配制相应的培养基；置于115℃下灭菌30min。

本实施例中所用发酵菌种为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）CGMCC NO. 26136。所用豆渣为大豆制作豆腐后产生的残渣。

用接种环刮取菌种斜面一环，接种到含100ml LB培养基的三角瓶中，在35℃、180rpm条件下培养10h，制备枯草芽孢杆菌的种子液。

取0.5 mL枯草芽孢杆菌的种子液，接种到上述固态发酵培养基中，在35℃条件下培养6天，每隔8h用无菌竹签将三角瓶中的固态培养物进行翻动。

发酵结束后，利用pH 8.5~9.5的NaOH水溶液100 mL在60℃下浸提固态发酵培养物30min，先滤纸过滤、再离心（8000 rpm，10 min）收集浸出液，利用6 mol/L的盐酸溶液调节浸出液pH至2.0，4℃下静置6h，离心（8000 rpm，10 min）收集沉淀，在75℃烘箱干燥沉淀，得到脂肽产物。所得脂肽的量为150.0±5.2 mg。豆渣转化为脂肽的转化率约1.5%。

实施例2

称取适量实施例1制备的脂肽样品，溶解于 10%乙腈-水中，配成500mg/L 的溶液，用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后，加样到液相色谱仪系统，进样量为 20 μL；流动相为乙腈-水，采用线性梯度洗脱（0~1min，流动相中乙腈含量10%；1~20min流动相中乙腈含量从35％线性增加到60％，20~30min乙腈含量保持在60％30~45min乙腈含量保持在85％），流速为0.3mL/min。

质谱条件如下：毛细管电压5kV、锥孔电压32V、电喷雾离子源(ESI)：120℃、雾化温度350℃、雾化气流速：200L/h。选择正离子模式，质谱扫描质量数范围为 150~1250m/z。

根据检测到的特征荷质比（m/z）分析脂肽同系物组成。该实施例中检测得到如下7个特征荷质比（m/z）：994，1008，1016，1030，1044，1058，1036，1072；分别对应surfactin-C12 [M+H]⁺，surfactin-C13 [M+H]⁺，surfactin-C12 [M+Na]⁺，surfactin-C13 [M+Na]⁺，surfactin-C14 [M+Na]⁺，surfactin-C15 [M+Na]⁺，surfactin-C16 [M+Na]⁺。结果表明枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136利用豆渣合成的脂肽类表面活性剂主要为surfactin。

实施例3

该实施例对比枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136利用豆渣和豆粕固态发酵生产脂肽的效果。豆渣是大豆制作豆腐产生的残渣，豆粕是大豆提取豆油后产生的残渣。

用于制备种子液的培养基为液态LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl10g/L，余量为水，pH 7.0。

固态发酵生产脂肽的豆渣培养基：豆渣15 g，小麦秸秆1g，无机盐水溶液10 mL。无机盐水溶液组成：4.0 g/L NH₄Cl、4.0 g/L KH₂PO₄、5.0 g/L K₂HPO₄⋅3H₂O、0.8 g/L MgSO₄⋅7H₂O、0.2 g/L CaCl₂⋅2H₂O、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L KCl，余量为水。

固态发酵生产脂肽的豆粕培养基：豆粕15 g，小麦秸秆1g，无机盐水溶液10 mL。无机盐水溶液组成：4.0 g/L NH₄Cl、4.0 g/L KH₂PO₄、5.0 g/L K₂HPO₄⋅3H₂O、0.8 g/L MgSO₄⋅7H₂O、0.2 g/L CaCl₂⋅2H₂O、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L KCl，余量为水。

待培养基冷却至20℃~40℃后，用接种环刮取枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136菌种斜面一环，接种到含100ml LB培养基的三角瓶中，在35℃、180rpm条件下培养10h，制备种子液。

然后，分别将1 mL枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136的种子液接种到豆渣固态发酵培养基（约26g）和豆粕固态发酵培养基（约26g）中，每组设置3个平行，在35℃条件下培养6天，进行固态发酵生产脂肽，每隔8h用无菌竹签将三角瓶中的固体培养物进行翻动。发酵结束后，利用pH 8.5~9.5的NaOH水溶液100 mL在60℃下浸提固态发酵培养物30min，先滤纸过滤、再离心（8000 rpm，10 min）收集浸出液，利用6 mol/L的盐酸溶液调节浸出液pH至2.0，4℃下静置6h，离心（8000 rpm，10 min）收集沉淀，在75℃烘箱干燥沉淀，得到脂肽产物。

从豆渣固态培养物中共得到脂肽0.53 g，而从豆粕固态培养物中共得到脂肽0.14g。结果表明，豆渣比豆粕更适合作为枯草芽孢杆菌固态发酵生产脂肽的底物。

实施例4

该实施例对比枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136利用豆渣固态发酵和液态发酵生产脂肽的效果。豆渣是大豆制作豆腐产生的残渣。

固态发酵生产脂肽的豆渣培养基：豆渣10 g，小麦秸秆1g，无机盐水溶液10 mL。无机盐水溶液组成：4.0 g/L NH₄Cl、4.0 g/L KH₂PO₄、5.0 g/L K₂HPO₄⋅3H₂O、0.8 g/L MgSO₄⋅7H₂O、0.2 g/L CaCl₂⋅2H₂O、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L KCl，余量为水。

液态发酵生产脂肽的豆渣培养基：豆渣10 g，小麦秸秆1g，无机盐水溶液100 mL。无机盐水溶液组成：4.0 g/L NH₄Cl、4.0 g/L KH₂PO₄、5.0 g/L K₂HPO₄⋅3H₂O、0.8 g/L MgSO₄⋅7H₂O、0.2 g/L CaCl₂⋅2H₂O、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L KCl，余量为水。

然后，分别将1 mL枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136的种子液接种到豆渣固态发酵培养基和豆渣液态发酵培养基中，每组设置3个平行，在35℃条件下培养6天。固态发酵每隔8h用无菌竹签将三角瓶中的固体培养物进行翻动，液态发酵将三角瓶置于180rpm条件下培养。发酵结束后，发现固态发酵的三角瓶中无泡沫产生，在液态发酵的三角瓶的液体上部有一层泡沫产生。

利用pH 8.5~9.5的NaOH水溶液100 mL在60℃下浸提固态发酵培养物30min，先滤纸过滤、再离心（8000 rpm，10 min）收集浸出液，利用6 mol/L的盐酸溶液调节浸出液pH至2.0，4℃下静置6h，离心（8000 rpm，10 min）收集沉淀，在75℃烘箱干燥沉淀，得到脂肽产物。

从固态培养物中所得脂肽的量为153.5±7.0 mg，10 g豆渣转化为脂肽的转化率约1.5%；而从液态培养物中所得脂肽的量为82.9±5.8 mg，10 g豆渣转化为脂肽的转化率约0.8%。结果表明，利用豆渣为底物，固态发酵比液态发酵的脂肽产量和转化率更高，且固态发酵过程中无泡沫产生。

实施例5

豆渣固态残余物的应用，将提取脂肽后的固态发酵残余物，经离心（8000 rpm，10min）收集沉淀处理进一步脱水。

用于计数的培养基为固态LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂18 g/L，余量为水，pH 7.0。用电子天平分别称量上述材料或试剂，配制培养基；置于115℃下灭菌30min，倒平板备用。

称取脱水后的发酵残渣1g，置于9 mL无菌生理盐水中重悬，然后将重悬液在一系列9 mL无菌生理盐水中进行10倍梯度稀释，取梯度稀释液150 μL涂布LB培养基平板，在35℃下培养24 h，计数枯草芽孢杆菌的菌落数。

每克豆渣固态发酵残渣中枯草芽孢杆菌的活菌数达到4.26*10⁹ cfu/g，枯草芽孢杆菌是土壤有益菌，豆渣固态发酵残余物可开发成微生物肥料。

本发明利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法及其发酵残余物的应用，将豆渣这一豆腐、豆浆等豆制品的加工副产物转化为高附加值的脂肽类生物表面活性剂，提取脂肽后的固态发酵残渣还可开发成高含枯草芽孢杆菌的微生物肥料。本发明既实现豆渣的髙附加值资源化利用，又解决脂肽发酵过程中的严重泡沫问题，并降低脂肽的发酵生产成本。

Claims

1.一种利用豆渣固态发酵生产脂肽的方法，其特征在于，以保藏编号为CGMCC NO.26136的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为发酵菌种，通过固态发酵生产脂肽生物表面活性剂。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，固态发酵培养基由豆渣、秸秆和无机盐水溶液按1~2kg:0.1~0.2kg:0.3~1L的比例混合搅拌而成；豆渣为豆腐或豆奶豆制食品的加工副产物，秸秆为小麦秸秆或水稻秸秆；无机盐水溶液组成：4.0 g/L NH₄Cl、4.0 g/L KH₂PO₄、5.0g/L K₂HPO₄⋅3H₂O、0.8 g/L MgSO₄⋅7H₂O、0.2 g/L CaCl₂⋅2H₂O、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L KCl，余量为水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵包括以下步骤：

1）将豆渣、秸秆和无机盐水溶液按比例混合，然后115℃灭菌30min，制备发酵用固态培养基；

2）将枯草芽孢杆菌CGMCC NO. 26136接种至液体种子培养基中，制备发酵菌种的种子液；

3）将种子液以1%~6%mL/100g固态培养基的比例接种到固态培养基中，固态发酵生产脂肽，发酵时间为4~8天，发酵温度为30℃~40℃；

4）发酵结束后，利用pH 8.5~9.5的NaOH水溶液在60℃~80℃下浸提固态发酵培养物20~40min，过滤、离心收集浸出液，调节浸出液pH至1.5~2.0，低温沉降4~6h，离心、干燥得到脂肽。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取脂肽后的固态发酵残余物，经进一步脱水处理后，其中枯草芽孢杆菌的活菌数达到10⁸~10¹⁰ cfu/g，制成微生物肥料。